Добірка наукової літератури з теми "Vecteur cationique"

Un des buts de la therapie genique est d'introduire dans une cellule un gene-medicament afin de corriger un dysfonctionnement de son programme genetique. Cette nouvelle therapeutique necessite, la plupart du temps, la mise au point d'une vectorisation afin de transporter ce gene-medicament dans la cellule. Nous avons ainsi montre, dans un modele de cellules tracheales humaines, une augmentation specifique d'un facteur 10 de l'expression d'un plasmide (adnp) codant pour le gene rapporteur luciferase lorsque celui-ci est condense par un peptide cyclique specifique des integrines, comprenant une sequence polylysine-arg-gly-asp (k 1 6rgd). L'addition d'un lipide cationique au complexe adnp:k 1 6rgd permet d'obtenir des niveaux d'expression comparables a ceux obtenus avec un adenovirus, en ameliorant l'efficacite du vecteur d'un facteur 30. Ce lipopolyplexe (adnp:k 1 6rgd : lipide) penetre dans la cellule par endocytose mediee par les integrines, impliquant les puits recouverts de clathrine. L'augmentation de l'expression du gene rapporteur luciferase, en presence du lipide, est correlee avec une augmentation du passage de l'adnp dans les endosomes/lysosomes, une diminution de l'exocytose de l'adnp et un meilleur transfert nucleaire. Le trafic intracellulaire necessite une fusion endosomale et un environnement vesiculaire acide est benefique a l'efficacite du vecteur lipidique. Le passage de l'adnp a travers l'enveloppe nucleaire serait un mecanisme actif impliquant les pores nucleaires et ne necessitant pas l'apport d'elements cytosoliques. Le lipopolyplexe peut transfecter des cellules quiescentes mais son activite est multipliee par quatre sur des cellules en mitose. Des etudes in vivo chez la souris nous ont permis d'etablir que l'hemoglobine masquait la detection de l'activite luciferase. Une perfusion appropriee des organes permettant d'extraire l'hemoglobine s'impose alors, afin de determiner l'expression in vivo du gene rapporteur luciferase. Ces travaux participent a l'amelioration des connaissances devant permettre a terme, une optimisation des vecteurs non viraux necessaire a l'obtention d'essais cliniques concluants.

La thérapie génique est une forme de thérapie pour traiter les maladies génétiques héréditaires ou acquises tels que les cancers ou la mucoviscidose. L’introduction d’un polynucléotide, par voie systémique ou locale (orale ou nasale par exemple), au sein des cellules malades permet de corriger les défauts à l’origine des mutations génétiques. Néanmoins, le franchissement des différentes barrières biologiques nécessaire à l’internalisation de l’ADN ne peut se faire que par l’intermédiaire d’un vecteur qui va le protéger et lui permettre d’atteindre le noyau de la cellule où il sera transcrit. Divers vecteurs (viraux ou synthétiques) ont vu le jour, tels que des vecteurs polymères cationiques à base de PEI. Cependant, bien qu’efficaces, ces vecteurs sont immunogènes à forte dose. Des fonctionnalisations pour réduire cette toxicité, telle que la PEGylation, ont été mises au point et permettent de renforcer les vecteurs en apportant de la furtivité aux polyplexes finaux. Cependant, ces stratégies montrent des limites nécessitant la synthèse de nouveaux types de polymères. La POxylation représente une bonne alternative à l’utilisation du PEG pour former de nouveaux polyplexes par l’ajout d’un bloc formé d’une ou plusieurs poly(2-alkyl-2-oxazoline)s. Les copolymères sont synthétisés par hydrolyse sélective d’un copolymère triblocs PEtOx-b-PnPrOx-b-PMeOx en utilisant les propriétés thermosensibles des blocs hydrophobes et un sel kosmotrope afin de former des systèmes cœur-couronne permettant l’hydrolyse du bloc PMeOx en PEI. Les systèmes ont ensuite été formulés selon une formulation standard et une méthode par « micro-extrusion ». Les polyplexes ont ensuite été utilisés in vitro par déposition ou par une méthode de nébulisation, idéale pour le traitement de maladies pulmonaires. De très bons résultats de transfection ont été obtenus, résultats qui dépendent de différents paramètres (Mn, PEI, architecture polymère, rapport de charge +/-)
Gene therapy is a form of therapy used to treat hereditary or acquired genetic diseases such as cancer or cystic fibrosis. Introducing a polynucleotide into diseased cells, either via the systmeic route or the local route (oral or nasal inhalation), corrects the defects causing the genetic mutations. However, DNA can only be internalized using a vector that protects it and enables it to reach the cell nucleus, where it will be transcribed. Various vectors (viral or synthetic) have been developed, such as PEI-based cationic polymer vectors. However, although effective, these PEI-based vectors are immunogenic at high doses. Functionalizations to reduce this toxicity, such as PEGylation, have been developed, making it possible to reinforce vectors by adding stealthiness to the final polyplexes. However, these strategies have their limitations, necessitating the synthesis of new types of polymer. POxylation represents a good alternative to PEG usage to form new polyplexes by adding a block formed from one or more poly(2-alkyl-2-oxazoline)s. The copolymers are synthesized by selective hydrolysis of a PEtOx-b-PnPrOx-b-PMeOx triblock copolymer using the thermosensitive properties of the hydrophobic blocks and a kosmotropic salt to form core-shell systems enabling hydrolysis of the PMeOx block to PEI. Then, the systems were formulated using a standard formulation and a "micro-extrusion" method. The polyplexes obtained were used in vitro experiments, by deposition or by a nebulization method, ideal for the treatment of pulmonary diseases. Very good transfection results were obtained, depending on various parameters (Mn, PEI, polymer architecture, +/- charge ratio)

