Дисертації з теми "TRNA Structure"

La seryl-trna synthetase, serrs, est une enzyme qui catalyse l'attachement de la serine sur l'un des cinq trna specifiques de cet acide amine ainsi que sur le trna specifique de la selenocysteine en presence d'atp et d'ions mg. L'enzyme de escherichia coli (2430 residus) a ete cristallisee en presence d'ammonium sulfate et d'un lot special d'octyl-glucoside et la structure resolue a 2. 5a de resolution par la methode du remplacement isomorphe (mir). Trois cristaux derives de dy, hg et u ont ete necessaires pour calculer les phases mir. Quinze cycles d'aplatissement de solvant de cette premiere carte de densite electronique calculee a 2. 8a, combine a une extension des phases a 2. 5a a permis d'ameliorer la qualite des phases jusqu'a 2. 8a. Par contre les phases calculees par cette methode entre 2. 8 et 2. 5a sont de qualite mediocre. Cette nouvelle carte a permis le trace du premier squelette de l'assignement des differents residus de la serrs. Ce modele a ete affine par dynamique moleculaire et par moindres carres contre les donnees de diffraction x jusqu'a un facteur r cristallographique de 0. 183 et une excellente geometrie. La serrs peut etre divisee en deux domaines distincts: un domaine n-terminal comprenant les 100 premiers residus qui se replient en 4 helices dont deux forment une super helice a double brins de 60a de longueur. Le role de ce domaine serait d'interagir et de reconnaitre le trna; et un second domaine c-terminal forme par le reste de l'enzyme et qui se replie autour d'une cavite formee par sept brins beta antiparalleles. Ce domaine contient les trois motifs 1,2 et 3 communs aux synthetases de classe ii a laquelle la serrs appartient. Le motif 1, qui ne fait pas partie du tonneau beta mais plutot de l'insertion entre les brins a1 et a7, est implique dans l'interaction entre les deux sous-unites du dimere. Les motifs 2 et 3, qui constituent deux brins du tonneau beta, sont impliques dans la fixation de l'atp et l'activation de la serine meme si atp et serine n'ont jamais ete identifies dans la carte de densite electronique. Ce domaine contient une extra molecule non encore chimiquement identifiee et qui pourrait etre responsable de la cristallisation. Une nouvelle forme cristalline de la serrs a ete obtenue en presence d'hexyl-heptyl- et octyl-glucoside et d'ammonium sulfate. Ces cristaux sont orthorhombiques mais ont un faible pouvoir diffractant. La structure de la serrs differe de celles de la metrs, tyrs et glnrs toutes trois de classe i et construites autour d'un motif apparente au motif de rossmann. Cette difference dans le repliement conforte la nouvelle classification des synthetases en deux classes distinctes

Production of mutant biological molecules for understanding biological principles or as therapeutic agents has gained considerable interest recently. Synthetic genes are today being widely used for production of such molecules due to the substantial decrease in the costs associated with gene synthesis technology. Along one such line, we have engineered tRNA genes in order to dissect the effects of G:U base-pairs on the accuracy of the protein translation machinery. Our results provide greater detail into the thermodynamic interactions between tRNA molecules and an Elongation Factor protein (termed EF-Tu in bacteria and eEF1A in eukaryotes) and how these interactions influence the delivery of aminoacylated tRNAs to the ribosome. We anticipate that our studies not only shed light on the basic mechanisms of molecular machines but may also help us to develop therapeutic or novel proteins that contain unnatural amino acids. Further, the manipulation of the translation machinery holds promise for the development of new methods to understand the origins of life. Along another line, we have used the power of synthetic biology to experimentally validate an evolutionary model. We exploited the functional diversity contained within the EF-Tu/eEF1A gene family to experimentally validate the model of evolution termed ‘heterotachy’. Heterotachy refers to a switch in a site’s mutational rate class. For instance, a site in a protein sequence may be invariant across all bacterial homologs while that same site may be highly variable across eukaryotic homologs. Such patterns imply that the selective constraints acting on this site differs between bacteria and eukaryotes. Despite intense efforts and large interest in understanding these patterns, no studies have experimentally validated these concepts until now. In the present study, we analyzed EF-Tu/eEF1A gene family members between bacteria and eukaryotes to identify heterotachous patterns (also called Type-I functional divergence). We applied statistical tests to identify sites possibly responsible for biomolecular functional divergence between EF-Tu and eEF1A. We then synthesized protein variants in the laboratory to validate our computational predictions. The results demonstrate for the first time that the identification of heterotachous sites can be specifically implicated in functional divergence among homologous proteins. In total, this work supports an evolutionary synthetic biology paradigm that in one direction uses synthetic molecules to better understand the mechanisms and constraints governing biomolecular behavior while in another direction uses principles of molecular sequence evolution to generate novel biomolecules that have utility for industry and/or biomedicine.

Kyoto University (京都大学)
0048
新制・課程博士
博士(農学)
甲第6479号
農博第892号
新制||農||720(附属図書館)
学位論文||H8||N2923(農学部図書室)
UT51-96-F358
京都大学大学院農学研究科食品工学専攻
(主査)教授 外村 辨一郎, 教授 左右 田健次, 教授 佐々木 隆造
学位規則第4条第1項該当

Ce memoire traite de la structure tertiaire des trna et de leur interaction avec les aminoacyl-trna synthetases. Plusieurs problematiques ont ete abordees d'un point de vue structural, a l'aide de sondes chimiques de structure tertiaire, et d'un point de vue fonctionnel en utilisant des variants du trna#a#s#p de levure. Le premier aspect developpe concerne les sondes de structure. La reactivite de composes possedant des groupements diazoniums photoactivables a ete mise au point sur le trna#a#s#p de levure. L'un de ces composes est un analogue de la spermine, il a permis de localiser celle-ci sur le trna. Le deuxieme probleme aborde est relatif a la structure tertiaire de deux trna#m#e#t, ceci en relation avec leur role fonctionnel. Des differences interessantes ont ete observees dans la conformation de chacun d'eux. L'intervention de structures particulieres dans la reconnaissance entre rrna et synthetase, tel le grand bras variable du trna#s#e#r, a ete etudie par cartographie du trna complexe a la serrs de levure, montrant que ce bras est en contact avec la synthetase. Par ailleurs, la cartographie du trna#a#s#p dans le complexe trna#a#s#p/asprs a egalement ete realisee a l'aide de diverses sondes chimiques donnant une topographie d'interaction du trna suivant la face comprenant la boucle variable et suivant l'angle interne du l du trna. La grande importance de la region de l'anticodon a ete demontree a l'aide de sondes mais egalement par analyse des parametres cinetiques de variants aspartiques mutes dans cette region et peu reconnus par la synthetase. L'utilisation de variants aspartiques, obtenus par transcription in vitro et ne possedant pas de bases modifiees, a souligne l'importance de ces dernieres en tant qu'antideterminants pour la discrimination par d'autres synthetases, et en particulier par l'argrs de levure

