Дисертації з теми "Voies cellulaires"

Les proteases a serine representent une famille d'enzymes impliquee de longue date dans les processus de degradation proteique et plus recemment dans la regulation de la signalisation intracellulaire. Cette derniere fonction est liee notamment a la presence a la surface de nombreux types cellulaires de recepteurs specifiques actives par proteolyse. Ce sont des recepteurs a sept domaines transmembranaires couples aux proteines g (rcpg), dont le mecanisme d'activation se fait par coupure. La thrombine module au moins deux voies de signalisation intracellulaire necessitant des proteines g, gi inhibitrice de l'adenylate cyclase et gq activatrice d'une phospholipase c. L'activation de ces systemes genere des seconds messagers, l'inositol-1,4,5 trisphosphate (ip3) et le diacylglycerol (dag), impliques respectivement dans la mobilisation intracellulaire de calcium et l'activation de la proteine kinase c. Nous avons recemment montre l'existence de recepteur de la thrombine et de la trypsine a la surface de la lignee leucemique t humaine jurkat et des lymphocytes t du sang peripherique. Nous avons disseque les evenements moleculaires induit par la thrombine et son agonsite peptidique dans les lymphocytes t. Tous deux, induisent une augmentation de l'activite des trois voies mapk : erk, p38 mapk et jnk. L'activation des p38 mapk est dependante des src kinases alors que l'activation des erks est non seulement dependante des src kinases mais egalement des pkcs. Nous avons identifie une isoforme particuliere, pkc, necessaire a la stimulation des erks induite par la thrombine. Nous avons montre par ailleurs que la proteine csk etait impliquee positivement dans l'activation des erks. Notre travail a egalement mis en evidence une interdependance entre le recepteur t et le recepteur de la thrombine. En effet, la proteine p56lck, element necessaire a la signalisation via le recepteur, exerce un controle negatif sur la liberation de calcium et l'activation de p38 mapk induite par la thrombine dans les cellules jurkat. En conclusion, nous avons caracterise certains des elements impliques positivement ou negativement dans la signalisation induite par le recepteur de la thrombine dans les cellules jurkat. Cette etude devrait contribuer a une meilleure comprehension des mecanismes de transduction du signal par cette famille originale de recepteurs et permettra d'apprehender son role physiologique et pathologique.

La mitochondrie est un centre de régulation métabolique à la fois intégrateur de signaux (visant à ajuster son fonctionnement selon les besoins énergétiques cellulaires) et initiateur de voies rétrogrades (permettant une réponse cellulaire à des changements d'états fonctionneles de la mitochondrie). Ce travail s'intéresse plus particulièrement au métabolisme oxydatif mitochondrial et aux voies de signalisation activées, dans les cellules HepG2, lors de deux situations de stress énergétique : le découplage mitochondrial constitue un signal conduisant les cellules à développer leur métabolisme oxydatif sans modifier la glycolyse (notamment par activation de la transcription de gènes codant pour des protéines mitochondriales). La mitochondrie est également une des cibles du traitement par glucocorticoïdes, ces hormones induisant à la fois des effets à court terme et à long terme. les effets rapides (modification de l'activité des complexes I, II et III de la chaîne respiratoire mitochondriale) sont non génomiques et impliquent la fixation de la dexamethasone sur un récepteur membranaire. Ces effets sont médiés par l'activation calcium-dépendante de la protéine p38MAPK. Les effets à long terme (augmentation de la capacité de la chaîne respiratoire) sont transcriptionnels et nécessitent le recrutement du récepteur intracellulaire classique aux glucocorticoïdes. Les modifications du fonctionnement de la chaîne respiratoire mitochondriale par les glucocorticoïdes sont induites par le recrutement graduel de différents sites de liaison aux glucocorticîdes (membranaire et intracellulaire).

Contexte. Le cancer bronchopulmonaire (CBP) demeure la première cause de mortalité par cancer dans le monde. Malgré l'espoir suscité par le développement des thérapies ciblées, son pronostic demeure sombre, particulièrement dans les cas de CBP à petites cellules (CBP-PC) et de CBP non à petites cellules (CBP-NPC) présentant une activation de l'oncogène KRAS. Matériel et Méthodes. Nous avons mené 3 études successives, visant à (i) radiosensibiliser des modèles de CBP-PC par l'ajout d'un inhibiteur de BCL2, (ii) cibler des modèles de CBP-NPC mutés KRAS par l'association d'un inhibiteur de mTOR et d'un inhibiteur de RAF, et (iii) créer un modèle préclinique orthotopique murin de CBP reproduisant la progression tumorale observée en clinique. Résultats. Dans la première étude, l'inhibiteur de BCL2 oblimersen a présenté un effet radiosensibilisant sur des modèles de CBP-PC, in vitro et in vivo. Dans la seconde étude, l'association de l'inhibiteur de mTOR everolimus et de l'inhibiteur de RAF/VEGFR RAF265 a présenté un effet synergique sur des lignées cellulaires de cancers présentant la double mutation de KRAS et de PIK3CA, in vitro et in vivo. Dans la troisième étude, l'injection orthotopique d'une lignée bioluminescente de CBP-NPC chez des souris nude a permis d'établir des tumeurs intra pulmonaires évoluant vers une extension métastatique ganglionnaire et hématogène, et de détecter la présence de cellules tumorales circulantes. Conclusion. L'association d'un inhibiteur de BCL2 à la radiothérapie est une stratégie intéressante dans le CBP-PC, l'association d'un inhibiteur de mTOR et d'un inhibiteur de RAF/VEGFR est une stratégie intéressante dans le CBP-NPC présentant une double mutation KRAS-PIK3CA, mais ces données doivent être confirmées sur des modèles orthotopiques afin de gagner en pertinence avant d'envisager un transfert en clinique.

Le diabète de type 1 est caractérisé par une carence en insuline secondaire à la destruction autoimmune des cellules  pancréatiques. L’infiltration progressive des îlots de langerhans par les lymphocytes T autoréactifs ou effecteurs constitue la première lésion histopathologique de la maladie : l’insulite. Le développement du diabète résulte d’une part d‘une rupture de la tolérance vis-à-vis des antigènes des îlots pancréatiques et d’autre part de l’incapacité des cellules régulatrices et notamment les lymphocytes T CD4+CD25+CD62L+Foxp3+ à inhiber les lymphocytes T autoréactifs. De nouvelles perspectives de prévention des maladies autoimmunes spécifiques d’organe reposent sur la génération des lymphocytes T régulateurs (suppresseurs) dans le but de rétablir la balance Th1/Th2 par induction de tolérance périphérique et d’inhiber la réponse immunitaire effectrice. Nous démontrons dans ce travail l’importance d’une population lymphocytaire CD4+ exprimant un récepteur de chémokine, CXCR4, dans la protection du diabète chez la souris NOD. Ces lymphocytes T CXCR4+ sont capables d’inhiber la capacité des lymphocytes T diabétogènes à transférer le diabète dans un modèle de co-transfert adoptif. L’AMD3100, antagoniste du CXCR4, accélère le diabète chez la NOD. L’étude quantitative des ARNm de cytokines Th1 et Th2 dans les ganglions pancréatiques met en évidence chez les souris traitées par AMD3100 une diminution de l’expression de l’IL-4. Nous démontrons que les lymphocytes T CXCR4+ expriment le CD62L et sont probablement des T régulateurs de phénotype Th2. Nous avons aussi étudié un autre mécanisme d’immunosuppression induit par les cellules souches mésenchymateuses (CSM). Nous démontrons que les CSM protègent la souris NOD du diabète dans un modèle de co-transfert adoptif. In vitro, les CSM inhibent les réponses allogéniques en augmentant les cytokines Th2, IL4 et IL10. Nous démontrons que ces CSM sont capables d’atténuer la maladie autoimmune et les réponses allogéniques et peuvent être une nouvelle approche thérapeutique dans le diabète et la greffe d’îlots<br>Insulino-deficiency of type 1 diabetes results from an autoimmune destruction of pancreatic β cells. Progressive islet infiltration by autoreactive T lymphocyte represents the first histopathological lesion of the disease “insulitis”. Development of diabetes results from a breakdown in tolerance to pancreatic islet antigens and the inability of CD4+CD25+ regulatory T cells (Treg) to counteract autoreactive T cells, these cells specifically express L-selectin, CD62L. The balance between T helper 1 (Th1) and Th2 cytokines subsets in the pancreas and pancreactic lymph nodes (PLN) is one of determining factors in diabetes development. In this work we demonstrate that a subset of CD4+T lymphocytes expressing CXCR4, a chemokine receptor, block the capacity of diabetogenic T cells to transfer diabetes in NOD mouse, a model of type 1 diabetes. We also demonstrate that inhibition of CXCR4 by AMD3100, a CXCR4 antagonist, accelerates autoimmune diabetes by inhibiting Th2-mediated immune responses. These CD4+CXCR4+ cells express CD62L. We also study another immunosuppression mechanism induced by Mesenchymal Stem Cells (MSC). We demonstrate that MSC protect NOD mice from diabetes in a co-transfer model. These cells inhibit in vitro allogenic responses by increasing Th2 cytokines: IL4 and IL10

La protéine FADD (Fas associated death domain) est l’adaptateur clé de la voie de signalisation apoptotique dépendante des récepteurs de mort de la famille du TNF (tumor necrosis factor). Au cours des dix dernières années, il est apparu évident qu’au-delà de son rôle majeur dans la mort cellulaire, FADD est impliqué dans d’autres processus biologiques comme le développement embryonnaire, la réponse immunitaire innée ou encore la progression du cycle cellulaire. De même, il est devenu clair que la localisation subcellulaire de FADD est déterminante pour sa fonction. Identifier les voies de régulation de l’expression de la protéine est donc d’une importance capitale. En 2008, notre équipe a mis en évidence, dans un modèle murin de la thyroϊde, un nouveau mécanisme de régulation de l’expression de la protéine via la sécrétion. En parallèle, le laboratoire a rapporté que la présence de FADD dans le sérum de patients cancéreux était corrélée à l’agressivité des tumeurs et l’inflammation. (Tourneur et al, 2012). L’objectif de ce travail de thèse était de comprendre le mécanisme par lequel FADD était sécrété, et de déterminer, le cas échéant, les modalités de sa régulation. Un troisième objectif est apparu au cours de la thèse : identifier de nouveaux modes de régulation de l’expression de FADD. Au moyen d’une lignée modèle humaine, nous avons montré que l’expression de la protéine humaine pouvait être régulée via une voie non-conventionnelle de sécrétion, tout comme dans le modèle murin. En parallèle de la caractérisation de cette sécrétion, nous avons montré que celle-ci pouvait être régulée par la kinase anti-apoptotique CK2 (casein kinase 2). Enfin, nous montrons que la CK2 régule la localisation nucléaire de FADD via une phosphorylation dépendante de la sous-unité régulatrice de la kinase et que la CK2 pourrait interagir directement avec FADD. Ces résultats constituent la première démonstration de la régulation de FADD par sécrétion par des cellules humaines et les premiers à rapporter un nouveau mode de régulation de la localisation subcellulaire de FADD par la CK2. Les conséquences de ces résultats en regard des fonctions connus de FADD sont discutées<br>The FADD protein (Fas associated death domain) is the key adaptor molecule of the apoptotic signaling pathway triggered by death receptors of the TNF (Tumor necrosis factor) superfamily. During the last decade, it became obvious that, in addition to its major role in cell death, the protein was also involved in other biological processes like the embryonic development, the immune response or even cell cycle progression. Evidence also showed that the protein sub-cellular localization was a key determinant to its functions. Therefore, the identification of underlying regulatory mechanisms dictating FADD expression was of significant importance. In 2008 our laboratory identified, in a thyroid murine model, a new mechanism controlling FADD expression, namely via secretion. We discovered that the loss of FADD expression from tumor cells, by secretion, could be correlated to cancer aggressiveness as well as inflammation (Tourneur 2012). The goal of this thesis work was to apprehend the mechanism by which FADD was secreted and determine, in that case, the modalities of this regulation. A third objective of this work was to identify new potential regulatory pathways of FADD expression. By means of a human cell line model, we showed that, similarly to the mouse model, the expression of human FADD could be regulated via unconventional secretion. In parallel to the characterization of the secretory process itself, we demonstrated that secretion could be negatively regulated by the anti-apoptotic kinase CK2 (casein kinase 2). Finally, we showed that CK2 could regulate FADD nuclear localization via a regulatory sub-unit-dependent phosphorylation and that FADD and CK2 could directly interact. These results are the first to demonstrate that human FADD expression could be regulated via secretion and that FADD sub-cellular localization could be modulated by CK2. The consequences of such regulation with regards to known FADD functions are discussed

Dans le poumon, neuromediateurs (acetylcholine, noradrenaline, tachykinines. . . ) et mediateurs de l'inflammation (histamine, leukotriene, lipoxynes. . ) peuvent a la fois inhiber l'adenylate cyclase et stimuler les phospholipases conduisant a l'accumulation d'inositol trisphosphate, le messager qui peut mobiliser le stocks de ca#+#+ intra-cellulaire, cependant, le couplage entre l'activation des recepteurs, la formation des messagers et les effects biologiques dependent de l'agoniste. L'activation de 20-30% des recepteurs muscariniques ou a la substance p seulement (contre > 90% des recepteurs a l'histamine, a la leukotriene d#4 et a la neurokinine a) produit une contraction maximale du muscle lisse. Dans les voies aeriennes pathologiques d'humains hyper-reactifs et de cochons d'inde pre-traites avec du paf, la capacite des recepteurs a l'histamine et a l'acetylcholine a entrainer l'accumulation de messagers intra-cellulaires n'est pas modifiee. L'activation de la phospholipase c conduit aussi a l'accumulation de 1,2 sn-diacylglycerol, l'activateur naturel de la proteine kinase c, qui pourrait etre impliquee dans la contraction et la phosphorylation des recepteurs -ad-renergiques du muscle lisse et l'antagonisme a la leukotrieme b#4 dans les poly-nucleaires. Les voies d'activation e/ou d'inhibition de l'adenylate cyclase, des phospholipases et de la proteine kinase c, offrent de multiples cibles pour le developpement de medicaments anit-asthmatiques.

La protéine de l’adénovirus humain E4orf4 (Early region 4 open reading frame 4) induit un programme de MC programmée indépendant des caspases chez les cellules transformées et cancéreuses. Des données indiquent qu’E4orf4 pourrait fournir un outil moléculaire pour obtenir des connaissances plus approfondies sur la façon de manipuler les fonctions oncogéniques afin d’induire sélectivement le suicide des cellules cancéreuses. Les travaux du laboratoire indiquent que la cytotoxicité d’E4orf4 repose sur sa capacité à perturber le trafic des endosomes de recyclage (ERs) via l’action concertée des kinases de la famille Src (KFS), de la RhoGTPase Cdc42 et de l’actine. Ces perturbations stimulent le transport des ERs dirigés par Rab11a vers le trans-Golgi et la fragmentation du Golgi, laquelle contribue à la progression de la MC. Les travaux présentés dans ce mémoire visent à déterminer la contribution de cette nouvelle voie de signalisation (contrôlant le trafic des ERs) dans le remodelage des organites en réponse au stress. Pour ce faire, la staurosporine (STS), un inhibiteur de kinases à large spectre induisant plusieurs mécanismes de MC, a été utilisé comme modèle principal. Les résultats indiquent que la STS perturbe le trafic des ERs et stimule leur translocation vers les membranes du trans-Golgi, lesquelles sont subséquemment fragmentées. Ces évènements sont indépendants des caspases et contribuent à la MC. En outre, la mobilisation des ERs induite par la STS est médiée par les KFS, Cdc42 et l’actine, tout comme la fragmentation du Golgi. De plus, j’ai démontré que la fragmentation du Golgi induite par la STS en absence de caspases contrôle partiellement la fission apoptotique des mitochondries, une organelle ayant un rôle central dans la signalisation de plusieurs modes de MC. Finalement, j’ai évalué la contribution de cette voie de transport rétrograde à l’activation des caspases. Les résultats préliminaires suggèrent que les GTPases Rab11a et Cdc42 jouent un rôle en amont de l’activation des caspases effectrices. Nous proposons que les signaux de stress stimulent la mobilisation des ERs, lesquels pourraient délivrer des lipides et des protéines de signalisation contribuant au remodelage des organelles et à la communication inter-organites orchestrant l’activation de multiples mécanismes de MC, tout au moins, dans le contexte de cellules cancéreuses.

