Добірка наукової літератури з теми "Clonage de génome"

Les cartes géniques des espèces domestiques sont restées très rudimentaires, voire inexistantes, jusqu’au début des années 1990. La situation a évolué à cette période avec la mise en place de vastes programmes de cartographie du génome, aussi bien au plan national (programmes de cartographie de l’INRA, programmes Génome Français) qu’européen (programmes Bridge) pour quelques espèces majeures dont les espèces bovine et porcine. Il est en effet apparu clairement que la connaissance du génome, indispensable pour l’isolement et le clonage des gènes d’intérêt agronomique, passait par la construction des cartes génétique (mise en place d’un réseau de marqueurs polymorphes par analyse de liaison sur des familles de référence) et cytogénétique (localisation de marqueurs et de gènes sur les chromosomes). Les principales méthodes mises au point pour établir, dans un premier temps, la carte cytogénétique puis, dans un deuxième temps, la carte physique à haute résolution sont présentées.

Comparées à celles de l’homme et de la souris, les cartes génétiques des espèces d’élevage sont encore très rudimentaires. Toutefois, la gamme des techniques actuellement disponibles permet désormais de progresser rapidement dans l’établissement de ces cartes. L’objectif immédiat des équipes de génétique moléculaire et cytogénétique de l’INRA est d’identifier, pour les génomes bovin (à Jouy-en-Josas) et porcin (à Toulouse essentiellement), un premier réseau de marqueurs distants d’environ 20 centimorgans, soit un ensemble d’environ 150 marqueurs. Compte tenu du fait que l’organisation du génome est relativement conservée d’une espèce de mammifères à l’autre, les connaissances acquises chez l’homme et la souris permettront, dans une certaine mesure, de guider les travaux de cartographie des espèces d’élevage. On attend de ces recherches : 1) la mise en évidence des régions du génome intervenant dans la variabilité des caractères quantitatifs ; 2) des bases de départ pour le clonage des gènes d’intérêt zootechnique ; 3) le repérage précoce de gènes majeurs à l’aide de gènes marqueurs proches ; 4) une meilleure appréciation de la diversité génétique des races et 5) une précision accrue dans l’identification des animaux et le contrôle des filiations. Des collaborations internationales se mettent en place, notamment dans le cadre de la CEE.

