Дисертації з теми "Voie de signalisation RASSF/Hippo"

L’objectif de cette thèse est d’étudier le rôle de la Striatine3 (STRN3) dansl’hépatoblastome (HB) et le carcinome hépatocellulaire (CHC), deux cancers du foiecaractérisés par des dérégulations géniques, des réarrangements chromosomiques et desmutations dans les gènes liés à la voie de signalisation Wnt/bêta-caténine (Wnt). Cesaltérations conduisent à une activation anormale de cette voie. Des mutations sur le gènecodant pour la β-caténine (CTNNB1) sont très fréquentes dans ces cancers, avec environ80 % des cas dans l’HB et 30 % dans le CHC.STRN3 appartient à une famille de protéines d'échafaudage, les striatines, qui font partiedu complexe STRIPAK. Ce complexe régule la phosphatase PP2A et joue un rôle dans demultiples voies de signalisation, telles que la voie Hippo. Dans les cancers, STRN3 a étéassociée à un rôle oncogène en modifiant l’action de PP2A, transformant ce suppresseurde tumeur en un oncogène.Nos résultats montrent que STRN3 est sous-exprimée dans des cohortes de patientsatteints d’HB, ainsi que dans des lignées cellulaires dérivées d’HB. La surexpression deSTRN3 entraîne une diminution de la prolifération des lignées cellulaires issues d’HB etdes lignées dérivées de patients (HB-PDX). Cependant, elle n’a pas d’effet sur laprolifération des cellules Huh7, une lignée provenant de CHC qui possèdent une formesauvage de la β-caténine. Cette réduction de la prolifération des lignées HB a étéconfirmée par un arrêt irréversible du cycle cellulaire. Par ailleurs, nous avons montré quel'introduction de mutations inhibitrices du complexe de dégradation de la β-caténine dansles cellules Huh7 induit une diminution de leur prolifération.De plus, dans les Huh7, la surexpression de STRN3 entraîne une diminution de l’activitéde la voie Wnt, parallèlement à une augmentation de l’activité nucléaire des protéinesYAP/TAZ soit une inhibition de la voie Hippo. En revanche, aucun effet sur l’activité desvoies Wnt et Hippo n’a été observé dans des lignées possédant des formes mutées de laβ-caténine. Nos données suggèrent que STRN3 agit sur la voie Wnt indépendamment ducomplexe de dégradation de la β-caténine. STRN3 intervient également sur la régulationde la voie Hippo, non pas en agissant sur les kinases MST1/2 et LATS1/2, mais via lecomplexe de dégradation de la β-caténine.Par ailleurs, nous avons cherché à déterminer l’impact de mutations du gène CTNNB1retrouvées dans l’HB au cours des différentes phases du développement embryonnairedu foie. Pour cela, nous avons initié le développement d’un nouveau modèle dedéveloppement embryonnaire chez le xénope permettant une expression contrôlée deforme mutée de la β-caténine retrouvée dans l’HB, afin d’étudier la transformation malignedes cellules hépatiques. Bien que le développement de ce modèle n’ait pas encore aboutien raison de difficultés techniques, il devrait présenter une étape importante dans l’étudedes mécanismes de carcinogenèse de l’HB.Cette thèse contribue à une meilleure compréhension du rôle de STRN3 dans les cancershépatiques, en particulier dans la modulation des voies de signalisation Wnt et Hippo, ainsique dans la régulation du cycle cellulaire
The aim of this thesis is to study the role of Striatin-3 in hepatoblastoma (HB) andhepatocellular carcinoma (HCC), two liver cancers characterized by genederegulations, chromosomal rearrangements, and mutations in genes related to theWnt/beta-catenin (Wnt) signaling pathway. These alterations lead to abnormalactivation of this pathway. Mutations in the gene encoding β-catenin (CTNNB1) arevery frequent in these cancers, with around 80% of cases in HB and 30% in HCC.The STRN3 protein belongs to a family of scaffold proteins, the striatins, which are partof the STRIPAK complex. This complex is known to regulate the phosphatase PP2A,which plays a role in multiple signaling pathways, such as the Hippo pathway and theMAPK cascade. In cancers, STRN3 has been associated with an oncogenic role bymodifying the action of PP2A, transforming this tumor suppressor protein into anoncogenic protein.Our results show that STRN3 is under-expressed in patient cohorts with HB, as wellas in cell lines derived from HB. STRN3 overexpression leads to a decrease in theproliferation of HB-derived cell lines and patient-derived lines (HB-PDX). However, ithas no effect on the proliferation of Huh7 cells, a line derived from HCC that has a wildtypeform of β-catenin. This reduction in HB cell line proliferation was confirmed by anirreversible cell cycle arrest. Furthermore, we showed that introducing mutationsinhibiting the β-catenin degradation complex in Huh7 cells induces a decrease in theirproliferation.Additionally, in Huh7 cells, STRN3 overexpression leads to a decrease in Wnt pathwayactivity, along with an increase in the nuclear activity of YAP/TAZ proteins,corresponding to inhibition of the Hippo pathway. In contrast, no effect of STRN3 onWnt and Hippo pathway activity was observed in lines with mutated forms of β-catenin.Our data suggests that STRN3 acts on the Wnt pathway independently of the β-catenindegradation complex. STRN3 also affects the regulation of the Hippo pathway, not byacting on the MST1/2, SAV1, and LATS1/2 kinases, but through the β-catenindegradation complex.Moreover, we sought to determine the impact of CTNNB1 gene mutations found in HBduring the different phases of liver embryonic development. To do this, we initiated thedevelopment of a new embryonic development model in Xenopus, allowing forcontrolled expression of the mutated form of β-catenin found in HB, to study themalignant transformation of hepatic cells. Although the development of this model hasnot yet been completed due to technical difficulties, it should represent an importantstep in studying the mechanisms of HB carcinogenesis.This thesis contributes to a better understanding of the role of STRN3 in liver cancers,particularly in the modulation of the Wnt and Hippo signaling pathways, as well as inthe regulation of the cell cycle

L'ostéosarcome (OS) est la tumeur osseuse primitive maligne la plus fréquente chez les enfants et les adolescents dont le pronostic reste mauvais, surtout lorsque des métastases sont présentes au diagnostic. Des analyses transcriptomique de biopsies de patients atteint d’OS révèlent la présence d’une signature génique de la voie de signalisation Hippo dans l’OS. Son principal effecteur, YAP, est connu pour son rôle oncogène dans un certain nombre de cancer. Afin d’étudier son rôle dans le développement de l’OS, nous avons développé une approche moléculaire en surexprimant une protéine YAP capable ou non d’interagir avec son facteur de transcription TEAD. Des expériences in vitro et in vivo révèlent le rôle crucial de TEAD dans la prolifération cellulaire et la croissance tumorale médiée par YAP. De plus nous avons montré que la surexpression de YAP augmente la migration cellulaire in vitro et la dissémination métastatique in vivo, indépendamment de son interaction avec TEAD. Des analyses transcriptomique ont montré un enrichissement de gènes liés à la transition épithéliaux-mésenchymateuse, à la migration cellulaire et au TGF-β dans les cellules surexprimant YAP, quel que soit sa capacité à interagir avec TEAD. Des expériences de PLA et d’immunoprécipitation montrent une interaction YAP/Smad3, le principal effecteur de la voie du TGF-β. A l’aide d’un inhibiteur spécifique du TGF-β, le SD-208, nous montrons le rôle essentiel de la signalisation TGF-β/Smads dans la dissémination métastatique médiée par YAP. Ces résultats ont défini le rôle spécifique de TEAD et Smad3 dans la progression tumorale de l’OS, et identifié YAP comme un acteur central du développement de l’OS. Ainsi, YAP pourrait être une cible thérapeutique prometteuse dans l’OS