Les lipides cationiques sont parmi les agents chimiques les plus efficaces pour le transfert de gênes in vitro : ils forment avec l'ADN des particules appelées lipoplexes capables de transporter le gêne thérapeutique jusqu'au noyau des céllules. Malheureusement, ces systèmes interagissent non spécifiquement avec les milieux biologiques ce qui résulte en une faible sélectivite et une mauvaise efficacité in vivo. Cette thèse a pour objectif de concevoir des vecteurs chimiques induisant un transfert de gênes sélectif vers les tumeurs après injection intraveineuse. Les voies d'activation du polyethylene glycol (peg) mises au point au début de ce travail ont d'abord permis la synthèse de dérives lipidiques du peg. L'enrobage des lipoplexes par ces polymères modifie la bio-distribution et diminue les interactions non spécifiques de ces particules mais entraine une forte inhibition de leur pouvoir transfectant. Deux stratégies ont été développées pour augmenter sélectivement le transfert de gênes dans les tumeurs : la fixation de l'acide folique à l'extremité des lipides pegyles pour induire une reconnaissance spécifique par le recepteur au folate sur-exprime en surface des cellules cancéreuses, et la synthese de lipides pegyles comportant une fonction orthoester dégradable à faible ph pour exploiter l'acidite naturelle des tissus tumoraux. Les premiers résultats obtenus in vitro et in vivo avec ces deux strategies sont prometteurs : certains dérivés de l'acide folique sont reconnus de manière sélective et compétitive par le récepteur au folate et l'hydrolyse selective de la fonction orthoester dans les tumeurs permet d'y accroitre selectivement le transfert de gênes. La dernière partie de cette thèse est dediée à l'optimisation du trafic intracellulaire du gêne thérapeutique : l'incorporation d'une fonction orthoester dans la structure des lipides cationiques devrait favoriser la liberation de l'ADN dans la cellule par hydrolyse dans les endosomes.

L'objectif de ce travail a été d'étudier l'élaboration et la caractérisation des particules cationiques à partir de polymères préformés, et l'adsorption d'ADN plasmidique sur ces supports, en vue d'une application vaccinale. Deux stratégies ont été envisagées pour réaliser ces structures. Dans une première approche, nous avons préparé des colloi͏̈des en deux étapes successives suivant le procédé "Layer-by-Layer". Après la synthèse de particules nues de PLA, par Émulsification-diffusion ou par dialyse, leur fonctionnalisation a été optimisée par des polymères cationiques de manière à obtenir des colloi͏̈des stables pouvant complexer efficacement de l'ADN plasmidique. Les polycations utilisés dans le cadre de cette étude ont été le poly(éthylèneimine), le pDMAEMA puis le chitosane. La seconde approche a consisté à élaborer des colloi͏̈des cationiques en une seule étape, en introduisant directement dans la formulation initiale, le polyelectrolyte cationique permettant la fonctionnalisation de surface nécessaire à l'adsorption de plasmide. La présence du polyelectrolyte à l'interface a été démontrée par des mesures de mobilité électrophorétique, des clichés de microscopie à balayage ou à transmission et par dosage des fonctions amines en utilisant la Fluorescamine, l'Orange IIC ou la méthode de Bradford suivant le polycation analysé. Enfin, l'adsorption de plasmide a été effectuée sur ces systèmes particulaires fonctionnels et visualisée sur des gels d'agarose. Le processus de fixation de l'ADN dépend de la nature des interfaces (nombres de charge, accessibilité) mais aussi du type d'interaction existant entre le gène thérapeutique et le support colloi͏̈dal (interactions électrostatiques ou hydrophobes, liaisons hydrogène). Les colloi͏̈des obtenus ont été utilisés dans la vectorisation "in vivo" d'antigènes

L'évolution de la thérapie génique réside essentiellement sur le développement de systèmes de transfert de gènes. Les vecteurs synthétiques sont apparus comme une alternative prometteuse aux problèmes rencontrés lors de l'utilisation de virus comme transporteurs. Notre projet de recherche s'inscrit dans le cadre d'un programme développé au sein de la société Cayla visant à développer de nouveaux vecteurs synthétiques pour le transfert de gènes. Ce travail a permis de concevoir trois familles de lipides cationiques de type phosphonoammonium, phosphonopyridinium et phosphono ou amidopolyamine. C'est ainsi que nous avons développé des composés possédant des chaînes lipidiques phytanyle peu utilisées jusqu'à présent pour la synthèse de vecteurs de transfert de gènes. De même nous avons mis au point une méthode de synthèse de phosphites et phosphonates dissymétriques à longues chaînes. Enfin, le potentiel de chacun de ces composés en tant que transporteur de gènes a été évalué in vitro sur différentes lignées cellulaires. Nous avons obtenus des résultats prometteurs puisque certains lipides présentent une capacité de transfection comparable voire supérieure aux composés de références
Development of gene therapy is essentially based on gene transfer systems development. Considering the problems associated with viruses as delivery systems, synthetic vectors were proved to be promising alternative to viral-based systems. Our research project lies within the scope of a program developed within company CAYLA aiming at developing new synthetic vectors for gene transfer. In this work, we designed three synthetic cationic lipid families, phosphonoammonium, phosphonopyridium and phonosphono or amidopolyamine. Thus we synthesized compounds with phytanyl lipidic chains, that are until now little used, as gene transfer vectors. Moreover, a method for the synthesis of long dissymmetric chains of phosphite and phosphonate was developed. Finally, the in vitro transfection activity of these compounds was assessed on different cell lines. Promising results were obtained since some cationic lipids exhibited transfection properties comparable or even better than those commercially available and that are commonly used as references