Добірка наукової літератури з теми "Ingénierie de génome"

L’avènement des nucléases programmables, et de CRISPR-Cas9 en particulier, constitue une réelle rupture technologique dans le domaine de l’ingénierie génétique. Le principe de ces méthodes est relativement simple. Il consiste en premier lieu à générer des cassures double-brin au niveau de régions très précises d’une séquence cible (ADN d’une cellule somatique, germinale, embryonnaire, iPS...). Ces cassures sont ensuite réparées par des mécanismes cellulaires pouvant conduire à l’inactivation des régions modifiées (knock-out, ou KO), ou à l’insertion, par recombinaison homologue, d’un fragment de séquence modèle apporté à la cellule (knock-in, ou KI). Les domaines d’application de ces techniques sont très nombreux : recherche fondamentale, thérapie génique, ingénierie écologique, biotechnologies industrielles, agriculture, etc. Elles ont d’ores et déjà été utilisées à de multiples reprises dans les espèces animales d’élevage. Des exemples d’applications visant à améliorer la santé des animaux (induction de résistances pour des maladies infectieuses à fort impact économique, et/ou à fort potentiel zoonotique), à éviter des pratiques d’élevage compromettant le bien-être animal (écornage, élimination systématique de poussins mâles), ou à modifier les produits (lait, œufs, viande) dans le but d’améliorer leur valeur santé (réduction des allergies), ou nutritionnelle, sont présentés. Le déploiement de ces méthodes soulève de multiples questions (techniques, réglementaires, économiques, éthiques...) qui sont discutées.

Perçues par les instances de la Communauté européenne comme devant constituer le levier d'une nouvelle politique économique capable de relever pour les pays industrialisés le défi du double choc pétrolier, les biotechnologies ont fait l'objet d'une politique européenne ambitieuse destinée tout d'abord à en assurer la fiabilité technique puis à les intégrer à un marché ouvert et loyal. Paradoxalement, au moment où cette politique aurait dû produire ses premiers effets en permettant la mise sur le marché de produits issus d'organismes génétiquement modifiés (OGM) et en facilitant la brevetabilité de ceux-ci, sa légitimité a été remise en cause. Une succession de crises en matière de sécurité sanitaire (scandale du sang contaminé, crise de la vache folle), pourtant sans rapport direct avec les OGM, ont contribué à mettre en cause l'acceptabilité sociale des biotechnologies, tant en raison des doutes qui ont surgi quant au contrôle des risques que pour des raisons d'ordre culturel, s'agissant du lancement sur le marché de nouveaux aliments. Dès lors, pour trouver une issue à cette crise, le droit n'est plus seulement utilisé comme l'instrument au service d'une politique industrielle, mais il doit à la fois retrouver un rôle symbolique, capable de mobiliser valeurs et principes fondamentaux réaffirmant la primauté de l'être humain, et une fonction de terrain, consistant à organiser des filières de gestion des risques en vue de donner au principe de précaution vie et cohérence dans le domaine de la coopération internationale.

Depuis les années 70, sous l'influence notamment des travaux du Hastings Center, l'éthique de l'ingénierie a connu un développement remarquable. De la déontologie des ingénieurs, historiquement liée à la pratique du génie conseil, elle s'est progressivement ouverte aux autres décideurs en ingénierie, en particulier au «monde des affaires». Elle est devenue, d'autre part, un champ de réflexion multidisciplinaire tenant compte des impacts sociaux et environnementaux du développement technologique ainsi que du contexte industriel dans lequel évolue la majorité des ingénieurs. Tenant compte enfin des risques inhérents à la société technicienne, l'éthique de l'ingénierie a porté une attention particulière à la pratique du consentement éclairé du public dans le développement industriel et technologique. Créneau spécifique de la recherche actuelle en éthique professionnelle, l'éthique de l'ingénierie n'annule toutefois pas la tradition déontologique des corporations et des sociétés d'ingénieurs. Elle en constitue plutôt le contexte critique, sollicitant une évolution et une adaptation de la pratique, et conséquemment de la déontologie tant théorique que pratique de la profession.

Le traitement des effuents vinicoles est très souvent réalisé par des systèmes aérobies avec des bassins ouverts. Au-delà de la consommation d'énergie, ces dispositifs génèrent souvent des nuisances sonores, olfactives et visuelles, ce qui impose le plus souvent d'éloigner le dispositif de la cave. La coopérative « Les Vignerons de de Buzet », située dans le sud-ouest de la France, qui a déjà développé une démarche durable pour le vignoble et la cave, a souhaité intégrer une zone humide associée au traitement des effuents de cave avec le procédé breveté de la société BlueSET spécialisée dans le génie écologique. Après une première étape de traitement en aérobie, le dispositif se compose d'un ensemble de bassins dans lesquels sont implantés majoritairement de plantes locales non invasives. Il a pour objectif de favoriser la biodiversité et de permettre aux visiteurs de profiter de manière didactique d'une zone de promenade écologique qui valorise l'image environnementale de la cave. Les résultats de la première année démontrent que les performances sont compatibles avec les normes de rejet locales.