Osteosarcoma (OS) is the most common primary malignant bone tumour in children and adolescents for whom the prognosis remains poor, especially when metastases are present at diagnosis. Transcriptomic analyses of biopsies from OS patients reveal the presence of an Hippo signalling pathway gene signature in the OS. Its main effector, YAP, is known for its oncogenic role in a number of cancers. In order to study its role in the development of OS, we developed a molecular approach by overexpressing YAP that could or not interact with its transcription factor TEAD. In vitro and in vivo experiments revealed the crucial role of TEAD in cell proliferation and tumor growth mediated by YAP. In addition, we showed that overexpression of YAP increases cell migration in vitro and metastatic dissemination in vivo, regardless of its interaction with TEAD. Transcriptomic analysis showed a genes enrichment related to epithelial-mesenchymal transition, cell migration and TGF-β in cells overexpressing YAP, regardless of its ability to interact with TEAD. PLA and immunoprecipitation experiments showed YAP/Smad3 interaction, the main effector of the TGF-β pathway. Using a specific inhibitor of TGF-β, SD-208, we demonstrated the essential role of TGF- β/Smads signalling in YAP-mediated metastatic dissemination. These results defined the specific role of TEAD and Smad3 in the tumor progression of OS, and identified YAP as a central actor in the development of OS. Thus, YAP could be a promising therapeutic target in OS

La perte d’expression de RASSF1A dans les cancers bronchiques non à petites cellules est un évènement fréquent puisqu’il concerne 25 à 30 % des patients. Nous avons mimé in vitro la perte d’expression de RASSF1A au moyen de siARN dans des cellules épithéliales bronchiques humaines. Nous avons démontré que cette inactivation induit i) une transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) en provoquant la translocation nucléaire du cofacteur transcriptionel YAP sous sa forme active ; ii) l’acquisition de capacités pro-migratoires et invasives (c’est à dire d’un phénotype métastatique) en inhibant la GTPase anti-migratoire RhoB et sa GEF, GEFH1. Cet effet sur RhoB participe à la perturbation de la dynamique des microtubules et filaments d’actines par dérégulation de la voie de signalisation LIMK/Cofiline, et aux nombreuses anomalies de la cytocinèse observées après invalidation de RASSF1A. Nous avons établi que l’activité inappropriée de la kinase NDR2, membre de la voie de signalisation Hippo, rend compte, en grande partie, des effets induits par l’absence de RASSF1A, notamment parce qu'en absence de RASSF1A, cette kinase se lie et pourrait phosphoryler/inactiver GEFH1, or GEFH1 est impliquée dans les différents processus perturbés par l'absence de RASSF1A. Nous avons également pu démontrer que YAP mais pas son paralogue TAZ, participe au phénotype induit par la perte d’expression de RASSF1A. Nous avons enfin rapporté qu’une expression tumorale élevée de YAP tend à prédire la moins bonne survie sous chimiothérapie des patients atteints de CBNPC, probablement parce que YAP, en plus de provoquer la TEM des cellules n’exprimant plus RASSF1A, induit l’expression d’un gène codant pour un inhibiteur d’apoptose, c-IAP2. Ce travail nous a ainsi permis d’identifier dans l’interactome de la voie de signalisation RASSF1A/Hippo, un acteur central participant à la transformation oncogénique des cellules épithéliales bronchiques humaines n’exprimant plus RASSF1A, à savoir la kinase NDR2, ce qui en fait une potentielle cible thérapeutique
RASSF1A loss in non-small cell lung cancer is a frequent event observed in 25 to 30% of patients. We mimicked in vitro RASSF1A loss by siRNA transfection in human bronchial epithelial cells. We demonstrated this inactivation induced i) an epithelial-mesenchymal transition (EMT) by causing nuclear translocation of the active transcriptional co-factor YAP, ii) the acquisition of promigration and invasive capacity (i. E. A metastatic phenotype) by inhibiting the anti-migratory GTPase RhoB and its GEF, GEFH1. This effect on RhoB also participates in the cytoskeleton remodeling dynamics by deregulating the LIMK/Cofilin signaling pathway, and in the cytokinesis abnormalities observed after RASSF1A depletion. We determined that the kinase NDR2, a Hippo pathway member, could account for many of the effects observed after RASSF1A cell invalidation since possibly phosphorylating and inactivating GEFH1, involved in the various processes disrupted by the absence of RASSF1A. We also demonstrated that YAP but not TAZ, participates in the phenotype induced by RASSF1A loss of expression. We further reported that a high YAP tumor expression tends to predict a poorer survival in NSCLC patients receiving chemotherapy probably since YAP, in addition to inducing EMT in RASSF1A depleted cells, also increases the c-IAP2 gene expression, encoding for an apoptosis inhibitor. This work thus allowed us to identify in the interactome of RASSF1A/Hippo signaling pathway, a central actor involved in the oncogenic transformation of human bronchial epithelial cells lacking RASSF1A, namely NDR2 kinase, making this kinase, a potential therapeutic target

Les papillomavirus humains (HPV) constituent l’archétype des virus à ADN oncogènes. Les HPV muqueux à haut risque (principalement HPV16) sont les principaux agents étiologiques du cancer du col utérin. Les protéines virales E6 et E7 sont des acteurs cruciaux de la cancérogenèse induite par HPV. Nous avons construit une ressource composée de 600 ADNc codant les effecteurs humains du système ubiquitine-protéasome (UPS) et identifié de nouvelles cibles potentielles des protéines E6 et E7 en utilisant une méthode basée sur la complémentation protéique de la Gaussia princeps luciférase (GPCA). HPV16 E6 lie les motifs LxxLL présents dans E6AP et IRF3. Nous avons résolu la structure cristallographique des complexes E6/LxxLL de E6AP/p53 et E6/LxxLL de IRF3. Par ailleurs, nous avons montré que les HPV ciblent une nouvelle voie suppresseur de tumeurs, la voie Hippo, avec ses deux médiateurs clef YAP et TAZ. Nous avons généré une banque d’ADNc codant 265 domaines PDZ humains et identifié de nouveaux partenaires potentiels des protéines YAP/TAZ en utilisant la méthode GPCA. Les résultats obtenus permettent de mieux comprendre la biologie des HPV et leur pouvoir oncogène
The human papillomavirus (HPVs) are the archetype of DNA oncogenic viruses. High-risk mucosal HPVs (mainly HPV16) are the main causative agents of cervical cancer and are also involved in other cancers. HPV oncogenic properties are mainly due to the expression of E6 and E7 proteins. We built a resource composed of 600 cDNA encoding the human ubiquitin-proteasome system (UPS) effectors and identified novel E6 and E7 potential targets by using a method based on the complementation of the Gaussia princeps luciferase (GPCA). HPV16 E6 binds to specific LxxLL motifs present in E6AP and IRF3. We have solved the crystallographic structure of the E6/E6AP LxxLL/p53 and E6/IRF3 LxxLL complexes. Furthermore, HPV may target a novel tumour suppressor pathway, the Hippo signalling pathway with its two main mediators YAP and TAZ. We have built a cDNA library dedicated to the 265 human PDZ domains and identified news potential partners of YAP and TAZ proteins by using the GPCA. The results provide novel insights on HPV biology and their oncogenic property

Le mésothéliome pleural malin (MPM) est une tumeur primitive de la plèvre, rare, très agressive, avec un pronostic sombre. Nous avons souhaité au cours de ce travail de thèse, identifier de nouveaux biomarqueurs du MPM en testant l’influence de l’inactivation des membres de la famille RASSF/Hippo sur la survie des 448 patients inclus dans l’essai clinique MAPS (IFCT-GFPC-0701). Nous souhaitions également comprendre quelles fonctions et signalisations essentielles à l’homéostasie cellulaire, auxquelles participe la voie de signalisation RASSF/Hippo, sont perturbées lors du processus de transformation des cellules mésothéliales. L’inactivation des membres de la voie a été étudiée par PCR spécifique de méthylation (MS-PCR) et leur influence sur la survie des 448 patients inclus dans l’essai clinique MAPS testée en analyse uni- et multivariée avant d’être validée par boostrap. D’autre part, nous avons mimé in cell, l’inactivation par ARN interférence de plusieurs membres de la voie Hippo dans des cellules de lignées mésothéliales humaines (MSTO-211H, H2452, H28 et H2052). Nous avons pu identifier plusieurs biomarqueurs du MPM : i) la kinase MST1 dont l’inactivation est un facteur de mauvais pronostic, ii) l’amphiréguline dont l’expression cytoplasmique est au contraire un facteur de bon pronostic et enfin iii) le CD44 dont l’expression élevée constitue un outil diagnostique du MPM. Les approches in cell, nous ont permis de démontrer que les altérations de la voie RASSF/Hippo induisent une activité inappropriée de l’effecteur terminal YAP : le moins bon pronostic des patients présentant une inactivation de MST1 s’explique ainsi par le fait qu’en régulant l’activité de YAP, MST1 contrôle la balance apoptose/prolifération et prévient l’invasion et la croissance sans adhésion. En son absence, ces processus cellulaires sont dérégulés. Ce travail démontre l’importance de l’axe CD44/RASSF1A/MST1 dans le contrôle d’une activité appropriée de YAP et de l’homéostasie des cellules mésothéliales. La compréhension des désordres cellulaires induits par la dérégulation de le voie RASSF/Hippo, désigne YAP comme cible thérapeutique potentielle chez les patients atteints de MPM et présentant des altérations de cette voie de signalisation