Puisque l'utilisation des pesticides augmente dans la pratique agricole (Gorse, 2015), il est inévitable que nous allons retrouver ces contaminants dans l'eau de surface qui se trouve à proximité des zones d'épandage. Il est certain que les pesticides ont plusieurs manières d'affecter notre organisme. Cependant, l'effet de ces pesticides sur les différents mécanismes cellulaires est peu étudié. En effet, il est connu que certains pesticides permettent l'activation de gènes régulés par le récepteur à l'hydrocarbure d’aryle (AhR), mais il n'y a peu de documentation par rapport à leur effet sur les dommages à l'ADN. De plus, ces pesticides sont la plupart du temps utilisés en combinaison lors de leur utilisation agricole, mais il n'y a quasiment aucune étude qui est faite sur leurs effets lorsqu'ils sont en combinaison. Ainsi, mon projet de maîtrise se base sur l'hypothèse que certains contaminants présents dans l’environnement ainsi que dans les eaux de surface peuvent, à court et à long terme, perturber deux voies cellulaires, soit celle du récepteur à l'hydrocarbure d’aryle et celle de p53. Pour la première partie de mon projet, je me suis intéressée principalement aux gènes CYP1A1 et CYP1B1, deux enzymes impliquées dans le métabolisme de ces contaminants environnementaux dont l'expression est régulée par AhR. L'activation de ces deux gènes a été mesurée suite à un traitement avec différents ingrédients actifs seuls à haute concentration ou en combinaison à faible concentration. Nous avons démontré que chacun des ingrédients actifs séparément permettent l'activation d’AhR. En plus, lorsque nous les combinons, nous observons une activation synergique d’AhR pour la plupart des combinaisons. Ainsi, leur effet en combinaison est beaucoup plus grand que celui qu'ils ont lorsqu'ils sont seuls. Nous avons aussi déterminé que les pesticides seuls ainsi que les combinaisons permettaient l'observation de l’interaction croisée entre AhR et le récepteur à l'oestrogène (ER[alpha]). Pour la deuxième partie de mon projet, j'ai vérifié si les pesticides utilisés à haute concentration ainsi que les différentes combinaisons à faible concentration entraînent l’activation du point de contrôle des dommages à l’ADN. Le carbaryl, le linuron et le bromoxynil sont les trois seuls pesticides permettant l’activation de ce point de contrôle à haute concentration. Toutes les combinaisons de pesticides à faibles concentrations ne permettent pas l’activation de ce point de contrôle. Ainsi, tous les pesticides testés à haute concentration permettent l’activation d’AhR, mais seulement certain d’entre eux permettent l’activation du point de contrôle des dommages à l’ADN. Cela montre donc que les pesticides ont plusieurs cibles dans la cellule et que selon le pesticide étudié, les cibles changent. La dernière partie de mon projet consistait à vérifier l’impact sur AhR des contaminants environnementaux présent dans la rivière Saint-François le 26 septembre 2016 sur AhR. Les contaminants ont été extraits et concentrés avant d'être testés sur des cellules en culture. Les contaminants présents dans l'eau de rivière permettent l'activation d’AhR. En conclusion, mes études permettent de mieux comprendre l'effet de ces cinq pesticides sur ces deux mécanismes cellulaires. Des études plus approfondies sont nécessaires afin de comprendre l'ensemble des mécanismes affectés par ces pesticides

La formation de voies est une méthode de traitement du signal utilisée dans les réseaux d'antennes, permettant de favoriser certaines directions d'émission ou de réception des signaux par commande des différents éléments.Dans les réseaux de téléphonie mobile, elle peut permettre notamment de réduire l'interférence au niveau d'une station de base.Son implémentation entièrement numérique se heurte à des limitations de consommation énergétique et de coût quand on augmente le nombre d'antennes.En réponse à ces problèmes, l'implémentation hybride analogique-numérique peut être utilisée afin de réduire le nombre de chaînes radio-fréquences (RF) et de convertisseurs analogique-numérique.Dans cette implémentation, l'étage analogique peut être réalisé en utilisant différents types de dispositifs (déphaseurs, amplificateur/atténuateurs, impédances variables) et avec une connectivité variable avec le réseau d'antennes.Toutefois, si on souhaite garder une circuiterie RF simple en utilisant des déphaseurs uniquement (phase-only) afin de régler les poids du formateur de voies analogique, le problème d'optimisation de ces poids devient non-convexe.Les travaux actuels sur les réseaux de petites cellules montrent que l'interférence entre stations de base est un des facteurs limitant la couverture et le débit.De plus, dans une implémentation entièrement numérique, la présence de forts bloqueurs mène à la saturation ou à une désensibilisation des convertisseurs analogique-numérique.L'objet de ces travaux de thèse portent sur l'étude de la formation de voies avec une implémentation hybride phase-only, ainsi que de proposer un algorithme de calcul des matrices de formation de voies, afin de réduire les interférences en réception au niveau d'une petite cellule.Après une description du contexte et de l'état de l'art, on a en préliminaire proposé une caractérisation de l'interférence en utilisant un angle algébrique entre vecteurs des signaux utiles, et vecteurs des signaux interférants, ce qui nous a permis d'obtenir une borne inférieure sur les performances du formateur de voies optimal en RSIB.On a proposé ensuite une solution sous-optimale de formation de voies hybride phase-only, qui dans un modèle à résolution numérique infinie, a de faible pertes par rapport à une solution avec des poids variable en module et phase.Dans un second lieu, on a introduit un modèle de convertisseur analogique numérique dans la chaîne de réception, ce qui nous a permis de mettre en évidence les limitations de la première approche ainsi que de l'implémentation entièrement numérique en présence de forts bloqueurs.On a ensuite proposé un algorithme d'optimisation de l'étage analogique, qui repose sur une méthode de relaxation semi-définie.Cet algorithme montre des performances en RSIB et en somme-capacité proches de celles du benchmark à deux degrés de liberté module et phase.En comparaison, les solutions testées de l'état de l'art qui utilisent des fonction coût non-convexe restent dépendantes de l'initialisation et donnent des performances inférieures<br>Beamforming is a signal processing method used in antenna arrays, allowing to enhance directions of emission or reception of signals by controlling the different elements.In mobile networks especially, it allows interference reduction in base stations.Its full digital impementation is limited by energy consumption and cost when increasing the number of antennas.As a response, hybrid analog-digital implementation could be used to reduce the number of radiofrequency (RF) chains as well as the number of analog-to-digital converters.In this implementation, the analog stage could be realised using different types of devices (phase shifters, amlifiers/attenuators, variable impedances) and with a variable connectivity to the antenna array.Nevertheless, if we want to keep a simple RF circuitry by using phase shifters only to tune the analog beamformer, the problem of optimising these weights becomes non-convex.The current works on small cell networks show that the interference between base station is one of the limiting factors of the coverage and the datarate.Furthermore, in a full digital implementation, the presence of strong blockers leads to analog-to-digital converters saturation or desensitization.The purpose of this work is the study of hybrid beamforming with phase-only implementation, as well as to propose an algorithm to compute the beamforming matrices, to reduce the received interference in a small cell.After a description and a state-of-the-art, we preliminarily proposed an interference characterization using an algebraic angle between the signals of interest vectors and the interference vectors, which allowed us to obtain a lower bound on the SINR performance of the optimal beamformer.We have then proposed a sub-optimal solution of hybrid phase-only beamforming, which when using an infinite resolution digitization, has a low loss as compared to a solution using modulus and phase.Secondly, we introduced an analog-to-digital converter model, which allowed us to bring out the limitations of the first appproach as well as of the full digital implementation, in the presence of strong blockers.Afterwards, we proposed an optimisation algorithm of the analog stage, based on a semidefinite relaxation.The peroformance of this algorithm, in terms of SINR and sumrate are close to the benchmark with full degree of freedom, modulus and phase.In comparison, the performance state-of-the-art tested solutions using non-convex cost function are lower and depend on initialization point

Daxx (Death Associated protein) est une protéine adaptatrice aux fonctions multiples impliquée dans différentes voies de signalisation. Au cours de ma thèse, j’ai étudié le rôle de Daxx dans l’homéostasie lymphocytaire T, en me focalisant sur son rôle dans les voies de signalisation des récepteurs Fas/CD95 et TCR-CD3. L’activation de Fas suite à l’interaction avec son ligand induit une mort cellulaire. Après activation de Fas, les protéines FADD et Caspase 8 sont recrutées au récepteur, donnant lieu au « Death-Inducing Signaling Complex » (DISC). Nous avons montré que, dans les cellules T, Daxx est également recruté à Fas après activation, ce qui favorise la formation du DISC. En effet, dans les cellules T où Daxx a été aboli (par la surexpression d’un dominant négatif de Daxx ou par la technique du siRNA), Daxx n’est plus recruté au récepteur, ce qui empêche la formation du DISC et donc inhibe la mort cellulaire. Par ailleurs, l’activation du complexe TCR-CD3 par l’antigène génère un signal qui induit la prolifération des cellules T. Le recrutement de la protéine ZAP70 au complexe TCR-CD3 et sa phosphorylation sont des étapes initiales de l’induction de ce signal prolifératif. Nous avons montré que Daxx est également recruté au complexe TCR-CD3, ce qui inhibe le recrutement de ZAP70 phosphorylé et donc la prolifération. En effet, dans les cellules T où Daxx a été aboli, Daxx n’est plus recruté au TCR-CD3, ce qui favorise l’association de ZAP70 phosphorylé. L’ensemble de ces résultats démontre que Daxx est un élément régulateur critique de l’homéostasie lymphocytaire T<br>Daxx (Death Associated protein) is a multifunctional adaptor protein involved in several signalling pathways. During my PhD, I studied the role of Daxx in T cell homeostasis, focussing on its role in Fas and TCR-CD3 signalling pathways. The activation of Fas pathway, by the engagement of the receptor Fas by its ligand, induces cell death. After activation, the proteins Fadd and Caspase 8 are recruited to Fas, forming the Death Inducing Signalling Complex (DISC). We have shown that, in T cells, Daxx is also recruited to Fas after activation, enhancing the DISC formation. In fact, in T cells in which Daxx has been abolished (by the overexpressing a dominant negative form of Daxx (Daxx-DN) or by siRNA technique) Fas-induced cell death is inhibited because of the impaired Daxx recruitment to the receptor, preventing DISC formation. On the other hand, the activation of TCR-CD3 signalling pathway by the antigen in T cells generates a signal inducing proliferation. The recruitment of the protein ZAP70 to the TCR-CD3 complex and its phosphorylation are initial steps of this pathway. We have shown that Daxx is also recruited to TCR-CD3 complex, what prevents the recruitment of phosphorylated ZAP70 to the signalling complex and so inhibits TCR-induced proliferation. Indeed, we have observed, in vivo and in vitro, that TCR-induced proliferation is increased in T cells in which Daxx has been abolished because of the impaired recruitment of Daxx to the TCR-CD3 complex, enhancing phosphorylated ZAP70 recruitment. All together, these results show that Daxx is a critical regulator element in T cell homeostasis

Les voies aériennes transportent des sels et de l’eau pour hydrater le liquide de surface les recouvrant. Le rôle primordial du canal CFTR dans ces transports a été souligné par la découverte des mutations du gène CFTR associées à la mucoviscidose. La stimulation de canaux CL-alternatifs au CFTR, comme les CACC, est proposée dans la lutte contre cette pathologie. Mon travail de thèse a pour objectif l’étude des mécanismes de régulation de ces voies de sécrétion. Cette étude, utilisant différents modèles cellulaires de l’épithélium bronchique humain, montre le rôle clé des canaux K+SK4 dans l’établissement de la force électromotrice indispensable au processus de sécrétion. La localisation préférentielle de ces canaux à la membrane apicale des cellules caliciformes, sécrétrices de mucines, suggère une fonction spécifique de ces canaux au sein de cette population cellulaire. Le transport de NACL de l’épithélium des voies aériennes est sous le contrôle de nombreux facteurs, incluant les neurotransmetteurs et les nucléotides extracellulaires. Cette étude montre, pour la première fois, la stimulation de la sécrétion des ions CL- d’un modèle cellulaire de l’épithélium bronchique humain par les neuropeptides de la famille de l’arginine vasopressine. Les récepteurs V1 et V2 sont impliqués dans cette réponse et les effecteurs stimulés sont les canaux CFTR et SK4. La stimulation de l’activité de transporteurs basolatéraux est également supposée. Le travail souligne également l’importance du récepteur purinergique P2Y6, dont le ligand endogène est l’UDP, dans la stimulation de la sécrétion anionique de nos modèles d’étude<br>The airway epithelium secretes salt and fluid to maintain the optimal of the airway surface liquid. The CFTR CL-channel role in these transports is crucial as underlined by the discovery of CFTR gene mutations, which are responsible for the cystic fibrosis disease. A therapeutic approach would be to stimulate the activity of alternatives CL-channels to overcome the loss of functional CFTR. The aim of this study was to clarify the mechanisms underlying the regulation of these secretion pathways. This work shows the key role of SK4 channels in modulating airway epithelium CL-secretion. Their opening at the basolateral membrane of epithelial cells creates the driving force for CL-transport. In addition, their preferential location at the apical site of the goblet cells, which secrete mucins, suggest a specific role of these channels in this cellular population subtype. NACL transport of airways is under control of various factors such as neurotransmitters and extracellular nucleotides. This study is the first to report the stimulation of CL-seretion of a human bronchial epithelial cell line by neuropeptides belonging the arginin vasopressin family. The induced response is mediated by V1 and V2 receptors to vasopressin and the stimulated effectors are CFTR and SK4 channels. The stimulation of basolateral transporter activity us also supposed. This work also underlines the importance of purinergic P2Y6 receptors in the stimulation of anion secretion of the cellular models used in this study

L'implication des phénomènes d'oxydation et de glycation est maintenant reconnue dans de nombreuses pathologies. Au cours de ce travail, j'ai procédé à l'identification de voies physiologiques altérées au niveau de cultures cellulaires humaines traitées avec des produits avancés de glycation. J'ai pu démontrer que les albumines d'origine bovine ou humaine présentent une sensibilité différente à la modification par glycoxydation. Ces albumines glycoxydées induisent des altérations de type oxydative au niveau de monocytes humains en culture. Deux protéines ont été identifiées comme étant spécifiquement oxydées au niveau d'adipocytes incubés en présence d'albumine glycoxydée. En présence d'albumine glycoxydée, nous avons observé une modification d'expression de protéines au niveau des cellules SW872. L'albumine glyquée pourrait entraîner des modifications quantitatives et qualitatives de protéines adipocytaires ou monocytaires contribuant à l'aggravation de la pathologie diabétique<br>Proteins glycoxidation can lead to the formation of Advanced Glycoxidation Endproducts (AGEs), which induce various deleterious effects on cells. I studied the impact of glycoxidation modification on albumin structures and antioxidant properties and identified altered physiological pathways in cell cultures (monocytes and adipocytes) incubated with AGEs. I first reviewed recent insights on albumin antioxidant properties. Secondly, I studied the effect of glucose or methylglyoxal-induced oxidative modifications on bovine serum albumin (BSA) or human serum albumin (HSA) protein structures and on THP1 monocyte physiology. Also, and at the adipocyte level, I proceeded to the identification of specifically carbonylated targets following 2D gels analyses. Finally I identified proteins which expression levels were impaired by AGEs treatment in adipose cells. My work brings new insights about an association of oxidative damage with the progression of diabetes disorders at the monocyte and adipocyte levels

Dans le traitement des cancers des voies aérodigestives supérieures (VADS), une approche biologique par des anti-EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) comme le cetuximab (Erbitux®) a récemment été proposée. Le cetuximab est un anticorps monoclonal chimérique qui se lie spécifiquement au domaine extracellulaire de l'EGFR, régulateur central de la prolifération et de la différenciation dans les cancers. Par cette liaison, le cetuximab entre en compétition avec les ligands du récepteur et empêche son activation, induit son internalisation et bloque la transduction du signal vers les voies de signalisation en aval. Même si cette approche thérapeutique est rationnelle puisque l'EGFR est surexprimé dans la plupart des cancers et notamment dans les cancers des VADS, certains types de cancers présentent une résistance à cet anticorps. Parmi les molécules qui ciblent EGFR il existe également des inhibiteurs de l'activité tyrosine kinase intracellulaire de l'EGFR comme le gefitinib (Iressa®), mais ce dernier n'est actuellement pas prescrit dans le traitement des cancers des VADS.Le but de notre travail a été d'étudier les mécanismes de résistance au cetuximab dans des lignées cellulaires de cancers des VADS puis de proposer des associations thérapeutiques pouvant pallier à cette résistance.Nous avons choisi deux lignées cellulaires de cancers des VADS, CAL33 et SQ20B en comparaison à la lignée épidermoïde A431 sur exprimant EGFR et sensible au cetuximab. Nous avons pu mettre en évidence que CAL33 et SQ20B étaient résistantes au cetuximab mais de manière surprenante sensibles au gefitinib. Nous avons montré que l'absence d'inhibition de phosphorylation d'AKT et qu'une altération de l'internalisation de l'EGFR par le cetuximab étaient responsables en partie de la résistance au cetuximab dans ces modèles cellulaires.Afin de pallier à cette résistance nous avons alors étudié les conséquences biologiques de l'association du cetuximab avec (i) des inhibiteurs de la voie PI3K/AKT par différentes approches et avec (ii) les radiations ionisantes. Dans un premier temps, nous avons étudié l'influence de l'inhibition de la voie AKT par un inhibiteur de PI3K ou un siRNA ciblant AKT. Nous avons démontré que l'inhibition de la phosphorylation d'AKT par l'inhibiteur LY294002 sensibilisait au cetuximab la lignée CAL33 porteuse d'une mutation activatrice du gène PIK3CA codant pour la sous-unité catalytique p110 de la protéine PI3K. Nous avons montré que la persistance de l'activation d'AKT dans la lignée CAL33 prévenait l'effet anti tumoral du cetuximab, tandis que la résistance au cetuximab dans la lignée SQ20B ne semblait pas dépendante de la voie AKT.Une association de traitement du cetuximab avec les radiations ionisantes est déjà proposée en clinique dans le traitement des cancers des VADS. Nous avons donc dans un second temps déterminé les effets de cette association de traitement dans les lignées SQ20B et CAL33 respectivement sauvage et mutée dans la voie de signalisation AKT et dans la lignée contrôle A431. Nous avons montré que l'association du cetuximab aux radiations ionisantes potentialisait l'effet du cetuximab sur l'inhibition de prolifération de la lignée A431 alors que nous n'avons observé aucune potentialisation de l'effet du cetuximab sur la prolifération dans les lignées résistantes CAL33 et SQ20B. Dans ce travail, nous montrons que la voie AKT apparaît donc comme un élément central dans la réponse au cetuximab dans la lignée CAL33 et que l'association du cetuximab avec un inhibiteur de la voie PI3K/AKT pourrait être une bonne option thérapeutique dans le traitement des cancers des VADS mutés pour PIK3CA.