La caractérisation de l’aléa sismique constitue un enjeu majeur dans le domaine du génie civil. En ingénierie des vibrations, il n’existe pas de domaine d’étude similaire bien que cette question soit décisive pour la prédiction de l’impact et de la gêne occasionnée (population, environnement, ouvrages, industrie de pointe). Cette caractérisation passe nécessairement par la connaissance des diverses sources de vibrations : exploitation des infrastructures (ferrées et routières), travaux de construction ou de rénovation (vibrofonçage, battages). Elle dépend fortement du mode de propagation des ondes mécaniques entre la source et le récepteur selon les sols (sites) et leur stratification. La nocivité des vibrations (i.e. capacité à occasionner des dégâts) dépendra donc du type de source, de la propagation, mais également de la réponse dynamique du récepteur exprimée en fonction de ses propriétés modales. Dans cet article, des simulations numériques sont combinées à des enregistrements de vibrations, liées à l’exploitation d’infrastructures ou engendrées par des chantiers. Dans l’hypothèse de sols à comportement viscoélastique et pour une configuration stratigraphique donnée, les niveaux de vibrations envisageables à la surface libre s’estiment en fonction de la distance à la source. Les enregistrements considérés permettent d’identifier des indicateurs pertinents et de proposer une classification simplifiée des sources et des sites. On combine ainsi les caractéristiques spectrales des sources (représentées par leur Transformée de Fourier) et la propagation entre la source et le récepteur au moyen d’une fonction de transfert (rapport spectral entre vibration à une distance donnée et celle au niveau de la source). La correspondance entre les propriétés spectrales des sources et celles d’un site donné est quantifiée par le facteur d’immunité (IMF) indépendamment du récepteur à considérer. Cette quantification représente l’ « aléa vibratoire » qui indique le niveau vibratoire attendu en entrée au niveau du récepteur. Ceci est similaire à la définition de l’aléa sismique utilisée dans l’Eurocode 8 pour les études de dimensionnement et renforcement sismique. En utilisant les paramètres comme le gradient de vitesse et le contenu spectral des enregistrements, les effets induits ont été analysés pour de multiples sources. Des indicateurs pertinents (vitesse moyenne à faible profondeur et gradient de vitesse) sont introduits afin de proposer une classification simplifiée de l’aléa vibratoire pour les différentes sources considérées. En cas d’absence de mesure pour une source et un site donnés, cette classification empirique pourra être utilisée afin d’estimer le niveau vibratoire attendu en entrée d’un récepteur.

L’avènement des nucléases programmables, notamment de CRISPR-Cas9, constitue une rupture technologique dans le domaine de l’ingénierie génétique. Le principe de ces méthodes est simple : il consiste à générer des cassures au niveau de séquences d’ADN cibles dans des cellules d’intérêt. Ces cassures sont ensuite réparées par un mécanisme de ligation non-homologue des extrémités pouvant conduire à l’inactivation d’un gène de la région modifiée, ou par recombinaison homologue permettant l’insertion d’un fragment de séquence apporté aux cellules. Les domaines d’application sont très nombreux : recherche fondamentale, thérapie génique, ingénierie écologique, biotechnologies, agriculture... Des exemples d’applications visant à améliorer la santé des animaux, à améliorer le bien-être animal ou l’éthique de la production, ou à modifier les produits pour une meilleure valeur santé ou nutritionnelle, sont présentés. L’utilisation de ces méthodes soulève de multiples questions (techniques, réglementaires, économiques, éthiques...) qui sont discutées.

Les mycoplasmes sont des bactéries pathogènes, dotées de petits génomes d’environ 1Mbp, avec une faible teneur en G+C. L'intérêt de la communauté scientifique pour ces bactéries a été récemment renouvelé par des avancées dans les domaines de la synthèse et de la transplantation de génomes. Ces nouvelles approches ont ouvert la voie à l'ingénierie génomique à grande échelle des mycoplasmes. Les systèmes CRISPR/Cas sont des systèmes de défense adaptatifs procaryotes contre les acides nucléiques invasifs. Le système CRISPR de Streptococcus pyogenes est composé d’une endonucléase (SpCas9) et de deux CRISPR ARNs (crRNA et tracrRNA) qui dirigent Cas9 vers sa séquence d’ADN cible. La reconnaissance de l’ADN cible se fait par appariement du crRNA et de la présence en aval d’une séquence nommée protospacer adjacent motif (PAM). Apres cette reconnaissance, Cas9 coupe l’ADN cible. A partir de ce système, un outil génétique simplifié composé de Cas9 et d’un ARN guide (gRNA) a été développé pour de nombreux organismes. Le premier objectif de ma thèse était de combiner les méthodes de biologie synthétique de clonage et de la transplantation de génomes avec les outils CRISPR/Cas9 pour l’ingénierie des génomes de mycoplasmes clonés dans la levure. Nous avons réussi à utiliser cette approche pour enlever des gènes et des régions génomiques dans trois espèces: Mycoplasma mycoides subsp. capri (Mmc), M. capricolum subsp. capricolum et M. pneumoniae. Afin de développer un système plus adapté aux mycoplasmes, nous avons ensuite caractérisé le système CRISPR/Cas9 de Mycoplasma gallisepticum (Mg). En utilisant une combinaison d'approches in silico et in vivo, la séquence PAM de MgCas9 a été caractérisée comme NNNAAAA. Nous avons alors entrepris de développer un système CRISPR/Cas minimal de M. gallisepticum pour une utilisation directe dans les cellules de mollicutes: le gène codant MgCas9 a été introduit dans le génome de Mmc, mais son activation avec un gRNA chimère entre le crRNA et le tracrRNA de M. gallisepticum n’a pas été obtenue pour le moment
Mycoplasmas are small pathogenic bacteria that are characterized by reduced genomes of about 1 Mbp with a low G+C content. The interest of the scientific community towards these species has been recently renewed by successful synthesis of their genome and transplantation experiments. These new genetic tools opened the way to further applications and developments for large-scale genome engineering programmes. CRISPR/Cas systems are natural systems that provide bacteria and archaea with an adaptive defense mechanism against invading nucleic acids. The CRISPR system from Streptococcus pyogenes includes an endonuclease (SpCas9) and two CRISPR RNAs (crRNA et tracrRNA) which role are to drive Cas9 to a target sequence. Target recognition depends on a specific pairing of the crRNA and the presence of a motif named protospacer adjacent motif (PAM). After recognition, Cas9 cleaves the targeted DNA. From the natural S. pyogenes system, a simplified genetic tool including Cas9 and a guide RNA (gRNA) was developed for many organisms . The first goal of my thesis was to combine the synthetic biology methods of genome cloning in yeast and back transplantation into recipient cells with a CRISPR/Cas9 tool for efficient engineering of mycoplasma genomes cloned in yeast. We succeeded in removing genes and genomic regions in three different species, Mycoplasma mycoides subsp. capri (Mmc), M. capricolum subsp. capricolum and M. pneumoniae. Then, in order to develop a system optimized for mycoplasma genome editing, we characterized a natural CRISPR/Cas9 system derived from Mycoplasma gallisepticum (Mg). Using a combination of in silico and in vivo approaches, MgCas9 PAM sequence was characterized as NNNAAAA. We then started to develop a minimal CRISPR/Cas system from M. gallisepticum for direct genome editing in mollicutes. Thus we introduced MgCas9 encoding gene in Mmc and tried to activate it with a newly designed gRNA, a chimeric molecule between the crRNA and the tracrRNA of M. gallisepticum, without success yet