Malignant pleural mesothelioma (MPM) is a rare, very aggressive, primary tumor with a poor prognosis. During this thesis, we wanted to identify new biomarkers of MPM by testing the influence of the RASSF/Hippo pathway inactivation on the survival of the 448 patients included in the clinical trial MAPS (IFCT- GFPC-0701). We also wanted to understand which functions and signals essential to cellular homeostasis, linked to RASSF/Hippo signaling pathway, are disturbed during the mesothelial cell transformation process. Inactivation of RASSF/Hippo members was studied by methylation-specific PCR (MS-PCR) and their influence on the survival of the 448 patients included in the MAPS clinical trial tested in uni- and multivariate analysis before being validated by bootstrap. We also mimed in cell, by RNA interference, several members of the Hippo pathway inactivation in human mesothelial cells lines (MSTO-211H, H2452, H28 and H2052). We have identified several biomarkers of MPM: i) MST1 kinase whose inactivation is a factor of poor prognosis, ii) amphiregulin whose cytoplasmic expression is on the contrary a factor of good prognosis and finally iii) CD44 whose high expression is a diagnostic tool for MPM. In cell we demonstrate that RASSF/Hippo pathway alterations induce an inappropriate activity of YAP, one Hippo end effector: the poorer prognosis of patients with inactivation of MST1 is thus explained by the fact that, by regulating YAP activity, MST1 controls the apoptosis/proliferation balance and prevents invasion and growth without adhesion from mesothelial cells. In its absence, these cellular processes are deregulated. This work finally demonstrates the importance of the CD44/RASSF1A/MST1 axis in controlling appropriate YAP activity and mesothelial cell homeostasis. The understanding of the cellular disorders induced by the of the RASSF/Hippo pathway deregulation designates YAP as a potential therapeutic target in patients with MPM and presenting alterations of this signaling pathway

Les protéines paralogues YAP et TAZ sont les effecteurs de la voie Hippo chez les Mammifères. Elles sont connues pour favoriser la prolifération cellulaire et décrites eni ^ant qu'oncogènes dans de nombreux cancers. Peu de choses sont connues sur le statut de la voie Hippo dans la pathologie du mélanome cutané. Nous avons donc entrepris une vaste analyse de l'expression des membres de la voie Hippo dans des lignées cellulaires de mélanomes et des tumeurs de patients, puis caractérisé la capacité de YAP et TAZ à contrôler le comportement de cellules de mélanome. Les immunomarquages de YAP et TAZ ont révélé une localisation cytoplasmique et nucléaire des deux protéines aussi bien dans le naevus bénin que dans les lésions mélanocytaires humaines. Les PCR quantitatives et les analyses protéiques ont permis l'identification d'expressions variables des kinases de la voie Hippo et de leurs effecteurs dans un panel de lignées cellulaires de mélanome humain, indiquant une signalisation Hippo fonctionnelle. De plus, la répression stable de TAZ dans quatre lignées cellulaires de mélanome, réduit considérablement leur croissance indépendante de l'ancrage, leur capacité à envahir le Matrigel et le derme de peaux reconstruites in vitro, ainsi que l'expression du gène cible de la voie Hippo : le CTGF. Celle de YAP mène à des effets similaires, mais en moindre mesure. Inversement, la surexpression de YAP augmente le pouvoir invasif des cellules de mélanome, la transcription dépendante des facteurs de transcription TEADs et donc l'expression du CTGF. Ainsi, ces résultats indiquent que les effecteurs YAP et TAZ exercent tous les deux des activités oncogéniques dans les cellules de mélanome
YAP and its paralog protein TAZ are downstream effectors of the Hippo pathway in mammals. Both are amplified in many human cancers and promote cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition. To date, little is known about the status of the Hippo pathway in cutaneous melanoma. Then, we undertook a broad analysis of Hippo pathway component expression in human melanoma cell lines and tumors, and! characterized the capacity of YAP and TAZ to control melanoma cell behavior. YAP and TAZ immunostaining revealed mixed cytoplasmic and nuclear staining for both proteins in benign nevi as well as in human melanoma samples. Variable expression of Hippo kinases LATS1/2 and MST1/2 and their effectors YAP1/2 and TAZ was found across a panel of human melanoma cell lines, irrespective of their BRAF mutation status. TAZ was the most predominantly expressed in ail cell lines. Western analysis revealed constitutive phosphorylation of LATS, MST, YAP and TAZ in several cell lines, indicating functional Hippo signaling. Stable knockdown of YAP or TAZ expression in four distinct |cell lines dramatically reduced the expression of CTGF, a classical Hippo target, as well |as anchorage-independent growth, and capacity to invade Matrigel and form lung! métastases in mice. YAP knockdown in 1205Lu cells also reduced invasion in a model of skin reconstruct. Inversely, YAP overexpression increased melanoma cell invasiveness, associated with increased TEAD-dependent transcription and CTGF expression. Together, these results indicate that both YAP and TAZ contribute to the invasive capacity in melanoma cells

Les maladies dégénératives de la rétine sont une des causes principales de cécité. Parmi différentes stratégies thérapeutiques actuellement étudiées, notre équipe s’intéresse au potentiel régénératif de la rétine. Une source cellulaire d'intérêt sont les cellules de Müller, principal type de cellules gliales de la rétine, capables de se réactiver en cas de dégénérescence et d’adopter certaines caractéristiques de cellules souches. Elles entrent alors dans un état appelé gliose réactive. Tandis que chez certaines espèces comme le poisson, elles permettent la régénération de la rétine, elles ont des capacités régénératives très limitées et inefficaces chez les mammifères. Une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires régissant la gliose réactive des cellules de Müller est donc essentielle si l’on veut identifier des cibles thérapeutiques capables de stimuler le potentiel de régénération de ces cellules. Dans ce contexte, le but de mon projet de thèse a été d’étudier le rôle du co-facteur de transcription YAP dans la réactivation des cellules de Müller. Cette protéine est l’effecteur de la voie de signalisation Hippo, connue pour son implication dans la régulation des cellules souches et la régénération de certains organes.Dans un premier temps, nous avons réalisé une analyse transcriptomique qui a montré que la voie Hippo/YAP est une des principales voies dérégulées dans un modèle de dégénérescence rétinienne chez la souris. Nous avons ensuite montré que la protéine YAP est spécifiquement exprimée dans les cellules de Müller et que son expression et son activité transcriptionnelle sont augmentées au cours de la dégénérescence lorsque les cellules de Müller deviennent réactives. Ces données suggèrent pour la première fois un lien entre YAP et la gliose réactive dans la rétine. Par conséquent, dans un second temps, mon projet de thèse a consisté en l’étude fonctionnelle de YAP dans les cellules de Müller. Dans ce but, nous avons généré par croisements chez la souris un modèle inductible de délétion du gène Yap spécifiquement dans ces cellules. Ce modèle a permis de montrer qu’en absence de Yap en conditions physiologiques, plusieurs gènes spécifiques des cellules de Müller sont dérégulés, suggérant un dysfonctionnement de ces cellules. L’étude phénotypique a permis de révéler que ces dérégulations moléculaires conduisent à un vieillissement prématuré des cellules de Müller et à une baisse de la vision chez les souris âgées. Ces données suggèrent que YAP est requis pour le fonctionnement normal des cellules gliales de Müller. Nous avons ensuite examiné l’impact de la perte de Yap dans les cellules de Müller en conditions de dégénérescence des photorécepteurs. Une analyse transcriptomique a permis de montrer que différents aspects de la réponse moléculaire des cellules de Müller réactives sont affectés. Parmi les processus biologiques dérégulés, nous nous sommes intéressés à la régulation de la prolifération cellulaire. Nous avons montré que YAP est nécessaire à l’augmentation de l’expression de gènes associés à la réentrée dans le cycle cellulaire de la glie de Müller. Par ailleurs, nos résultats suggèrent que des composants de la voie de signalisation EGFR, connue pour son rôle central dans la réactivation des cellules de Müller, sont régulés par YAP.Dans l’ensemble, ces résultats révèlent l’importance de YAP (i) dans le fonctionnement des cellules de Müller en conditions physiologiques pour maintenir l’homéostasie rétinienne, et (ii) dans la régulation des processus de réactivation de ces cellules en conditions dégénératives. De plus, ces données permettent de proposer un modèle selon lequel YAP serait impliqué dans le contrôle de la réentrée des cellules de Müller dans le cycle cellulaire via une interaction avec la voie de signalisation EGFR. Ce travail a donc contribué à approfondir nos connaissances du réseau de signalisation impliqué dans la réactivation des cellules de Müller de la rétine des mammifères