L'angiogenèse est un processus physiologique qui correspond à la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir d'un réseau vasculaire préexistant et est régulée par l'équilibre entre les facteurs endogènes pro- et anti-angiogéniques. La rupture de cet équilibre est associée à de nombreuses pathologies dont l'ischémie, la rétinopathie ou encore la progression tumorale. Etant donné que les cellules endothéliales, principal type cellulaire composant les vaisseaux sanguins expriment les récepteurs à activité tyrosine kinase du facteur anticoagulant, la protéine S, Tyro3, Axl et Mer et produisent de la protéine S, l'objectif de ce travail est d'étudier le rôle, de la protéine S dans l'angiogenèse. Dans la première partie de ce travail, nous avons montré in vivo que la protéine S inhibe l'angiogenèse induite par les facteurs pro-angiogéniques (VEGFA et FGF2). Parallèlement, nous avons observé in vitro une inhibition par la protéine S de la prolifération et de la migration des cellules endothéliales induites par le VEGFA. Cet effet est corrélé à l'inhibition par la protéine S des voies de signalisation des MAP-Kinases et de la phosphatidylinositol 3-kinase (PIK3) induites par le VEGFA. Nous avons ensuite mis en évidence, par l'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques et de petits ARNs interférents, que la protéine S inhibe, via l'activation du récepteur Mer et le recrutement de la protéine phosphatase SHP2, l'activation du VEGFR2, le principal récepteur du VEGFA. Dans la deuxième partie, nous avons montré de manière intéressante que le rôle joué par la protéine S lors de l'angiogenèse est plus complexe, puisqu'elle est capable d'activer directement la voie de signalisatio<br>Angiogenesis is a physiological process that leads to new blood vessel formation and is regulated by a balance between pro-and anti-angiogenic endogenous factors. Disruption of this balance leads to many pathologies such as ischemia, retinopathies or tumor growth. Because endothelial cells, the main cellular type composing blood vessels, produce the anticoagulant factor, protein S and express its tyrosine kinase receptors Tyro3, Axl and Mer, we investigated the implication of protein S in angiogenesis. In the first part of this work, we demonstrated that protein S inhibits pro-angiogenic factors (VEGFA and FGF2)-induced angiogenesis in vivo. We also observed an inhibition of VEGFA-dependent endothelial cell proliferation and migration induced by protein S. These effects were correlated with protein S induced inhibition of VEGFA-dependent MAP-Kinases (Erk1, Erk2) and phosphatidylinositol 3-kinase (PIK3) activation. Furthermore, we demonstrated, using pharmacological inhibitors and small interfering RNAs, that protein S inhibits VEGFA-induced VEGFR-2 activation through Mer receptor activation and SHP2 protein phosphatase recruitment. In the second part, we demonstrated that, protein S on its own, is able to induce MAP-kinases pathway activation and endothelial cells proliferation. These cellular and molecular effects involved Mer receptor and SHP2 protein activation and required protein kinase SRC recruitment. Our results describe for the first time that protein S is an endogenous regulator for angiogenesis both in vitro and in vivo and may form the framework for the use of protein S as part of an anti-angiogenic treatment

Nous avons etudie l'action de l'acide tout-trans retinoique (ar) et de la vitamine d#3(vd) sur plusieurs lignees myelomonocytaires humaines, hl-60, thp-1 et u937. Nous avons tout d'abord poursuivi l'etude du phenotype induit par les deux agents, seuls ou en association. Nous avons montre que les cellules differenciees par la combinaison ar/vd deviennent capables de secreter les cytokines il-1b, il-6 et tnf. Nous avons egalement etudie l'expression de la transglutaminase tissulaire. De maniere selective dans la lignee u937 et pour tous les parametres analyses, la vd et l'ar renforcent mutuellement leur action pour induire un phenotype monocytaire. La recherche des mecanismes sous-jacents nous a permis de montrer que selon les lignees, il existe des variations qualitatives et quantitatives des recepteurs nucleaires des retinoides rar et rxr au cours de la differenciation. Nous avons compare les phenotypes induits par des ligands synthetiques de l'ar et de la vd, et agissant selectivement sur ces recepteurs nucleaires. Nos resultats suggerent que les deux types de recepteurs rar et rxr sont requis pour une differenciation optimale mettant donc en jeu des heterodimeres rar/rxr et rxr/vdr. Quelle que soit la lignee etudiee, ces agents en association avec la vd ou ses analogues induisent un arret complet de la proliferation, ce qui pourrait avoir un interet therapeutique dans le traitement de certaines leucemies

Avec l’essor de technologies transcriptomiques à haut débit, une grande quantité de données a été générée.Ce travail est axé sur la réutilisation de ces données publiquement disponibles, pour la construction deréseaux de co-expression de gènes et leur exploitation dans l’élucidation de voies métaboliques et designalisation. Ce travail, dont l’objectif a été de fournir une méthodologie pour l’identification de gènescandidats, est axé autour de trois aspects : (i) le choix d’une distance appropriée pour évaluer la similarité deprofils d’expression entre gènes, (ii) l’identification du nombre d’échantillons minimal à inclure dans lamatrice d’expression, et (iii) la comparaison de réseaux, de type Pathway Level Co-expression (PLC) dedifférentes espèces et construits, avec les gènes codant les acteurs de la voie Multi Step Phosphorelay (MSP)comme guides<br>With the rise of high throughput technologies able to provide a large-scale view of transcriptomes, a highamount data has been produced. This work focuses on publicly available data reuse to construct gene coexpressionnetworks for metabolic or signalling pathways elucidation. The final aim of this work, was toprovide a methodology for candidate gene identification and thus focuses on (i) the choice of an appropriateddistance to evaluate similarity between gene expression profiles, (ii) the identification of a minimal numberof samples to be included in the expression matrix in order to construct robust co-expression networks, andfinally (iii) the comparison of targeted co-expression networks built with the Pathway Level Co-expression(PLC) approach and using guide genes coding actors of the Multi Step Phosphorelay (MSP) among differentspecies

La formation de la mémoire repose sur la modification des connexions neuronales, définissant ainsi une " trace nmésique ". En particulier, alors qu'un apprentissage intense ou répété peut conduire à la formation d'une mémoire à long terme (MLT), après une période de consolidation, lors de laquelle la trace mnésique passe d'un état labile à un état stable. L'étude des mécanismes moléculaires de la consolidation dans différents paradigmes d'apprentissage a montré que ceux-ci sont fortement conservés entre les espèces. La consolidation dépend de la synthèse protéique (transcription et traduction), ainsi que de cascades de signalisation spécifiques comme la signalisation basée sur l'activation du facteur de transcription CREB (cAMP responses element binding protein). Nous nous sommes intéressés aux bases moléculaires et cellulaires de la consolidation d'une mémoire olfactive associative chez l'abeille domestique (Apis mellifera). Pour cela, nous avons utilisé le paradigme du conditionnement du réflexe d'extension du proboscis (REP), qui permet chez cette espèce modèle l'apprentissage et la mémorisation d'une association entre une odeur et une récompense sucrée. Notre étude porte plus précisément sur les voies de signalisation et les processus de réorganisation structurale du réseau neuronal associés à la formation de la forme la plus stable de la MLT, dépendante de la transcription : la mémoire à long terme tardive (MLT-t). Les objectifs étaient (i) de préciser les caractéristiques et les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation de cette MLT-t et (ii) d'étudier l'implication de ces mécanismes dans la réorganisation structurale de la voie olfactive de l'abeille, associée à la formation de cette MLT-t. En focalisant notre analyse sur la part de mémoire spécifique à l'association odeursucre, nous avons montré tout d'abord que la MLT-t est induite spécifiquement par un conditionnement en plusieurs essais suffisamment espacés dans le temps, et qu'elle requiert deux vagues successives de transcription, précoce et tardive. Nous avons alors fait l'hypothèse que la vague précoce de transcription était induite, au moins en partie, par l'action de la protéine CREB. Nous avons donc évalué les conséquences de l'inhibition de CREB sur la MLT-t : nos données suggèrent que ce facteur de transcription pourrait jouer un rôle, non exclusif et apparemment localisé aux lobes antennaires (premier relais de la voie olfactive), dans la consolidation, de la MLT-t. Nous avons également mis à jour une modulation de la MLT-t par une voie de signalisation impliquant sans doute l'arginine, dont les substrats moléculaires précis restent à identifier. Par la suite, nous avons étudié l'implication éventuelle de la signalisation par le monoxyde d'azote et le calcium, dans l'établissement des modifications neurales associées à cette forme de mémoire. En effet, ces deux voies de signalisation ont été identifiées précédemment comme étant importantes pour la mémorisation à long terme. Nous avons donc cherché à mettre en évidence des modifications de changements structuraux associés à la MLT-t après perturbation de l'une ou l'autre voie (par traitement pharmacologique). Nous nous sommes intéressés pour cela à des changements de volume et de densité des unités neuropilaires fonctionnelles de la voie olfactive, respectivement les glomérules des lobes antennaires et les microglomérules des corps pédonculés. Si le manque de reproductibilité des données nous a empêché de conclure quant à l'implication du monoxyde d'azote, en revanche nos résultats indiquent une implication du calcium dans la réorganisation du circuit olfactif de l'abeille au niveau des corps pédonculés, lors de la formation d'une MLT-t. Dans l'ensemble, ces résultats ont permis de mieux caractériser les mécanismes de la mémorisation à long terme chez l'abeille, et en montrent les points communs avec d'autres espèces. Ils ouvrent des perspectives pour l'étude des mécanismes fins de plasticité synaptique associés à la mémoire dans ce modèle<br>Memory formation is based on the modification of neuronal connections, which thus define a "memory trace". In particular, an intense or repeated learning process may lead to the formation of a long-term memory (LTM) after a period of consolidation, during which the memory trace changes from a labile to a stable state. Studies of the molecular mechanisms of consolidation in different learning paradigms have shown that these are highly conserved between species. Consolidation depends on protein synthesis (transcription and translation), as well as specific signaling cascades such as signaling based on the activation of the transcription factor CREB (cAMP responses element binding protein). We were interested in the molecular and cellular bases of the consolidation of olfactory associative memory in the honeybee (Apis mellifera). For this, we used the proboscis extension reflex (PER) conditioning paradigm, which allows this model species to learn and remember an association between an odor and a sucrose reward. Our study focuses specifically on the signaling pathways and processes of structural reorganization of the neural network associated with the formation of the most stable form of transcription-dependent LTM: the late long-term memory (l-LTM). The objectives were (i) to clarify the characteristics and molecular mechanisms involved in the formation of the l-LTM and (ii) to study the involvement of these mechanisms in the structural reorganization of the bee olfactory pathway, associated with l-LTM formation. By focusing our analysis on the part of memory specific of the odor-sugar association, we showed first that l-LTM is induced specifically by conditioning using several trials separated by enough time, and requires two successive waves of transcription, an earlier one and a later one. We then hypothesized that the early wave of transcription was induced, at least in part, after CREB activation. We thus evaluated the effects of CREB inhibition on l-LTM: our data suggest that this transcription factor could play a non-exclusive role, apparently localized in the antennal lobes (first olfactory centers), in LTM consolidation. We have also discovered a modulation of l-LTM by a signaling pathway involving probably L-arginine, whose precise molecular substrates remain to be identified. Subsequently, we investigated the possible involvement of nitric oxide and calcium, in the formation of neural changes associated with this form of memory. Indeed, these two signaling pathways have been identified previously as being important for long-term memory. We therefore sought to highlight changes in structural changes associated with l-LTM after interfering with either pathway (using pharmacological treatments). For this, we looked for changes of volume and density affecting the functional neuropilar units of the olfactory pathway, respectively the antennal lobe glomeruli and mushroom body microglomeruli. Though the lack of reproducibility of data prevented us from concluding about a role for nitric oxide signaling, our results indicate the involvement of calcium signaling in the reorganization of the bee's olfactory system in the mushroom bodies, associated with l-LTM formation. Overall, these results have led to better characterize the mechanisms of long-term memory in the honeybee, showing similarities with other species. They open new perspectives for studying the mechanisms of synaptic plasticity associated with memory in this model