L’ingénierie des génomes des micro-organismes est devenue un standard dans les biotechnologies microbiennes. En 2010, des technologies prometteuses de biologie de synthèse utilisant la levure comme plateforme pour l’assemblage et l’ingénierie de génomes synthétiques bactériens suivi de leur transplantation dans une cellule receveuse ont vu le jour. Ces technologies ont conduit à la création des premières cellules synthétiques et ouvert de nouvelles voies vers la construction de cellules aux propriétés biologiques entièrement contrôlées. Le transfert de ces outils à des micro-organismes d’intérêt industriel comme la bactérie Gram+ Bacillus subtilis (Bsu), modèle dans le secteur des biotechnologies, constituerait une avancée majeure. C’est précisément l’objectif du projet ANR « Bacillus 2.0 », qui réunit deux équipes INRAE et qui se propose d’adapter l’ensemble de ces outils de biologie de synthèse à Bsu afin d’être en mesure de partir d’une conception, assistée par ordinateur, de génomes semi-synthétiques de Bsu jusqu’à l’obtention de nouvelles souches industrielles. Cependant, les premiers travaux réalisés sur ce projet ont montré que le génome entier de Bsu ne pouvait pas être cloné et maintenu en l’état dans la levure. Ces résultats risquaient de remettre en question la faisabilité du projet dans son ensemble et en particulier la pertinence d’utiliser la levure comme plateforme d’assemblage du génome semi-synthétique de Bsu.L’objectif de ma thèse a consisté à démontrer que la levure restait un hôte pertinent pour le projet « Bacillus 2.0 ». Elle s’est déclinée en 3 parties. Dans la première partie, une méthode de clonage de génome récemment développée au laboratoire et dénommée CReasPy-Fusion, a progressivement été adaptée à Bsu. Les résultats obtenus ont montré (i) le transfert possible d'ADN plasmidique entre protoplastes bactériens et sphéroplastes de levure, (ii) l'efficacité d'un système CRISPR-Cas9 porté par les cellules de levure pour capturer/modifier cet ADN plasmidique pendant la fusion Bsu/levure, puis (iii) l'efficacité de ce même système pour capturer des fragments de génome d’une centaine de kb à partir de trois souches différentes. Des observations en microscopie à fluorescence ont également été réalisées et ont mis en évidence deux types d’interactions qui permettraient de passer d’un contact protoplastes/sphéroplastes à un ADN bactérien cloné dans la levure. Dans la seconde partie de ma thèse, la méthode CReasPy-Fusion a été mise à profit pour tenter de cloner de grands fragments du génome de Bsu dans la levure. Des fragments génomiques jusqu’à ~1 Mb ont pu être clonés dans la levure, mais leur capture a nécessité l’ajout préalable d’un grand nombre d’ARS sur le génome de Bsu pour stabiliser les constructions génétiques. La dernière partie a été l’adaptation de la méthode RAGE à Bsu. Cette méthode permet le transfert, non pas d’un génome entier mais de portions de génomes bactériens depuis la levure vers la bactérie à éditer. Une preuve de concept a été réalisée avec l’échange d’un premier fragment de génome de 155 kb par une version réduite de 44 kb.En conclusion, les travaux réalisés au cours de cette thèse ont montré la pertinence d’utiliser la levure comme plateforme d’ingénierie dans les modifications à grande échelle du génome de Bsu. D’une part, nous avons montré que des fragments d’une centaine de kb peuvent être clonés dans la levure, modifiés et transférés dans une cellule receveuse de façon à générer des Bsu mutants. Cette stratégie offre une véritable alternative à la transplantation de génome. D’autre part, nous avons montré que de grands fragments du génome de Bsu (jusqu’à 1Mb) peuvent également être clonés dans la levure à condition de contenir de nombreux ARS dans leurs séquences. Grâce à ces résultats, le clonage d’un génome réduit de Bsu chez la levure est redevenu un objectif réalisable
Genome engineering of microorganisms has become a standard in microbial biotechnology. In 2010, promising synthetic biology technologies using yeast as a platform for the assembly and engineering of synthetic bacterial genomes followed by their transplantation into a recipient cell have emerged. These technologies have led to the creation of the first synthetic cells and opened new avenues towards the construction of cells with fully controlled biological properties. Transferring these tools to microorganisms of industrial interest such as the Gram+ bacterium Bacillus subtilis (Bsu), a model in the biotechnology sector, would be a major step forward. This is precisely the aim of the ANR "Bacillus 2.0" project, which brings together two INRAE teams and aims to adapt all these synthetic biology tools to Bsu so as to be able to go from computer-aided design of semi-synthetic Bsu genomes to the production of new industrial strains. However, initial work on this project showed that the entire Bsu genome could not be cloned and maintained in yeast in its current state. These results threatened to call into question the feasibility of the entire project and, in particular, the relevance of using yeast as a platform for assembling the semi-synthetic Bsu genome.The goal of my thesis was to demonstrate that yeast remained a relevant host for the Bacillus 2.0 project. It was divided into 3 parts. In the first part, a genome cloning method recently developed in the laboratory, called CReasPy-Fusion, was progressively adapted to Bsu. The results obtained showed (i) the possible transfer of plasmid DNA between bacterial protoplasts and yeast spheroplasts, (ii) the efficiency of a CRISPR-Cas9 system carried by yeast cells to capture/modify this plasmid DNA during Bsu/yeast fusion, and then (iii) the efficiency of the same system to capture genomic fragments of about a hundred kb from three different strains. Fluorescence microscopy observations were also carried out revealing two types of interaction that would enable the transition from protoplast/spheroplast contact to cloned bacterial DNA in yeast. In the second part of my thesis, the CReasPy-Fusion method was used in an attempt to clone large Bsu genome fragments in yeast. Genomic fragments of up to ~1 Mb could be cloned in yeast, but their capture required the prior addition of a large number of ARS to the Bsu genome to stabilize the genetic constructs. The final part was the adaptation of the RAGE method to Bsu. This method allow the transfer, not of a whole genome, but of portions of bacterial genomes from yeast to the bacteria to be edited. Proof of concept was achieved by exchanging a 155 kb genome fragment with a reduced 44 kb version.In conclusion, the work carried out during this thesis has shown the relevance of using yeast as an engineering platform for large-scale modifications of the Bsu genome. On the one hand, we have shown that fragments of around 100 kb can be cloned in yeast, modified and transferred into a recipient cell to generate Bsu mutants. This strategy offers a real alternative to genome transplantation. On the other hand, we have shown that large fragments of the Bsu genome (up to 1 Mb) can also be cloned in yeast, provided they contain numerous ARS in their sequences. Thanks to these results, cloning a reduced Bsu genome in yeast has once again become an achievable goal