Retinal dystrophies are one of the main causes of blindness. Among the different therapeutic strategies currently studied, our team is interested in the regenerative potential of endogenous retinal cells. A cellular source of interest are Müller cells, which are the main type of glial cells in the retina. These cells are able to reactivate in case of retinal degeneration and adopt various characteristics of stem cells. They enter a state called reactive gliosis. While in some species such as the fish, they allow the complete regeneration of the retina, they have very limited and ineffective regenerative capacities in mammals. Increasing our knowledge of the complex molecular response of Müller cells to retinal degeneration is thus essential for the development of promising new therapeutic strategies. In this context, the aim of my thesis project was to study the role of the co-transcription factor YAP in Müller cells reactivation. This protein is the main effector of the Hippo signaling pathway which is a crucial player in the field of stem cell biology and regeneration.As a first step, we performed a transcriptomic analysis, which revealed that the Hippo/YAP pathway is one of the main signaling deregulated in a mouse model of photoreceptor degeneration. In particular, we found that YAP is specifically expressed in Müller cells and strongly upregulated upon retinal degeneration, when these cells are reactivated. We thus uncovered for the first time a link between the Hippo/YAP pathway and reactive gliosis in the retina. Consequently, the second part of my thesis project was to undertake a functional study of YAP in Müller cells. For this purpose, we generated, by crossing, a mouse model allowing for Yap conditional knockout specifically in these cells. This model allowed us to show that Yap deletion leads to deregulation of several Müller cell specific genes. A phenotypic analysis revealed that these molecular deregulations lead to premature aging of Müller cells and visual defects in old mice. These results suggest that YAP is required for normal function of Müller glial cells. We then studied the impact of Yap deletion in Müller cells under degenerative conditions. A transcriptomic analysis revealed that various aspects of the molecular response of reactive Müller cells are affected in the absence of Yap. Among the deregulated biological processes, we focussed in particular in the regulation of cell proliferation. We found that YAP is required to trigger cell cycle gene upregulation that occurs in Müller glial cells following photoreceptor cell death. Furthermore, our results suggest that some components of the EGFR signaling pathway, which is known for its central role in the reactivation of Müller cells in pathological conditions, are regulated by YAP in Müller cells.Taken together, these results highlight the importance of YAP (i) in Müller cell function under physiological conditions to maintain retinal homeostasis, and (ii) in the regulation of Müller cell reactivation process under degenerative conditions. Moreover, these data allow us to propose a model in which YAP would be involved in the control of Müller glia cell cycle re-entry through its interaction with the EGFR signaling pathway. Therefore, this work has contributed to increase our knowledge of the signaling network involved in the reactivation of Müller cells in the mammalian retina

Les ciliopathies sont un groupe de maladies génétiques multi-systémiques liées à un dysfonctionnement du cil primaire, une structure sensorielle présente à la surface des cellules qui régule des voies de signalisation clés au cours du développement et de l'homéostasie tissulaire. Afin d'identifier de nouveaux gènes responsables de ciliopathies développementales sévères, ~ 500 patients / fétus ont été analysés par une approche de séquençage à haut débit de l'exome ciblant > 1 200 gènes ciliaires ("ciliome"). Nous avons identifié huit nouvelles mutations dans le gène NEK8/NPHP9 chez cinq familles dont les syndromes se chevauchent. NEK8/NPHP9 code une protéine kinase de la famille des NIMA qui se localise au niveau du compartiment Inversine du cil primaire et agit comme un régulateur de la signalisation Hippo, une voie essentielle contrôlant la taille des organes. Nous montrons pour la première fois que les mutations du gène NEK8 sont associées à une agénésie rénale et une hypodysplasie. De plus, notre travail met en évidence une corrélation génotype/phénotype: les mutations "perte de fonction" de NEK8 conduisant à reins élargies et kystiques, des kystes pancréatiques et hépatique, alors que les mutations faux-sens de NEK8 causent une hypodysplasie/agénésie rénale associée à une cardiopathie et une paucité des canaux biliaires. La première partie de mon projet de thèse porte sur l'étude de l'impact des mutations faux-sens de NEK8 sur divers processus cellulaires et des voies de signalisation dépendantes de NEK8. Nous avons démontré un effet "gain de fonction" des mutations faux-sens de NEK8 puisqu'elles affectent la ciliogenèse et la composition du compartiment Inversine (localisation ciliaire de ANKS6). De plus, ces mutations altèrent la localisation nucléaire de YAP, le principal acteur de la voie Hippo, ainsi que l'expression des gènes cibles de YAP dans les fibroblastes de patients et dans la lignée cellulaire rénale (mIMCD3) invalidée pour NEK8. De même, nous avons montré une accumulation anormale de YAP nucléaire dans les reins polykystiques de la souris Jck, porteuse d'une mutation faux-sens de Nek8. Un déséquilibre de la voie Hippo serait donc à l'origine des défauts de morphogenèses épithéliales. En effet, les cellules mIMCD3 invalidées pour NEK8 forment en culture 3D des structures anormales et/ou des sphères élargies qui s'accompagnent d'une persistance du marquage nucléaire de YAP et Ki-67 et forment de grandes sphères par rapport aux cellules contrôles. Des défauts plus sévères ont été observés pour les cellules ré-exprimant les différents mutants de NEK8, confirmant la pathogénicité de ces mutations et leur effet "gain de fonction". Enfin, le traitement par la Vertéporfine, un inhibiteur spécifique de l'activité transcriptionnelle de YAP, améliore non seulement le phénotype des fibroblastes de patients et des cellules rénales invalidées pour NEK8 en culture 3D, mais également in vivo les anomalies observées chez les embryons de poisson zèbre dues à la surexpression de la forme NEK8 humaine, confirmant ainsi l'implication d'une dérégulation de YAP dans les mécanismes physiopathologiques. Par ailleurs, nous avons observé que les mutants de NEK8 s'accumulent de manière anormale au niveau de l'appareil de Golgi dans les fibroblastes de patients, et que cet appareil de Golgi apparait dispersé. Nos résultats montrent que le recrutement de NEK8 au Golgi est sensible à la Brefeldine A et dépendrait donc de ARF1, une petite GTPase impliquée dans le trafic de protéines entre les compartiments du Golgi et du réticulum endoplasmique. Nous avons démontré que NEK8 interagit et co-localise préférentiellement avec la forme d'ARF1 liée au GDP, suggérant pour NEK8 une possible fonction de facteur d'échange d'ARF1 à des sites spécifiques (appareil de Golgi, membranes, cil) afin de promouvoir le trafic vésiculaire de protéines telles que les protéine ciliaires. (...)