La plupart de ARN de transfert (tRNA) subissent des modifications post-transcriptionnelle nécessaires à leur fonction. La modification t6A (N6-threonylcarbamoyladenosine) présente en position 37 des ARNt spécifiques des codons ANN, joue un rôle primordial dans la fidélité de la traduction (appariement correct avec le codon AUG initiateur ; prévention des décalages de phase de lecture etc.). La modification t6A est catalysée en deux étapes par les protéines de la famille Sua5 /YrdC (aboutissant à la synthèse d’un intermédiaire TCA : threonylcarbamoyladenylate) puis transfert de l’entité Carbamoylthreonine du TCA sur l’ARNt via les protéines du complexe KEOPS chez les eucaryotes et archae ou des protéines YgjD, YeaZ et YjeE chez les bactéries ou encore de la protéine Qri7 dans les mitochondries de levures. Le complexe KEOPS comprend les 4 sous-unités suivantes : Kae1, Bud32, Cgi121 et Pcc1 auxquelles s’ajoutent une 5ème sous-unité (Gon7) retrouvée uniquement chez la levure. Alors que YgjD est l’homologue bactérien de la protéine Kae1, YeaZ et YjeE n’ont pas d’homologue chez les eucaryotes ni les archées. Jusqu’à présent, les mécanismes catalytiques responsables de la modification t6A restent peu connus.Nous présentons dans cette thèse une série d’études structure-fonction de plusieurs protéines impliquées dans la biosynthèse de la modification t6A : Sua5 de P. Abyssi ; les sous-complexes Bud32-Cgi121 et Gon7-Pcc1 de S. cerevisiae ainsi que le sous-complexe YgjD-YeaZ de E. coli. Les principaux résultats confirment que Sua5/YrdC est l’acteur majeur de la synthèse de l’intermédiaire TCA via son activité pyrophosphatase. Dans la levure, la protéine Gon7, empêche l’homodimérisation de Pcc1 qui ne peut plus induire de dimérisation du complexe entier (alors que c’est le cas chez les archées pour lesquelles Gon7 est absente). La structure du sous-complexe Bud32-Cgi121 de levure fournit des informations essentielles quant à son rôle de Kinase et d’ATPase au sein du complexe KEOPS. Ensemble, ces deux structures Bud32-Cgi121 et Gon7-Pcc1 nous permettent de proposer un modèle pentamérique du complexe KEOPS. Enfin, concernant les protéines bactériennes, nous montrons que l’activité ATPase de YjeE est stimulée par son association au complexe YgjD-YeaZ et que la formation du complexe ternaire YgjD-YeaZ-YjeE a lieu en présence d’ATP. Nous proposons un modèle structural de ce complexe ternaire pouvant expliquer les rôles des protéines YeaZ et YjeE dans la modification t6A.L’ensemble des études structurales abordées dans cette thèse permet donc de mieux comprendre le mécanisme catalytique de la modification t6A essentielle et ubiquitaire dans les 3 royaumes de la vie
Most tRNAs undergo chemical modifications during their maturation after the transcription. N6-threonylcarbamoyladenosine (t6A) is universally present at position 37 of tRNAs that recognize ANN-codons. tRNA t6A plays an essential role in translational fidelity through enhancing the codon-anticodon interaction. Recently, the tRNA t6A-modifying enzymes have been identified and characterized in bacteria, archaea and yeast. The biosynthesis of tRNA t6A proceeds in two main steps: first, the biosynthesis of an unstable intermediate threonylcarbamoyladenylate (TCA) by Sua5/YrdC family protein, using ATP, L-threonine, bicarbonate as substrates; second, the transfer of threonylcarbamoyl-moiety from TCA onto A37 of cognate tRNAs by a set of other proteins that use Kae1/Qri7/YgjD family proteins as a catalytic component. Though the biosynthesis of tRNA t6A could be accomplished by Sua5 and Qri7 in yeast mitochondria, the t6A biosynthesis in archaea and yeast cytoplasm requires Sua5 and KEOPS protein complex, which consists of Kae1, Bud32, Cgi121, Pcc1 in archaea, and a fifth Gon7 in yeast. In bacteria, it requires YrdC, YgjD, YeaZ and YjeE, of which YeaZ and YjeE are not related to any KEOPS subunits. Presently, the molecular mechanism of Sua5/YrdC in catalyzing the TCA biosynthesis is not well understood; How the KEOPS subunits assembly and cooperatively transfer threonylcarbamoyl-moiety from TCA to tRNA is not known; The contribution of YeaZ and YjeE in t6A biosynthesis in bacteria still remains to be probed.In this study, we report crystal structures of P. abyssi Sua5, S. cerevisiae Gon7/Pcc1 and Bud32/Cgi121 binary complexes, and E. coli YgjD-YeaZ heterodimer. Based on the information revealed by the crystal structures, advanced biochemical characterizations were carried out to validate the hypotheses. We confirm first that Sua5/YrdC is capable of catalyzing the TCA biosynthesis using substrates of ATP, L-threonine, and bicarbonate. The structure of P. abyssi Sua5 in complex with pyrophosphate provides a basis for its ATP-pyrophosphatase activity. Second, the structure of Gon7 reveals that it functions as a structural mimic of Pcc1 and therefore prevents the formation of Pcc1 homodimer, which mediates the formation of a dimer of tetrameric KEOPS from archaea. The structure of Bud32-Cgi121 in complex with ADP provides a basis in support of the dual kinase and ATPase activities of Bud32. We present a structural model of yeast KEOPS that exists as a heteropentamer. Third, we discovered that the weak intrinsic ATPase activity of YjeE is activated by YgjD-YeaZ heterodimer. YgjD, YeaZ and YjeE associate and form a ternary complex that is regulated by both the formation of YgjD-YeaZ heterodimer and the binding of ATP to YjeE. The model of YgjD-YeaZ-YjeE ternary complex provides structural insight into the essential role of YeaZ and YjeE in t6A biosynthesis in bacteria. This work provides structural insights into understanding the biosynthesis of tRNA t6A that is essential and ubiquitous in all three domains of life

Thesis (Ph. D.) -- University of Maryland, College Park, 2007.
Thesis research directed by: Dept. of Cell Biology and Molecular Genetics . Title from t.p. of PDF. Includes bibliographical references. Published by UMI Dissertation Services, Ann Arbor, Mich. Also available in paper.