Le syndrome de Bloom (SB) est une maladie génétique autosomique récessive rare caractérisée principalement par une prédisposition au développement de tous les types de cancers affectant la population générale et une instabilité génétique généralisée. Le gène BLM, dont les mutations sont à l'origine de ce syndrome, code pour une protéine appartenant à la sous-famille des hélicases RecQ et qui possède une activité 3'-5' ADN hélicase dépendante de l'ATP. Le rôle physiologique de la protéine BLM est encore très peu connu à ce jour et son identification constitue la priorité de notre laboratoire. Les anomalies cellulaires et cliniques associées au syndrome de Bloom, et l'appartenance de la protéine BLM à la famille des hélicases RecQ, nous ont naturellement orientés vers une implication de la protéine BLM dans un mécanisme de maintien de la stabilité du génome. Les travaux présentés dans ce manuscrit montrent que l'expression de la protéine BLM endogène est régulée au cours du cycle cellulaire et qu'elle s'accumule et se phosphoryle en réponse aux radiations ionisantes (RI) par une voie dépendante de la présence d'une protéine kinase ATM fonctionnelle. Nous montrons également que cette protéine est phosphorylée en réponse à un traitement par un inhibiteur de la réplication (HU) ainsi qu'aux rayonnements ultraviolets (UVC) par une voie indépendante de la kinase ATM. Par ailleurs, nous observons dans les cellules SB traitées aux RI ou aux UVC présentent un défaut partiel du point de contrôle G2/M ainsi que des anomalies de réponse des protéine p53 et p21^(CIP1/WAF1) en réponse aux UVC. Nous montrons également que la protéine BLM est clivée au cours de l'apoptose induite aussi bien par un traitement aux UVC qu'à l'HU, et qu'une lignée SB n'exprimant pas de protéine BLM est résistante à l'apoptose UVC-induite, alors qu'une lignée SB exprimant une protéine BLM entière mais non fonctionnelle présente une sensibilité normale à ce type d'apoptose. En revanche, ces deux lignées présentent la même résistance à l'apoptose induite par l'HU. L'ensemble de nos résultats sont en faveur de l'implication de la protéine BLM dans différents mécanismes assurant le maintien de l'intégrité du génome en réponse à différents stress génotoxiques, tels que la réparation des cassures double-brin de l'ADN, le point de contrôle G2/M du cycle cellulaire et l'induction de l'apoptose<br>Bloom's syndrome (BS) is a rare human autosomal recessive disorder characterized by an increased risk to develop cancer of all types. BS cells are characterized by a generalized genetic instability including a high level of sister chromatid exchanges. BS arises through mutations in both alleles of the BLM gene which encodes a 3'-5' DNA helicase identified as a member of the RecQ family. We showed that BLM protein expression is regulated during the cell cycle, accumulating to high levels in S phase, persisting in G2/M and sharply declining in G1, suggesting a possible implication of BLM in a replication (S phase) and/or post-replication (G2 phase) process. On the other hand, we showed that, in response to ionizing radiation, BLM-deficient cells exhibit a normal p53 response as well as an intact GUS cell cycle checkpoint, which indicates that ATM and p53 pathways are functional in BS cells. We also show that the BLM defect is associated with a partial escape of cells from the g-irradiation-induced G2/M cell cycle checkpoint. Finally, we present data demonstrating that, in response to ionizing radiation, BLM protein is phosphorylated and accumulates through an ATM-dependent pathway. Altogether, our data indicate that BLM participates in the cellular response to ionizing radiation by acting as an ATM kinase downstream effector. We also show that following UVC treatment, BLM-deficient cells exhibit a reduction in the number of replicative cells, a partial escape from the G2/M cell cycle checkpoint, and have an altered p21 response. Surprisingly, we found that hydroxyurea-treated BLM-deficient cells exhibit an intact S-phase arrest, proper recovery from the S phase arrest, and intact p53 and p21 responses. We also show that the level of BLM falls sharply in response to UVC radiation. This UVC-induced reduction in BLM does not require a functional ATM gene and does not result from a sub-cellular compartment change. Finally, we demonstrate that exposure to UVC and hydroxyurea treatment both induce BLM phosphorylation via an ATM-independent pathway. Furthermore, we report the cleavage of the Bloom's syndrome protein (BLM) in hydroxyurea (HU)- or UVC-induced apoptosis. Appearance and solubility of BLM proteolytic products differed whether proteolysis occurred in response to HU or UVC. One BS cell line homozygous for a null mutation in BLM was found resistant to both UVC- and HU-induced apoptosis. Another one expressing a mutated BLM protein resisted HU-induced apoptosis, but displayed a normal sensitivity to UVC. Thus, UVC and HU appear to induce apoptosis through distinct pathways

Les perturbateurs endocriniens sont une nouvelle catégorie de produits environnementaux qui interfèrent avec la fonction endocrine. Leurs effets sur la physiologie et le développement des organismes ont pu être mis en évidence chez les poissons, les reptiles, les oiseaux, les invertébrés et les mammifères. Certains de ces composés sont capables de lier les récepteurs des oestrogènes alpha et bêta (ERα et ERβ) et/ou le récepteur de la dioxine (AhR, Aryl hydrocarbon Receptor). Ces récepteurs, activés par les ligands, régulent l'expression de leurs gènes cibles après liaison à des éléments de réponses spécifiques appelés éléments de réponse aux oestrogènes (ERE) ou aux xénobiotiques (XRE). Des études récentes ont montré que les récepteurs des oestrogènes pouvaient former un complexe ternaire avec Ahr et son partenaire d'hétérodimérisation Arnt. Ce complexe pourrait se lier à la fois sur des ERE et des XRE ce qui expliquerait les interférences transcriptionnelles qui existent entre ces récepteurs. Au cours de cette thèse, afin de mieux comprendre ces interférences transcriptionnelles, nous avons établi des modèles cellulaires bioluminescentes qui permettent de mesurer les activités oestrogéniques et "dioxine like". A l'aide de ces outils, nous avons mis en évidence la présence de ligand de ER et d'AhR dans des échantillons d'eaux et de sédiments de rivière. Nous avons également étudié l'activité (agoniste/antagoniste) et la sélectivité de ligands de ces trois récepteurs. Enfin, nous avons abordé l'étude de l'interférence transcriptionnelle qui existe entre ERα ou ERβ et AhR. Nous avons mis en évidence que les ligands d'AhR présentaient une activité oestrogénique qui varie selon le contexte cellulaire. Nous avons également observé que les oestrogènes affectaient l'activité transcriptionnelle d'AhR. La poursuite de ce travail devrait permettre de mieux comprendre le mécanisme de ces interférences et ainsi de mieux appréhender les risques potentiels des ligands environnementaux d'ERα, ERβ et AhR pour la santé humaine.

Le récepteur à l'EGF (REGF) est particulièrement surexprimé dans les cancers épidermoïdes de la sphère ORL où il représente un facteur de mauvais pronostic avéré. D'un point de vue clinique, il ressort des deux études menées sur des séries cancers de l'oropharynx localement très évolués traités par cisplatine (CP)- 5 fluorouracile ( 5FU) plus radiothérapie concomitante et de cancers du larynx traités par chimiothérapie d'induction à base de CP-5FU plus radiothérapie séquentielle, que l'expression des REGF dans la tumeur primitive est capable de stratifier la survie-totale parmi les différentes catégories de répondeurs à la chimiothérapie et à la radiothérapie : il n' y a aucune différence de survie totale entre les patients ayant une réponse complète et un taux de REGF élevé et les patients ayant soit une réponse partielle soit une absence de réponse et un taux de REGF bas. Le ciblage thérapeutique du REGF se justifie donc dans cette pathologie où la chimiothérapie de référence est représentée par l'association CP-5FU avec ou sans radiothérapie concomitante. Sur des lignées cellulaires ORL d'origine humaine, la sensibilité au ZD1839 (Iressa™, inhibiteur réversible de la tyrosine kinase REGF) dépend directement du taux de REGF exprimé par les lignées cellulaires, elle est par contre indépendante de leur statut p53. L'activation intrinsèque de la voie ras-MAP Kinase entraîne une baisse de la sensibilité au ZD1839. ZD1839 potentialise l'effet du CP et/ou du 5FU, l'effet du 5'DFUR et des radiations ionisantes avec une importance de l'ordre d'association (effets optimaux quand ZD1839 est appliqué avant et maintenu pendant l'exposition à ces cytotoxiques). Les effets cytotoxiques supra-additifs observées peuvent être expliquées par l'action du ZD1839 sur: - le cycle cellulaire avec un blocage de plus de 50% des cellules en phase G0/G1 accompagné d'une augmentation de p21 et p27 de plus de 60% ; - la thymidylate synthase (baisse d'un facteur 40) ; - la thymidine phosphorylase (augmentation d'un facteur 2,5) ; - l'apoptose avec une augmentation de Bax de plus de 100% et une diminution de Bcl2 d'au moins 60% ; - la phosphorylation AKT (baisse de 50%) ; l' activité caspase 3 ; - DNA-PK (baisse de 30%). La détermination de REGF dans les cancers ORL présente donc un intérêt de premier ordre puisqu'elle est à la fois synonyme de valeur pronostique par elle-même, qu’elle permet une meilleure orientation de traitement, et qu'elle offre de plus la possibilité d'un traitement ciblé hautement spécifique anti-REGF. Pour les cancers ORL, l'association ZD1839 à un traitement conventionnel (CP-5FU, radiation ionisante) est supra-additive et les changements moléculaires induits par ZD1839 permettent d'en fournir des explications mécanistiques plausibles. Sur ces bases, des futurs essais thérapeutiques sont à mettre en œuvre dans les cancers ORL.

Le poliovirus (PV), un Enterovirus de la famille des Picornaviridae, est l’agent étiologique de la Poliomyélite Paralytique Aigue (PPA). La PPA se caractérise par des paralysies flasques dues à la destruction des neurones moteurs de la moelle épinière suite à la multiplication du PV. La destruction des motoneurones semble être associée à un processus apoptotique, comme cela a été montré dans différents modèles murins et cellulaires. Récemment, le laboratoire a montré dans les cellules neuronales humaines IMR5, que ce processus implique un dysfonctionnement mitochondrial dépendant de la protéine pro-apoptotique Bax (Bcl-2 Associated X protein) et médié par l’activation des JNK (c-Jun NH2-terminal Kinase). Nous avons montré que l’infection de ces cellules par le PV induisait également l’activation précoce de la voie de survie PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase)/Akt, limitant l’amplitude d’activation des JNK, et par conséquent la mort cellulaire (Autret A. Et al, Journal of Virology, 2008). Cette voie de survie pourrait contribuer à limiter l’étendue des lésions du système nerveux central induites par le PV au cours de la pathogenèse de la poliomyélite. De plus, nous avons montré que l’infection par le PV induisait un transfert de calcium du réticulum endoplasmique vers les mitochondries, ce qui contribue également au dysfonctionnement mitochondrial et à l’apoptose (Brisac C. Et al. Journal of Virology, 2010). Enfin, nous avons initié l’étude du rôle des protéines non structurales (NS) et de leurs interacteurs cellulaires potentiels, dans la signalisation cellulaire et la cytopathogénicité du PV. Il serait intéressant d’élargir cette étude aux protéines NS d’autres entérovirus, notamment les coxsackievirus A 11, 13 et 17. En effet, les séquences codant les protéines NS de ces virus ont été retrouvées dans les génomes des souches de PV neuropathogènes circulantes dérivées des souches vaccinales Sabin (cVDPV) à l’origine des épidémies de PPA de Madagascar de 2001/2002 et 2005, actuellement étudiées au laboratoire. Ces travaux devraient permettre de mieux comprendre la forte cytopathogénicité des cVDPV et leur émergence. De plus, ils pourraient conduire à l’identification de nouveaux facteurs de virulence<br>Poliovirus (PV), a member of the genus Enterovirus in the Picornaviridae family, is the etiological agent of acute paralytic poliomyelitis (APP). Flaccid paralysis characteristic of APP results from the destruction of motor neurons in the spinal chord associated with PV replication. Works with mice and cellular models indicate that motor neuron destruction is associated with an apoptotic process. Recently, work in our laboratory with human neuronal IMR5 cells has shown that this process involves mitochondrial dysfunction dependent on the pro-apoptotic protein Bax (Bcl-2 Associated X protein), mediated by JNK (c-Jun NH2-terminal Kinase) activation. We found that early after infection, PV also activates the PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase)/Akt survival signaling pathway in these cells, limiting the extent of JNK activation, and thereby cell death (Autret A. Et al, Journal of Virology, 2008). This survival pathway may limit the spread of PV-induced damage in the central nervous system during poliomyelitis. Moreover, we demonstrated that PV infection induced calcium flux from the endoplasmic reticulum to mitochondria, and that this contributes to mitochondrial dysfunction and apoptosis (Brisac C. Et al. Journal of Virology, 2010). Finally, we have initiated studies of the involvment of viral non structural (NS) proteins, and their potential cellular partners, in cell signaling and PV cytopathogenicity. It would be interesting to extend this study to the NS proteins of other enteroviruses, notably coxsackievirus A 11, 13 and 17. Indeed, the sequences from these viruses encoding NS proteins have been found in the genomes of circulating neuropathogenic vaccine-derived PV (cVDPV) responsible for APP epidemics in Madagascar in 2001/2002 and 2005. These studies should help elucidate the high cytopathogenicity and emergence of cVDPV. Moreover, they may lead to the identification of new virulence factors

Le poliovirus (PV), un Enterovirus de la famille des Picornaviridae, est l’agent étiologique de la Poliomyélite Paralytique Aiguë (PPA). La PPA se caractérise par des paralysies flasques dues à la destruction des neurones moteurs par apoptose suite à la réplication du PV. Nous avons montré notamment qu’un transfert de calcium du réticulum endoplasmique vers les mitochondries contribue à l’apoptose induite par le PV (Brisac C. Et al. , 2010). De plus, l’exécution du processus apoptotique complet implique la réplication et la synthèse des protéines virales non-structurales (NS). Nous avons identifié deux interacteurs cellulaires de la protéine NS 3A du PV : ACBD3 (Acyl-Coenzyme A binding domain containing 3) et CREB3 (cyclic AMP response element-binding protein). Nous avons montré qu’ACBD3 pouvait moduler la réplication du PV (Téoulé F. Et al. , en révision) tandis que CREB3 pourrait être impliquée dans la régulation de la signalisation calcique et l’apoptose au cours de l’infection<br>Poliovirus (PV), an Enterovirus of the Picornaviridae family, is the causal agent of acute paralytic poliomyelitis (APP). APP is characterised by flaccid paralysis due to the destruction of motor neurons by apoptosis following PV replication. We have shown, in particular, that the transfer of calcium from the endoplasmic reticulum to the mitochondria contributes to the apoptosis induced by PV (Brisac et al. , 2010). This apoptotic process also involves the replication and synthesis of viral non-structural (NS) proteins. We have identified two cellular proteins interacting with the NS 3A protein of PV: ACBD3 (acyl-coenzyme A binding domain-containing 3) and CREB3 (cyclic AMP response element-binding protein). We have shown that ACBD3 modulates the rate of PV replication (Téoulé et al. , in revision), whereas CREB3 may be involved in regulating cell signalling and apoptosis during infection

Un large spectre de bactéries pathogènes est capable d'interagir avec la cellule hôte via des microdomaines membranaires appelés radeaux lipidiques. Après l'invasion, certaines bactéries transitent vers la voie de l'autophagie. Dans ce travail, j'ai examiné le mécanisme d'entrée de la bactérie entéroinvasive Yersinia pseudotuberculosis dans les macrophages. Après avoir utilisés les radeaux lipidiques, la bactérie détourne la voie de l'autophagie pour se répliquer. Les autophagosomes contenant les bactéries présentent également des composants de ces microdomaines lipidiques. Lors de l'infection, la maturation de l'autophagosome est bloquée et l'inhibition de l'autophagie induit une mort cellulaire par apoptose. Cette étude présente un mécanisme original de subversion de la voie d'autophagie par un pathogène avec des conséquences majeurs sur la compréhension des mécanismes de défense et de l'immunité

Les récepteurs Toll-like (TLR), impliqués dans la reconnaissance de nombreux pathogènes comme les mycobactéries, jouent un rôle important pour la mise en place de l’immunité innée. L’utilisation de souris déficientes en différents TLR (TLR1-6, TLR9) a permis l’étude de ces récepteurs dans des modèles d’infection in vivo à Mycobacterium bovis BCG par voie intraveineuse ou à Mycobacterium tuberculosis par aérosol ou par voie intranasale. Les phénotypes observés, notamment chez les souris déficientes en TLR2 ou TLR4, se sont avérés mineurs en comparaison de celui des souris déficientes en MyD88, protéine adaptrice commune aux TLRs (sauf TLR3), qui meurent rapidement de pneumonie nécrotique sévère après infection par Mycobacterium tuberculosis. Cette déficience de l’immunité innée n’empêche cependant pas la mise en place de l’immunité acquise chez ces souris. MyD88 est un adaptateur commun aux voies de signalisation de l’IL-1R et de l’IL-18R. Afin d’étudier la contribution relative de l’absence des signaux TLRs versus IL-1R et IL-18R dans le défaut de contrôle de l’infection à Mycobacterium tuberculosis observé en l’absence de MyD88, des souris déficientes en TIRAP (protéine indispensable aux signaux via TLR2-TLR1-TLR6 et TLR4), IL-1R1, IL-18R ou caspase-1 (enzyme permettant la production d’IL-1b active) ont été utilisées. Les résultats montrent que le phénotype sévère des souris déficientes en MyD88 serait dû plutôt au défaut de signalisation par le récepteur IL-1R1 et non à l'absence d'IL-1B active ou de signal via les différents TLRs, via TLR2-TLR1-TLR6-TLR4 ou via l'IL-18R.