Ciliopathies are a group of genetic multi-systemic disorders related to dysfunction of the primary cilium, a sensory organelle present at the cell surface that regulates key signaling pathways during development and tissue homeostasis. In order to identify novel genes whose mutations would cause severe developmental ciliopathies, ~500 patients/fetuses were analyzed by a targeted high throughput sequencing approach allowing exome sequencing of > 1200 ciliary genes. We have identified eight novel mutations in NEK8/NPHP9 in five independent families with severe overlapping syndromic disorders. NEK8/NPHP9 encodes a NIMA-related kinase that localizes at the inversin compartment of the primary cilium and acts as a regulator of Hippo signaling, a pathway that is essential for control of organ size during development. We show for the first time that NEK8 mutations are associated with renal agenesis and hypodysplasia, and our work highlights a genotype/phenotype correlation with NEK8 loss-of-function mutations leading to enlarged cystic kidney, pancreas and liver, whereas NEK8 gain-of-function (missense) mutations cause renal hypodysplasia, cardiopathy and paucity of bile ducts. The first part of my thesis project focuses on the study of the impact of these NEK8 missense mutations on various cellular processes and NEK8-dependent signaling pathways. We demonstrate that NEK8 missense mutations impair the Inversin (INVS) compartment composition and ciliogenesis, and also alter the nuclear localization of the main Hippo signalling effector, YAP, as well as expression of its target genes in patient fibroblasts and renal cell lines. We also demonstrated that this Hippo pathway imbalance causes epithelial morphogenesis defects in 3D matrigel culture. Indeed, mIMCD3 cells depleted for NEK8 showed persistent YAP and Ki-67 staining and formed bigger spheres compared to control cells. Abnormal sphere volume was also observed in cells re-expressing NEK8-GFP mutations, suggesting their pathogenicity. We confirm these data in vivo in Jck mice, a model of polycystic kidney disease bearing a Nek8 missense mutation. Finally, treatment with Verteporfin, a specific inhibitor of YAP transcriptional activity, improves the mutant phenotype of both cellular models and zebrafish embryos overexpressing human NEK8, further supporting the involvement of YAP dysregulation in the pathogenic cellular mechanisms. Surprisingly, in patient fibroblasts, we showed that mutated NEK8 accumulates at the Golgi that appeared dispersed. NEK8 recruitment at the Golgi apparatus is dependent on ARF1 (Brefeldin A sensitive), a small GTPase involved in protein trafficking between Golgi compartments and ER. We notably demonstrated that NEK8 mostly interacts and localizes with the dominant negative form of ARF1 (T31N), suggesting that NEK8 could act as an activator (GEF) of ARF1 to promote vesicular trafficking of ciliary proteins. The second part of my project focuses on a new candidate gene for which a missense homozygous mutation has been identified in 3 individuals presenting a late onset NPH with hepatic fibrosis. This gene encodes ANKS3, an evolutionarily conserved protein whose function is still poorly characterized. Interestingly, ANKS3 has been reported to be a partner of NEK8, even though we showed it does not localize at the INVS compartment with NEK8 but is rather present at the base of cilia in fibroblasts. We showed that the missense mutation does not affect ANKS3 localization but leads to longer cilia and abnormal accumulation of NEK8 at the cilium base in patient fibroblasts and kidney tubules. Altogether, my work focused on NEK8 and its partners, ANKS6 and ANKS3, each of whose related gene is mutated in patients presenting a broad clinical spectrum of phenotypes. (...)

Une cellule souche est capable de s’auto-renouveler et de générer des cellules différenciées après division cellulaire. La duplication complète de son génome doit être exempte d'erreurs afin d'éviter la propagation aux cellules filles de mutations délétères. Chez les eucaryotes, il a été montré que des segments d’ADN sur les chromosomes se répliquent de manière coordonnée et à des moments définis pendant la phase de synthèse, un processus appelé programme spatio-temporel de réplication de l'ADN (RT). Des changements majeurs dans le RT sont corrélés avec les changements de détermination des cellules souches et associés à l'organisation et à l’expressivité du génome. Malgré ce rôle central, les mécanismes qui sous-tendent le contrôle du RT restent méconnus. Mon laboratoire a mis en évidence que YAP, l'effecteur en aval de la voie de signalisation Hippo impliquée dans la croissance cellulaire, régule la vitesse et la chorégraphie de la réplication de l’ADN des cellules souches rétiniennes chez l’amphibien xénope. Ces données révèlent YAP comme un nouvel acteur moléculaire dans le contrôle du RT. Pour tester l’implication directe de YAP dans la dynamique de réplication de l’ADN, nous avons tiré profit du système in vitro d’extraits d'œufs de xénope dans lequel toutes les étapes du processus sont reproduites de manière synchrone. Nous montrons que YAP est recruté à la chromatine pendant la réplication et que ce processus se produit seulement après la phase d’initiation des origines de réplication. Des extraits déplétés de la protéine YAP présentent une accélération de la vitesse de réplication et une augmentation du nombre de sites d’activation de la synthèse de l’ADN. Par ailleurs, nous avons identifié RIF1 (Rap1-Interacting Factor 1 ou Replication Timing Regulatory Factor 1), un des rares régulateurs connus du RT, comme un nouveau partenaire de YAP. Comme pour YAP, la perte de fonction de RIF1 dans les embryons de xénope conduit à un phénotype de petit œil et à la dérégulation du RT dans les cellules souches rétiniennes.Dans l'ensemble, nos résultats montrent l’implication de YAP dans le contrôle de la dynamique de réplication de l’ADN et révèlent RIF1 comme un nouveau partenaire dans ce processus. Ce travail ouvre de nouvelles perspectives d’étude quant à l’importance biologique de cette interaction YAP-RIF1 dans le contrôle du RT et sa pertinence comme cible pour influencer le devenir des cellules souches
Stemness could be defined as a state in which a cell is able to self-renew and/or to differentiate after cell division. Before this happens, exhaustive duplication of the genome free of errors must occur in order to avoid deleterious mutations, a hallmark of cancer. Thus, DNA replication is particularly important to stem cells because of their continuous division capacities. Regarding DNA replication in eukaryotes, it was discovered that segments of chromosomes close in space, replicate in a coordinated manner during S phase, a process called replication timing. Moreover, major changes in replication timing correlate with cell differentiation, 3D chromatin architecture and transcription. However, the molecules that govern its regulation are poorly understood. Previously, my laboratory found that YAP, the downstream effector of the Hippo pathway, regulates S phase progression of retinal stem cells in Xenopus laevis. To test YAP function in the direct control of replication timing, we took advantage of the powerful in vitro DNA replication system of X. laevis egg extracts. Briefly, we discovered that YAP is recruited to replicating chromatin dependently of origin licensing. In addition, YAP depleted extracts showed increased DNA synthesis and origin activation; revealing that YAP normal function is to slow-down replication by limiting origin firing. Interestingly, we found Rif1, a major regulator of replication timing, as a novel partner of YAP. In vivo, Rif1 expression overlaps that of Yap within the stem cell compartment of the Xenopus retina. Knockdown of Rif1 leaded to a small-eye phenotype and alterations in replication foci of retinal stem cells, resembling the effect observed in YAP deficient cells. Finally, early-embryonic depletion of both molecules resulted in a strikingly acceleration of cell division.Altogether, our findings unveil YAP implication in the regulation of replication dynamis and show Rif1 as a novel partner. Further investigation to analyze this interaction would help us to understand the biological relevance in the control of replication timing and whether it could be used as a target in regenerative medicine

Au cours du développement, le comportement des cellules est étroitement régulé, ce qui assure un fonctionnement optimal des tissus épithéliaux sains. Les cellules épithéliales établissent ainsi des jonctions intercellulaires bien organisées, une polarité apico/basale, une architecture de la cytosquelette et intègrent des entrées régulatrices et homéostatiques relayées par des voies de signalisation dédiées. Les altérations de ces processus sont le plus souvent associées au cancer.Mon laboratoire s'intéresse au décryptage des mécanismes par lesquels les altérations de jonctions et de polarité sont capables d'induire une tumorigenèse. Les protéines d'échafaudage représentent des régulateurs importants de ces différents processus, et les altérations de plusieurs échafaudages épithéliaux clés ont été liées au cancer. Des travaux récents de l'équipe ont identifié Magi, un membre de la famille MAGUK, comme un régulateur des jonctions adhérentes à base d'E-Caherin pendant le développement de l'œil chez la drosophile. Le but principal de ma thèse était d'étudier la fonction de MAGI1, le membre le plus abondant de la famille MAGI dans les tissus humains, pendant le cancer, et plus spécifiquement ses rôles dans les cellules luminales A du cancer du sein. En utilisant principalement des approches de perte de fonction, nous avons pu identifier une fonction de suppression de tumeur de MAGI1 dans les cellules BCa luminales, aussi bien par des essais cellulaires in vitro que sur des souris nudes xénogreffées. De plus, ces travaux ont révélé que MAGI1 inhibe un axe de signalisation AMOTL2/P38 qui est activé lors de la perte de MAGI1 et qui est ensuite responsable du phénotype de tumorigénicité accrue obtenu. Il est intéressant de noter que la perte de MAGI1 a induit une augmentation de l'activité de la myosine, des comportements de compression amplifiés et une tension élevée de la membrane plasmique associée, que nous proposons d'être l'un des activateurs de P38 en aval de la perte de MAGI1. Il est frappant de constater que, même si les cellules dépourvues de MAGI1 présentent une tumorigénicité élevée, l'activité de l'onco-protéine YAP est réduite dans les cellules du cancer du sein luminal dépourvues de MAGI1, ce qui suggère que la relation entre YAP et la tumorigénèse pourrait être plus complexe qu'on ne le pense généralement.L'étude de la régulation de la voie d'Hippo est en effet un axe majeur de l'équipe. Un objectif secondaire de ma thèse était donc d'explorer l'implication de YAP/TAZ et de la voie Hippo lors de l'exposition à l'oxaliplatine dans les cellules cancéreuses du côlon. En tant que chimiothérapie de première ligne avec le 5 Fluorouracil, il est important de comprendre le mécanisme d'action de l'Oxaliplatine au-delà de son rôle majeur d'inducteur de cassures délétères des doubles brins d'ADN. Les cellules cancéreuses du côlon HCT116 traitées avec des doses relativement modestes d'oxaliplatine (à la IC50) ont présenté une translocation de YAP/TAZ vers le noyau accompagnée d'une augmentation de la transcription médiée par YAP/TAZ, comme en témoignent la RTqPCR et l'ARN-Seq. Cet effet a été couplé à une réorganisation du cytosquelette d'actine à l'intérieur de la cellule lors du traitement, et de nombreux gènes affectés par le traitement à l'oxaliplatine étaient des régulateurs d'actine (dont plusieurs qui sont également des cibles potentielles de YAP/TAZ). Cette étude implique YAP/TAZ dans la réponse HCT116 au traitement à l'oxaliplatine, et nous proposons qu'elle conduise à une réorganisation de l'actine