Allèle : une des formes alternatives d'un locus. Dans une cellule diploïde, il y a deux allèles pour chaque locus (un allèle transmis par chaque parent), qui peuvent être identiques. Dans une population, on peut avoir plusieurs allèles pour un locus.Annotation structurale : repérage des coordonnées des diverses structures dans le génome, telles que les gènes.Annotation fonctionnelle : renseignements sur les fonctions des séquences, le plus souvent pour les gènes.BAC : Bacterial Artificial Chromosome. Vecteur de clonage permettant l’obtention de clones bactériens contenant un grand fragment d’ADN génomique (taille > 100 kb*). Les BAC assemblés en contigs* sont à la base des cartes physiques du génome.Carte cytogénétique : carte des chromosomes. Réalisée par localisation visuelle (FISH*) au microscope de fragments d’ADN sur les chromosomes au stade métaphase de la mitose.Carte d’hybrides irradiés : réalisée en testant par PCR la présence ou l’absence de fragments d’ADN dans une collection de clones d’hybrides irradiés (RH*). Deux fragments d’ADN sont proches sur le génome s’ils sont trouvés fréquemment dans les mêmes clones.Carte génétique : obtenue par l’étude de la ségrégation dans des familles ou des populations, de marqueurs polymorphes, soit moléculaires, soit phénotypiques, deux séquences étant d’autant plus proches qu’elles sont souvent transmises ensemble lors de la méiose.Clonage positionnel : stratégie visant à identifier un gène responsable de l’expression d’un phénotype en utilisant des informations de position sur le génome.Contig : ensemble de clones (le plus souvent des BAC*) ou de lectures de séquence ordonnés grâce à des informations sur leur parties chevauchantes.Cosmide : vecteur de clonage permettant l’obtention de clones bactériens contenant des fragments d’ADN génomique de taille avoisinant les 50 kb*.CNV : Copy Number Variation ; polymorphisme du génome correspondant à la variation du nombre de copies d’une séquence, pouvant dans certains cas contenir un ou plusieurs gènes.Déséquilibre gamétique : pour deux loci quelconques, c'est le fait que la fréquence des haplotypes* estimée pour tous les gamètes est différente de celle attendue à partir du produit des fréquences alléliques de chaque locus. Synonyme : déséquilibre de liaison. Contraire de : équilibre gamétique.Dominance : qualificatif de l’effet d'un allèle, dont une copie suffit à l'expression du phénotype* approprié. L’allèle A est dominant sur l’allèle a si l’hétérozygote* Aa a le même phénotype* que l’homozygote AA.EST : Expressed Sequence Tag : séquences étiquettes (partielles) de transcrit, obtenues par séquençage aléatoire d’ARN.Evaluation génomique : évaluation de la valeur génétique d’individus d’après leurs génotypes pour un ensemble de loci distribués sur le génome, d’après des équations établies à partir des performances d’individus de référencephénotypés et génotypés.Expression génique : études visant à estimer le niveau de production (expression) des gènes en fonction d’états physiologiques ou de tissus différents.Exon : fraction de la partie codante d’un gène eucaryote. Les gènes des organismes eucaryotes sont le plus souvent fractionnés en plusieurs séquences d’ADN dans le génome, les exons, séparés entre eux par d’autres séquences (introns*).FISH : Fluorescent In Situ Hybridisation. Hybridation de sondes d’ADN marquées à l’aide d’un fluorochrome, sur des chromosomes au stade métaphase de la mitose. Permet la réalisation de la carte cytogénétique.Fingerprinting : technique permettant d’estimer très grossièrement la similarité entre des séquences d’ADN sans les séquencer, par la comparaison des longueurs de bandes produites par des enzymes de restriction coupant l’ADN à des sites précis.Fosmide : vecteur de clonage permettant l’obtention de clones bactériens contenant des fragment d’ADN génomique de taille déterminée et égale à 40 kb*.FPC : FingerPrint Contig* ; contig* de clones (généralement des BAC*) ordonnés par la technique du fingerprinting, afin d’obtenir une carte physique du génome.Génotype 1 : constitution génétique d'un individu. 2. Combinaison allélique* à un locus particulier, ex: Aa ou aa.Haplotype : combinaison allélique spécifique pour des loci appartenant à un fragment de chromosome défini.Héritabilité au sens strict : proportion de la variance phénotypique due à la variabilité des valeurs génétiques = proportion de la variance phénotypique due à la variance génétique additive.Hétérozygote : individu ayant des allèles non identiques pour un locus* particulier ou pour plusieurs loci. Cette condition définit l’ «hétérozygotie». Contraire de: homozygote.Homologues : séquences similaires en raison d’une origine évolutive commune.Hybride irradié : cellule hybride obtenue par fusion entre cellules hôte d’une espèce et donneuse d’une autre espèce, contenant une fraction aléatoire du génome de l’espèce donneuse, après cassures par irradiation, reconstitution aléatoire de chromosomes ou insertion dans des chromosomes de la cellule hôte et rétention partielle. Deux séquences proches sur le génome sont en probabilité dans les mêmes clones RH*, tandis que deux séquences distantes ont une probabilité faible d’être conservées ensemble.IBD : pour identity by descent. Identité entre deux chromosomes (ou parties de chromosomes), liée à leur descendance d’un même chromosome ancestral.Indel : Insertion – deletion ; polymorphisme de présence ou absence d’un ou plusieurs nucléotides.Intron : séquence non-codante dans les gènes, séparant les exons, qui codent pour une protéine.Kb : kilobase ; séquence de mille paires de bases (pb*).Locus (pl. : loci) : Site sur un chromosome. Par extension, emplacement d’un gène ou d’un marqueur génétique sur un chromosome.Marqueur génétique : séquence d'ADN dont le polymorphisme est employé pour identifier un emplacement particulier (locus) sur un chromosome particulier.Mate-pair : séquences appariées (1 à 10 kb* de distance), produites en circularisant les fragments d’ADN, puis par séquençage à travers le point de jointure.Mb : mégabase ; séquence d’un million de paires de bases (pb*) de longueur.Orthologues : séquences homologues* entre deux espèces.Paired-end : séquences appariées produites par la lecture des deux extrémités de courts fragments d’ADN (moins de 500 pb*) dans le cas des nouvelles technologies de séquençage.Paralogues : séquences homologues* résultat de la duplication d’une séquence ancestrale dans le génome. Il s’agit de deux (ou plus) séquences similaires par homologie dans un même génome.Pb : paire de base ; unité de séquence d’ADN, représentée par une base et sa complémentaire-inverse sur l’autre brin.Phénotype : caractère observable d'un individu résultant des effets conjugués du génotype et du milieu.Phylogénomique : utilise les méthodes de la génomique et de la phylogénie. Par la comparaison de génomes entiers, permet de mettre en évidence des pertes et gains de gènes dans les génomes, ainsi que leur variabilité moléculaire, afin (entre autres buts) d’aider à prédire leur fonctions.Plasmide : vecteur de clonage permettant l’obtention de clones bactériens contenant des fragment d’ADN génomique de taille allant de 500 pb* à 10 kb* environ.Polymorphisme d'ADN : existence de deux ou de plusieurs allèles* alternatifs à un locus.Puce à ADN ou puce pangénomique : Système permettant pour un individu le génotypage simultané de très nombreux marqueurs génétiques (de quelques milliers à quelques centaines de milliers).QTL : abréviation de locus à effets quantitatifs (de l’anglais Quantitative Trait Locus).Récessivité : qualificatif de l’effet d'un allèle, où l'homozygotie* est nécessaire pour l'expression du phénotype* approprié. opposé de : dominance*.RH : Radiation Hybrid (hybride irradié*)Sanger (méthode de) : méthode de séquençage publiée en 1977 (Sanger et al 1977) et encore utilisée de nos jours avec les séquenceurs à électrophorèse capillaire.Scaffold : ensemble de contigs* de séquence reliés entre eux par des informations apportées par des lectures appariées (mate-pairs* ou paired-ends*).Sélection assistée par marqueurs (abréviation : SAM) : utilisation d’un jeu restreint de marqueurs de l'ADN pour améliorer la réponse à la sélection dans une population : les marqueurs sont choisis comme étroitement liés à un ou plusieurs loci cibles, qui sont souvent des loci à effets quantitatifs ou QTL*.SNP : polymorphisme d'un seul nucléotide à une position particulière de la séquence d’ADN (abréviation de l’anglais Single Nucleotide Polymorphism).Supercontig : nom alternatif pour les scaffolds*.WGS : Whole Genome Shotgun ; production de lectures de séquence d’un génome entier de manière aléatoire.

Les technologies mises en place dans le cadre des projets sur les génomes humain et murin ont stimulé le développement de la cartographie des espèces d’intérêt agronomique. Des cartes ont été construites pour les ruminants, le porc, le cheval et le poulet, permettant de localiser des gènes d’intérêt agronomique ou des QTL (quantitative trait loci) chez ces espèces. Ces travaux de cartographie génétique, cytogénétique et physique devraient se révéler être des outils indispensables pour le clonage positionnel de ces gènes ou QTL.

Les progrès récents de la biologie et notamment ceux réalisés dans le domaine des acides nucléiques et des protéines permettent d’envisager de nouvelles stratégies très prometteuses pour l’élevage des animaux domestiques. Des sondes d’acide nucléique permettent la détermination du sexe chez l’embryon bovin précoce. Plus généralement la multitude de sondes qui vont être progressivement disponibles et la cartographie des génomes vont donner une bien meilleure connaissance des animaux. Il en résultera de nouvelles stratégies de sélection beaucoup plus fines et beaucoup plus rapides. La préparation en masse de peptides recombinants (antigènes d’agents pathogènes, hormones, cytokines, anticorps monoclonaux...), laisse envisager des interventions sur les animaux jusqu’alors réservées à des cas très particuliers. Les nouvelles techniques liées à la reproduction des mammifères (maturation des ovocytes in vitro, fécondation in vitro, développement des embryons précoces in vitro, duplication des embryons par clivage et par clonage) vont progressivement se superposer aux techniques déjà existantes (insémination artificielle, transfert d’embryons) et contribuer à raccourcir les cycles de reproduction et la durée des programmes de sélection génétique. L’ingénierie génétique va permettre, dans les cas les plus favorables, de transmettre une protéine à un organisme entier sous la forme d’un gène actif. Des gènes peuvent être transférés dans les cellules somatiques des organismes entiers (thérapie génique) ou dans les embryons précoces (transgénèse). La thérapie génique peut permettre de ne plus devoir administrer un polypeptide de manière répétée à un animal et la transgénèse conduit à l’obtention de nouvelles lignées d’animaux présentant des caractères génétiques nouveaux définis par les transgènes. Ces interventions, qui sont les plus radicales et les plus prometteuses, ne pourront devenir une réalité significative dans les élevages qu’à la fin de ce siècle.