Deinococcus geothermalis est un organisme non-model intéressant pour les bio-productions de part sa résistance extrême et ses capacités de fermentation partant de diverses sources de carbone. Cependant les outils d’ingénierie permettant une fine maîtrise des voix métaboliques restent limités pour cet organisme. Le but de ce travail de thèse, est d’essayer de surpasser cet obstacle à travers l’observation des motifs génétiques et de leur organisation. L’analyses de ces motifs a été menée via deux approches. La première est l’étude de l’impact de la position dans le génome sur l’expression d’une cassette reportrice. Grâce à une collection de 150 souches, nous avons observé que l’expression est plus forte au niveau de l’origine de réplication que du terminus. Une autre observation concerne la présence de zone de forte expression réparties symétriquement le long du chromosome. La seconde approche est l’analyse des motifs génétiques en cas de stress grace outil GREAT:SCAN:patterns. Ces motifs sont fortement liés régulation de l’expression des gènes et sont des points intéressant pour l’ingénierie du génome. En analysant les résultats de différentes conditions de stress ainsi que les régulons décrits dans la littérature, nous avons pu observer que des stress voisins partagent les mêmes motifs et que ces motifs semblent conservés chez des organismes distants. Ces deux approches ont permis de déterminer des positions d’insertion dans le génome intéressantes pour l’ingénierie métabolique
Deinococcus geothermalis is a non-model organism of high interest for bio-manufacturing since it shows a extreme resistance and good capacities for fermentation process on different carbon sources. However the engineering tools are limited to finely tuned metabolic pathways for bio-productions. This PhD work aims at contributing to overcome this obstacle through a whole-genome approach to the issue of understanding the genomic organization of D. geothermalis and defined interesting genomic locations. The whole-genome approach is based on the existence of genome-scale patterns that were analyzed in two different ways. A first approach consisted of studying the influence of the genome location on the expression of a reporter cassette. On a library of over 150 strains, the expression is higher near the origin of replication than near the terminus, a common observation. However, other hot spots of expression along the genome additionally appeared with a symmetric distribution about the origin of replication. The second approach consisted of analyzing the genomic patterns under stress through the in-house GREAT:SCAN:patterns software. These patterns interrelate with gene expression regulation and are an interesting key for genome engineering. Testing different stress conditions and considering the matching regulons as described in the literature, it appeared that related stresses share genomic patterns. Moreover these patterns tend to be conserved between distant organisms. These two approaches lead to define interesting genome loci for inserting genes encoding the enzymes of a pathway, with a view to metabolic engineering

Une stratégie d'innovation en biotechnologie consiste en la construction d'un châssis cellulaire suffisamment simple pour être opérable et optimisé pour la production de composés d'intérêt. Cette stratégie nécessite l'utilisation d'outils génétiques d'ingénierie des génomes efficaces, robustes et multiplexables. Les bactéries modèles à Gram négatif disposent de multiples outils génétiques d'origine phagique, mais ce n'est pas le cas pour les bactéries à Gram positif. Ce travail vise à mettre au point des approches méthodologiques permettant de manipuler et d'étudier l'ensemble du génome de bactériophages, en particulier celui du phage SPP1 de Bacillus subtilis. SPP1 est l'un des bactériophages lytiques le mieux caractérisés de la famille des siphovirus. Néanmoins, de nombreuses questions sur la fonction et l'essentialité de ses gènes, sa transcription, sa réplication et son encapsidation restent sans réponse.Deux collections complémentaires de mutants ont été construites. La première est une collection de souches de B. subtilis, chacune possédant un ou plusieurs gènes phagiques intégrés au chromosome bactérien et dont l'expression est inductible. La toxicité des protéines virales pour B. subtilis a ainsi été testée pour 82 mutants. Environ 23% des mutants ont montré un phénotype affecté par l'expression des gènes phagiques. Par exemple concernant des gènes de fonction inconnue, l'expression de gp29.1 réduit le taux de croissance de manière dose-dépendent, et celle de gp37.1-37.2 induit une filamentation cellulaire.La seconde collection ce sont des phages semi-synthétiques de SPP1, chacun délété pour un ou plusieurs gènes. Une méthode de délétion par assemblage in vitro de fragments du génome de SPP1 a été mise au point, et chaque mutant a été propagé dans la souche provenant de la première collection qui le trans-complémente. Le fitness de 36 mutants a été caractérisé au cours d'infection de B. subtilis. Environ 25% des gènes phagiques se sont avérés essentiels ou quasi-essentiels à la propagation du phage. A titre d'exemple, le mutant SPP1Δgp22, un gène impliqué dans l'assemblage de la queue du phage mais dont le rôle n'est pas encore élucidé, a montré une capacité de multiplication fortement réduite. Enfin, une méthode d'ingénierie in vivo du phage SPP1 par l'intermédiaire du système CRISPR-Cas9 a été développée et validée.Ces résultats ont permis de décrypter certaines interactions entre SPP1 et B. subtilis et serviront à terme à concevoir de nouveaux outils d'ingénierie génétique
A strategy to foster innovation in biotechnology relies on constructing cellular chassis strains with genomes appropriately streamlined for the desired application. Streamlining genomes requires the development of efficient and robust genetic tools for genome engineering. While Gram-negative model bacteria have multiple genetic tools of phage origin, this is not the case for Gram-positive bacteria. This work aims to pioneers methods and techniques for investigating and manipulating bacteriophage genomes, with a particular focus on the SPP1 phage from Bacillus subtilis. SPP1 is one of the best-characterized lytic bacteriophages in the siphovirus family. However, numerous questions persist regarding the function and essentiality of its genes, as well as the processes of SPP1 transcription, replication, and encapsidation.Two complementary libraries of mutants have been constructed. The first one is a library of B. subtilis mutant strains, each carrying one or more phage genes integrated into the bacterial chromosome, with inducible expression. The toxicity of viral proteins to B. subtilis was tested for 82 mutants. Approximately 23% of the mutants displayed altered phenotypes due to the expression of phage genes. For instance, regarding genes of unknown function, the expression of gp29.1 led to a dose-dependent reduction in growth rate, while gp37.1-37.2 expression induced cell filamentation.The second library is composed of semi-synthetic SPP1 phages, each deleted for one or more essential and non-essential genes. A deletion method by in vitro assembly of SPP1 genome fragments followed by host cell transformation was developed. Each phage mutant was built and propagated in the corresponding B. subtilis mutant strain from the first collection to allow for trans-complementation of the phage mutation. The fitness of 36 mutants was characterized during B. subtilis infection, revealing that around 25% of phage genes were found to be essential or nearly essential for phage propagation. For instance, the mutant SPP1 Δgp22, involved in the tail assembly but of unknown function, exhibited significantly reduced capacity for multiplication.Lastly, an in vivo engineering method of genomes of phages from Gram-positive bacteria using CRISPR-Cas9 was developed and validated.These results have helped decipher some interactions between SPP1 and B. subtilis and will ultimately contribute to the design of new genetic engineering tools