Les approches bioinformatiques développées au cours de cette thèse ont permis d’une part le développement de banques de données concernant les ARNt classiques ainsi que les ARNt mitochondriaux de métazoaires. Celles-ci sont basées sur de nouveaux outils pour la détection de gènes d’ARNt «bizarres» et des alignements de séquences basés sur les propriétés structurales préservées. Les analyses des séquences collectées ont conduit non seulement à une vision globale de la diversité des ARNt dans les génomes mitochondriaux couvrant l’ensemble des groupes taxonomiques des métazoaires, mais également une meilleure connaissance de l’organisation des génomes et d’en proposer des liens évolutifs. Elles ont également permis de confirmer et d’élargir l’existence d’ARNt les plus petits connus à ce jour et de poser les bases de compréhension des repliements tridimensionnaux des ARNt mitochondriaux. Ces travaux permettent de mieux appréhender la compréhension des relations structure/fonction des ARNt mitochondriaux humains, et en particulier les dysfonctionnements dans les pathologies mitochondriales
The bioinformatic approaches presented in this thesis include the development of databases for classical tRNAs and the mitochondrial tRNAs of metazoans. They are based on new tools for the detection of "bizarre" tRNA genes and sequences, and for the calculation of alignments based on their structural features. The analysis of collected sequences have led to an global overview on the diversity of tRNAs in mitochondrial genomes covering all taxonomic groups of metazoans, but also to a better understanding of genome organization and their evolution. The present study revealed the existence of the smallest known tRNA so far and provides the basis for understanding the three-dimensional folding of mitochondrial tRNA. This work helps to better understand the structure/function relationships of human mitochondrial tRNAs and, in particular, the dysfunctions in mitochondrial pathologies

During translation, the transfer RNAs (tRNAs) play the crucial role of adaptors between the messenger RNA and the amino acids. The tRNAs are first transcribed as pre-tRNAs which are then maturated. During this maturation, several nucleosides are modified by tRNA modification enzymes. These modifications are important for the functions of the tRNAs and for their correct folding. Many of the modifications are methylations of the bases or the ribose. Four families of tRNA methyltransferases are known, among which the SPOUT superfamily. Proteins of this superfamily are characterised by a C-terminal topological knot where the methyl donor is bound. With the exception of the monomeric Trm10, all known SPOUT proteins are dimeric and have an active site composed of residues of both protomers. Interestingly, depending on the organism, the same modification can be catalysed by completely unrelated enzymes. On the other hand, homologous enzymes can have different specificities or/and activities. These differences are well illustrated for the TrmJ and Trm10 enzymes.

In the first part of this work we have identified the TrmJ enzyme of Sulfolobus acidocaldarius (the model organism of hyperthermophilic Crenarchaeota) which 2’-O-methylates the nucleoside at position 32 of tRNAs. This protein belongs to the SPOUT superfamily and is homologous to TrmJ of the bacterium Escherichia coli. A comparative study shows that the two enzymes have different specificities for the nature of the nucleoside at position 32 as well as for their tRNA substrates. To try to understand these shifts of specificity at a molecular level we solved the crystal structure of the SPOUT domains of the two TrmJ proteins.

In the second part of this work, we have determined the crystal structure of the Trm10 protein of S. acidocaldarius. This is the first structure of a 1-methyladenosine (m1A) specific Trm10 and also the first structure of a full length Trm10 protein. The Trm10 protein of S. acidocaldarius is distantly related to its yeast homologues which are 1-methylguanosine (m1G) specific. To understand the difference of activity between the Trm10 enzymes, we compared the yeast and the S. acidocaldarius Trm10 structures. Remarkably several Trm10 proteins (such as Trm10 of Thermococcus kodakaraensis) are even able to form both m1A and m1G. To understand the capacity of the T. kodakaraensis protein to methylate A and G, a mutational study was initiated./Lors de la traduction, les ARN de transfert (ARNt) jouent le rôle crucial d’adaptateurs entre l’ARN messager et les acides aminés. Les ARNt sont transcrits sous forme de pré-ARNt qui doivent être maturés. Lors de cette maturation, plusieurs nucléosides sont modifiés. Un grand nombre de ces modifications sont des méthylations des bases ou du ribose. Quatre familles d’ARNt méthyltransferases sont actuellement connues, dont la superfamille des SPOUT. Les membres de cette superfamille sont caractérisés par un nœud dans la chaîne polypeptidique du côté C-terminal. C’est au niveau de ce nœud que se lie la S-adénosylméthionine qui est le donneur de groupement méthyle. A l’exception de Trm10 qui est monomérique, toutes les protéines SPOUT connues sont dimériques et leur site actif est formé de résidus provenant des deux protomères. Selon l’espèce, une même modification peut être formée à la même position dans la molécule d’ARNt par des enzymes qui appartiennent à des familles différentes. A l’opposé, des enzymes homologues peuvent présenter des spécificités ou des activités différentes.

Au cours de ce travail, nous avons identifié l’enzyme TrmJ de Sulfolobus acidocaldarius (l’organisme modèle des Crénarchées hyperthermophiles) qui méthyle le ribose du nucléoside en position 32 des ARNt. Cette protéine est un homologue de l’enzyme TrmJ de la bactérie Escherichia coli. L’étude comparative que nous avons réalisée a révélé que ces deux enzymes présentent une différence de spécificité pour la nature du nucléoside en position 32 ainsi que pour les ARNt substrats. Afin de comprendre ces différences de spécificité au niveau moléculaire, les structures des domaines SPOUT des deux TrmJ ont été déterminées et comparées.

En parallèle, nous avons résolu la structure cristalline de la protéine Trm10 de S. acidocaldarius. C’est la première structure disponible d’un enzyme Trm10 formant de la 1-méthyladénosine (m1A). C’est aussi la première structure complète d’une protéine Trm10. Les enzymes homologues des levures Saccharomyces cerevisiae et Schizosaccharomyces pombe qui n’ont que peu d’identité de séquence avec l’enzyme de S. acidocaldarius, forment de la 1-méthylguanosine (m1G). Dans le but de comprendre comment ces enzymes homologues peuvent présenter des activités différentes, leurs structures ont été comparées. De manière surprenante, certains homologues de Trm10 (comme l’enzyme de l’Euryarchée Thermococcus kodakaraensis) sont capables de former du m1A et du m1G. Afin de mieux comprendre comment ces protéines sont capables de méthyler deux types de bases, nous avons initié l’étude de l’enzyme Trm10 de T. kodakaraensis par mutagenèse dirigée.