Cette étude s'inscrit dans une thématique de phénotypage métabolique de souris génétiquement modifiées. A l'aide d'hépatocytes isolés, nous avons étudié les effets de l'hormone thyroi͏̈dienne T3, et le rôle de chacun de ses récepteurs,[alpha] et [beta], sur le métabolisme de la glutamine, principal précurseur hépatique de glucose et d'urée. L'effet de l'état nutritionnel, nourri ou à jeun, a d'abord été étudié chez des souris Swiss et 129SV normales. La RMN du carbone 13, couplée à des dosages enzymatiques et un modèle mathématique, montre que le jeûne ne modifie pas l'utilisation de glutamine. Mais il augmente la néoglucogenèse relative ou absolue et diminue l'oxydation de la glutamine (inhibition des flux citrate synthase, pyruvate et [alpha]-cétoglutarate déshydrogénases). Nous avons ensuite utilisé les souris [alpha]0/0 et [beta]-/- respectivement déficientes en récepteur [alpha) et [beta]. Quel que soit le génotype des souris (sauvages, [alpha] 0/0 et [beta]-/-), la T3 stimule les activités hépatiques de la citrate synthase, l'enzyme malique et la phosphoénolpyruvate carboxykinase. Par contre, les ARNm correspondants ne sont augmentés que chez les souris sauvages et [alpha]0/0. Ainsi, l'action transcriptionnelle établie ou supposée de la T3 sur ces gènes serait véhiculée par le récepteur [beta]. Chez les [beta]-/-, il existerait également une régulation de ces enzymes par la T3 à un niveau encore indéterminé. Les flux enzymatiques suggèrent que la suppression de la T3 chez la souris [beta]-/- s'accompagne d'une diminution de la consommation de glutamine, de la néoglucogenèse et de l'oxydation. La supplémentation en T3 ne restaure que le métabolisme oxydatif chez les [beta]-/-, donc via le récepteur [alpha]. En conclusion, la confrontation de trois niveaux différents de fonctionnement cellulaire (ARNm, protéine, flux enzymatique) apporte des éléments nouveaux sur le rôle respectif des récepteurs [alpha] et [beta] dans l'action métabolique hépatique de la T3.

L’hématopoïèse se déroule dans un microenvironnement spécialisé appelé niche où les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont en contact étroit avec les cellules stromales mésenchymateuses. Cette interaction cellulaire associée à d’autres facteurs environnementaux, comme la présence des espèces réactives à l’oxygène, est cruciale pour la régulation des CSH normales, mais aussi leucémiques. Pour étudier ce microenvironnement, il est donc important de développer un modèle in vitro de niche humaine qui mime la physiologie in vivo. Nous avons choisi comme modèle deux lignées mésenchymateuses stromales humaines HS-27a et HS-5, très peu décrites dans la littérature. Le premier objectif a été de déterminer la qualité de cette niche tant du point de vue cellulaire, moléculaire que fonctionnel. Nos résultats montrent clairement que les cellules HS-27a participent à la formation d’une niche « quiescente » alors que les cellules HS-5 représentent une niche « proliférative ». Le deuxième objectif a été de créer une niche contrôlée pour le métabolisme oxydatif en régulant l’expression d’une protéine antioxydante, la glutathion peroxydase 3 ou GPx3. L’originalité de ce travail repose sur l’utilisation d’une méthode non virale de transfert de gène par le transposon piggyBac. Le plasmide porteur du gène d'intérêt a été apporté sous forme d’ADN et une source de transposase, enzyme catalysant la réaction d'intégration sous forme d’ARNm. Notre travail montre que GPx3 est un régulateur clé de l’homéostasie hématopoïétique favorisant le maintien des progéniteurs immatures. Pour la première fois, nous créons par ingénierie in vitro une niche hématopoïétique « calibrée » capable de mimer le microenvironnement normal et leucémique. Ce modèle permet non seulement d’identifier les acteurs clés de la régulation des cellules médullaires, mais aussi de développer des stratégies thérapeutiques ciblées<br>Hematopoiesis occurs in a hypoxic microenvironment or niche in which hematopoietic stem cells (HSCs) are in close contact with mesenchymal stromal cells. Cellular interactions as well as microenvironmental factors such as reactive oxygen species are crucial for the maintenance of normal and leukemic HSCs. Developing an in vitro human culture system that closely mimcs marrow physiology is therefore essential to study the niche. Here, we present a model using two human stromal cell lines, HS-27a and HS-5. Previously poorly described in the literature, we have further characterized both of these cell lines. The first objective was to assess the quality of HS-27a and HS-5 niches by investigating their cellular, molecular and functional characteristics. Our results clearly show that HS-27a cells display features of a “quiescent” niche whereas HS-5 cells rather represent a “proliferative” niche. The second objective was to engineer a hematopoietic niche where the oxidative metabolism is optimized for the expression of an antioxidant protein, glutathione peroxidase 3 (GPx3). The originality of this work is the use of a non-viral gene transfer system by using the transposon piggyBac. This strategy was achieved by delivering a DNA plasmid carrying the gene of interest, and an mRNA source of transposase, the enzyme which catalyzes the transgene integration. Functionally, GPx3 was shown to be a key regulator for sustaining hematopoietic homeostasis by maintaining immature progenitor cells. For the first time, an original non-viral gene transfer has been used to create an in vitro hematopoietic niche that recapitulates the complexity of normal and leukemic microenvironment. This niche not only provides a platform to identify regulatory factors controlling medullary cells, but may also help in the development of targeted therapeutic strategies

CrMYC2 est un facteur de transcription (FT) de type bHLH qui lie la séquence G-box du promoteur du gène Str codant la strictosidine synthase, enzyme clé de la biosynthèse des AMI (Alkaloid Monoterpenic Indolic), chez C. Roseus. L’expression de Crmyc2 est rapidement induite en réponse au methyl jasmonate et aux éliciteurs. CrMYC2 ne régule pas, seul ou couplé avec un FT de type MYB, le promoteur du gène Str ou celui du gène Ban (codant une anthocyanidine réductase dans la biosynthèse des proanthocyanidines). CrMYC2 active l’expression du gène Gus placé sous le contrôle de l’élément de réponse au jasmonate du promoteur du gène codant pour ORCA3, FT régulant des gènes de la voie de biosynthèse des AMI. L’étude structure/fonction de l’adressage au noyau de CrMYC2 montre que les signaux de localisation nucléaire prédits par analyse de la séquence ne sont pas fonctionnels seuls, l’import nucléaire implique trois domaines agissant en synergie situés en N-terminal de la protéine<br>CrMYC2 is a C. Roseus bHLH transcription factor isolated by a yeast one hybrid screening using the G-box element of the Strictosidine synthase (Str) gene promoter as bait. The Str gene encodes a key enzyme of TIAs biosynthesis. Crmyc2 gene expression is induced early by methyl jasmonate and elicitor treatments. CrMYC2 has no impact on the Str or Ban promoters. Ban encodes for the anthocyanidin reductase, an enzyme involved in the proanthocyanidins biosynthesis. CrMYC2 activates expression of the Gus gene placed under the control of the Jasmonate Responsive Element of the Orca3 promoter. Orca3 encodes for a transcription factor involved in the regulation of the expression of several genes encoding enzymes of the TIAs biosynthesis pathway. A structure/function analysis of CrMYC2 nuclear targeting showed that each nuclear localization signals alone is not functional and that three domains are essentials and cooperate for CrMYC2 nuclear import

Les hépatopathies médicamenteuses survenant sur un mode idiosyncrasique représentent un obstacle majeur au développement de médicaments et sont à l’origine du retrait du marché de nombreux d’entre eux. Un des mécanismes mis en cause est lié à la survenue d’un épisode inflammatoire aigu qui, lors d’un traitement médicamenteux, sensibiliserait le foie pour les effets indésirables des médicaments, mettant en évidence leur toxicité idiosyncrasique. A l’heure actuelle, la détection précoce de médicaments potentiellement hépatotoxiques dans un contexte inflammatoire avant leur mise sur le marché, reste encore difficile et leurs mécanismes sous-jacents ne sont pas clairement élucidés. Dans ce contexte, notre travail s’articule sur 3 axes : 1) Développer un nouveau modèle cellulaire in vitro humain, adaptable au criblage à haut débit prédictif d'hépatotoxicité idiosyncrasique liée à un stress inflammatoire, basé sur l’exposition synergique des cellules HepG2 cultivées dans des conditions particulières exposées à des médicaments potentiellement idiosyncrasiques et des médiateurs pro-inflammatoires(LPS et TNF- ).2) Elucider les mécanismes sous jacents de la toxicité de 4 médicaments idiosyncrasiques connus (trovafloxacine, nimésulide, télithromycine et néfazodone), en mettant l'accent sur le stress oxydatif, la stéatose et la cholestase 3) Etudier les mécanismes moléculaires sous-jacents de la mort cellulaire observée lors d’une hépatotoxicité idiosyncrasique liée à un stress inflammatoire. Ainsi, nous avons développé un modèle cellulaire humain prédictif d’hépatotoxicité idiosyncrasique liée à un stress inflammatoire sensible, spécifique et applicable au criblage en haut débit d’un grand nombre de médicaments. Pour cela, nous avons étudié dans ce modèle, les effets toxiques de quatre médicaments testés et élucidé leurs mécanismes. La trovafloxacine exerce un effet cholestatique par diminution de l’expression et de l’activité de MDR1 et MRP2. Le nimésulide favorise l'accumulation intracellulaire de radicaux superoxydes en plus de son potentiel cholestatique par inhibition de l’activité MRP2. La télithromycine favorise une hépatotoxicité principalement via un mécanisme cholestatique impliquant l’inhibition de MDR1. La néfazodone favorise l'accumulation des radicaux superoxydes en plus de son potentiel stéatosique important et de son effet inhibiteur sur les deux transporteurs MDR1 et MRP2. Bien que chaque médicament idiosyncrasique testé présente un mécanisme de toxicité différent, ils ont tous entraîné une mort hépatocellulaire amplifiée en présence de LPS et TNF- , via la voie apoptotique intrinsèque pour la trovafloxacine, extrinsèque pour la néfazodone et les deux voies de l'apoptose pour le nimésulide et la télithromycine. Le potentiel apoptotique amplifié des quatre médicaments s'est avéré être médié par la surexpression de Bax et de caspase 8 via un mécanisme dépendant de ERK ½. Nos résultats indiquent que notre modèle peut être utilisé non seulement comme un outil préclinique pour l'identification de nouveaux médicaments qui pourraient être potentiellement hépatotoxiques lors d’un stress inflammatoire, mais aussi pour l'élucidation de leurs mécanismes<br>Idiosyncratic adverse drug reactions (IADRs) are considered as an important subset of ADRs, accounting for approximately 13% ofall acute liver failure cases and representing one of the leading causes for post-marketing drug withdrawal (Shaw et al. 2010). The lack of effective in vitro or in vivo models able to predict the hepatotoxic potential of idiosyncratic drugs before being approved formarketing on one hand, and the ambiguity of the mechanisms underlying their hepatic pathogenesis on the other hand render IADRs a perplexing human health problem (Shaw et al. 2010). Accordingly, the work presented in this thesis was based on three main objectives: 1) Development of a high throughput human-based cellular model for the prediction of inflammation associated idiosyncratic drug-induced hepatotoxicity; based on the synergistic exposure of HepG2 cells to potentially hepatotoxic drugs and proinflammatory mediators (LPS and TNF- ). 2) Elucidation of the hepatotoxic mechanisms underlying four known idiosyncratic drugs (trovafloxacin, nimesulide, telithromycin and nefazodone) with emphasis on oxidative stress, steatosis and cholestasis.3) Investigation of the molecular mechanisms underlying drug-inflammation synergistic induction of hepatocellular death Firstly, the results attained in this thesis demonstrated that the developed model is sensitive, specific and applicable to high throughputtoxicity screening of different categories of drugs. Secondly, our results demonstrated that the inflammation associated hepatotoxicpotentials of the four tested idiosyncratic drugs are mediated as follows: trovafloxacin exerts a cholestatic potential that involves thedown-regulation of both MDR1 and MRP2. Nimesulide promotes the intracellular accumulation of superoxide anions in addition topotently inhibiting MRP2. Telithromycin promotes hepatotoxicity predominately via a cholestatic mechanism that involves the downregulation of MDR1. Nefazodone favors the accumulation of superoxide anions in addition to its prominent steatotic potential and inhibitory effect on both MDR1 and MRP2. Although each of the idiosyncratic drugs exhibited a different mechanism of toxicity they all induced amplified hepatocellular death in presence of LPS and TNF- , which proved to be mediated via the intrinsic apoptotic pathway for trovafloxacin, the extrinsic for nefazodone and both apoptotic pathways for nimesulide and telithromycin. The amplified apoptotic potential of the four drugs proved to be based on the up-regulation of Bax and caspase 8 via an ERK½-dependent mechanism. These results indicate that the presented drug-inflammation model constitute an effective pre-clinical tool not only for the detection of inflammation-associated hepatotoxic drugs but also for the elucidation of their underlying mechanisms

Résumé du premier manuscrit : Facteurs influençant le dialogue entre les cellules épithéliales et immunes : Interactions entre les cytokines et les voies de signalisation induites par l’ATRA. Nous avons choisi les deux plus puissantes cytokines proinflammatoires connues, l’IL1β et le TNFα pour étudier les effets de l’ATRA. Nous avons utilisé ces deux cytokines, en présence ou en absence d’ATRA, pour stimuler pendant 6 h la lignée épithéliale de colon Caco2. Nous avons constaté que l’ATRA induisait l’expression de CD103 à la surface des cellules dendritiques (DC) et des macrophages (Mf). Quand l’expression du CX3CR1 était observé à la surface des cellules, les DC traitées avec un surnageant conditionné de CEC traitées par l’ATRA montraient une augmentation de l’expression de CX3CR1 alors que les Mfprésentaient un diminution de l’expression de CX3CR1 suite à un traitement similaire. Le fait que l’ATRA ait un effet variable sur différents types cellulairesmontrel’aptitude de l’ATRA à influencer les réponses lymphocytaires T finales. Dans notre système in vitro, nous avons constaté que les surnageants de CEC traitées par l’ATRA peuvent influencer les DC qui, lorsqu’elles sont cultivées avec de lymphocytes T CD4+, induisent moins de cellules Th17 alors que dans la même situation, les Mf conduisent à un nombre accru de cellules Th17.Résumé du second manuscrit (en collaboration avec le Dr. Éva Csősz, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Proteomics Core Facility University of Debrecen) : Quantification relative des β-défensines humaines dans les cellules épithéliales de colon par une approche protéomique basée sur la SRM ciblée. Dans cette étude, nous avons développé une méthode basée sur la protéomique ciblée pour déterminer les niveaux de défensines dans les lysats cellulaires et les surnageants de culture. La lignée épithéliale humaine Caco2 a été soumise à un stimulus inflammatoire constitué par l’IL-1β et les niveaux de β-défensine 2 ont été analysés dans les lysats cellulaires et les surnageants de culture. La méthode a été validée par qPCR, ELISA et Western blot quantitatifs. Les niveaux d’expression du gène de la β-défensine 2 ainsi que de la protéine étaient significativement plus élevés dans les échantillons traités par l’IL-1β comparés aux contrôles non stimulés. Les niveaux de β-défensine 2,de β-défensine 3, de β-défensine 4 et d’α-défensine ont également été étudiés et des niveaux significativement plus élevés de β-défensine 3 ont été détectés dans les surnageants de cellules Caco2 activées. Nos résultats montrent que la méthode de protéomique ciblée développée ici fournit une approche alternative aux analyses de spectrométrie de masse de certaines défensines<br>Retinoids and other derivatives of vitamin A are known to bear important functions in regulating differentiation and proliferation of epithelial cells (EC). We studied the effects of ATRA on colonic EC in combination with different pro-inflammatory activators. We selected the two most potent known pro-inflammatory cytokines IL-1β and TNF-α for studying the effects of ATRA. When we used these cytokines in the presence or absence of ATRA as inducers of Caco2 colonic EC cell lines we observed that ATRA was responsible for conferring the CD103 cell surface expression on DC and Mf after 6 hrs. In case of CX3CR1 cell surface expression, DC treated with ATRA-conditioned CEC supernatant showed an increase in CX3CR1 expression, whereas in Mf decreased CX3CR1 expression was observed after similar treatment. The fact that ATRA exerted different effects on different cells indicates the capability of ATRA to affect the final outcome of T-lymphocyte responses. In our in vitro system we observed that ATRA treated CEC supernatant can influence the outcome of DC responses when co-cultured with CD4+ T lymphocytes, as the balance of Th17 cells was reduced, while in Mf the number of Th17 cells was significantly increased. Defensins represent an important group of AMP consisting of 16 – 50 amino acids, organized to a structurally conserved compact organization associated with multiple functions in order to act as a first line of defense mechanism. The three subfamilies of defensins (α, β, θ) differ in their peptide length, location of disulphide bonds, their precursor structures and in the site of protein expression. Elevated levels β-defensin 3 in colonic mucosa of patients with ulcerative colitis suggest their role in the inflammatory response. In this study we have developed a targeted proteomics based method for the determination of defensin levels in cell lysates and cell culture supernatants. Human Caco2 epithelial cells were challenged with IL-1β as an inflammatory stimulus and the levels of β-defensin 2 was analyzed in cell lysates and in cell culture supernatants. The developed method was validated by using qPCR, quantitative ELISA and Western blot. The gene and protein expression levels of β-defensin 2 were significantly higher in the IL-1β treated samples as compared to the unstimulated controls. Beside β-defensin 2, the levels of β-defensin 3, β-defensin 4 and α-defensin was also measured and showed significantly higher levels in the supernatants of activated Caco2 cells. Our results show that the targeted proteomics method developed here offers an alternative approach for the mass spectrometric analyses of a selected set of defensins