La croissance en taille et en complexité des logiciels actuels, ainsi que les contraintes du marché, rendent de plus en plus nécessaires les techniques d'ingénierie concurrente. Ces techniques servent à réduire les temps de développement en permettant à plusieurs développeurs de travailler simultanément sur les mêmes objets. Malheureusement, la concurrence pose de nombreux problèmes mal gérés par les systèmes de support à la collaboration qui existent aujourd'hui. Le contrôle de la concurrence est donc un défi pour les concepteurs d'environnements de génie logiciel. Cette thèse s'intéresse au support informatique des procédés collaboratifs de génie logiciel et, en particulier, au contrôle de la concurrence.
Notre proposition sera divisée en deux parties. Dans la première partie nous définissons un langage pour la modélisation des procédés de génie logiciel concurrents et nous expliquons les mécanismes qui permettent l'application dans la réalité des procédés ainsi définis. La deuxième partie propose un système dit d'augmentation de l'information contextuelle, qui prend avantage de l'existence des modèles de procédés, pour fournir aux utilisateurs une information pertinente pour leur travail.
La proposition est implémentée au sein du logiciel CELINE. Ce logiciel a été mis en service dans un environnement industriel au sein de deux équipes de conception de la société STMicroelectronics.

Un des défis de la biologie de synthèse (BS), est d’apporter des solutions nouvelles à des enjeux globaux majeurs (thérapeutiques/sanitaires, climatiques), en particulier via la construction de souches de production utiles, performantes et respectueuses de l’environnement.Bacillus subtilis (Bsu) est une bactérie Gram+ non pathogène utilisée en biotechnologie comme plateforme de production de molécules d’intérêt. Or, des études récentes ont établi que des souches de Bsu génétiquement modifiées permettaient d’obtenir une plus grande production de protéines recombinantes. Cela suggère que la production de châssis Bsu réduits pourrait être une étape importante dans l’amélioration des souches à visée industrielle.Le projet ANR Bacillus 2.0 dans lequel s’inscrit cette thèse, vise à transposer à Bsu des outils récents du domaine de la BS, et à mettre en place un pipeline efficace pour construire à haut débit des châssis modulables selon l’application biotechnologique. Ce pipeline rassemble les technologies suivantes : (i) design d’un génome synthétique (ii) assemblage de fragments d’ADN chevauchants au sein de la levure Saccharomyces cerevisiae (iii) isolement du génome et transplantation dans une cellule receveuse bactérienne et (iv) sélection et caractérisation des souches mutantes.Les objectifs de cette thèse étaient d’attester la faisabilité de ces méthodes, en tentant de cloner et maintenir le génome réduit de Bsu MPG192 (2,86 Mb) dans la levure, puis de le modifier avec les outils d’ingénierie disponibles chez S. cerevisiae. Dans un premier temps des stratégies déjà décrites dans la littérature ont été déployées afin de cloner le génome entier de Bsu, mais sont restées infructueuses. En nous basant sur une approche de TAR-Cloning, nous avons tenté de cloner plusieurs fragments obtenus par restriction du génome de Bsu. Initialement, seuls cinq fragments sur sept ont été clonés. L’incapacité à cloner le plus grand de ces fragments (1,50 Mpb) est vraisemblablement due à un manque d’ARS et/ou à sa taille. Concernant le second fragment, un ensemble de facteurs peuvent expliquer notre échec : à nouveau le manque d’ARS mais aussi, la présence de nombreux éléments répétés (7 opérons ribosomiques) ou l’expression délétère de ces gènes. Finalement, d’autres expérimentations ont permis de découper le génome en sous-fragments de tailles variables (6kb à 515kb) et ainsi de cloner en 21 morceaux la totalité du génome de Bsu MGP 192. Le TAR-Cloning imposant des contraintes dans le choix des sites de restriction, une nouvelle méthode de clonage, appelée CReasPy-Fusion, a été développée. Elle combine le système d’édition CRISPR-Cas9 et la fusion entre des sphéroplastes de levure et des cellules bactériennes. Comme preuve de concept, nous avons d’abord travaillé avec six espèces de mycoplasmes, et démontré qu’il est possible de cloner et modifier des génomes entiers. Cette approche a ensuite été transposée à Bsu, validant pour la première fois la fusion entre des sphéroplastes de levure et des protoplastes de bactéries Gram+. Elle a permis la capture précise d’un fragment d’environ 150kb.Bien que le génome entier de Bsu n’ait pas été cloné dans la levure à ce jour, plusieurs éléments critiques ont pu être identifiés. Tout d’abord, ces travaux soulignent l’importance de la méthode de clonage à adopter en fonction de l’organisme avec lequel on travaille. Ensuite, ils mettent en exergue l’existence de facteurs biologiques et techniques qui expliquent les difficultés actuelles et qui devront être pris en compte dans la suite des expérimentations. Enfin, ils ont permis le développement d’une nouvelle technique de clonage appelée CReasPy-Fusion, qui vient étoffer le catalogue des méthodes déjà décrites. Par sa versatilité, elle ouvre des perspectives pour la capture de grands fragments de génome, pour l’élimination de loci problématiques, ou encore, en appui à l’assemblage de fragments synthétiques