Quoiqu’entré dans le langage courant, le terme de “biotechnologies” a gardé une signification quelque peu imprécise. Au sens large, les biotechnologies peuvent être définies comme un ensemble de techniques et de connaissances permettant d’exploiter les propriétés du vivant à des fins d’application. Sous cette acception, les biotechnologies sont aussi vieilles que nos civilisations puisque l’homme s’est servi très tôt - bien sûr sans le savoir - de micro-organismes pour fabriquer des aliments tels le pain, le fromage et des boissons fermentées. Mais ce sont les avancées spectaculaires de la biologie moderne, notamment celles de la biologie moléculaire, qui élargissent presque à l’infini le champ d’application potentiel des biotechnologies. C’est le cas, entre autres, des applications possibles à l’élevage des progrès de la biologie animale. Le présent ouvrage regroupe, sur les biotechnologies animales, huit contributions qui représentent un spectre très large d’applications : produits issus de procédés biotechnologiques (vaccins, hormone), techniques de reproduction, aide à l’ amélioration génétique, transgenèse et nouveaux outils d’analyse de mécanismes biologiques. Prenant le contre-pied d’une certaine partie de la littérature antérieure sur le sujet, qui se présente comme une sorte d’hymne un peu naïf à la modernité, ces textes sont inspirés par le souci de replacer les biotechnologies dans leur contexte d’application réel, qu’il soit actuel ou potentiel, en essayant de dégager les perspectives et les limites de leur utilisation, tant du point de vue économique que de celui de l’acceptabilité par le citoyen. Dans cette optique, il est intéressant de rapprocher certaines des contributions présentées. Le premier rapprochement suggéré est celui des contributions traitant de l’utilisation de produits issus des biotechnologies, les vaccins et l’hormone de croissance recombinante. Dans le cas de la fabrication des vaccins, les progrès de la biologie moléculaire, associés à ceux des connaissances sur les agents pathogènes et le déterminisme de leur virulence, ont ouvert une série de voies nouvelles (vaccins recombinants, vecteurs inertes ou subunitaires). Toutefois, comme le remarque M. Eloit, ces produits ne sont pas encore entrés en force sur le marché pour des raisons d’ordre pratique et économique. En effet, les vaccins “de nouvelle génération” ne sont pas forcément à ce stade plus intéressants que les vaccins conventionnels existants, et ne sont pas nécessairement plus faciles à produire quand ces derniers n’ont pas pu l’être. On a donc ici le cas d’applications très attendues, ne posant pas de problème majeur d’acceptabilité par le public, mais qui n’ont pas encore débouché autant qu’on pouvait l’espérer. Bien entendu, il reste encore une marge de progrès considérable, et la vaccinologie moderne ne peut qu’aboutir, à l’avenir, à des obtentions significatives. A l’opposé, la production industrielle d’hormone de croissance recombinante est bien maîtrisée. Par ailleurs, une somme importante de connaissances, synthétisées par Y. Chilliard et coll., a été accumulée sur les effets zootechniques de cette hormone -positifs- ainsi que sur son mode d’action et sur les conséquences prévisibles de son utilisation au niveau des élevages et de la filière. Mais on sait que l’utilisation de cette hormone recombinante est interdite en Europe pour des raisons socio-économiques : il s’agit du refus de voir encore accélérer le processus de concentration des élevages avec ses conséquences sur la déprise de certaines zones agricoles, ainsi que de la crainte d’une dégradation de l’image des produits laitiers. On a donc ici le cas, inverse du précédent, d’un outil techniquement au point mais dont l’utilisation, pourtant fortement voulue par les lobbies industriels intéressés, se heurte à des oppositions inspirées par le souci de l’intérêt général. Le second groupe d’articles qu’il est intéressant de rapprocher est celui des biotechnologies de la reproduction : insémination artificielle, cryoconservation des gamètes, transplantation embryonnaire, sexage des embryons, fécondation in vitro et clonage embryonnaire. Il s’agit des contributions de J. Mallard et J.-C. Mocquot, J.-J. Colleau et coll., et G. Maisse et coll. L’insémination artificielle, et notamment son application aux bovins laitiers, est l’exemple par excellence d’une technologie de la reproduction ayant connu un plein succès. Comme le notent J. Mallard et J.-C. Mocquot, on dispose dans ce cas du recul nécessaire pour analyser tous les effets de l’utilisation de cette technologie, bien au point chez les bovins, qui sont considérables. Associée à la congélation du sperme, l’insémination artificielle a surtout permis le testage des mâles puis l’utilisation préférentielle des sujets améliorateurs ainsi repérés. Or, même si le terme de “testage” n’existait pas encore, l’idée d’une pratique consistant à observer la descendance des taureaux pour pouvoir ensuite en utiliser les meilleurs préexistait, avant sa réalisation effective, chez les plus clairvoyants des éleveurs et des cadres de l’élevage. On a, sur ce point, des témoignages datant de plus de 75 ans. Il est donc fondamental de prendre conscience du fait que la technologie de l’insémination artificielle associée à la congélation du sperme est venue répondre à un besoin latent très fort, ce en quoi elle représente un cas de figure très particulier. La situation n’est pas tout à fait comparable pour les autres biotechnologies de la reproduction - transplantation embryonnaire, sexage des embryons, clonage embryonnaire - qui répondent certes à des besoins, mais à des besoins beaucoup moins caractérisés et plus réduits que le précédent. L’article de J.-J. Colleau et coll. permet de préciser les limites techniques et économiques de l’utilisation de ces nouveaux outils de la reproduction, ainsi que leurs perpectives d’application dans les programmes d’amélioration génétique, c’est-à-dire dans le cadre d’une démarche d’intérêt collectif. Curieusement, la cryoconservation des gamètes, routinière dans certaines espèces, est loin d’être au point dans d’autres, alors qu’elle pourrait rendre de grands services dans le cadre de la sélection et dans celui de la préservation des ressources génétiques. La contribution de G. Maisse et coll. fait le point des travaux qui se poursuivent chez les poissons, où de nombreuses difficultés restent à résoudre. Au début des années 80, période pendant laquelle, selon la formule de J. Mallard et J.-C. Mocquot, le terme de biotechnologies était “majoritairement décliné au futur”, la transgenèse a été volontiers présentée comme le substitut moderne aux méthodes de la génétique quantitative utilisées pour l’amélio ration génétique des espèces d’élevage. La lecture des contributions de D. Boichard et coll. sur l’utilisation des marqueurs moléculaires en génétique animale et de L.M. Houdebine sur la transgenèse animale confirme à quel point ces prévisions étaient naïves. A l’heure actuelle, deux constats principaux doivent être faits. Tout d’abord, la transgenèse appliquée à la création de souches des grandes espèces animales est encore balbutiante, surtout par manque de techniques vérita blement opérationnelles. En second lieu, les travaux d’analyse des génomes animaux qui, eux, progressent très vite, doivent permettre, dans un avenir proche, de détecter les principales régions chromosomiques impliquées dans le déterminisme des caractères économiques et d’intégrer cette masse d’informations nouvelles dans le processus de sélection. Il s’agira du début d’une nouvelle phase décisive de l’histoire de la génétique appliquée aux espèces d’élevage. Les progrès auront donc été beaucoup plus significatifs que pour la trans genèse. A l’avenir, celle-ci devrait bénéficier des résultats de ces travaux d’analyse du génome, ne serait-ce que pour identifier des gènes dont le transfert ou la mutation pourrait s’avérer judicieux. Il restera quand même à prendre en compte, dans le contexte futur encore incertain, les limites de l’acceptabilité par le public des obtentions transgéniques. Last but not least, il ne faut pas oublier que les nouvelles biotechnologies sont à leur tour des outils très puissants d’analyse des mécanismes du vivant. La contribution de T. Pineau donne l’exemple des avancées en cours dans les domaines de la pharmacologie et de la toxicologie. En définitive le bilan qui peut être fait aujourd’hui des avancées des biotechnologies animales peut paraître contra sté, surtout si on se réfère aux prévisions faites il y a une quinzaine d’années par les bateleurs de la Science. De nos jours, l’affichage des perspectives d’application des biotechnologies reste parfois contaminé par la nécessité devant laquelle se trouvent les équipes, engagées dans la chasse aux crédits, de justifier leurs travaux par la promesse de retombées concrètes. Toutefois, la lecture du présent document montre que, dans certains domaines, les choses ont déjà beaucoup avancé. Par ailleurs, les perspectives de progrès de la biologie animale sont encore considérables, tout comme les perspectives d’application des biotechnologies qui en décou leront. Mais beaucoup d’inattendu étant devant nous, on se gardera ici d’être plus précis dans les prédictions !