During development, the behaviour of cells is tightly regulated ensuring optimal functioning of healthy epithelial tissues. Epithelial cells thus establish well organized intercellular junctions, apico/basal polarity, cytoskeletal architecture, and integrate regulatory and homeostatic inputs relayed by dedicated signalling pathways. Alterations in these processes are most often associated with cancer.My lab is interested in deciphering the mechanisms in which junctional and polarity alterations are able to induce tumorigenesis. Scaffold proteins represent important regulators of these different processes, and alterations to several key epithelial scaffolds have been linked to cancer. Recent work in the team identified Magi, a member of the MAGUK family, as a regulator of E-Caherin-based Adherens Junctions during eye development in Drosophila. The main goal of my thesis was to study the function of MAGI1, the most abundant MAGI family member in human tissues, during cancer, and more specifically its roles in luminal A Breast Cancer cells. Using mainly loss-of-function approaches, we were able to identify a tumour suppressive function of MAGI1 in luminal BCa cells both in vitro cellular assays as well as in xenografted nude mice. Moreover, this work revealed that MAGI1 inhibits an AMOTL2/P38 signalling axis that is activated upon MAGI1 loss and then responsible for the enhanced tumorigenicity phenotype obtained. Interestingly, the loss of MAGI1 induced increased myosin activity, increased compressive behaviours, and associated elevated plasma membrane tension, which we propose to be one of the activator of P38 downstream of MAGI1 loss. Strikingly, even though cells lacking MAGI1 showed increased tumorigenicity, the activity of the YAP onco-protein is lowered in MAGI1-deficient luminal breast cancer cells, suggesting that the relationship between YAP and tumorigenesis could be more complex than commonly assumed.The study of Hippo pathway regulations is indeed a major axis of the team. A secondary objective of my thesis was thus to explore the involvement of YAP/TAZ and of the Hippo pathway during Oxaliplatin exposure in colon cancer cells. As first line chemotherapy along with 5 Fluorouracil, it is important to understand the mechanism of action of Oxaliplatin beyond its major role as inducer of deleterious DNA double strand breaks. HCT116 colon cancer cells treated with relatively modest doses of Oxaliplatin (at IC50), featured a translocation of YAP/TAZ to the nucleus accompanied with increased YAP/TAZ-mediated transcription, as judged by qPCR and RNA-Seq. This effect was coupled with a re-organization of the actin cytoskeleton inside the cell upon the treatment, and many genes affected by oxaliplatin treatment were actin regulators (including several that are also potential YAP/TAZ targets). This study involves YAP/TAZ in HCT116 response to Oxaliplatin treatment, and we propose that it leads to actin re-organization

Les schwannomes sont des tumeurs bénignes se développant à partir d’une hyper-prolifération des cellules de Schwann suite à l’inactivation bi-allélique du gène NF2. Signe pathogonomique d’une pathologie rare et héréditaire, la Neurofibromatose de type 2 (NF2), ils peuvent aussi apparaître de façon sporadique. Hormis la chirurgie ou la radiothérapie, peu d’options pharmacologiques sont proposées aux patients porteurs de schwannomes, principalement à cause du peu de cibles thérapeutiques identifiées. Dans les cellules de Schwann, le phénotype cellulaire associé à la perte NF2 est une perte d’inhibition de la prolifération par le contact. Deux fonctions majeures de Merlin, produit de NF2, ont émergé au cours de ces dix dernières années. La première, démontrée par notre groupe, concerne la régulation de l’expression membranaire des récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK) qui s’accumulent à la membrane plasmique des schwannomes humains. Le second implique Merlin dans la régulation de la voie de signalisation Hippo. Cette dernière, activée par le contact cellulaire réprime l’activité de deux co-facteurs de transcription, Yap et Taz, et régule ainsi et aussi l’inhibition de contact. Les mécanismes moléculaires par lesquels Merlin inhibe l’activité de Yap/Taz sont toutefois méconnus. Le but de nos études a été de déterminer une signature moléculaire associée à la croissance des schwannomes humains et l’importance relative de Yap/Taz. Dans une analyse protéomique à grande échelle sur des biopsies humaines, nous avons identifié à la fois l’activation spécifique de cinq RTKs que sont le PDGFRβ, Her2, Her3, Axl et Tie2 ainsi qu’une accumulation nucléaire spécifique de Yap. Nous montrons que sur la totalité des protéines étudiées, seules Yap, le PDGFRβ et P-Her3 corrèlent avec la prolifération des cellules de schwannomes humain. De plus, Yap induit la transcription des RTK activés (à l’exception de Tie2). Nous plaçons donc Yap au centre des mécanismes de régulation de la croissance des schwannomes humains et proposons que son inhibition pourrait représenter une nouvelle et prometteuse stratégie thérapeutique pour réduire la croissance de ces tumeurs. Nous apportons une nouvelle lecture des fonctions de Merlin, qui, par une potentielle interaction directe avec Yap, inhibe spécifiquement sa translocation dans le noyau indépendamment d’une régulation par la densité cellulaire ou par la voie Hippo. Par ailleurs, Merlin ne semble pas essentiel à l’activation de la voie Hippo dans les cellules de Schwann soulignant une fonction nouvelle et inattendue de Merlin dans la régulation de Yap et de la voie Hippo. Enfin nous avons étudié le rôle d’AmotL1, un puissant partenaire de Merlin et membre de la voie Hippo, dans la migration et la progression des cancers du sein. Nous mettons en évidence une fonction antagoniste de Merlin et AmotL1 dans la promotion de ces mécanismes soulignant une autre fonction nouvelle de Merlin en tant que suppresseur de la progression de cancers non associés à NF2
Schwannomas are benign tumors arising from Schwann cell hyper-proliferation under NF2 bi-allelic inactivation. They appear in the context of a rare hereditary disease called Neurofibromatosis type 2 (NF2) or in sporadic cases. To this day, surgery and radiotherapy remain the only options to treat these patients, mainly due to the lack of therapeutical targets identified. The NF2 loss associated cellular phenotype is the loss of cell contact inhibition. Two main functions of Merlin, the NF2 product, have emerged in the last decade. The first was shown by our group and consists in the accumulation of tyrosine kinase receptors (RTK) at the plasma membrane in schwannomas. The second involves Merlin in the regulation of the Hippo signaling pathway. This pathway is activated by cell contact and inactivates a couple of transcription co-factors, Yap and Taz, then participating in cell contact inhibition of proliferation. However, the mechanisms by which Merlin inactivates Yap and Taz remain unknown. In our studies, we aimed to determine both the molecular signature of human schwannomas taking advantage of a large proteomic study, and the relative importance of Yap in the tumor suppressor function of Merlin. We could show both a specific activation of five RTKs : PDGFRβ, Her 3, Her2, Axl and Tie2 and a specific nuclear accumulation of Yap in human schwannoma. Among all the protein studied, Yap, PDGFRβ and P-Her3 are the only ones to correlate with the proliferation of human schwannoma cells. Furthermore, the activated RTK (excepted Tie2) are transcriptional targets of Yap. Hence, we found Yap as a pivotal regulator of schwannoma growth and proposed its inhibition as a new and promising therapeutical target to reduce human schwannoma growth. In addition, we show that Merlin specifically inhibits Yap nuclear translocation into the nucleus of Schwann cells by a direct interaction which is independent from the regulation by cell density and by the Hippo pathway. Moreover, Merlin expression seems not to be essential for Hippo activation in Schwann cells which brings a new and unexpected role of Merlin in Yap and Hippo regulation. In the end, we studied the role of AmotL1, a strong Hippo partner of Merlin in the migration and progression of breast cancer. We could show an antagonist function of Merlin and AmotL1 in the promotion of these mechanisms highlighting a new progression suppressor function of Merlin in cancer which are not linked to NF2 mutations

Comment la taille d'un organisme est-elle régulée au cours du développement embryonnaire ? Quels sont les mécanismes génétiques à l'origine de l'arrêt de la prolifération pendant la croissance d'un organisme pluricellulaire ? Afin d'identifier des acteurs de la sortie du cycle cellulaire au cours du développement, mon travail s'est orienté sur l'étude de gènes suppresseurs de tumeurs pendant la croissance du toit optique (TO) du médaka Oryzias latipes. Le TO, structure dorsale du cerveau moyen des Vertébrés, est un modèle particulièrement adapté à l'étude de la régulation de la prolifération. Trois zones de la marge vers le centre du TO sont discernables : une zone périphérique de prolifération, une zone intermédiaire de cellules sortant du cycle cellulaire et une zone centrale de cellules différenciées. Un crible d'expression par hybridation In Situ a été réalisé et a permis d'identifier 28 gènes exprimés dans le TO, suggérant leur implication dans le contrôle de la sortie du cycle cellulaire au cours du développement. Dans le but de caractériser in vivo la fonction de gènes issus de ce crible, le gène BTG1 (B-cell Translocation Gene 1) et les membres de sa famille, ont été étudiés au cours du développement du médaka. J'ai mené des expériences fonctionnelles sur BTG1, permettant de mettre en évidence son rôle central pour la morphogenèse du système nerveux central. De plus, une autre partie de mon travail s'est penchée sur l'étude de l'expression des membres de la voie de signalisation Hippo, bien connue et caractérisée chez la drosophile et les Mammifères pour son rôle dans le contrôle de la taille des organes via une régulation de l'arrêt de la prolifération. A l'issu de notre travail, une fonction de la voie de signalisation Hippo dans la formation du TO et des somites a pu être mise en évidence au cours du développement du médaka.