Doctorat en Sciences
info:eu-repo/semantics/nonPublished

Methodologie analytique a ete developpee pour determiner la struture primaire d'une proteine avec une quantite de depart de quelques nonomales. Optimisation des techniques de separation de peptides, analyse d'acides amines et de la sequence n terminale selon edman. Apport de la spectrometrie de masse dans le domaine de la sequence peptide a ete evalue. Les modes de desorption sous ionisation chimique et par bombardement par atomes rapides ont ete utilises sur un instrument du type triple quadripole. Application au sequencage d'une ferrodoxine, et a l'etude des aminoacyl-trna synthetase

Les interactions acide nucleique-proteine, generalement inhibes dans de fortes concentrations de sel, sont cependant presentes dans le cytoplasme des bacteries halophiles (sature en kcl). Les acides nucleiques ainsi que les proteines des bacteries halophiles sont fortement charges negativement. L'etude separee de la solvatation d'un acide nucleique: l'arntphe de levure et d'une proteine issue d'une bacterie halophile: la malate deshydrogenase d'haloarcula marismortui (hmdh) a ete entreprise, dans de fortes concentrations de differents sels, en considerent ces macromolecules comme des polyelectrolytes associes a des contre-ions. La determination des parametres d'interaction preferentielle par differentes methodes thermodynamiques (equilibre de sedimentation, densimetrie, diffusion centrale de neutrons) a permis d'evaluer la quantite d'eau et de sel ou de contre-ions associes a la macromolecule. Trois programmes ont ete developpes pour comparer la structure en solution mesuree par diffusion centrale a la structure cristallographique. Dans nac1 (entre 1 et 5m), 4 molecules d'eau par nucleotide et 40% de contre-ions sont associes a l'arntphe de levure. Dans mgcl2 (entre 1 et 3m), 6 molecules d'eau par nucleotide et seulement 10% de contre-ions sont associes. La solvatation de la hmdh a ete determinee dans differents sels choisis pour leurs differents effets sur la stabilisation des proteines. La hmdh lie une quantite non negligeable de sel en plus de ses contre-ions dans mgcl2 et mgso4. Dans nacl, elle semble lier peu ou pas de sel en plus de ses contre-ions. Dans cscl, elle ne lie que ses contre-ions. Dans (nh4)2so4, une partie des contre-ions de la hmdh est dissociee. La hmdh lie 30001000 molecules d'eau dans les sels etudies sauf dans mgcl2 ou elle lie 7000 molecules d'eau. La solvatation et particulierement le pourcentage de contre-ions dissocie depend donc fortement du type sel mais aussi du polyelectrolyte considere. L'importance de la structure en solution pour les interactions est discutee

Cette these porte sur une etape cle de la biosynthese des proteines, l'aminoacylation des trna par les aminoacyl-trna synthetases (aars). Des etudes de cartographie en solution du pseudo-trna present a l'extremite 3' du virus de la mosaique jaune du navet ont conduit a l'affinement de son modele tridimensionnel. L'etude fonctionnelle de variants de cette molecule a permis de caracteriser les nucleotides qui lui conferent la specificite valine. Par ailleurs, une double specificite de ce pseudo trna a ete mis en evidence puisque cette molecule est efficacement chargee par l'hisrs de levure. Un resultat original a ete la premiere mise en evidence d'une aminoaxylation d'une minihelice de rna qui presente un pseudo nud. D'autre part, les etudes d'histidinylation ont permis de montrer le role preponderant du nucleotide-1 pour la charge par l'hisrs de levure. La deuxieme partie de cette these a aborde l'etude du mode d'action des nucleotides d'identite du trnaasp de levure par l'utilisation d'une nouvelle technique d'empreinte. Elle a permis de montrer que les nucleotides d'identite du trnaasp sont en contact direct avec l'asprs et que le trna subissait un changement conformationnel dans le complexe. Les variants du trnaasp, mutes aux positions d'identite, perdent les contacts aux positions mutees et certains ne subissent pas de changements conformationnels. Enfin, des recherches fonctionnelles ont montre l'existence d'une relation entre les systemes aspartique et histidine, puisque des transcrits du trnaasp se sont averes aminoacylables par l'hisrs

Mes divers thèmes de recherche concernent la traduction qui, au sens large du terme, peut être considérée comme la production de biomolécules à rôle structural et/ou fonctionnel à partir de l'information contenue dans les gènes. Pour ma part je me suis intéressé tout d'abord à l'aminoacylation des ARNs de transfert (ARNt) ainsi qu'à la formation de certaines bases modifiées qui les composent. En effet, l'ARNt est un acteur clé de la synthèse protéique car c'est de l'exactitude de son aminoacylation que dépend grandement la fidélité de la synthèse protéique.
Chez la levure, il existe un complexe multi-synthétasique simplifié formé de la MetRS, la GluRS et Arc1p, une protéine dont le gène est en interaction non seulement avec la machinerie de transport nucléocytoplasmique mais également celle de la biosynthèse des ARNts. Ces découvertes m'ont amené à étudier le rôle de Mtr10p dans les échanges nucléocytoplasmiques et un possible lien avec le transport des ARNts. Les acquis lors de ces travaux auront été utiles dans l'étude du rôle d'Efl1p, une GTPase de type EF-2 impliquée dans une étape tardive (cytoplasmique) de la biogenèse de la grande sous-unité ribosomale 60S.
Grâce aux travaux antérieurs, j'ai pu me familiariser avec de nombreuses techniques biochimiques et génétiques qui s'avèreront précieuses pour mon projet d'étude de la localisation et de l'interactome des aminoacyl-ARNt synthétases (aaRS). En effet, il n'est pas concevable que le couple ARNt/aaRS évolue de façon autonome dans la cellule mais il doit interagir / communiquer d'une part avec les acteurs directs de la synthèse protéique et, d'autre part, avec des facteurs intervenant dans d'autres processus cellulaires. Trouver, comprendre et étudier les spécificités de divers organismes fournira peut-être de nouvelles pistes à but thérapeutique restées insoupçonnées jusqu'alors.
Un autre aspect de mon projet, toujours relié aux aaRS, traitera d'un système atypique de la machinerie traductionnelle qui est celui des voies de formation des aminoacyl-ARNts dans les systèmes asparagine et glutamine. En effet, un certain nombre d'organismes, pathogènes de l'homme, ne possèdent pas d'aaRS (AsnRS, GlnS) pour l'un et/ou l'autre de ces acides aminés et pallient à cette absence par l'utilisation d'une voie indirecte pour la formation de ces aminoacyl-ARNts. L'étude de ces voies est non seulement intéressante sur les plans évolutifs et relation structure-fonction ARN-protéine mais également d'un point de vue appliqué, certes à plus long terme, dans le but d'enrayer ces voies de biosynthèse amenant ainsi des cibles alternatives pour des molécules de type antibiotique. Cet aspect est d'autant plus important qu'à l'heure actuelle apparaissent des phénomènes de résistance aux antibiotiques posant de vrais problèmes de santé publique.

Thesis (Ph. D.)--Ohio State University, 2005.
Title from first page of PDF file. Document formatted into pages; contains xv, 139 p.; also includes graphics (some col.) Includes bibliographical references (p. 123-139).