Grâce aux progrès de la synthèse et de l’assemblage d’ADN, il est maintenant possible de créer des génomes complètement différents de ceux retrouvés dans la nature. Il sera bientôt possible de concevoir des bactéries ayant des génomes fait sur mesure pour pouvoir répondre à différentes problématiques qui touchent notre société. Par contre, le design rationnel de génome n’est pas encore possible, car les contraintes à respecter pour qu’un génome soit fonctionnel nous sont encore largement inconnues. De plus, le faible nombre d’organismes minimaux modèles ne permet pas encore de tirer de conclusions générales. J’ai donc cherché à améliorer ces deux aspects, en développant un nouveau modèle pour la génomique synthétique et en combinant plusieurs approches pour déterminer les éléments génétiques essentiels de son génome. Lors de mes travaux, j’ai dans un premier temps cloné le génome complet de la bactérie Mesoplasma florum L1 sous la forme d’un chromosome artificiel dans la levure Saccharomyces cerevisiae. J’ai fait une analyse transcriptionnelle ainsi qu’une analyse de croissance de cette souche de levure pour déterminer que le génome bactérien avait un impact limité sur son hôte. J’ai aussi observé de la transcription cryptique issue du génome cloné. J’ai ensuite pu découvrir que la transplantation du génome bactérien est une manipulation mutagène et que cet effet est amplifié par la distance phylogénétique entre le génome transplanté à partir de la levure et la bactérie réceptrice, Mycoplasma capricolum sous-espèce capricolum. Ces connaissances et la mise point de la boucle de clonage et transplantation permettent de mieux comprendre ce processus encore peu caractérisé et de positionner M. florum comme modèle pour la génomique synthétique. J’ai ensuite identifié les éléments importants du génome de M. florum en combinant une approche de génomique comparative sur 13 souches appartenant à cette espèce et la mutagénèse par transposons chez la souche L1. J’ai pu ainsi identifier des gènes plus ii propices à la délétion et à concevoir des plans de réduction du génome de cette souche. J’ai par la suite comparé ces plans au génome de la bactérie minimale Mycoplasma mycoides sous-espèce capri JCVI-syn3.0. J’ai finalement démontré que bien que ces bactéries soient phylogénétiquement proches, une bactérie minimale construite à partir de M. florum serait différente de la souche JCVI-syn3.0 et que la combinaison d’information sur la conservation et l’essentialité des gènes permet d’arriver à une bonne approximation de ce que serait génome minimal d’une bactérie.