Les récepteurs à dépendance (RDs) ont la particularité d’induire deux types de signalisation selon la disponibilité de leur ligand. En présence de leur ligand, ils induisent une signalisation positive favorisant la survie, la prolifération ou encore la différentiation cellulaire, tandis qu’en son absence, ils induisent la mort cellulaire par apoptose. Ptc et CDON, tous deux récepteurs du morphogène Shh, appartiennent à la famille des RDs. Ces deux récepteurs sont impliqués dans le développement embryonnaire, mais aussi dans le contrôle de la tumorigenèse et de l’homéostasie. La plupart des mécanismes moléculaires de la signalisation proapoptotique de ces récepteurs sont encore inconnus. Nous avons donc étudié les voies de signalisations proapoptotiques de ces récepteurs grâce à un crible d’ARN interférents. Parmi les partenaires potentiels identifiés, nous nous sommes intéressés à l’IGFBP7, caractérisé comme gène suppresseur de tumeurs dans de nombreux cancers. Nous avons mis en évidence que la mort induite par Ptc implique un contrôle transcriptionnel d’IGFBP7 de façon p53 dépendante. Dans un second temps, nous nous sommes intéressés au rôle des voies apoptotiques des récepteurs Ptc et CDON dans des cancers colorectaux associés à des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, pour lesquels il a été montré que le ligand Shh est surexprimé. La surexpression du ligand est l’un des mécanismes d’échappement au contrôle apoptotique exercé par les RDs acquit par les cellules tumorales. Notre étude vise à démontrer que le ciblage de Shh dans ces cancers pourrait induire une réactivation des voies apoptotiques des RDs Ptc et CDON, et ainsi constituer une nouvelle stratégie anti-tumorale<br>Dependence receptors (DRs) are able to inducing two types of signaling according to their ligand availability. In the presence of their ligand, they induce a positive signaling promoting survival, proliferation or cell differentiation, whereas in its absence, they induce cell death by apoptosis. Ptc and CDON, both receptors of the morphogen Shh, belong to the DRs family. Both receptors are involved in embryonic development, but also in the control of tumorigenesis and homeostasis. Most of the molecular mechanisms of the pro-apoptotic signaling of these receptors remain unknown. We therefore studied both receptors pro-apoptotic pathways through a shRNA screen. Among the identified potential partners, we have been interested in IGFBP7 shown as a tumor suppressor gene in many cancers. Secondly, we studied the role of Ptc and CDON pro-apoptotic pathways in colorectal cancers associated with chronic inflammatory bowel diseases, in which it has been shown that Shh is overexpressed. Overexpression of the ligand is one mechanism of pro-apoptotic control escapement by DRs acquired by tumor cells. Our study aims to demonstrate that targeting Shh in these cancers could induce reactivation of DRs pro-apoptotic pathways and thus constitute a new anti-tumor strategy

La maturation terminale et la mort cellulaire sont des mecanismes biologiques essentiels aux fonctions cellulaires dans l'ensemble des tissus. Ils sont regules par une signalisation intracellulaire impliquant generalement un controle transcriptionnel. Toutefois, cette signalisation intracellulaire se revele etre polyvalente : les memes voies peuvent servir au controle de la proliferation, de la differenciation cellulaire ou de l'apoptose. Cette situation est illustree par les reponses biologiques aux retinoides et a l'ampc dans differents modeles cellulaires. Nous avons cherche a caracteriser les etapes intracellulaires responsables de la specificite du signal dans les mecanismes d'induction de ces reponses biologiques. Nous avons pour cela developpe des modeles cellulaires originaux permettant d'etudier les relations entre les programmes de maturation et d'apoptose induits par les voies de signalisation des retinoides et de l'ampc. La lignee leucemique myeloide du rat bn, ipc-81 est un modele d'etude de l'apoptose induite par des agents elevateurs du taux intracellulaire d'ampc. Nous avons montre l'induction du gene crem, par l'ampc, les isoformes induits correspondant au represseur transcriptionnel icer. Le signal ampc peut egalement induire la differenciation dans ces cellules, ce, suivant l'intensite du signal ampc, ou la surexpression de la proteine bcl-2. La lignee leucemique promyelocytaire humaine nb4 est un modele d'etude des laps, elle se differencie sous l'action de l'acide retinoique. La voie de signalisation de l'ampc est recrutee au cours du processus de maturation, voire indispensable. Nous avons developpe ce modele en isolant des cellules resistantes a l'acide retinoique en terme de differenciation. L'ajout simultane d'ampc et de retinoides leve la resistance de ces cellules. Nous avons ete amenes a conclure a une eventuelle alteration de la voie de signalisation ampc dans ces cellules.

Les maladies pulmonaires, responsables de 3,1 millions de décès de part le monde représentent un problème majeur de santé publique. En particulier, la fibrose pulmonaire et la broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO) conduisent à la perte de la fonction pulmonaire. Aucun traitement efficace n’a été identifié à ce jour pour lutter contre ces maladies, la seule alternative étant la transplantation. Au cours de ma thèse, j’ai exploré les mécanismes du développement de ces maladies en utilisant différents modèles chez la souris, soit par l’instillation de nanoparticules de métaux ou de bléomycine, conduisant à l’inflammation et/ou à la fibrose pulmonaire, soit par exposition à la fumée de cigarette provoquant une inflammation. Nous avons montré le rôle de la voie de signalisation IL-33/ST2 dans les réponses inflammatoires induites par les nanoparticules ou la bléomycine et identifié de nouveaux mécanismes de régulation de l’IL-33 au sein des macrophages, différents de ceux décrits pour les cellules épithéliales. Nos résultats indiquent que l’expression intracellulaire de l’IL-33 et de son récepteur ST2, joue un rôle important dans l’inflammation, ainsi que la translocation nucléaire de l’IL-33. D’autre part, mes travaux de thèse ont permis d’identifier le rôle clef du senseur intracytosolique NLRP6 dans l’inflammation provoquée par l’exposition à la fumée de cigarette. Nos résultats indiquent que NLRP6, aux fonctions pulmonaires inexplorées, contrôle l’activation des cellules épithéliales et le recrutement des neutrophiles de façon indépendante de la formation d’un inflammasome mais dépendante de la signalisation par les récepteurs des interférons de type I et III<br>Pulmonary diseases are a major health problem with 3.1 million deaths in the worldwide. Among them pulmonary fibrosis and chronic obstructive pulmonary disease (COPD), which occur after repeated lung epithelium injury, are characterized by impaired lung functions. To date, no effective therapy against pulmonary fibrosis and COPD were developed, lung transplantation being the only alternative. During my thesis, I studied the mechanisms leading to disease development using different experimental models in mice in particular by metal dioxide nanoparticles or bleomycin instillation leading to inflammation and/or pulmonary fibrosis, or by cigarette smoke exposure promoting pulmonary inflammation which may lead to emphysema. We show the crucial role of IL-33/ST2 signaling pathway in response to nanoparticles or bleomycine and identify new mechanisms for IL-33 regulation in macrophages which are different from those described in epithelial cells. Our results indicate that intracellular expression of IL-33 and of its receptor ST2, together with nuclear IL-33 translocation, play an important role in inflammatory response to nanoparticles instillation. On the other hand, my thesis work allowed identifying that the cytosolic sensor NLRP6 as a key player in pulmonary inflammation developed upon mouse cigarette smoke exposure. Interestingly, our results show that the receptor NLRP6, whose pulmonary functions are still unexplored, controls epithelial cells activation leading to neutrophils recruitment in the airways, in an inflammasome-independent manner but dependently of type I and III interferon receptors signaling

La regulation de la transcription du virus de l'immunodeficience humaine (vih) a ete analysee dans differents systemes cellulaires. Une partie de ce travail a analyse les signaux de transduction menant a l'activation du ltr. Nous avons montre l'implication de la phospholipase c specifique de la phosphatidylcholine dans les voies de transduction activant le facteur nf-kb et la replication du virus. D'autre part, nous avons mis en evidence que l'inhibition de la pp2a par l'acide okadaique active le ltr du virus en agissant sur la region activatrice du ltr par l'intermediaire du facteur nf-kb, comme sur la region promoteur du ltr par l'intermediaire de la phosphorylation du facteur de transcription sp1. La sur-expression de la proteine moyen t du virus du polyome nous a permis de mettre en evidence le role de la signalisation transduite par la pi3k sur l'activation du domaine promoteur par la proteine sp1. Ces resultats suggerent que plus d'une voie de transduction agissent en collaboration afin d'induire l'activation physiologique complete du ltr viral par l'intermediaire de ses regions enhancer et promoteur. La seconde partie de ce travail a porte sur l'etude de l'importance critique des sequences kb du ltr dans l'expression du virus. Nous avons analyse son role dans les lymphocytes t normaux du sang peripherique, ou leur presence est sine qua non pour que le ltr dirige l'expression du genome viral, au contraire des lignees lymphoblastoides t. Dans les cellules de la lignee myelomonocytaire, la mutation des sequences kb du ltr s'oppose a la replication virale. De plus, l'utilisation d'un peptide aldehyde inhibiteur du proteasome inhibe la persistance de la replication virale dans les cellules u937 chroniquement infectees. Ces resultats soulignent l'importance critique du facteur nf-kb et de ses sequences de reponse dans le fonctionnement du ltr et dans l'activation de la replication virale

L'identification du réarrangement du gène RARα comme en étant le mécanisme moléculaire responsable de la Leucémie Aiguë à Promyélocytes (LAP) a conduit à la première thérapie ciblée visant à réorienter les cellules tumorales vers une différenciation normale, grâce au traitement par l'acide rétinoïque (AR). Alors que nous avions mis en évidence l'existence d'une hétérogénéité de réponse in vitro des cellules de patients LAP à CAR qui corrélait avec une certaine hétérogénéité de réponse clinique, nous avons engagé des travaux dans deux directions complémentaires. -Nous avons participé à une étude montrant que certains types de mutations du gène de fusion PML-RARα sont retrouvés chez des patients de pronostic défavorable. Nous avons également pu montrer que l'analyse de la maladie résiduelle des patients par RT-PCR quantitative pouvait permettre une meilleure détection des patients à risque de rechute. Enfin nous avons montré que la présence de corps d'Auer en grandefréquence dans les cellules LAP au moment du diagnostic était corrélée avec une moins bonne réponse à l'AR et un moins bon pronostic. -Nous avons également tenté de comprendre comment des signaux extracellulaires de deux types différents (signal membranaire venant d'une cytokine comme le G-CSF et signal nucléaire venant de l'AR) pouvaient s'interconnecter et être synergiques pour permettre une différenciation optimale de cellules LAP. En utilisant un modèle de cellules résistantes à l'AR nous avons montré que la voie ERK1/2 est capable de restaurer les fonctions trancriptionnelles de l'AR via le recrutement de RARα, CBP/P300 et d'histones acétylées sur les promoteurs de gènes cibles de l'AR<br>The identification of RARa gene rearrangement as the molecular origin of Acute Promyelocytic Leukemia (APL) led to the first targeted therapy aiming at reinducing normal differentiation of tumour cells using retinoic Acid (RA). Because we previously identified a level of heterogeneity in in vitro response of patients' cells to the RA induced differentiation which was correlated to the heterogeneity in clinical response, we developed several studies: -we collaborated to a study which allowed to identify certain mutations of the PML-RARα gene in APL patients with an adverse prognostic. We have also shown in another study that the minimal residual disease analysis using quantitative RT-PCR allowed to better identify patients that will relapse. We also demonstrated that a high frequency of Auer rods in APL cells at diagnosis is correlated to a poorer clinical outcome. -We have analysed whether extracellular signalling of 2 different origins (membrane signalling induced by the G-CSF and nuclear signalling induced by RA) may be interconnected and become synergistic to induce the differentiation of APL cells. In a model of APL cells resistant to the differentiation effect of RA we demonstrated that ERK1/2 pathway can restore transcriptional activation by RA via RARα, CBP/P300 and acetylated histone H3 recruitment on RA target gene promoters

L’adénomyose est une pathologie chronique bénigne de l’utérus caractérisée par une infiltration du myomètre par du tissu endométrial composé de glandes et de stroma avec une hypertrophie et une hyperplasie des cellules musculaires lisses adjacentes. Cette maladie fréquente de la femme en âge de procréer cause des symptômes invalidants comme des dysménorrhées, des saignements utérins anormaux et une infertilité. L’adénomyose utérine est souvent associée à d’autres pathologies gynécologiques bénignes œstrogéno-dépendantes comme les léiomyomes utérins et l’endométriose. Les options thérapeutiques médicamenteuses sont purement symptomatiques et non-curatives et l’adénomyose reste une cause majeure d’hystérectomie. Les mécanismes physiopathologiques qui aboutissent au développement de l’adénomyose sont probablement multifactoriels et ne sont que partiellement compris actuellement. Selon la théorie la plus communément admise, l’adénomyose trouve son origine dans la couche basale de l’endomètre avec une invagination de cellules entre les faisceaux musculaires et/ou le long de vaisseaux lymphatiques. De multiples facteurs pourraient être impliqués dans l’initiation de cette invasion, notamment une résistance à l’action de la progestérone, une production intra-lésionnelle d’œstrogènes par activation de l’aromatase, des anomalies myométriales prédisposant à l’invasion, des lésions tissulaires induites par la grossesse, l’accouchement, le dyspéristaltisme utérin ou iatrogènes et des anomalies de l’endomètre le prédisposant à l’invasion. Dans un premier temps nous détaillons, dans un article de revue, les traitements médicamenteux actuellement utilisés pour traiter les symptômes causés par l’adénomyose et discutons les mécanismes physiopathologiques qui pourraient être la cible de nouveaux traitements médicamenteux. Ensuite, nous exposons les résultats de l’étude in vitro des voies de signalisation cellulaires des mitogen-activated protein kinases (MAPKs) et phosphatidylinositol 3 kinase/Akt/mammalian target of rapamycin (PI3K/mTOR/Akt) dans les cellules musculaires lisses utérines issues de femmes avec de l’adénomyose et de témoins sans adénomyose. Nous montrons une augmentation de la prolifération des cellules myométriales avec une activation in vitro de la voie MAPK/ERK chez les femmes avec de l’adénomyose en comparaison avec les témoins. L’activation de la voie PI3K/mTOR/Akt n’est pas significativement différente. La production de dérivés réactifs de l’oxygène et leurs voies de détoxification ne sont pas différentes dans les cellules myométriales de femmes avec de l’adénomyose et celles de témoins, ce qui suggère une activation de la voie des MAPK/ERK indépendante des dérivés réactifs de l’oxygène. Nos résultats montrent que des inhibiteurs des protéines kinases et le rapanalogue temsirolimus contrôlent la prolifération des cellules myométriales in vitro, ce qui suggère une implication des voies de signalisation MAPK/ERK et PI3K/mTOR/Akt dans la prolifération des cellules musculaires lisses dans l’adénomyose et les léiomyomes. Finalement, nous avons étudié l’ostéopontine comme biomarqueur sérique dans une cohorte de femmes en âge de procréer opérées pour des pathologies gynécologiques bénignes. La présence d’endométriose a été déterminée chirurgicalement et les lésions endométriosiques ont été confirmées histologiquement et classées en lésions superficielles, endométriomes ou lésions invasives profondes. La présence d’adénomyose a été déterminée par imagerie par résonance magnétique préopératoire et deux types d’adénomyose ont été caractérisés : l’adénomyose diffuse, l’adénomyose focale avec ou sans lésions diffuses associées. L’ostéopontine sérique est diminuée en cas d’adénomyose focale et de lésions d’endométriose profonde en comparaison avec des témoins sains et augmentée dans l’endométriose superficielle en comparaison avec l’endométriose profonde. (...)<br>Adenomyosis is chronic benign uterine disease characterized by myometrial infiltration by endometrial tissue – both glands and stroma – with hypertrophy and hyperplasia of surrounding smooth muscle cells. This frequent disease occurring in reproductive age women causes invalidating symptoms such as dysmenorrhoea, abnormal uterine bleeding and infertility. Adenomyosis is frequently associated with other estrogen-dependant gynaecologic diseases such as uterine leiomyomas and endometriosis. Medical treatments are non-curative and act purely by alleviating symptoms and adenomyosis remains a major cause of hysterectomy. Physiopathological mechanisms underlying the disease are probably multifactorial and currently not fully elucidated. According to the most widely accepted theory adenomyosis originates from the basal layer of the endometrium which invaginates between smooth muscle cell bundles and/or along lymphatic vessels. Multiple factors could be implicated in triggering this invasion, amongst others resistance to progesterone, intra-lesional production of estrogens through aromatase activation, myometrial anomalies predisposing to invasion, tissue lesions induced by pregnancy, labour, uterine dysperistaltism or iatrogenic and endometrial anomalies predisposing to invasion. First, in a clinical review article, we detail current medical therapies used to alleviate adenomyosis-associated symptoms and discuss physiopathological mechanisms that could be targets for novel medical treatments. We then describe an in vitro study on the activation of the mitogen-activated protein kinases (MAPKs) and phosphatidylinositol three kinase/mammalian target of rapamycin/Akt (PI3K/mTOR/Akt) signalling pathways in uterine smooth muscle cells derived from women with adenomyosis and from adenomyosis-free controls. We show an increased proliferation of uterine smooth muscle cells related to the in vitro activation of the MAPK/ERK pathway in women with adenomyosis compared to controls. The activation of PI3K/mTOR/Akt was not significantly different. The production of reactive oxygen species and their detoxification enzymes were not different in uterine smooth muscle cells of women with adenomyosis compared to controls suggesting a reactive oxygen species independent activation of the MAPK/ERK pathway. Our results also show that inhibitors of protein kinases and the rapanalogue temsirolimus control the in vitro proliferation of uterine smooth muscle cells suggesting an implication of both MAPK/ERK and PI3K/mTOR/Akt in the proliferation of uterine smooth muscle cells in adenomyosis and leiomyomas. Finally, we studied osteopontin as a serum biomarker in a cohort of reproductive-age women undergoing surgery for benign gynaecological conditions. The presence of endometriosis was determined surgically and endometriosis lesions were confirmed histologically and classified into superficial lesions, endometriomas and deep infiltrating lesions. The presence of adenomyosis was determined by magnetic resonance imaging before surgery and women were classified according to two types of adenomyosis: diffuse adenomyosis, focal adenomyosis with or without associated diffuse lesions. Osteopontin levels were decreased in case of focal adenomyosis and deep infiltrating endometriosis compared to disease-free women and increased in superficial endometriosis compared to deep infiltrating endometriosis. Osteopontin, a secreted glycoprotein implicated in inflammation and in tumor-metastasis, is not a biomarker of disease severity in endometriosis and adenomyosis but could reflect events implicated in peritoneal dissemination of endometriosis lesions