As aminoacil tRNA sintetases (AaRSs) são enzimas essenciais na síntese de proteínas assegurando a correta relação entre os aminoácidos e seus tRNA cognatos. O genoma mitocondrial dos tripanossomatídeos perdeu os genes codificantes dos tRNAs, assim os tRNA mitocondriais são codificados no núcleo e importados do citoplasma. O código genético do kinetoplasto desvia do código genético pela utilização do códon de terminação UGA para a decodificação do códon do triptofano. Um único gene codificando o tRNATrp(CCA) observado no genoma de Leismania é responsável pela incorporação do aminoácido triptofano durante a síntese proteíca na mitocôndria. Para decodificar os dois códons do Trp (UGA e UGG) a base na posição 34 do tRNATrp(CCA) passa por um evento de editoração, convertendo o ribunuclotídeo C34 em U34, produzindo o tRNATrp(UCA) capaz de decodificar o códon UGA. Nesse trabalho foram caracterizadas duas triptofanil tRNA sintetases de Leishmania major. De acordo com experimentos de ?western blotting? e análises ?in silico? das seqüências de aminoácidos, uma enzima tem localização citoplasmática (LmTrpRS1) enquanto a outra mitocondrial (LmTrpRS2). Os mRNAs dos dois genes foram definidos por experimentos de 5? e 3? RT-PCR. As duas enzimas foram clonadas em diversos vetores de expressão procariotos e eucariotos. A LmTrpRS1 foi obtida somente na fração insolúvel, já a LmTrpRS2 foi obtida na fração solúvel quando clonada no vetor de expressão pET28a. Esta porém mostrou-se instável precipitando rapidamente após sua purificação. Os ensaios enzimáticos realizados com a mesma mostraram que ela é capaz de reconhecer os tRNAsTrp editado e não editado. Modelagem molecular por homologia com as duas proteínas foi realizada usando a proteína citoplasmática humana como molde, para estudar a interação entre a proteína e o tRNATrp. Xylella fastidiosa é um bactéria gram negativa limitada ao xilema, responsável por um grande número de doenças economicamente importantes, como a doença de Pierces em videiras, Clorose variegata do Citrus (CVC) e a doença da requeima das folhas em outras plantas incluindo, amendoeira, ameixeira, louro, amoreira e café. Em todos os casos a X. fastidiosa afeta o xylema da planta causando redução na produção de frutos. Nesse trabalho nós mostramos a estrutura da Xylellaína, uma cisteíno protease desse patógeno. A estrutura foi resolvida por dispersão anômala a um único comprimento de onda, utilizando cristais de xylellaína selenometionina substituídos. A estrutura da Xylellaína foi refinada até 1,65 Å de resolução, mostrando enovelamento similar às proteínas da família da papaína, porém algumas características interessantes como uma região N-terminal composta por 38 aminoácidos cobrindo o sulco ativo da enzima, um intrigante ribonucleotídeo encontrado fora do sítio ativo da enzima e um ?loop? semelhante ao ?loop? de oclusão presente na catepsina B.
The aminoacyl tRNA synthetases (aaRSs) are essential enzymes in protein synthesis that ensure the correct match between amino acids and their cognate tRNAs. The mitochondrial (kinetoplast) genome of trypanossomatids lacks tRNA genes, and therefore nucleus-encoded tRNAs are imported from the cytoplasm, the kinetoplast genetic code deviates from the universal code in that UGA instead of UGG encodes for tryptophan. A single nucleus-encoded tRNATrp(CCA) is responsible for Trp insertion during organellar protein synthesis. To decode both Trp codons (UGA and UGG), tRNATrp(CCA) undergoes a single C to U editing event at position 34 of the anticodon yielding to versions of the tRNA in the mitochondria with anticodon CCA and UCA, permitting UGA decoding. This work have characterized two Leishmania major tryptophanyl-tRNA synthetase, acording western blotting experiments and ?in silico? sequence analisis one of cytoplasmatic localization (LmTrpRS1) and another from mitochondria localization (LmTrpRS2). The mature mRNA transcripts for both genes were defined by 5? and 3? RT-PCR. Both enzymes were cloned into several expressions vectors. LmTrpRs1 was obtained as an insoluble protein and LmTrpRs2 expressed into the soluble fraction in pET28a expression system. LmTrpRS2 protein, however, is unstable precipitating shortly after purification. The enzymatic assay showed that this enzyme is able to recognize both tRNATrp. Molecular modeling for LmTrpRS1 and LmTrpRS2 were constructed using the cytoplasmatic human tryptophanyl tRNA synthetase as a model, to study the interaction between proteins and tRNATrp. Xylella fastidiosa is a xylem-limited, gram-negative bacteria responsible for a large number of economically important plant diseases, such as Pierces disease in grapevines, citrus variegated chlorosis (CVC) in sweet oranges and leaf scorch diseases in other plants, including almond, plum, oleander, mulberry and coffee. In all cases, X. fastidiosa infects the plant xylem and impairs fruit production. Here, we report the crystal structure of xylellain, a cystein protease from X. fastidiosa. The structure was solved by single-wavelength anomalous dispersion (SAD) using seleno-methionine containing xylellain crystals. The final structure of Xylellaína was refined against the best native data set (1.65 Å) showing R/Rfree= 17/21. Xylellain shares fold similar to Papain like Family, but contains some interesting features, like a 38 N-terminal tail covering the active site cleft; one intriguing ribonucleotide found outside the active site and one loop that resemble the ocluding loop from cathepsin B.

Les ARNt sont des molécules adaptatrices reliant l'information génétique de l’ARN messagers à la séquence d'acides aminés primaire des protéines. Les ARNt ont une structure typique, appelée "feuille de trèfle". Certains ARNt mitochondriaux montrent une forte dérivation de cette structure. Un cas extrême peut être observé dans les mitochondries du nématode R. culicivorax. Cette étude vise la caractérisation fonctionnelle de ces ARNt «bizarres» et de définir leurs propriétés structurales et leur fonctionnalité avec des protéines partenaires telles que les CCAses et les aminoacyl-ARNt synthetases. Ce travail révèle que les ARNt sans bras forment une structure secondaire en forme d'épingle à cheveux et que leurs structures 3D présentent une grande flexibilité intrinsèque. Les tests initiaux n’ont pas démontré l'activité d'aminoacylation. Cependant, les ARNt sans bras représentent des molécules fonctionnelles pour le CCAse, indiquant des adaptations de l’enzyme aux ARNt sans bras
TRNAs are adapter molecules linking the genetic information of messenger RNAs with the primary amino acid sequence of proteins. tRNAs have a typical cloverleaf-like secondary structure. Some mitochondrial tRNAs show a high derivation from this canonical tRNA structure. An extreme case of structural truncations can be observed in mitochondria of the nematode R. culicivorax. This study aims the functional characterization of such “bizarre” tRNAs in defining their structural properties and their functionality with interacting partner proteins such as CCA-adding enzymes and aminoacyl-tRNA synthetases. This work reveals that armless tRNAs form a hairpin-shaped secondary structure. 3D structures exhibit a high intrinsic flexibility. Initial tests could not demonstrate aminoacylation activity. However, armless tRNAs represent functional molecules for CCA-incorporation, indicating adaptations of CCA-adding enzymes to armless tRNAs