Mycoplasma hominis est un pathogène humain opportuniste responsable d’infections génitales et néo-natales. Modifier génétiquement cette bactérie est nécessaire afin de comprendre les mécanismes de virulence et d’infection de ce pathogène. Il n’existe à ce jour aucun outil moléculaire efficace permettant de manipuler le génome de M. hominis, limitant les recherches sur sa pathogénicité et son métabolisme particulier reposant sur l’arginine. De nouvelles technologies rassemblées sous le terme de Biologie de Synthèse (BS) ont récemment émergé, offrant des perspectives inédites pour l’étude des mycoplasmes en permettant de modifier leurs génomes à grande échelle et de produire des souches mutantes. Ces travaux menés au J. Craig Venter Institute (JCVI, USA) ont montré que le génome de mycoplasmes apparentés pouvait être cloné et manipulé dans la levure avant d’être transplanté dans une cellule receveuse. La levure sert d’hôte d’accueil temporaire pour modifier le génome de la bactérie. Cette approche novatrice ouvre de nombreuses perspectives dans le cadre du développement de la génomique fonctionnelle chez les mycoplasmes pour lesquels les outils génétiques efficaces sont peu nombreux. Le but de cette thèse a été d’adapter pour la première fois certains outils de BS à M. hominis dans le but de créer des mutants déficients pour une fonction donnée. Pour cela, le génome de la souche type de M. hominis PG21 (665 kb) a été cloné dans la levure Saccharomyces cerevisiae par « Transformation-Associated Recombination cloning » (TAR-cloning). Deux clones (B3-2 et B3-4) de levure possédant le génome complet de M. hominis ont été validés par analyse en PCR simplex, PCR multiplex et électrophorèse en champs pulsé (PFGE). Ces clones levures ont ensuite été propagés en milieu sélectif durant 180 générations (30 passages), afin d’évaluer la stabilité du génome bactérien dans son hôte. Cette expérience a montré que (i) si la taille du génome de M. hominis ne variait pas au cours des premiers passages, elle diminuait progressivement à partir du dixième passage (≈60 générations), et que (ii) les zones du génome enrichies en séquence répétées étaient préférentiellement perdues. En tenant compte de ces résultats, le génome de M. hominis a été modifié chez le clone B3-4 par la technique « Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9 » (CRISPR/Cas9) lors de passages précoces. Des clones de S. cerevisiae possédant un génome de M. hominis PG21 complet délété du gène vaa, codant une protéine d’adhésion majeure, ont été ainsi produits. La dernière étape de cette approche consistait à transplanter le génome modifié dans une cellule receveuse de M. hominis ou de Mycoplasma arthritidis, espèce phylogénétiquement la plus proche de M. hominis. Aucun protocole de transformation de M. hominis n’étant disponible au début de nos travaux, cette étape constituait un verrou majeur dans la mise en place des outils de BS chez cette espèce. Ce verrou a été en partie levé puisqu’une méthode de transformation de M. hominis basée sur du polyéthylène glycol (PEG) et mettant en jeu le plasposon pMT85 (plasmide contenant un transposon conférant la résistance à la tétracycline) a été mise au point au laboratoire. Cette technique de transformation, développée pour la souche de référence M. hominis M132 (745 kb) reste encore peu efficace ; elle est néanmoins reproductible et a permis d’obtenir des mutants d’intérêt de M. hominis. Le transformant n°28-2 a, ainsi, été muté dans le gène Mhom132_2390, codant le précurseur de la protéine P75, une adhésine putative de M. hominis. Le séquençage des génomes complets d’autres transformants a révélé l’insertion de multiples copies du transposon et la présence d’évènements de duplication et d’inversion de larges fragments d’ADN dans au moins deux génomes de M. hominis
Mycoplasma hominis is an opportunistic human pathogen responsible for genital and neonatal infections. Genetically modifying this bacterium is necessary to understand the virulence and infection mechanisms of this pathogen. There is currently no effective molecular tool to engineer the genome of this bacterium, limiting research on its pathogenicity and its peculiar metabolism based on arginine.New technologies have recently emerged in the field of Synthetic Biology (BS), offering new perspectives for the study of mycoplasmas by allowing large scale genome modifications and the production of mutant strains. Work at the J. Craig Venter Institute (JCVI, USA) has shown that the genome of related mycoplasmas can be cloned and manipulated in yeast before being transplanted into a recipient cell. The yeast serves as a temporary host to modify the genome of the bacterium. This innovative approach opens many perspectives in the development of functional genomics in mycoplasmas for which there are few effective genetic tools. The goal of this thesis was to adapt a number of BS tools to M. hominis for the first time, in order to create mutants deficient for a given function. To achieve this goal, the genome of the M. hominis type strain PG21 (665 kb) was cloned into the yeast Saccharomyces cerevisiae by Transformation-Associated Recombination cloning (TAR-cloning). Two yeast clones (B3-2 and B3-4) possessing the complete genome of M. hominis were validated by simplex PCR, multiplex PCR and Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) analyses. These yeast clones were then propagated in a selective medium for 180 generations (30 passages) to evaluate the stability of the bacterial genome in its host. This experiment showed that (i) the size of the genome of M. hominis did not change during the first passages, it decreased progressively from the tenth passage (≈60 generations), and (ii) the enriched genome areas in repeated sequence were preferentially lost. Thus, the genome of M. hominis was modified in the B3-4 clone at early passages using the Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9 (CRISPR/Cas9) technology. Yeast clones with a complete M. hominis PG21 genome with a deleted vaa gene, encoding a major adhesion protein, were produced using this approach. The final step of this approach was to transplant the modified genome into a recipient cell of M. hominis or Mycoplasma arthritidis, the species phylogenetically closest to M. hominis. As no M. hominis transformation protocol was available at the beginning of our work, this step constituted a major obstacle in the implementation of BS tools in this species. This barrier has been partially lifted since a method of transformation of M. hominis based on polyethylene glycol (PEG) and involving the plasposon pMT85 (plasmid carrying a transposon conferring resistance to tetracycline) has been developed in the laboratory. This transformation technique, developed for the reference strain M. hominis M132 (745 kb) still remains not very efficient; it is nevertheless reproducible and allowed to obtain M. hominis mutants of interest. The Mhom132_2390 gene, encoding the precursor of the P75 protein, a putative adhesin of M. hominis, was effectively mutated in transformant No. 28-2. Complete genome sequencing of other transformants revealed the insertion of multiple copies of the transposon and the presence of duplication and inversion of large DNA fragments within at least two M. hominis genomes.In conclusion, this data has opened the way for the development and transposition of existing genetic modification approaches to M. hominis, previously considered as a genetically intractable bacterium