One of the major challenges in the synthetic biology (BS) field, is to provide new solutions to global issues (therapeutic/sanitary or climatic), in particular through the construction of useful, efficient and environmentally friendly production strains.The well-characterized, non-pathogenic, Gram+ bacterium Bacillus subtilis (Bsu), is widely used in industry as a biotechnological workhorse. Recent studies have established that mutant strains with modified genomes are able to produce larger amounts of recombinant proteins. This suggests that the production of rationally designed Bsu chassis could be an important step in the improvement of valuable strains for industrial purposes.This work was performed within the Bacillus 2.0's ANR project, which aims at applying SB tools for Bsu, and at developing an effective pipeline for the high-throughput construction of versatile Bsu chassis strains. Selected SB technologies for the pipeline include (i) the synthetic genome design, (ii) the in-yeast DNA assembly methods using Saccharomyces cerevisiae, (iii) the from-yeast whole genome isolation and transplantation (GT) to a recipient bacteria cell and, (iv) the characterization of recombinant strains.The objectives of this thesis were to ensure the feasibility of these methods using a Gram+ bacterium, by showing, in particular, that it was possible to clone and maintain in S. cerevisiae the genome of a minimal Bsu strain, MPG192 (2.86 Mbp) and to modify it using the large repertoire of yeast genetic tools. Our first attempts to clone the entire Bsu genome into yeast using already described methods failed. Using a TAR-Cloning approach, we then attempted to clone large DNA fragments obtained by restriction of the Bsu genome. In a first experiment, five out of seven fragments were cloned. Difficulties to clone the largest fragment (1.50 Mbp), are presumably related to its size, and/or the lack of ARS elements. Concerning the other fragment, several factors have been proposed to explain the cloning failure: again, an insufficient number of ARS elements, but also, the presence of many repeated sequences (7 ribosomal operons), and/or the deleterious expression of these genes. Finally with other experiments, the whole 2.86 Mb genome was cloned in 21 pieces ranging from 6 kbp to 515 kbp. As TAR-Cloning imposes constraints in the choice of restriction sites, a new cloning method, called CReasPy-Fusion, was developed. This method allows the simultaneous cloning and engineering of mega-sized genome in yeast using the CRISPR-Cas9 system, after direct bacterial cell to yeast spheroplast cell fusion. As a proof of concept, we demonstrated that the method can be used to capture a piece of genome, or to clone and edit the whole genome from six different Mycoplasma species. This method was then adapted to Bsu, showing for the first-time yeast spheroplast and Gram+ protoplast cell fusion. A fragment of ~150 kb has been successfully cloned in yeast.Even if, the entire Bsu genome has not yet been cloned in yeast, several critical elements have been identified. First of all, this work underlines the importance of the cloning method to be adopted depending on the organism of interest. Then, it emphasizes the existence of both biological and technical factors that explain current difficulties and that will have to be taken into account in subsequent experiments. Finally, it enabled the development of the new in-yeast cloning method called CReasPy-Fusion which expands the catalog of technics already described. Through its versatility, it opens up prospects for the capture of large genome fragments, the suppression of problematic loci, and to support the assembly of synthetic fragments

Les lésions dégénératives des tissus squelettiques affectent une part importante de la population et représentent un enjeu majeur de santé publique. Cependant, les approches thérapeutiques mises en place pour la réparation de ces tissus, souffrent de nombreuses limitations. Dans ce contexte, des efforts pluridisciplinaires pour développer des solutions thérapeutiques alternatives ont conduit à une nouvelle discipline, l’ingénierie tissulaire. Cette discipline se donne pour objectif de développer des substituts biologiques aux tissus squelettiques en développant des constructions hybrides associant des matrices tridimensionnelles avec des cellules. L’objectif de cette thèse a été d’évaluer le potentiel de deux exopolysaccharides (EPS) marins HE800 et GY785, en ingénierie des tissus squelettiques. Lors d’une première étude nous avons mis en place un mode de stérilisation adapté aux EPS marins. Dans le but de développer des matrices tridimensionnelles physiquement et biologiquement compétentes nous avons démontré dans une deuxième étude que l’association d’EPS marins à un hydrogel auto réticulant à base d’hydroxypropyl méthylcellulose silanisée (HPMC-Si) permettait d’augmenter ces propriétés mécaniques. Une troisième étude plus approfondie sur la construction associant l’EPS GY785 à l’hydrogel d’HPMC-Si à montrer les capacités de cette matrice à favoriser la prolifération et le maintien du phénotype de chondrocytes articulaires de lapin tout en fournissant un microenvironnement adéquate pour la production d’une matrice extracellulaire cartilagineuse. Les résultats de ces travaux montrent l’intérêt des EPS marins en ingénierie tissulaire et plus particulièrement de l’EPS GY785 en ingénierie tissulaire du cartilage
Degenerative hurts of skeletal tissue affect an important part of the population and represent a major stake in health care. However, the therapeutic approaches for the repair of these tissues, suffer from numerous limitations. In this context, a multidisciplinary efforts has been done to develop alternative therapeutic solutions, leading to a new discipline; tissue engineering. This discipline has for objective to develop biological substitutes, by developing hybrid constructs associating three-dimensional matrices with cells. The goal of this thesis was to estimate the potential of two exopolysaccharides (EPS) from marine origin HE800 and GY785 in skeletal tissue engineering. During a first study, we set up a sterilization method adapted to marine EPS. Then, toward the development of physically and biologically competent 3 D matrices, we demonstrated in the second study that the association of EPS to a sililated hydroxypropyl methylcellulose (Si-HPMC) increases the mechanical properties of the scaffold. The third study deepened on the biological properties of the GY785/Si-HPMC scaffold on cartilage tissue engineering with rabbit articular chondrocytes (RAC). Results indicate the ability of this scaffold to maintain and to recover a chondrocytic phenotype as well as the production of cartilage-like extracellular matrix. The results of these works show the interest of marine EPS in tissue engineering and more particularly, the significance of GY785 EPS in cartilage tissue engineering