Les maladies dégénératives de la rétine sont une des causes principales de cécité. Parmi les différentes stratégies thérapeutiques actuellement étudiées, notre équipe s’intéresse au potentiel régénératif de la rétine. Une source cellulaire d'intérêt sont les cellules de Müller, principal type de cellules gliales de la rétine capables de se réactiver en cas de dégénérescence, un processus appelé gliose réactive, et dans certaines espèces d’adopter des caractéristiques de cellules souches. Si un tel processus confère la capacité de régénérer la rétine chez les téléostéens, il est cependant largement inefficace chez les mammifères. Avoir une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires sous-jacents pourrait aider à transformer leur potentiel de régénération en nouvelles stratégies thérapeutiques en condition pathologique de dégénérescence rétinienne. Dans ce contexte, mon laboratoire s'est focalisé sur l'effecteur terminal de la voie Hippo, le cofacteur de transcription YAP, dont il a été démontré qu'il stimule la régénération de plusieurs organes en cas de lésion. Dans la rétine, YAP est spécifiquement exprimé dans les cellules de Müller et son niveau d’expression augmente en cas de lésion. Cependant, sa fonction dans l'homéostasie rétinienne, et en particulier son rôle dans la régénération rétinienne, sont encore inconnus. La première partie de ma thèse visait donc à décrypter la fonction de YAP dans les cellules de Müller de souris dans des conditions physiologiques et pathologiques. Nous avons révélé que YAP joue un rôle central dans l'homéostasie des cellules de Müller et en tant que tel, est un acteur clé de la survie des cônes au cours du vieillissement. En cas de lésion rétinienne, nous avons montré que YAP est essentiel pour la réactivation des gènes du cycle cellulaire qui accompagne normalement la gliose réactive. Dans ce contexte, nous avons également trouvé une interaction fonctionnelle entre YAP et la voie de signalisation EGFR, suggérant une fonction de YAP en tant qu’intégrateur des réseaux de signalisation mis en jeu dans le contexte régénératif. J'ai également constaté que la suractivation de YAP est suffisante pour induire la reprogrammation des cellules de Müller de souris en cellules hautement prolifératives […]. Dans l'ensemble, ce travail met en évidence le rôle critique de YAP dans la sortie de quiescence des cellules de Müller chez les mammifères et révèle ainsi une cible potentielle pour la médecine régénérative. La deuxième partie de mon projet de doctorat naît des découvertes émergentes mettant en évidence les voies inflammatoires comme régulateurs du processus de régénération. […] De plus, des découvertes récentes sur le rôle de YAP dans la régulation du processus inflammatoire m’ont conduit à faire l'hypothèse qu'il pourrait jouer un rôle dans la relation entre l'inflammation et la régénération rétinienne. J'ai donc cherché à étudier le rôle joué par l'inflammation sur le comportement des cellules de Müller de souris, et à comprendre comment YAP s'inscrit dans cette interaction. J'ai découvert de manière inattendue qu'un contexte pro-inflammatoire établi par les cellules microgliales stimule la prolifération des cellules de Müller de souris dans des explants rétiniens. De plus, mes résultats ont montré que cet effet mitogène se produit de manière dépendante de YAP. Par ailleurs, j'ai découvert que l'effet de la surexpression de YAP sur la prolifération des cellules de Müller peut être potentialisé par un environnement pro-inflammatoire et aboli en cas d’ablation des microglies. Enfin, nous avons constaté que, à son tour, YAP régule des cytokines inflammatoires clés. Dans l'ensemble, cette partie de mon projet permet non seulement d’approfondir nos connaissances concernant l'impact de l'inflammation sur le comportement des cellules de Müller de la souris, mais met également en évidence YAP en tant qu'acteur clé dans la connexion entre l'inflammation et la régénération rétinienne
Degenerative diseases of the retina are one of the main causes of blindness. Among the various therapeutic strategies currently being studied, our team is focusing on the regenerative potential of the retina. One cellular source of interest are Müller cells, the main type of glial cells in the retina capable of reactivating in case of degeneration, a process called reactive gliosis, and in some species adopting certain characteristics of stem cells. If such a process sustains powerful regeneration abilities in teleosts, it is however largely inefficient in mammals. Hence, increasing our knowledge of the molecular mechanisms underlying the behaviour of these cells under pathological conditions may help turning their regenerative properties into new therapeutic strategies. In this context, my laboratory focused on the terminal effector of the Hippo pathway, the co-transcriptional factor YAP, which has been shown to stimulate regeneration of several injured organs. In the retina, YAP is specifically expressed in Müller cells and upregulated in case of damage. However, its function in retinal homeostasis, and its role in retinal regeneration remained unknown.The first part of my PhD aimed at deciphering YAP function in mouse Müller cells in both physiological and pathological conditions. In essence, we revealed a central role of YAP in Müller cell-dependent retinal homeostasis and as such, as a key player for cone survival during aging. In case of retinal damage, we showed that YAP upregulation is critical for cell-cycle gene reactivation that normally accompanies reactive gliosis. In this context, we also found a functional interaction between YAP and the EGFR signaling pathway, supporting a function of YAP as a hub within the complex signaling network of key regenerative signaling pathways. I also found that YAP overactivation is sufficient to induce mouse Müller cell reprogramming into highly proliferative cells, mimicking a fish or amphibian condition, when Müller cells spontaneously proliferate upon injury. As a whole, this work highlights the critical role of YAP in driving mammalian Müller cells to exit quiescence and thus reveals a potential target for regenerative medicine.The second part of my PhD project stemmed from the emerging discoveries highlighting inflammatory pathways as regulators of the regenerative process. Although inflammation is considered to hamper retinal regeneration in mammals, there are no studies regarding the influence of inflammation on mouse Müller cell-dependent regenerative process. In addition, recent discoveries on the role of YAP in the regulation of the inflammatory process lead to the hypothesis that it could play a role in the relationship between inflammation and retinal regeneration. I thus aimed at investigating the role played by the injury-induced inflammation on mouse Müller cell behavior and how YAP fits in this interplay. I unexpectedly discovered that a microglial-dependent pro-inflammatory context stimulates mouse Müller cell proliferation in retinal explants. Importantly, my results showed that this mitogenic effect occurs in a YAP-dependent manner. Moreover, I uncovered that the effect of YAP overexpression on Müller cell proliferation can be potentiated by a pro-inflammatory environment, and abolished upon microglia depletion. Finally, we found that, in turn, YAP regulates key inflammatory cytokines. Altogether, this part of my project not only deepen our knowledge regarding the impact of inflammation on mouse Müller cell behavior, it also highlights YAP as a key player in the crosstalk between inflammation and retinal regeneration