Les champignons endomycorhizogènes à arbuscules (glomales) sont des symbiotes obligatoires qui jouent un rôle très important pour le développement et la bioprotection de la plante. Les connaissances génétiques et moléculaires de ces champignons sont encore parcellaires, du fait de l'impossibilité de les cultiver sans la plante-hote. La mise au point d'une technique d'extraction d’ADN de spores de champignons endomycorhizogènes a arbuscules a permis de réaliser un clonage partiel de l’ADN de l'espèce scutellospora castanea. Le criblage de cette banque génomique a permis de mettre en evidence des séquences répétées par hybridation moléculaire. L'hybridation en dot ou en southern de l’ADN de spores des espèces s. Castanea, gigaspora rosea, glomus caledonium et acaulospora laevis avec un échantillon de séquences répétées a permis de mettre en évidence une séquence (sc1), spécifique de s. Castanea et une autre (myclire), présente chez les quatre espèces utilisées. Une caractérisation approfondie a été entreprise montrant que la séquence sc1 est organisée en tandem dans le génome de s. Castanea, et possède des séquences répétées directes ; aucun cadre de lecture ouvert n'a ete trouve. Par ailleurs cette séquence possède plusieurs codons stop et ne code pour aucune proteine. La séquence sc1 pourrait donc être une séquence de structure heterochromatique. La séquence myclire, dispersée dans le génome de s. Castanea, possède des séquences répétées directes et répétées inversées. Par ailleurs des séquences à autonomie de réplication (ars) et des éléments centromeriques (cde) ont été mis en évidence dans cette séquence ; ce qui ferait de cette séquence un élément centromérique a autonomie de réplication. En vue de mettre au point des outils de détection spécifique par la technique pcr, des amorces ont été choisies de la séquence sc1 pour amplifier électivement l’ADN de spores de s. Castanea et l’ADN de racines de poireau infectées par cette espèce. Le choix d'un couple d'amorces de la séquence non spécifique myclire a permis de suivre la variation inter générique de cette séquence après amplification de l’ADN de spores et analyse comparée des produits d'amplification. Cette analyse a permis de montrer que cette séquence est conservée sous forme allélique chez les espèces g. Rosea, g. Caledonium, s. Castanea et s. Pellucida alors qu'elle a subi une modification très importante chez l'espèce a. Laevis

Le transposon Mariner Mos 1 a la capacité intrinsèque de changer de position dans le génome. Le premier axe de mes travaux de thèse est consacré aux caractéristiques du transposon influençant l'activité de transposition de l'élément Mos1 (dont la composition nucléique du transposon et sa taille). Il a permis de montrer qu'un de transgène de taille supérieure à 2,5kb limite l'efficacité de transposition, qu'un fort pourcentage en GC favorise la transposition, et qu'il n'existe pas de taille minimale pour la transposition de Mos1. Le deuxième axe de recherche porte sur l'adaptation et l'amélioration du système Mos1 au contexte des cellules eucaryotes, pour développer un vecteur intégratif non viral de transfert de gène. L'ajout d'une séquence de localisation nucléaire améliore le transfert du noyau, l'humanisation de la séquence de la transposase augmente son expression en cellules de mammifères, et l'utilisation d'un système suicide HSVVtK permet de limiter les évènements de recombinaison
The mariner Mos 1 transposon can naturally move into the genome. The first research axis of this work concern the transposon characteristics which act upon the transposition activity of Mos1 (like the nucleic content of the transposon and its size). It have shown that a size of transgene upper than 2,5 kb limit the transposition efficiency, that a strong GC percentage favour the transposition, and that there is no minimal size for Mos1 transposition. The second research axis concern the adaptation and improvement of the Mos1 system to the eukaryotic cells, to developp a nonviral vector for gene transfer. The addition of a nuclear localization sequence improve the nuclear transfer, the "humanization" of the transposase sequence increase it expression in mammal cells, and the use of the HSVtK suicide system permit to limit the recombination events

L’activation transcriptionnelle du génome est une étape critique de l’embryogenèse. Jusqu’alors régulé strictement par l’information maternelle, le développement passe progressivement sous le contrôle embryonnaire. Cette transition (MET - Maternal Embryonic Transition) suppose des interactions, étroitement régulées et déterminantes pour le développement ultérieur de l’embryon, entre l’information maternelle cytoplasmique et le noyau embryonnaire qui devient totipotent. Parce qu’il perturbe les interactions nucléocytoplasmiques mais permet un développement à terme, donc la restauration de la totipotence nucléaire ("reprogrammation"), le clonage représente un modèle d’étude de ces interactions. Dans ce contexte, notre recherche a été conduite avec l’objectif d’analyser comment s’acquiert l’état particulier qui caractérise le noyau embryonnaire au moment oū il initie ses premières synthèses en devenant transitoirement totipotent. A cette fin, nous avons développé une étude comparative du patron d'expression des gènes dans l'embryon de bovin issu d'un développement normal, représentant le contrôle de rétablissement optimal de la totipotence (reprogrammation MET), et d'un développement où les interactions nucléocytoplasmiques sont expérimentalement perturbées par clonage somatique, représentant des situations de décroissance progressive de l’efficacité de reprogrammation. Le choix du modèle bovin, parce qu’il procure ces situations biologiques différentielles, et la volonté d’obtenir une information pertinente sur un processus global par analyse transcriptomique de ces situations nous ont conduit à développer des outils et des approches moléculaires appropriés (réseau d'ADNc dédié, procédure pertinente de criblage différentiel à partir de matériel rare). Notre travail a permis d’accéder à une description dynamique des deux modes de reprogrammation étudiés. Ces résultats mettent en lumière une corrélation directe et "quantitative" entre: l’ampleur de la reprogrammation de l’expression des gènes (ou le degré de corrélation entre les 2 modes de reprogrammation) et l’efficacité fonctionnelle de la reprogrammation se soldant par un développement à terme des individus clonés. Ils pourraient donc déboucher sur la mise en œuvre d’un critère prédictif précoce de l’aptitude de lignées de cellules donneuses de noyaux à une reprogrammation efficace, permettant de prévoir le potentiel de développement à terme des embryons reconstitués par transfert de leurs noyaux. Au-delà de ces perspectives d’application, l'utilisation de cette approche de comparaison globale devrait nous permettre de mieux caractériser l'état totipotent en vue de comprendre les conditions de sa restauration
Transcriptional activation of the genome is a critical step in embryogenesis. Until that point, development is regulated strictly by maternal information, before gradually moving under embryonic control. This transition (MET for Maternal Embryonic Transition) implies interactions which are closely regulated and determinant regarding subsequent embryonic development between maternal cytoplasmic information and the embryonic nucleus which becomes totipotent. Because it perturbs nucleocytoplasmic interactions but enables long-term development, and hence the restoration of nuclear totipotence ("reprogramming"), cloning constitutes a study model for these interactions. In this context, our research was carried out with the aim of analysing the acquisition of the particular state which characterises the embryonic nucleus at the time it initiates its first syntheses by becoming transiently totipotent. For this purpose, we developed a comparative study of the pattern of gene expressionin bovine embryo arising from normal development, thus representing control of the optimum restoration of totipotence (MET reprogramming), and development where the nucleocytoplasmic interactions were experimentally perturbed by somatic cloning, representative of a gradual decline in reprogramming efficiency. The choice of the bovine model (because it enables these differential biological situations) and our desire to obtain relevant data on a global process through transcriptomic analysis of these situations, led us to develop appropriate molecular tools and approaches (dedicated cDNA network, appropriate procedure for differential screening starting from scarce material). Our work enabled access to a dynamic description of the two reprogramming modes studied. These results highlighted a direct and "quantitative" correlation between the extent of reprogramming of gene expression (or the degree of correlation between the two reprogramming modes) and the functional efficacy of reprogramming resulting in the subsequent long term development of cloned individuals. The results may thus enable the implementation of an early-stage predictive criterion concerning the aptitude of nucleus-donor cell lines for efficient reprogramming, enabling prediction of the long-term potential for development of embryos reconstituted by transfer of their nuclei. In addition to these perspectives for application, use of this global comparative approach should allow us to better characterise the totipotent state and thus understand more clearly the conditions required for its restoration