La restauration de la continuité digestive suite à l'ablation d'une portion de l'œsophage consiste à la réalisation chirurgicale d’une anastomose œsogastrique intra-thoracique. Néanmoins des complications post-opératoires sont décrites telles que des atteintes pulmonaires, des fistules, des sténoses, des nécroses de plastie, et un reflux gastro-œsophagien. Le développement d'un substitut issu de l'ingénierie tissulaire dérivé de la matrice œsophagienne biologique décellularisée (MBD) est prometteur dans la perspective d’améliorer la prise en charge du traitement chirurgical pour le remplacement de l’œsophage. L'objectif principal de cette étude était d'optimiser la conception d’une MBD de porcs et de caractériser ses propriétés biologiques et mécaniques. Le second objectif était de cellulariser la MBD au moyen de cellules immuno-privilégiées, facilement disponibles : les cellules stromales mésenchymateuses humaines issues de la gelée de Wharton (CSM-GW).La décellularisation de l'œsophage était réalisée selon un protocole basé sur la perfusion dynamique de solutions chimiques et enzymatiques de la lumière de l’organe. L’analyse histologique et la quantification de l’ADN résiduel de la MBD permettaient de déterminer l’efficacité du protocole de décellularisation. L'ultrastructure de la MBD était analysée par des marquages immunohistochimiques (IHC), et la composition du contenu protéique de la matrice extracellulaire (MEC) était décrite par spectrométrie de masse. Les tests de cytotoxicité in-vitro de la MBD étaient réalisés conformément à la norme ISO 10993-5. L’évaluation de la force de rétention à la suture, la résistance à la traction et la pression à l’éclatement de la MBD consistait à décrire le comportement mécanique du substitut en regard de son utilisation clinique.Les CSM-GW utilisées pour la cellularisation de la MBD étaient extraites à partir de cordons ombilicaux humains et leur profilage par cytométrie en flux permettait de confirmer la pureté de la population cellulaire. La réponse immunitaire des CSM-GW était quantifiée après une co-culture avec des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC). Le phénotypage des PBMC permettait d’évaluer l’expression des marqueurs immunitaires au contact des MSC-GW, et l’étude du sécrétome, par une méthode immuno-enzymatique (ELISA), quantifiait le relargage des cytokines. La stratégie de cellularisation de la MBD proposée reposait sur le développement de feuillets cellulaires de MSC-GW. La validation du protocole de fabrication des feuillets consistait en la caractérisation du phénotype cellulaire par IHC et l’étude mécanique des feuillets permettait de mesurer leur résistance à la perforation.L’absence de contenu cellulaire et la quantification de l’ADN résiduel de la MBD confirmaient l’efficacité de la décellularisation selon les critères de validation en vigueur. L’ultrastructure et les composants biologiques de la MEC étaient préservés et l'analyse protéomique de la MEC mettait en évidence une complexité protéique. Le traitement de décellularisation n’induisait pas de toxicité de la MBD et le comportement mécanique de la MBD était adapté à son utilisation en tant que substitut œsophagien.La culture des CSM-GW sous forme de feuillets favorisait la cellularisation de la MBD. Une fois ensemencés, les feuillets avaient conservé leur phénotype cellulaire et leur caractéristiques immuno-privilégiées. Un remodelage tissulaire in-vitro était visible ainsi que la formation d’une nouvelle MEC produite par les CSM-GW.Les caractérisations de la MBD obtenue offraient une complexité biologique et un comportement mécanique favorable à son utilisation en tant que substitut œsophagien. La MBD était cellularisable avec des feuillets cellulaires de CSM-GW, pouvant favoriser ainsi l'intégration et le remodelage des tissus
Upon removal of a portion of the esophagus, the restoration of the digestive continuity involves the surgical creation of an intrathoracic esophagogastric anastomosis. However, postoperative complications such as lung impairments, fistulas, strictures, graft necrosis, and gastroesophageal reflux are reported. The enhancement of surgical procedures for esophageal replacement has made promising progress by the development of a substitute through tissue engineering that utilizes a decellularized biological esophageal matrix (DEM). The primary objective of this study was to optimize the design of porcine DEM and characterize its biological and mechanical properties. The secondary objective was to cellularize DEM using readily available immune-privileged human mesenchymal stromal cells derived from Wharton's jelly (hMSCs-WJ).Esophageal decellularization was performed according to a protocol based on the dynamic perfusion of chemical and enzymatic solutions through the organ lumen. Histological analysis and residual DNA quantification of the DEM were conducted to determine the efficiency of the decellularization protocol. The ultrastructure of the DEM was analyzed using immunohistochemical (IHC) labeling, and the composition of the extracellular matrix (ECM) protein content was described by mass spectrometry. In-vitro cytotoxicity tests of DEM were conducted following ISO 10993-5 standards. The evaluation of suture retention strength, tensile strength, and bursting pressure of DEM aimed to describe the mechanical behavior of the substitute for clinical use.hMSCs-WJ used for DEM cellularization were extracted from human umbilical cords, and their flow cytometry profiling confirmed the purity of the cell population. The immune response of hMSCs-WJ was quantified after co-culture with peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). PBMCs phenotyping assessed the expression of immune markers in contact with hMSCs-WJ, while enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) quantified cytokine release. The proposed DEM cellularization strategy involved the development of cell sheets from hMSCs-WJ. The validation of the cell sheet production protocol involved the characterization of the cellular phenotype by IHC analysis, and the mechanical study of the sheets measured their resistance to perforation.The absence of cellular content and residual DNA quantification in DEM confirmed the efficacy of decellularization according to current validation criteria. The ultrastructure and biological components of the ECM were preserved, and proteomic analysis highlighted protein complexity. Decellularization treatment did not induce DEM toxicity, and the mechanical behavior of DEM was suitable for its use as an esophageal substitute.Culturing hMSCs-WJ as cell sheets promoted the cellularization of the DEM. Once seeded, the sheets retained their cellular phenotype and immune-privileged characteristics. In-vitro tissue remodeling was visible, along with the formation of a new ECM produced by hMSCs-WJ.Characterization of the obtained DEM offered biological complexity and favorable mechanical behavior for its use as an esophageal substitute. DEM was cellularizable with hMSCs-WJ cell sheets, potentially promoting tissue integration and remodeling