El virus de l'hepatitis C (VHC) provoca una hepatitis crònica que afecta a més de 170 milions de persones d'arreu del món. És un virus petit que es classifica dins de la família Flaviviridae i és un virus d'RNA de cadena positiva amb un genoma d'aproximadament 9.600 nucleòtids. A l'extrem 5' del genoma viral s'hi troba una regió no codificant (5'NCR) que comprèn els primers 341 nucleòtids i la seva funció està relaciona amb la traducció. Immediatament després hi ha una pauta de lectura oberta ORF que acaba en un únic codó d'aturada i codifica una poliproteïna de 3.010 aminoàcids. A continuació l'extrem 3' no codificant (3'NCR), que malgrat es desconeixen les seves funcions exactes, s'ha demostrat que és essencial per a la replicació vírica. La única poliproteïna generada és processada co- i postraduccionalment mitjançant proteases de l'hoste i víriques, donant lloc a les proteïnes estructurals (Core, E1 i E2-p7) i no estructurals (NS2-NS5B). Igual que la majoria de virus RNA, el VHC es caracteritza per tenir una taxa de mutació elevada. De fet, el genoma del virus no es pot definir com una única seqüència sinó per una població de variants molt relacionades entre sí. A aquesta manera d'organitzar la informació genètica se l'anomena quasiespècie viral i una de les seves implicacions principals és la facilitat amb què sorgeixen resistents al tractament. Els tractaments disponibles són llargs, cars, provoquen efectes secundaris considerables i només es resolen completament el 40% dels casos. Per aquesta raó es busquen altres solucions terapèutiques per combatre el virus entre les quals s'hi inclouen diferents estratègies. Una de les més innovadores i prometedores és la utilització de ribozims dirigits directament contra el genoma del virus. Aquest treball es centra en l'estudi de les noves estratègies terapèutiques basades en ribozims, concretament la ribonucleasa P. La ribonucleasa P és un ribozim que està present en tots els organismes ja que és l'enzim responsable de la maduració dels precursors d'RNA de transferència. El més interessant a nivell terapèutic és que s'ha demostrat que es pot dirigir la seva activitat cap a qualsevol RNA utilitzant una seqüència guia d'RNA que quan hibrida amb l'RNA diana, l'híbrid imita l'estructura secundària del substrat natural. En el cas del VHC, s'han estudiat ribozims dependents de seqüència (ribozims derivats d'RNAs satèl·lits i de viroides de plantes), sempre dirigits contra la regió més conservada del virus per evitar una disminució de l'eficiència del ribozim deguda a la variació de la diana. La ribonucleasa P és una endonucleasa d'activitat molt específica i es diferencia dels altres ribozims naturals en el sistema de reconeixement del substrat, reconeix elements estructurals i no de seqüència. L'objectiu final del treball és tallar in vitro l'RNA del VHC aprofitant la propietat que presenta aquest ribozim de reconèixer elements estructurals i no de seqüència ja que per a un mateix nombre de seqüències, el nombre d'estructures viables que pot adoptar l'RNA genòmic és molt més petit i per tant la variabilitat de la diana disminueix.
S'han estudiat dos models d'RNasa P, la RNasa P humana guiada per seqüència guia externa (EGS) i l'RNA M1 de l'RNasa P d'E.coli unit a la seqüència guia per l'extrem 3' (ribozim M1GS). Abans però de dirigir el ribozim, s'han estudiat l'estructura i la variabilitat d'una regió del genoma del virus ja que s'ha descrit que són factors que poden limitar l'eficiència de qualsevol ribozim. Derivat d'aquests estudis s'aporten dades sobre accessibilitat i variabilitat d'una regió interna del genoma del virus de l'hepatitis C, la zona d'unió de la regió E2/NS2 (regió 2658-2869). L'estudi d'accessibilitat revela que la regió 2658-2869 del genoma del virus conté dominis oberts i tancats i que la transició entre uns i altres no és brusca si es compara amb altres regions d'estructura coneguda (regió 5' no codificant). Els resultats dels assajos in vitro amb els dos models de RNasa P mostren que s'ha aconseguit dirigir tant la ribonucleasa P humana com el ribozim M1GS cap a una zona, predeterminada segons l'estudi d'accessibilitat, com a poc estructurada i tallar l'RNA del virus. De l'anàlisi de mutacions, però, es dedueix que la regió estudiada és variable. Tot i dirigir el ribozim cap a la zona més accessible, la variació de la diana podria afectar la interacció amb la seqüència guia i per tant disminuir l'eficiència de tall. Si es proposés una estratègia terapèutica consistiria en un atac simultani de vàries dianes.D'altra banda i derivat d'un resultat inesperat on s'ha observat en els experiments control que l'extracte de RNasa P humana tallava l'RNA viral en absència de seqüències guia externes, s'ha caracteritzat una nova interacció entre l'RNA del VHC i la RNasa P humana. Per a la identificació de l'enzim responsable dels talls s'han aplicat diferents tècniques que es poden dividir en mètodes directes (RNA fingerprinting) i indirectes (immunoprecipitació i inhibicions competitives). Els resultats demostren que la ribonucleasa P humana, i no un altre enzim contaminant de l'extracte purificat, és la responsable dels dos talls específics observats i que es localitzen, un a l'entrada interna al ribosoma (IRES) i molt a prop del codó AUG d'inici de la traducció i l'altre entre la regió codificant estructural i no estructural. La ribonucleasa P és un dels enzims del metabolisme del tRNA que s'utilitza per identificar estructures similars al tRNA en substrats diferents del substrat natural. Així doncs, el fet que la ribonucleasa P reconegui i talli el genoma del VHC en dues posicions determinades suggereix que, a les zones de tall, el virus conté estructures semblants al substrat natural, és a dir estructures tipus tRNA. A més, tot i que el VHC és molt variable, els resultats indiquen que aquestes estructures poden ser importants per el virus, ja que es mantenen en totes les variants naturals analitzades. Creiem que la seva presència podria permetre al genoma interaccionar amb factors cel·lulars que intervenen en la biologia del tRNA,particularment en el cas de l'estructura tipus tRNA que es localitza a l'element IRES. Independentment però de la seva funció, es converteixen en unes noves dianes terapèutiques per a la RNasa P. S'ha de replantejar però l'estratègia inicial ja que la similitud amb el tRNA les fa susceptibles a l'atac de la ribonucleasa P, directament, en absència de seqüències guia externes.
Hepatitis C virus is a human pathogen causing chronic liver disease in 170 million people worldwide. The virus is classified within the family Flaviviridae. The RNA genome is single-stranded and functions as the sole mRNA species for translation. It comprises a 5'-untranslated region, which functions as an internal ribosome entry site, and a long open reading frame, which encodes a polyprotein precursor of about 3010 amino acids, that is cleaved into structural (core, envelope 1, envelope 2 and p7) and non-structural (NS-2, NS-3, NS-4 and NS-5) proteins; followed by a 3' non-coding region. Analyzing significant numbers of cDNA clones of hepatitis C virus (HCV) from single isolates provides unquestionable proof that the viral genome cannot be defined by a single sequence, but rather by a population of variant sequences closely related to one another. In the infected patient, a master (the most frequently represented sequence) and a spectrum of mutant sequences may be isolated at any given time during chronic infection. This manner of organizing genetic information, which characterizes most RNA viruses, is referred to as quasispecies. HCV resistance to treatment (either alone or in combination with ribavirin) is one of the most important clinical implications predicted by the quasispecies model suggesting the necessity to seek new therapies. HCV therapeutic strategies based on ribozyme cleavage are leading candidates. The ribozyme activity of Ribonuclease P (RNase P) is among proposed antiviral agents. RNase P is a ubiquitous cellular endonuclease and one of the most abundant and efficient enzymes in the cell. This enzyme is a ribonucleoprotein complex that catalyzes a hydrolysis reaction to remove the leader sequence of precursor tRNA to generate the mature tRNA. Substrate recognition by the RNase P ribozyme does not rely on sequence requirements but on structural features of the RNA substrate. Custom-designed ribo-oligonucleotides, which hybridize with the target, called external guide sequences (EGSs), may provide the RNA structure which RNase P recognizes and cleaves in the hybridized complex. Recognition of structures instead of sequences may represent a great advantage in the fight against variable viruses because single or even double mutations in the target may be tolerated for RNase P recognition.
One of the major aims of this work is to cleave HCV RNA using the RNase P ribozyme guided by EGS. To expand investigation of targeting in the HCV genome we assessed accessibility and low potential of variation of the target RNA since it is described that are crucial requirements for ribozyme therapy against viral infections. In the hepatitis C virus, the sequence of the 5' non coding region is conserved but the highly folded RNA structure severely limits the number of accessible sites. We have considered an internal genomic region whose sequence variation has been widely investigated. We have first mapped the accessibility of the genomic RNA to complementary DNAs within an internal genomic region. We performed a kinetic and thermodynamic study. Accordingly, we have designed and assayed four RNase P ribozymes targeted to the selected sites. Considerations on RNA structural accessibility and sequence variation indicate that several target sites should be defined for simultaneous attack. While performing targeting experiments on HCV RNA transcripts with RNase P we have found that, surprisingly, purified RNase P (peak activity) from HeLa cells cleaved HCV genomic RNA efficiently at two sites in the absence of EGSs. We report the techniques used to prove that the cleavage is specific to human RNase P (indirect methods: immunoprecipitation and competitive inhibition), and to show where cleavage occurs (direct method: RNA fingerprinting). We have confirmed that human RNase P is responsible for HCV RNA processing and that the two cleavages sites are in the IRES HCV domain, close to AUG initiator triplet, and in the E2/NS2 junction fragment (between structural and non structural coding region). To define cleavage by RNase P as a general property of HCV, viral sequences obtained from different patients were compared for RNase P cleavage accessibility. Cleavage was consistently observed in all sequences tested although with different efficiencies. Since RNase P recognizes and cleaves tRNA-like structures, we believe that such recognition by RNase P is an indication for the presence of two possible tRNA-like structures in the HCV genome. Comparison of such results at the two HCV RNase P cleavage sites should help us to understand in greater detail HCV substrate structure, tRNA mimicry, rules underlying recognition by human RNase P, and, in the particular case of the IRES motif, possible participation in translation. Whatever the role of such tRNA-like structures, such a strong tendency to maintain them might be important in the development of therapeutic strategies against the virus because they can represent highly susceptible targets for RNase P.