L'expression de récepteurs de type olfactif (OLRs) dans les bourgeons gustatifs de rat a été rapportée, suggérant leur implication dans la perception du goût en tant que récepteurs gustatifs. L'objectif de cette thèse était d'identifier et de caractériser des OLRs exprimés dans les tissus gustatifs humains. Neuf gènes et huit pseudogènes d'OLRs exprimés dans la langue humaine adulte et/ou fœtale ont été identifiés par RT-PCR. Leurs orthologues murins ont été déterminés : 5 sont exprimés dans la langue de souris adulte, dont 3 spécifiquement dans les papilles gustatives. Ils sont tous exprimés dans les tissus sensoriels et le cerveau, mais sont rarement détectés dans d'autres organes. L'un d'eux semble cependant présenter une expression ubiquitaire. Les expériences d'hybridation in situ, n'ont pas permis de détecter clairement l'expression de ces récepteurs dans les cellules gustatives. Un outil cellulaire visant à identifier les ligands de ces récepteurs a été construit
The expression of olfactory like receptors (OLRs) in rat taste buds has been previously described, suggesting their involvement in taste perception as gustatory receptors. The aim of this work was to identify and characterize human OLRs expressed in human gustatory tissues. Nine OLRs genes and eight pseudogenes expressed in human adult and/or foetal tongue were identified by RT-PCR. Their murine orthologs were assigned: 5 are expressed in adult mouse tongue, among which 3 are expressed specifically in gustatory papillae. The latter were detected in sensory tissues and brain, but rarely in other organs. Nevertheless, one of them seems to be ubiquitously expressed. In situ hybridization experiments did not show a clear expression of these receptors in mouse taste buds. A cellular tool was constructed in order to identify the ligands of these receptors

La carte physique du genome du densovirus de junonia coenia (jc dnv) a ete etablie pour 37 sites de restriction a l'aide de 25 enzymes. Une sequence correspondant a la quasi-totalite du genome a ete clonee dans pbr322 au site unique eco rv. Le plasmide obtenu (pbrj) est capable de transfecter les larves de l'insecte sensible spodoptera littoralis avec la meme efficacite que l'adn extrait des virions. Les virions issus de cette transfection sont identiques a ceux de type sauvage par leurs proprietes biologiques et biophysiques. L'insert viral de pbrj a ete sequence dans sa totalite, soit 5908 nucleotides. Plusieurs proprietes remarquables du genome sont detuites de cette sequence. Les extremites du genome sont constituees d'une repetition inversee de 517 nucleotides dont les 96 premiers du cote du site hind iii de pbr322 forment une structure bicatenaire en y. L'analyse de cette sequence a revele une organisation originale au sein de la famille des parvoviridae. En effet, les eux brins d'adn possedent une capacite de codage equivalente contrairement aux parvovirus de vertebres dont un seul des brins est codant. Sur l'un des brins, l'orf1 majeur code pour les proteines structurales tandis que trois autres orfs sur le brin oppose codent pour les proteines non structurales. La comparaison au niveau des sequences proteiques entre le genome du jc dnv et celui des autres parvovirus a mis en evidence des homologies au niveau des proteines de capside (region pgy) et de la proteine non structurale (ns1, region gkrn). Par l'organisation unique de son genome, le densovirus de j. Coenia constitue un phylum a part au sein des parvoviridae

La folliculogenèse assure le déroulement de la fonction de reproduction femelle. L'étude des variations phénotypiques affectant le taux d'ovulation dans des populations permet d'identifier des mutations naturelles dans des gènes ayant une incidence majeure sur la fonction ovarienne. Mes travaux de thèse ont permis de localiser le locus Lacaune dans une région chromosomique de 4 cM sur le chromosome 11 ovin. Mes travaux de thèse ont permis d'identifier la mutation causale dans le gène BMPR-IB responsable du phénotype hyperprolifique Booroola. Durant l'étape d'identification du gène Booroola, une nouvelle méthode (HSA) a été mise au point pour sélectionner les transcrits spécifiques d'un tissu et d'une région chromosomique. L'identification du gène Booroola a contribué à la mise en évidence du rôle primordial des BMP sur la fonction ovarienne. L'identification du gène responsable du phénotype Lacaune permettra de mettre en lumière un autre facteur important pour cette fonction
Folliculogenesis is the biological mechanism of the female reproductive function. The study of phenotypic variations affecting ovulation rate in populations enables to identify natural mutations with a major impact on ovarian function. In the Course of my thesis research, I have localised the Lacaune locus within a 4 cM region on ovine chromosome 4 and identified the causal mutation of the hyper prolific Booroola phenotype in the BMPR-IB gene. For the identification of the Booroola gene, 1 developed a new method (HSA, for Hybrid Specific Amplification) to select transcripts specific of a tissue and a chromosomal region. The identification of the Booroola gene contributed to highlight the primordial role of Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) in ovarian function. The identification of the gene responsible for the Lacaune phenotype will enable to identify another factor important for this function