Les petites GTPases RAS alternent entre une forme inactive liée au GDP et une forme active liée au GTP. Ce mécanisme permet aux protéines RAS de transmettre les signaux des récepteurs se trouvant à la surface cellulaire vers divers réseaux de signalisation en aval. La protéine RAS joue un rôle important dans plusieurs fonctions biologiques, notamment la prolifération cellulaire, la survie cellulaire et même l'apoptose. Les mutations des gènes de la famille RAS sont retrouvées dans environ un tiers des tumeurs. HRAS, KRAS et NRAS, les trois principaux homologues de la protéine RAS, sont principalement mutées au niveau des codons 12, 13 ou 61. Les mutations avec un effet de gain de fonction au niveau de ces codons rendent ces protéines RAS constitutivement actives et sont à l’origine des signaux hyperprolifératifs. Depuis la découverte de la protéine RAS, de nombreuses "protéines effectrices RAS" agissant en aval ont été identifiées. Le rôle biologique de la plupart de ces effecteurs RAS est lié à la prolifération et à la survie des cellules. Cependant, au cours des deux dernières décennies une nouvelle famille d'effecteurs RAS, les protéines RASSF, a été découverte comme ayant une fonction pro-apoptotique. Les protéines suppresseures de tumeurs de la famille RASSF sont fréquemment inhibées dans les cellules cancéreuses humaines. Il existe 10 homologues de RASSF (RASSF1-10) chez humain, chacun comprenant un domaine d'association RAS (RA) impliqué dans la liaison avec les GTPases RAS. Plusieurs RASSF comportent également les domaines SARAH (Salvador-RASSF-Hippo), connus pour interagir avec les kinases Hippo contenant aussi les domaines SARAH. On ne sait toutefois pas si toutes les protéines RASSF sont de véritables effecteurs RAS. Il a été démontré qu'un seul membre de la famille RASSF, appelé RASSF5, s'associe directement à HRAS et cette interaction a été validée par des études cristallographiques à rayons X. Dans la première partie de cette thèse, je démontre qu'aucun autre membre de la famille RASSF n'interagit directement avec KRAS. En me servant de la modélisation par l'homologie du domaine RA hautement apparenté de RASSF1, j’ai identifié les acides aminés essentiels pour l’interaction avec la GTPase. Je démontre que la substitution d’un seul acide aminé dans la protéine RASSF1 permet l'interaction avec KRAS, et je pose l'hypothèse que ce résidu, ayant divergé au cours de l'évolution, a modifié la spécificité de RASSF1 pour les petites GTPases. En utilisant une approche informatique, nous avons prédit six GTPases candidates que pourraient interagir avec RASSF1 : GEM, REM1, REM2, RASL12, ERAS et DIRAS3. J'ai validé les interactions avec plusieurs GTPases RGK (GEM, REM1, REM2) et j’ai démontré que la co-expression des GTPases RGK avec RASSF1 active la voie Hippo. Ainsi, je propose un nouveau lien entre ces GTPases peu étudiées et la régulation de la voie de signalisation Hippo. Dans la deuxième partie de ma thèse, je tente de rediriger la signalisation de prolifération cellulaire de KRAS (RAF/MAPK) vers une signalisation impliquant les effecteurs pro-apoptotiques (RASSF-Hippo). Pour y parvenir, j'ai conçu des mutations dans KRAS dans le but d’augmenter son affinité pour RASSF5 et d’affaiblir son interaction avec BRAF. Comme deuxième stratégie, j'ai remplacé les résidus divergents de l'effecteur RASSF1 par les résidus correspondants de RASSF5 et j’ai démontré que cette variante de RASSF1 est capable de lier KRAS. Diverses approches biophysiques et biochimiques ont été utilisées pour valider KRAS et RASSF1 mutés, impliquées dans cette signalisation redirigée. Les études de co-localisation montrent que ces mutants interagissent avec leurs nouveaux partenaires comme prévu. D’autre part, je démontre par les expériences intracellulaires que KRAS modifiée ne lie plus BRAF tout en interagissant fortement avec RASSF5 et RASSF1, et que les mutants établis activent la voie Hippo. Ainsi, j'ai développé deux approches qui nous aideront à étudier la signalisation de KRAS dans la voie pro-apoptotique impliquant RASSF en absence de l’activation de la voie des MAP kinases. Les données présentées ici nous permettent de mieux comprendre la manière dont les protéines RASSF ont divergé au cours de l'évolution; cette divergence leur empêchant d’interagir avec les RAS. Ces données fournissent également une stratégie innovante pour rediriger les signaux RAS vers les effecteurs RASSF, qui pourrait être utilisée comme nouvelle stratégie dans les études cliniques utilisant RAS comme cible thérapeutique.
RAS small GTPases function as molecular switches to transduce signals from cell surface receptors to various downstream signalling networks. The RAS protein has roles in multiple biological functions, including cell proliferation, survival, and even apoptosis. Mutations in RAS genes are present in up to 30% of all human tumors. The three major RAS homologs HRAS, KRAS, and NRAS are each found mutated, predominantly at codons 12, 13 or 61. Gain-of-function mutations at these codons render these RAS proteins constitutively active and thereby produce hyperproliferative signals. Since the discovery of RAS, numerous downstream ‘RAS effector proteins’ have been identified. The biological role of most identified RAS effectors relates to cell proliferation and survival, however, in the past two decades a new family of RAS effectors, RASSF proteins, were discovered to have a pro-apoptotic function. The RASSF family of tumor suppressors proteins are frequently downregulated in human cancer cells. There are 10 RASSF homologs (RASSF1-10) in humans, each comprising a RAS association (RA) domain presumed to bind RAS GTPases. RASSF also encode SARAH (Salvador-RASSF-Hippo) domain, known to interact with SARAH-containing Hippo kinases. It is not clear whether all the RASSF proteins are true RAS effectors. Only a single family member, RASSF5, has been shown to directly associate with HRAS and this interaction has been completely validated by X-Ray crystallographic studies. In the first part of this thesis, I demonstrate that no other RASSF family members directly interact with KRAS. I used homology modelling of the highly related RASSF1 RA domain to identify amino acids crucial to GTPase binding. I show that a single amino acid substitution in RASSF1 enables interaction with KRAS, and hypothesize that this evolutionarily diverged residue has altered RASSF1 specificity for small GTPases. Using an informatics approach, we predicted six candidate GTPases that could interact with RASSF1: GEM, REM1, REM2, RASL12, ERAS and DIRAS3. I validated interactions with several RGK GTPases (GEM, REM1, REM2) and show that co-expression of RGK GTPases with RASSF1 activates the Hippo pathway. Thus, I show a novel link between these unstudied GTPases to Hippo pathway regulation. In the second part of my thesis I attempt to rewire KRAS signalling from cell proliferation pathways (RAF/MAPK) to pro-apoptotic effectors (RASSF-Hippo). To achieve this, I designed mutations in KRAS that augmented its affinity for RASSF5 and weakened interaction with BRAF. As a second strategy, I reverted evolutionarily diverged residues in the RASSF1 effector to corresponding residues in RASSF5 and demonstrate that this variant now binds KRAS. Various biophysical and biochemical approaches were used to validate both the KRAS and RASSF1 rewired mutants, and co-localization studies show that these mutants interact with their new binding partners as predicted. Further, I demonstrate that our rewired KRAS no longer binds BRAF in cells but interacts strongly with RASSF5 and rewired RASSF1, and that the rewiring mutants activate the Hippo pathway. Thus, I have developed two rewiring approaches that will help us to study KRAS signalling towards pro-apoptotic RASSF pathway in the absence of strong MAP kinase activation. The data presented here provide several novel insights into how RASSF proteins diverged through evolution and are not all direct effectors of RAS. In addition, I present an innovative rewiring strategy to couple RAS signals towards RASSF effectors which can be a clinical tactic to target RAS oncogenesis.