Plusieurs techniques de clonage n'ont pas permis l'obtention du gene de l'arg-arnt synthetase de levure. Par contre, l'isolement du gene aspartyl-trna synthetase de levure a permis d'aborder l'etude des relations structure-fonction de cette enzyme. Delimitation de certaines zones sensibles de la molecule: a) l'insertion de deux ou quatre acides amines via des insertions d'oligonucleotides dans le gene montre que la premiere moitie n- terminale de l'enzyme est responsable de la premiere etape catalytique (activation de l'acide aspartique). B) deletions a partir de l'extremite c terminale, mise en evidence du role dans le positionnement fonctionnel de l'arnt**(asp). L'aspartyl-trna synthetase a ete surproduite dans la levure et dans escherichia coli ou l'enzyme conserve son activite. Les dix derniers residus de l'extremite c terminale sont impliques aussi bien dans le positionnement fonctionnel de l'arnt**(asp) que dans l'etape d'activation

The structure and expression of a novel Euglena gracilis chloroplast ribosomal protein operon was studied by gene mapping, molecular cloning, nucleotide sequencing primer extension and Northern analyses. The nucleotide sequence (12,240 bp) was determined for 100% of both strands encoding the 12 genes, rpl23 - rpl2 - rps19 - rpl22 - rps3-(2.8 kb region)- rpl16 - rpl14 - rpl5 - rps8 - rpl36 - trnI - rps14. The gene organization resembles the S10 and spc ribosomal protein operons of E. coli. The rpl5 gene was a new chloroplast gene not previously reported for any chloroplast genome nor described as a nuclear gene. The presence of numerous introns and an unusual 2.8 kb rps3-rpl16 intercistronic region were additional features that were unparalleled in other chloroplast DNAs. At least 15 introns were identified in the genes. Evidence is presented from primer extension analysis of chloroplast RNA for the correct in vivo splicing of six of the introns. Two introns within rps8 flanked an 8 bp exon, the smallest exon yet characterized in a chloroplast genome. Four introns shared structural properties with group II organelle introns. The remaining 11 introns were defined as new category of organelle intron, now designated "group III." The presence of additional introns in several intercistronic regions is proposed. Conserved regions in the predicted polypeptides were identified from the alignments with related proteins from other chloroplasts and bacteria. Evidence from Northern hybridization experiments with gene-specific probes supported the interpretation that 11 ribosomal protein genes, the 2.8 kb rps3-rpl16 intercistronic region and trnI were co-transcribed and encoded in a single operon. The co-transcription of genes coding for proteins and a tRNA is a novel finding for a chloroplast operon. Several stable polycistronic transcripts were identified, including a common 8.3 kb pre-mRNA. Stepwise processing pathways proposed for the mRNAs are described. Most mRNAs appeared to be fully spliced. The 5$\sp\prime$ ends of mRNAs for the first gene in the operon, rpl23, were mapped by primer extension. Plastid mRNAs from dark and light grown Euglena were analyzed on Northern blots.