Une population de cellules souches pluripotentes residant dans la moelle osseuse genere l'ensemble des cellules sanguines matures au cours d'un processus impliquant des mecanismes d'engagement, de proliferation et de differenciation. Un certains nombre de facteurs de croissance hematopoietiques interviennent dans ces processus, mais leur role exact dans l'engagement d'une cellule pluripotente est encore sujet a debat. Dans ce contexte, la premiere partie de ce travail relate l'etablissement de modeles cellulaires d'etude de la differenciation monocytaire, bases sur des cellules hematopoietiques pluripotentes murines. Nous avons montre que l'expression ectopique du csf-1r murin conduit a l'engagement de ces cellules dans la voie monocytaire, en reponse au csf-1, et a l'extinction concommitante de leur potentiel erythroide. Un role instructif du csf-1 a pu etre mis en evidence dans ce processus. Nous avons ensuite montre que le recepteur humain du csf-1, transfere a un taux equivalent dans les memes cellules, induit un autorenouvellement, sans engagement dans la voie monocytaire et sans alteration du potentiel erythroide. Afin d'identifier la region du csf-1r murin responsable de l'engagement de ces progeniteurs pluripotents, nous avons construit des recepteurs chimeres humain/murin, par echange des principaux domaines fonctionnels. Certains de ces recepteurs chimeres presentent alors une alteration de leurs proprietes mitogeniques, en depit de la forte homologie entre les regions echangees. Par cette strategie, nous avons egalement montre que l'association du kinase insert et de la region c-terminale murines est necessaire pour conferer au csf-1r humain la capacite a induire un engagement. Ceci suggere que le signal de differenciation resulte de l'addition de plusieurs signaux cooperatifs emanant de differentes regions du csf-1r, plutot que d'une voie unique de signalisation. La nature de ces signaux reste cependant a identifier.

De nombreuses publications plaident pour l'implication des cellules musculaires lisses (CML)dans la physiopathologie des maladies respiratoires (asthme, dysplasie broncho-pulmonaire, mucoviscidose, etc). Outre leur rôle dans le contrôle de la bronchomotricité, ces cellules sont capables de sécréter des médiateurs et des cytokines pro-inflammatoires, et de proliférer anormalement, favorisant ainsi l'installation d'une obstruction irréversible. Dans l'asthme, à partir du constat clinique que le pronostic fonctionnel à très long terme est fixé dès l'âge de 6 ans, nous avons cherché à comprendre quelles en étaient les explications à l'échelle biologique et cellulaire. L'objectif de cette étude a été d'explorer la bronchomotricité, la capacité sécrétrice et la prolifération des CML au cours du développement, en comparant les résultats obtenus chez les ratons et les enfants à ceux obtenus chez les adultes de la même espèce. Nous avons montré que : 1) chez le rat immature, l'augmentation de la relaxation d'anneaux aux β2-agonistes est liée à une atténuation de l'expression des récepteurs muscariniques de type M2 post-jonctionnels. L'efficacité fonctionnelle de l'antagonisme des M2R par la méthoctramine est en conséquence plus marquée chez les animaux adultes. Ces différences de maturation sont retrouvées à un degré moindre dans des cellules en culture ; 2) les médiateurs de l'inflammation sont capables d'augmenter le pic de calcium cytosolique dans les cellules à l'état basal (micro-perfusion des médiateurs au moment de la mesure de la concentration calcique intracellulaire, ou après 3 jours d'incubation dans des conditions pro-inflammatoires (TNFα) ; 3) En clinique humaine, 4 bouffées de bromure d'ipratropium (Atrovent*) ou de terbutaline (Bricanyl*) entraînent une baisse significative des résistances du sysystème respiratoire chez 38 à 43 % des nouveau-nés intubés et ventilés, respectivement ; 4) La réplication des CML immatures non-asthmatiques est supérieure à celle des CML adultes. Cette différence n'est pas liée aux variations de niveau d'expression du facteur de transcription anti-prolifératif, le C/EBPα. 5) Les CML immatures sécrètent plus de leukemia inhibitory factor (LIF) que les CML adultes. Les effets de cette molécule sur la signalisation calcique et la contractilité à l'acétylcholine d'anneaux isolés de trachée de rat sont plus marqués en présence d'une immaturité. En conclusion, les CML sont capables d'auto-amplifier le processus d'hyperactivité, de l'inflammation et du remodelage des voies aériennes pendant les premières années charnières de la vie<br>Many reports highlight the role of airway smooth muscle cells (ASMC) in the patho-physiology of inflammatory airway diseases (asthma, bronchopulmonary dysplasia, cystic fibrosis, etc. ). In addition to the control of bronchomotor tone, ASMC can secrete pro-inflammatory mediators and cytokines, and can proliferate, thus producing irreversible airway obstruction. Based on the fact that the long-term functional prognosis of asthma is determined as early as at the age of 6 years, we sought to explore the underlying basic biological and cellular mechanisms. The aim of the present work was to explore the 3 properties (control of airway tone, secretory properties, proliferation) of ASMC during the course of their development, by comparing the results obtained in immature and adult rat and human ASMC. We have demonstrated that : 1) In immature rats, increased tracheal ring relaxation to β2-receptor agonists is related to the attenuated expression of post-jonctionnal muscarinic M2 receptors. The functional efficacy of M2-R blocade by methoctramine is thus enhanced in adult animals. These maturational differences are less marked in cultured ASMC ; 2) Inflammatory mediators increase the peak cytosolic calcium concentration in ASMC at baseline (micro-perfusion of the mediators at the time of the intracellular calcium concentration measurement, or after 3 days' incubation in pro-inflammatory conditions (TNFα) ; 3) Clinically, 4 puffs of ipratropium bromide (Atrovent*) or terbutaline (Bricanyl*) significantly lower respiratory system resistance in 38 to 43 % of intubated ventilated neonates, respectively ; 4) The replication of immature non-asthmatic ASMC is increased compared to adults. This is not related to a differential expression of the anti-proliferative transcription factor, C/EBPα ; 5) Immature ASMC secrete more leukemia inhibitory factor (LIF) than adult ASMC). The effects of this molecule on calcium signalling and rat airway contractility to acetylcholine is greater in the presence of immaturity. In conclusion, ASMC may auto-amplify airway hypersponsiveness, as well as the inflammatory and remodeling process during the critical first few years of a child's existence

Le mode de coordination parmi les différentes molécules qui régulent la migration reste très peu connu. Ce travail traite de deux voies de transduction régulant la migration: la voie Rac1/WRC (Wave Regulatory Complex) qui contrôle la formation du réseau d'actine au front des cellules migrantes, et la voie RalB/exocyst, dont les mécanismes moléculaires de son implication dans la motilité cellulaire étaient inconnus au début de cette thèse. Rac1 et RalB sont des petites protéines G des familles Rho et Ras, respectivement. Les complexes WRC et exocyst sont leurs effecteurs directs.Au cours de la recherche de connexions entre l'exocyst et des régulateurs de la migration, nous avons trouvé que deux sous-unités de l'exocyst, Exo70 et Sec6, interagissent directement in vitro avec Abi et Cyfip, respectivement, deux sous unités du WRC. De plus, nous avons trouvé que les sous-unités de l'exocyst peuvent interagir in vitro avec le WRC entier. Nous avons également montré que ces deux complexes s'associent in vivo. Sur le plan fonctionnel, l'exocyst est requis pour le positionnement du complexe WRC au front des cellules migrantes. D'autre part, nous avons également trouvé que deux autres sous- unités de l'exocyst Sec8 et Exo84, interagissent avec SH3BP1 (une RhoGAP) en double hybride et en co-immunoprécipitation. SH3BP1 se localise au front des cellules migrantes, et cette localisation dépend de l'exocyst. De façon intéressante, in vivo, la voie RalB/exocyst/SH3BP1 cible spécifiquement Rac1, et non Cdc42. Grâce à plusieurs approches, nous concluons que SH3BP1 est requis pour inactiver Rac1 au front. Dans notre modèle nous proposons que RalB/exocyst règulerait la migration cellulaire en véhiculant au front de migration deux éléments majeurs de la signalisation de Rac1 : son complexe effecteur WRC, qui stimule la nucléation de filaments d'actine et son régulateur négatif SH3BP1, une GAP qui promeut l'inactivation et le cycle GDP/GTP de Rac1. En conclusion, ce travail fournit de nouvelles connexions moléculaires et fonctionnelles entre l'exocytose polarisée et la dynamique de l'actine au cours de la motilité cellulaire.

La régulation de la mort cellulaire est cruciale pour les êtres vivants. La mort cellulaire programmée (PCD) peut être déclenchée par des signaux extra- ou intracellulaires dans des conditions physiologiques (cette programmation permet par exemple le maintien de l’homéostasie tissulaire et un développement optimal) ou pathologiques afin d’éliminer des cellules altérées ou en prolifération anarchique. Une dérégulation de la mort cellulaire programmée est impliquée dans diverses pathologies humaines telles que les cancers, les maladies neurodégénératives et les maladies inflammatoires. La découverte de modulateurs de la mort cellulaire ouvre sur des perspectives prometteuses notamment en thérapie anticancéreuse, mais également en recherche fondamentale, pour améliorer notre compréhension des régulations moléculaires mises en jeu. Dans le cadre de cette thèse, des molécules marines (pigments marins et métabolites purifiés à partir d’éponges, notamment Crambe tailliezi et Crambe crambe, issues de la Mer Méditerranée et de l’Océan Atlantique) ont été utilisées afin d’inhiber, ou de déclencher, des voies de mort cellulaire non canoniques. Ces travaux ont été notamment focalisés sur l’étude d’un métabolite de haut poids moléculaire purifié à partir de l’éponge Crambe tailliezi, appelé P3 (2200-2800 Da). Celui-ci est cytotoxique et induit une mort apoptotique des cellules d’ostéosarcome U-2 OS qui ne dépend pas des caspases mais qui est sensible à la molécule necrostatine-1. Ce métabolite induit également une inhibition spécifique des protéines kinases mitotiques Aurora A et B. Ces résultats, tout en soulignant l’importance d’étudier la chimiodiversité marine, ouvrent de nouvelles perspectives en recherche fondamentale et appliquée<br>The regulation of cell death is crucial for the life living beings. The programmed cell death (PCD) can be triggered by extra- or intracellular signals under physiological (PCD is essential for normal development and tissue homeostasis) or pathological conditions for eliminating impaired cells (notably with uncontrolled cell proliferation). The dysregulation of PCD contributes to a variety of human pathologies including cancer, neurodegenerative disorders and inflammatory diseases. The discovery of chemical modulators of PCD opens up promising prospects, particularly in anti-cancer therapy, but also in fundamental research, to improve our understanding of the molecular regulations involved. In the context of this thesis, various marine metabolites (pigments and purified metabolites from Mediterranean and Atlantic sponges, notably from the sponges Crambe tailliezi et Crambe crambe) were used to inhibit or activate non-canonical PCD. The cell death induced by the high molecular weight metabolite (2200-2800 Da), called P3, purified from the sponge Crambe tailliezi, was notably studied. P3 is a cytotoxic metabolite that induces a necrostatin-1 inhibitable caspase-independent apoptosis in human osteosarcoma cells (U-2 OS). P3 was also characterized as a new inhibitor of Aurora A and B mitotic kinases. Taken together, these results shed light on the huge potential of marine chemodiversity to open new perspectives for both applied and fundamental research

Nous avons etudie les evenements biochimiques actives lors de la liaison d'hormones sur leurs recepteurs membranaires et leur implication dans le controle de la proliferation cellulaire. Pour la lignee de fibroblastes ccl39, la thrombine est un mitogene puissant. Par l'intermediaire de proteines g, elle module differents effecteurs, dont negativement l'adenylate cyclase (ac) (sensible a la toxine pertussique ptx) et positivement la phospholipase c (plc). L'hypothese que la plc soit un regulateur important dans la proliferation cellulaire a ete testee. Dans des cellules exprimant le recepteur muscarinique m1, la stimulation par le carbachol (cch) permet de mimer l'activation de la plc mais non le pouvoir mitogenique de la thrombine. L'expression du recepteur 5ht1c couple a la plc n'induit pas l'apparition d'un phenotype de transformation dans les fibroblastes ccl39. Ainsi, une forte activation de la plc est insuffisante pour induire une reponse mitogenique. Les voies de signalisation du cch et de la thrombine divergent des une heure apres stimulation au niveau des map et s6 kinases. La thrombine les active de maniere biphasique et sensible a la ptx, alors que le carbachol n'induit qu'un premier pic d'activation. La reponse mitogenique et la deuxieme phase d'activation des kinases induites par la thrombine sont totalement inhibees par la ptx, montrant une correlation entre une activation persistante des kinases et la proliferation cellulaire. Une augmentation du niveau d'amp cyclique n'inhibe pas la stimulation des map et s6 kinases par des agonistes de la voie sensible a la ptx, suggerant que l'inhibition de l'ac n'est pas l'evenement important dans la signalisation de ces facteurs. D'autres facteurs de croissance (fgf, csf-1) impliquent les map kinases dans leurs voies de signalisation. Ainsi un mutant du recepteur du csf-1 decouple de la reponse mitogenique n'active plus les map kinases