Lors de la fécondation, le sperme et l'ovule s'unissent pour former un zygote totipotent. Initialement, le zygote est transcriptionnellement inactif. Au cours des premiers clivages a lieu la mise en route du génome embryonnaire (EGA) et le développement passe alors sous le contrôle de l’information embryonnaire (au stade 8-16-cellules chez le bovin). Cette transition d’un contrôle maternel à un contrôle embryonnaire est appelée « maternal to embryonic transition (MET) ». De la même façon, lors du transfert nucléaire (clonage), un noyau de cellule somatique placé dans un ovocyte énucléé devient totipotent. Ce processus est appelé «reprogrammation nucléaire somatique?». En fait, la reprogrammation nucléaire lors du clonage est équivalente à la MET, toutefois, le clonage est très peu efficace. Les objectifs de cette étude chez les bovins sont a) d'explorer le processus de reprogrammation lors de la MET dans des embryons fécondés in vitro (FIV) et b) d’estimer l'efficacité de la reprogrammation génique après le transfert nucléaire lors du clonage. Nous émettons l'hypothèse que l'acquisition d'un profil d'expression génique correct pourrait être prédictif d’un potentiel de développement à terme de l'embryon, et pourrait être évalué dès juste après l'activation du génome embryonnaire (EGA) chez les bovins. Nous avons développé notre travail selon deux axes a) des analyses globales d'expression génique utilisant une puce dédiée à l’EGA et b) l’analyse du profil d'expression de gènes candidats par qRT-PCR dans les embryons fécondés et clonés. Dans un premier temps nous avons optimisé le protocole d'amplification d'ARNm pour l'analyse du transcriptome de matériels rares. Puis nous avons fait l'analyse du transcriptome avant et après EGA d’embryons issus d’ovocytes prélevés sur des vaches phénotypées comme « bonnes » ou « mauvaises » donneuses d’embryons. En outre, ces ovocytes ont été maturés soit in vivo soit in vitro. Nos analyses montrent que l'effet individuel est plus important que l'effet « bonne ou mauvaise donneuse » ou même que l’effet « conditions de maturation ». Nous avons ensuite analysé les expressions géniques de 5 types d'embryons clonés ayant différents potentiels de développement à terme en fonction de la lignée cellulaire utilisée comme source de cellules donneuses. Globalement, leur expression génique est proche de celle de morulae FIV, mais quelques gènes présentent une expression différente. Ces gènes varient avec la lignée de cellules donneuses et leur nombre n’est pas lié à l’aptitude au développement à terme. L’analyse d’un lien éventuel entre leur nature et cette aptitude devra être poursuivie. Dans un deuxième temps, nous avons analysé les profils d'expression spatio-temporelle des transcrits et des protéines des gènes de pluripotence (OCT4, SOX2 et NANOG) et les niveaux d'ARNm de certains de leurs cibles dans les ovocytes et les embryons précoces chez le bovin. Les profils d'expression de ces gènes ont aussi été analysés dans des embryons clonés présentant différents potentiels de développement à terme. Nos résultats montrent que (1) la triade de gènes de pluripotence n'est probablement pas impliquée dans l’EGA bovine. (2) les transcrits et protéines de SOX2 et de NANOG sont restreints au lignage pluripotent plus tôt que ceux de OCT4, (3) les embryons à faible taux de développement à terme ont un taux de transcription plus élevé, néanmoins, l’équilibre précaire entre les gènes de pluripotence est maintenue. Cet équilibre pourrait permettre un développement normal in vitro, mais le taux de transcription plus élevé pourrait avoir des conséquences délétères sur le développement ultérieur
In natural fertilization, sperm and ovum unite to form a totipotent zygote. Initially, the zygote is transcriptionally inactive and after few cleavages (8-16-cell stage in bovine) embryonic genome activation (EGA) takes place and embryo shifts from maternal to embryonic control, the process called maternal to embryonic transition (MET). Likewise, in nuclear transplantation (cloning) a somatic cell nucleus achieves totipotency when placed in an enucleated oocyte, the process called “nuclear reprogramming”. In fact, nuclear reprogramming in cloning experiments is equivalent to MET; however, this process is afflicted with low efficiency. The objectives of this study in bovine were a) to explore the process of MET reprogramming of in vitro fertilized (IVF) embryos and b) to estimate the efficiency of gene reprogramming after nuclear transfer in animal cloning. We hypothesized that the acquisition of a proper gene expression pattern could herald development potential of the embryos, which could be assessed as early as morula stage or after embryonic genome activation (EGA) in bovine. Here, we opted for a study plan consisting of two axes a) global gene expression analysis using an EGA-dedicated microarray and b) candidate gene expression profiling through qRT-PCR in the fertilized and cloned bovine embryos. Firstly, we optimized the protocol of mRNA amplification for transcriptome analysis which generates antisens-RNA (aRNA). Then we did transcriptomic analysis of the 4-cell and morulae derived from two genotypes having better and two genotypes having poorer in vitro embryonic development potentials. In addition, these oocytes were either matured in vivo or in vitro. We observed that the effect of individual genotype was more important than the effect of the phenotypic category (poorer or better) or conditions of oocyte maturation. Furthermore, we explored the expression patterns of 5 types of cloned embryos having different full term developmental potentials depending upon the donor cell line used. Their genes expression patterns closely resembled to the IVF morulae, except for few genes which present differences. These genes vary with the cell line used as somatic cell donor for SCNT and the number of these deregulated genes did not increase with the poorer developmental potential of the cloned embryos. The analysis of an eventual correlation between the potential for embryonic development to term and nature of the deregulated genes should be addressed. Secondly, we charted quantitative and/or qualitative spatio-temporal expression patterns of transcripts and proteins of pluripotency genes (OCT4, SOX2 and NANOG) and mRNA levels of some of their downstream targets in bovine oocytes and early embryos. Furthermore, to correlate expression patterns of these genes with term developmental potential, we used cloned embryos, instead of gene ablation, having similar in vitro but different full term development rates. We chose these genes to be analysed since pluripotency genes are implicated in mouse embryonic genome activation (EGA) and pluripotent lineage specification. Moreover, their expression levels have been correlated with embryonic term development. Our findings affirm: first, the core triad of pluripotency genes probably is not implicated in bovine EGA since their proteins were not detected during pre-EGA phase, despite the transcripts for OCT4 and SOX2 were present. Second, an earlier ICM specification of SOX2 and NANOG makes them better candidates of bovine pluripotent lineage specification than OCT4. Third, embryos with low term development potential have higher transcription rates; nevertheless, precarious balance between pluripotency genes is maintained. This balance presages normal in vitro development but, probably higher transcription rate disturbs it at later stage that abrogates term development