Les lésions du ligament croisé antérieur (LCA) sont fréquentes. En l´absence de cicatrisation spontanée, la reconstruction par greffe tendineuse autologue est indispensable. Malgré de bons résultats cliniques, certains problèmes demeurent. Dans le cadre de ce projet, nous avons développé un implant de nouvelle génération issu du génie tissulaire. La première partie traite de la caractérisation des cellules du LCA rompu. Nous présentons ensuite deux modèles ligamentaires élaborés à partir de « small intestinal submucosa » (SIS), un matériau matriciel acellulaire d’origine animale. L´utilisation de différentes populations cellulaires et de plusieurs versions du matériau est discutée en troisième partie. Nos résultats montrent que les cellules du LCA rompu se comportent in vitro comme celles du LCA intact. D´autre part, une forme hydratée de SIS permet d’obtenir un modèle à la morphologie proche de celle du LCA. La quatrième partie est consacrée à un essai animal dont l´objectif était de valider pour le LCA une nouvelle technique d´implantation permettant d´accélérer l´intégration de l’implant
Tears of the anterior cruciate ligament (ACL) are frequent. In absence of spontaneous healing, it is necessary to perform an autologous graft. In spite of clinical good results, some limitations remain. Within the framework of this project, we developed an new kind of tissue-engineered implant. The first part deals with the characterization of the cells extracted from the disrupted ACL. Then we present two models of ligament made of “small intestinal submucosa” (SIS), an acellular material of animal origin. The use of various cellular populations and several versions of SIS is discussed in the third part. Our results show that the cells of the disrupted ACL behave in vitro like those of the intact ACL. In addition, a hydrated form of SIS makes it possible to obtain a model with a morphology close to that of the ACL. The fourth part is devoted to an animal test which aimed to validate for the ACL a new protocole of implantation allowing a quicker integretion of the implant

Le cartilage articulaire est un tissu conjonctif spécialisé recouvrant la surface des articulations. Ce tissu a la particularité d'être aneural, avasculaire et alymphatique et présente des capacités de réparation spontanée limitées. Il peut être le siège de lésions d'origine traumatique, inflammatoire ou liées au vieillissement. Les traitements actuels des pertes de substance cartilagineuse ne permettent l'obtention de résultats satisfaisants qu'à court terme et aboutissent à la formation d'un tissu de réparation fibreux. C'est pourquoi des stratégies d'ingénierie tissulaire, dont le principe réside dans l'association de cellules, de matrices et de morphogènes, ont été développées. Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés à l'utilisation combinée de cellules souches du tissu adipeux humain (hCSTA), d'un hydrogel injectable et auto-réticulant (HPMC-Si) et à l'optimisation des conditions de différenciation chondrogénique. Tout d'abord, nous avons montré que les hCSTA présentent les caractéristiques des cellules souches adultes. Nous avons ensuite démontré que les hCSTA cultivées au sein de l'environnement 3D que constitue l'HPMC-Si et en présence de milieu d'induction, expriment un phénotype chondrocytaire et sont capables de former un tissu cartilagineux in vivo. Dans l'optique d'optimiser la différenciation chondrogénique des hCSTA, nous nous sommes intéressés à l'hypoxie et à un polysaccharide marin GAG-mimétique (GY785 DRS). Ces deux facteurs nous sont apparus comme de potentiels outils permettant l'optimisation de la différenciation chondrogénique en vue d'une utilisation en médecine régénérative du cartilage
Articular cartilage is a highly specialized connective tissue that covers the end of bone and forms the smooth surface of joints. Articular cartilage is an avascular, alymphatic, aneural tissue that has limited self-healing capabilities. Cartilage can be altered by traumatic injuries, inflammatory or degenerative diseases. Current surgical treatments for cartilaginous defects only allow to obtain short-term satisfactory results. Therefore strategies for long-term cartilage repair have been developed. These tissue engineering strategies are based on the use of chondrogenic cells, biomaterials and morphogens. In this context, we investigated the combined use of stem cells from human adipose tissue (hATSC) and a silated cellulose-based injectable self-setting hydrogel (Si-HPMC). First we have shown that hATSC exhibit stem cells features. We have then demonstrated that hATSC cultured within a 3D environment provided by Si-HPMC and in the presence of inductive medium, express a chondrocytic phenotype and are able to form a cartilaginous tissue in vivo. In order to optimize the chondrogenic differentiation of hATSC, we were finally interested in deciphering the potential roles of hypoxia and a marine polysaccharide GAG-mimetic (GY785 DRS) to improve chondogenic differentiation of hATSC. These two factors have emerged as potential tools to optimize the chondrogenic differentiation for use in regenerative medicine of cartilage

L’évolution de la conception multidisciplinaire numérisée s’est produite avec deux décennies d’avance pour le génie mécanique et l’industrie manufacturière, par rapport à celle que connait le génie civil et urbain. L’éclairage qui en est fait ici permet de l’interroger avec recul. Chaque concept, outil ou méthode sont définis et précisés en les situant les uns par rapport aux autres.

Ce chapitre introduit les étapes d’une modélisation probabiliste du comportement thermohydromécanique – variable dans l’espace – des ouvrages en béton. À titre d’exemple, la fuite d’une enceinte de confinement est modélisée sous forme d’un chaos polynomial. L’étude fiabiliste des grands ouvrages de génie civil vieillissants apparaît ainsi accessible et utile à une meilleure maîtrise des risques et opérations de maintenance et de réparation.