L’objectif de cette thèse est d’étudier comment la cellule mammifère adapte son métabolisme aux étapes du cycle cellulaire. Le cycle cellulaire est l’ensemble des étapes menant une cellule à se diviser. Le rôle du métabolisme est de fournir à la cellule les éléments et l’énergie dont elle a besoin pour fonctionner. En particulier, à chaque étape du cycle cellulaire, la cellule a besoin de différents éléments pour pouvoir, à terme, se diviser correctement. Il est donc crucial pour la cellule de coordonner le métabolisme et le cycle cellulaire et en particulier de contrôler ce que le métabolisme produit au cours du cycle cellulaire. Pour mieux comprendre ce lien entre ces deux processus, nous avons étudié comment un modèle mathématique du métabolisme répondait à différentes variations imposées par le cycle cellulaire et nous avons comparé ces réponses à la littérature. Satisfaits des résultats obtenus, nous avons alors construit un modèle hybride représentant l’évolution du métabolisme au cours du cycle cellulaire. Nous retrouvons dans ce modèle hybride les grandes variations connues des voies métaboliques au cours des phases du cycle cellulaire ainsi que des variations expérimentales des métabolites énergétiques et redox. Encouragés par ces résultats, nous avons finalement perturbé notre modèle hybride pour retrouver des tendances du métabolisme dues au cancer, un ensemble de maladies touchant à la fois le cycle cellulaire et le métabolisme<br>The goal of this thesis is to study how the mammal cell adjusts its metabolism to the steps of the cell cycle. The cell cycle is the series of events leading a cell to divide itself. The purpose of the metabolism is to supply the cell with all the elements and the energy it needs to work. In particular, at every step of the cell cycle, the cell needs different elements to properly divide itself. So, it is crucial for the cell to coordinate the metabolism and the cell cycle and in particular to control what the metabolism produces through the cell cycle. To have a better understanding of the links between these two processes, we studied how a mathematical model representing the metabolism answered to different variations imposed by the cell cycle and we compared those answers to the literature. Satisfied by the results, we therefore built a hybrid model representing the evolution of the metabolism through the cell cycle. We recover in this hybrid model the main known variations of the metabolism through the cycle’s phases as well as experimental variations of the energetic and redox metabolites. Encouraged by these results, we finally disturbed our hybrid model to recover metabolic tendencies due to cancer, a set of diseases affecting both the metabolism and the cell cycle

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2018-2019<br>Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2018-2019<br>La voie métabolique de glucuronidation, impliquant les enzymes uridine diphospho-glucuronosyltransférases (UGT), joue un rôle crucial dans le métabolisme des médicaments et contrôle l’exposition à divers composés exogènes via leur inactivation par la conjugaison à l’acide glucuronique. Cette voie métabolique a également comme rôle principal de maintenir l’homéostasie cellulaire et le contrôle de la biodisponibilité de nombreuses molécules endogènes. Nombre de ces composés sont impliqués dans des boucles de rétroaction régulant l’expression et l’activité de diverses voies métaboliques cellulaires, notamment via l’implication de récepteurs nucléaires et autres voies de signalisation. Une modification de l’expression et de l’activité de la voie de glucuronidation a donc le potentiel d’influencer le métabolisme cellulaire, au-delà du contrôle des substrats des enzymes UGT. Cette hypothèse est appuyée par des observations préliminaires démontrant la capacité des UGT à interagir avec des protéines d’autres voies métaboliques, affectant ainsi leur activité. De plus, les études récentes du laboratoire font état d’un transcriptome étendu de la grande famille de gènes UGT, permettant la production de protéines alternatives comprenant de nouveaux domaines peptidiques et dont les fonctions et les réseaux d’interaction demeurent inconnus. Dans le cadre de cette thèse, nos premières investigations ont porté sur les changements métaboliques associés à une modification de l’expression cellulaire d’enzymes UGT, ainsi que de leurs protéines alternatives nouvellement identifiées. Une approche métabolomique non-ciblée a révélé des répercussions importantes au niveau métabolique, parfois communes, parfois divergentes, selon l’enzyme et l’isoforme alternative étudiée. À titre d’exemple, les niveaux cellulaires de lipides bioactifs comme l’acide arachidonique sont grandement affectés dans les lysats de cellules exprimant des enzymes UGT, alors qu’ils ne le sont pas dans les lysats de cellules exprimant des protéines alternatives. Dans une seconde série d’investigations, nous avons établi les réseaux d’interactions protéiques des UGT dans le tissu rénal et hépatique humain. À l’aide d’anticorps développés au laboratoire et dirigés contre les enzymes ou les protéines alternatives UGT, nous avons réalisé une purification d’affinité sur bille couplée à la spectrométrie de masse. Ceci a permis d’établir de façon non-biaisée les interactomes endogènes des enzymes UGT et de leurs protéines alternatives dans un environnement protéique physiologique, révélant l’existence de partenaires communs et de partenaires spécifiques. En plus d’identifier des protéines associées au métabolisme des médicaments, nos travaux ont révélé plusieurs partenaires protéiques impliqués dans d’autres voies métaboliques, telles que les voies énergétiques (glycolyse, cycle des acides tricarboxyliques, oxydation des lipides, etc.). À l’aide de modèles cellulaires, nous avons démontré que certaines de ces interactions sont fonctionnelles et entrainent une modification significative de l’activité du partenaire des UGT, induisant des perturbations métaboliques et phénotypiques associées à la progression tumorale. Enfin, nos données ont révélé une induction différentielle de l’expression d’une enzyme UGT et de ses variants alternatifs suite à un traitement pharmacologique, influençant possiblement l’activité cellulaire en réponse à ces stimuli. Nos travaux soutiennent une interconnexion entre le métabolisme de glucuronidation et le métabolisme cellulaire. Ils appuient également un rôle plus vaste et complexe des protéines UGT, impliquant notamment la production d’isoformes alternatives aux structures protéiques distinctes et possédant des fonctions régulatrices possiblement différentes de celles des enzymes. Ces travaux démontrent également des interactions protéiques avec diverses voies métaboliques, permettant sans doute de moduler la réponse cellulaire à divers stimuli tout en optimisant les ressources métaboliques de la cellule.<br>La voie métabolique de glucuronidation, impliquant les enzymes uridine diphospho-glucuronosyltransférases (UGT), joue un rôle crucial dans le métabolisme des médicaments et contrôle l’exposition à divers composés exogènes via leur inactivation par la conjugaison à l’acide glucuronique. Cette voie métabolique a également comme rôle principal de maintenir l’homéostasie cellulaire et le contrôle de la biodisponibilité de nombreuses molécules endogènes. Nombre de ces composés sont impliqués dans des boucles de rétroaction régulant l’expression et l’activité de diverses voies métaboliques cellulaires, notamment via l’implication de récepteurs nucléaires et autres voies de signalisation. Une modification de l’expression et de l’activité de la voie de glucuronidation a donc le potentiel d’influencer le métabolisme cellulaire, au-delà du contrôle des substrats des enzymes UGT. Cette hypothèse est appuyée par des observations préliminaires démontrant la capacité des UGT à interagir avec des protéines d’autres voies métaboliques, affectant ainsi leur activité. De plus, les études récentes du laboratoire font état d’un transcriptome étendu de la grande famille de gènes UGT, permettant la production de protéines alternatives comprenant de nouveaux domaines peptidiques et dont les fonctions et les réseaux d’interaction demeurent inconnus. Dans le cadre de cette thèse, nos premières investigations ont porté sur les changements métaboliques associés à une modification de l’expression cellulaire d’enzymes UGT, ainsi que de leurs protéines alternatives nouvellement identifiées. Une approche métabolomique non-ciblée a révélé des répercussions importantes au niveau métabolique, parfois communes, parfois divergentes, selon l’enzyme et l’isoforme alternative étudiée. À titre d’exemple, les niveaux cellulaires de lipides bioactifs comme l’acide arachidonique sont grandement affectés dans les lysats de cellules exprimant des enzymes UGT, alors qu’ils ne le sont pas dans les lysats de cellules exprimant des protéines alternatives. Dans une seconde série d’investigations, nous avons établi les réseaux d’interactions protéiques des UGT dans le tissu rénal et hépatique humain. À l’aide d’anticorps développés au laboratoire et dirigés contre les enzymes ou les protéines alternatives UGT, nous avons réalisé une purification d’affinité sur bille couplée à la spectrométrie de masse. Ceci a permis d’établir de façon non-biaisée les interactomes endogènes des enzymes UGT et de leurs protéines alternatives dans un environnement protéique physiologique, révélant l’existence de partenaires communs et de partenaires spécifiques. En plus d’identifier des protéines associées au métabolisme des médicaments, nos travaux ont révélé plusieurs partenaires protéiques impliqués dans d’autres voies métaboliques, telles que les voies énergétiques (glycolyse, cycle des acides tricarboxyliques, oxydation des lipides, etc.). À l’aide de modèles cellulaires, nous avons démontré que certaines de ces interactions sont fonctionnelles et entrainent une modification significative de l’activité du partenaire des UGT, induisant des perturbations métaboliques et phénotypiques associées à la progression tumorale. Enfin, nos données ont révélé une induction différentielle de l’expression d’une enzyme UGT et de ses variants alternatifs suite à un traitement pharmacologique, influençant possiblement l’activité cellulaire en réponse à ces stimuli. Nos travaux soutiennent une interconnexion entre le métabolisme de glucuronidation et le métabolisme cellulaire. Ils appuient également un rôle plus vaste et complexe des protéines UGT, impliquant notamment la production d’isoformes alternatives aux structures protéiques distinctes et possédant des fonctions régulatrices possiblement différentes de celles des enzymes. Ces travaux démontrent également des interactions protéiques avec diverses voies métaboliques, permettant sans doute de moduler la réponse cellulaire à divers stimuli tout en optimisant les ressources métaboliques de la cellule.<br>The glucuronidation pathway, catalyzed by uridine diphospho-glucuronosyltransferases (UGTs), is crucial for drug metabolism and controls the body’s exposure to several exogenous compounds by the conjugation of a glucuronic acid moiety leading to their inactivation. A main role for this pathway is also to controls cellular levels of several endogenous compounds in order to maintain homeostasis. Many of those compounds are involved in feedback loops and control the expression and activity of numerous metabolic pathways through the regulation of nuclear receptors and other signaling events. Altered expression or activity of the glucuronidation pathway thus has the potential to influence cellular metabolism, beyond UGT substrate regulation. This hypothesis is supported by preliminary observations showing that UGTs possess the capacity to interact with enzymes from other metabolic pathways, affecting their activity. Furthermore, recent studies from our laboratory exposed an extended transcriptome for UGT genes, producing new alternative proteins comprising new domains and for which the functions and interaction networks remain unknown. In the context of this work, our first investigations explored the metabolic alterations induced by a modification in the cellular levels of UGT enzymes, as well as selected novel alternative proteins. A non-targeted metabolomics approach uncovered significant metabolic alterations, sometimes common or divergent, depending on the enzyme and the alternative isoform. As an example, bioactive lipids such as arachidonic acid were among the most modulated metabolites in lysates of cells expressing UGT enzymes but remained unchanged in cells expressing alternate proteins. In a second set of investigations, we established the interaction networks of UGT proteins in human liver and kidney tissues. We used in-house antibodies directed against UGT enzymes or their alternative proteins to conduct affinity purification coupled to mass spectrometry. These assays exposed an unbiased endogenous interactome in a physiologically relevant protein environment, revealing common and specific partners to UGT enzymes and alternative isoforms. In addition to proteins involved in drug metabolism, our work uncovered numerous partners implicated in other metabolic routes such as energetic pathways (glycolysis, tricarboxylic acids cycle, lipid oxidation, etc.). Using cellular models, we showed some of these interactions had a functional impact on cellular activity of the protein partners, triggering metabolic alterations associated with tumor progression. Lastly, our data further support a differential expression of UGT enzymes and their alternative isoforms following treatment with pharmacological compounds that could lead to variable metabolic activity in response to stimuli. Our results demonstrate functional crosstalk between UGT proteins and cell metabolism. This works also supports an extended and rather complex role for UGTs, notably through the production of numerous alternative isoforms presenting different peptide structures and likely diverse regulatory functions. Our findings indicate that one of the underlying mechanisms is related to protein-protein interactions between UGTs and proteins of other metabolic routes, likely permitting a fine regulation of cell response to stimuli while optimizing metabolic resources.<br>The glucuronidation pathway, catalyzed by uridine diphospho-glucuronosyltransferases (UGTs), is crucial for drug metabolism and controls the body’s exposure to several exogenous compounds by the conjugation of a glucuronic acid moiety leading to their inactivation. A main role for this pathway is also to controls cellular levels of several endogenous compounds in order to maintain homeostasis. Many of those compounds are involved in feedback loops and control the expression and activity of numerous metabolic pathways through the regulation of nuclear receptors and other signaling events. Altered expression or activity of the glucuronidation pathway thus has the potential to influence cellular metabolism, beyond UGT substrate regulation. This hypothesis is supported by preliminary observations showing that UGTs possess the capacity to interact with enzymes from other metabolic pathways, affecting their activity. Furthermore, recent studies from our laboratory exposed an extended transcriptome for UGT genes, producing new alternative proteins comprising new domains and for which the functions and interaction networks remain unknown. In the context of this work, our first investigations explored the metabolic alterations induced by a modification in the cellular levels of UGT enzymes, as well as selected novel alternative proteins. A non-targeted metabolomics approach uncovered significant metabolic alterations, sometimes common or divergent, depending on the enzyme and the alternative isoform. As an example, bioactive lipids such as arachidonic acid were among the most modulated metabolites in lysates of cells expressing UGT enzymes but remained unchanged in cells expressing alternate proteins. In a second set of investigations, we established the interaction networks of UGT proteins in human liver and kidney tissues. We used in-house antibodies directed against UGT enzymes or their alternative proteins to conduct affinity purification coupled to mass spectrometry. These assays exposed an unbiased endogenous interactome in a physiologically relevant protein environment, revealing common and specific partners to UGT enzymes and alternative isoforms. In addition to proteins involved in drug metabolism, our work uncovered numerous partners implicated in other metabolic routes such as energetic pathways (glycolysis, tricarboxylic acids cycle, lipid oxidation, etc.). Using cellular models, we showed some of these interactions had a functional impact on cellular activity of the protein partners, triggering metabolic alterations associated with tumor progression. Lastly, our data further support a differential expression of UGT enzymes and their alternative isoforms following treatment with pharmacological compounds that could lead to variable metabolic activity in response to stimuli. Our results demonstrate functional crosstalk between UGT proteins and cell metabolism. This works also supports an extended and rather complex role for UGTs, notably through the production of numerous alternative isoforms presenting different peptide structures and likely diverse regulatory functions. Our findings indicate that one of the underlying mechanisms is related to protein-protein interactions between UGTs and proteins of other metabolic routes, likely permitting a fine regulation of cell response to stimuli while optimizing metabolic resources.

Le développement embryonnaire des métazoaires suppose la mise en oeuvre coordonnée des processus de la dynamique cellulaire. Les informations nécessaires à cette coordination sont présentes dans chaque cellule et changent au fur et à mesure de sa différenciation. Ces informations sont acquises et transmises entre les cellules au moyen d'un petit nombre, moins d'une dizaine, de voies de signalisation conservées au cours de l'évolution. L'information de polarité apparaît essentielle à toutes les étapes de la morphogenèse. Les travaux présentés ici tentent de contribuer à la compréhension des mécanismes de signalisation qui lui sont associés. La voie PCP régule la polarisation dans le plan de l'épithélium de tissus aussi différents que l'aile de drosophile ou l'oreille interne de mammifère. La plupart des molécules impliquées dans cette voie et leurs interactions sont connues. Pourtant, l'origine du signal de polarité et le mécanisme précis de transduction conduisant à l'alignement des structures cellulaires restent mal compris. Nous proposons un modèle moléculaire de la voie PCP, fondé sur les données expérimentales concernant l'aile de drosophile. Ce modèle est ensuite utilisé pour étudier les interactions entre les voies PCP et Delta/Notch au cours de la différenciation des photorécepteurs de l'oeil de drosophile. Les simulations du modèle reproduisent la plupart des phénotypes mutants observés dans ces deux systèmes; elles suggèrent également des tests expérimentaux permettant de mieux comprendre le mécanisme de polarisation par la voie PCP. Les gènes Hox sont impliqués dans la spécification de l'identité régionale le long de l'axe antéro-postérieur (A/P) chez les bilatériens. Ces gènes sont regroupés en complexes de gènes paralogues chez les vertébrés. L'ordre des gènes dans chaque complexe est colinéaire à leur patron d'expression suivant l'axe A/P. Plusieurs mécanismes expliquant cette colinéarité ont été proposés. Une région de contrôle située en amont du locus HoxD détermine la colinéarité d'expression dans les doigts, les gènes étant d'autant moins exprimés qu'ils sont éloignés de cette région. Nous proposons un modèle de contrôle du locus par cette région. La structure du modèle et ses paramètres sont fondés sur les résultats d'un programme de délétions et duplications des gènes du locus. Ce programme a été déterminé par itérations successives entre résultats des simulations et résultats des mesures d'ARNm. Les travaux présentés illustrent la diversité et la complexité des mécanismes biologiques sous-jacents à la polarisation. Leur approche par la modélisation peut contribuer à en identifier les éléments communs et en faciliter la compréhension.