Recent years have seen the emergence of Mycobacterium abscessus, a highly drug-resistant non-tuberculous mycobacterium, which causes life-threatening infections in people with chronic lung conditions like cystic fibrosis. This opportunistic pathogen is refractory to treatment with standard anti-tuberculosis drugs and most currently available antibiotics, often resulting in accelerated lung function decline. This project aims to use a structure-guided fragment-based drug discovery approach to develop effective drugs to treat M. abscessus infections. During the early stage of the project, three bacterial targets were identified, based on analysis of the structural proteome of M. abscessus and prior knowledge of M. tuberculosis drug targets, followed by gene knockout studies to determine target essentiality for bacterial survival. The three targets from M. abscessus were then cloned, expressed and purified and suitable crystallization conditions were identified leading to the determination of high resolution structures. Further, a large number of starting fragments that hit the three target proteins were determined, using a combination of biophysical screening methods and by defining crystal structures of the complexes. For target 3, PPAT (Phosphopantethiene adenylyl transferase), a chemical linking of two fragments followed by iterative fragment elaboration was carried out to obtain two compounds with low micromolar affinities in vitro. However, these compounds afforded only low inhibitory activity on M. abscessus whole cell. All starting fragments of target 2, PurC (SAICAR synthase), occupied the ATP indole pocket. Efforts were then made to identify further fragment hits by screening diverse libraries. Sub-structure searches of these initial fragment hits and virtual screening helped to identify potential analogues amenable to further medicinal chemistry intervention. While fragment hits of target 1, TrmD (tRNA-(N1G37) methyl transferase), were prioritized, whereby two chemical series were developed using fragment growing and merging approaches. Iterative fragment elaboration cycle, aided by crystallography, biophysical and biochemical assays led to the development of several potential lead candidates having low nano-molar range of in vitro affinities. Two such compounds afforded moderate inhibition of M. abscessus and stronger inhibition of M. tuberculosis and S. aureus cultures. Further chemical modifications of these compounds as well as others are now being done, to optimize cellular and in vivo activities, to be ultimately presented as early stage clinical candidates.

Analyse structurale (structure secondaire et tertiaire) d'un fragment contenant la sequence "trna like" (extremite 3' oh possedant plusieurs caracteristiques d'un arn de transfert). Modelisation de la structure sur ecran graphique. Analyse des zones de contact entre ce fragment d'arn et la valyl-trna synthetase, a l'aide de differentes sondes structurales. Discussion sur le role de l'extremite "trna like" dans le cycle de developpement du virus (regulation de la traduction de l'information genetique portee par l'arn viral)

La méthylation de l'adénine en position 58 des ARNt (m1A58) est présente dans les trois domaines de vie et joue un rôle crucial chez plusieurs organismes. Sa formation est catalysée par la méthyltransférase SAM-dépendante TrmI. Alors que chez les eucaryotes et les bactéries, TrmI est site-spécifique pour l'adénine en position 58, chez l'archée Pyrococcus abyssi, TrmI est région-spécifique puisqu'elle catalyse également la méthylation de l'adénine en position 57. Nous nous sommes intéressés à cette enzyme, PabTrmI, pour comprendre cette différence de spécificité par rapport à ses homologues eucaryotes et bactériens.La structure cristallographique de l'enzyme, en complexe avec son cofacteur SAM ainsi qu'avec le produit de la réaction, la SAH, nous a conduit à construire différents mutants de la protéine et de son substrat ARNt. Nous avons ainsi montré que His78, située à l'entrée du site actif, est mobile et est importante pour l'efficacité catalytique de PabTrmI. L'analyse des positions de méthylation par spectrométrie de masse, simple et en tandem, montre qu'une partie de la région-spécificité de l'enzyme pour certains ARNt de P. abyssi, est liée à la présence de trois adénines consécutives, PabTrmI ne méthylant que la première adénine d'une séquence AA.En vue d'étudier les cinétiques rapides du mécanisme de retournement de la base de l'ARNt par l'enzyme région-spécifique PabTrmI et l'enzyme bactérienne site-spécifique TthTrmI de T. thermophilus, nous avons vérifié dans un premier temps, par spectrométrie de masse, qu'un mini-ARNt, constitué de la tige acceptrice et de la tige-boucle T, est substrat de TrmI.

Nous avons determine la sequence nucleotidique des genes de trna#l#y#s, trna#m#e#t-2, trna#t#y#r, trna#p#r#o, trna#s#e#r, trna#g#l#u, trna#a#s#n, trna#p#h#e et d'un pseudogene de trna#p#r#o presents sur le dna mitochondrial du mais. La localisation de l'ensemble des genes de trna portes par les cercles-maitres des varietes de mais a cytoplasme fertile b37-n et a cytoplasme male sterile b37-cmst a ete comparee. Tous les genes identifies dans ce travail sont transcrits dans la mitochondrie. Ils ont tous une nature procaryotique et trois d'entre eux (trna#m#e#t-2, trna#a#s#n et trna#p#h#e) derivent d'une insertion de dna chloroplastique dans le genome mitochondrial du mais. Nous avons en outre montre la presence, dans le dna nucleaire, de plusieurs genes de trna mitochondriaux qui sont ainsi importes dans la mitochondrie. Nous avons etudie d'autres insertions de dna chloroplastique dans la mitochondrie du mais et demontre que l'ensemble de la sequence repetee inversee du dna chloroplastique a ete transfere dans la mitochondrie lors d'un evenement unique. L'utilisation du code genetique dans la mitochondrie du mais est discutee

Le passage de l'adn aux proteines est une succession de reactions compliquees mais il peut etre decompose de facon simple en deux etapes principales : la transcription, qui copie fidelement l'information codee par l'adn en molecules d'arn messager, et la traduction de ces arns messagers en proteines. Pour activer la transcription d'un gene, des facteurs nommes facteurs de transcription doivent se fixer a leurs promoteurs. Nous avons etudie les interactions adn - proteine de deux d'entre eux : rev-erb et sry. D'une part, l'element de reponse aux hormones de rev-erb , le 15 mere rev-re, a ete modelise en se basant sur les contraintes obtenues par rmn. Sous sa forme libre, cette molecule d'adn adopte une conformation d'adn b quasi canonique. Les premieres etudes sur le complexe rev-erb - rev-re montrent que d'importantes deformations du duplex d'adn apparaissent. D'autre part, les complexes sry-8 mere et sry-14 mere ont ete analyses par rmn du phosphore et pour la premiere fois l'attribution complete de tous les signaux phosphore dans un complexe adn - proteine a ete realisee. Au niveau de l'etape de traduction, chaque codon de l'arn messager est reconnu par l'anticodon equivalent d'un arn de transfert charge avec l'acide amine apparente. Le chargement (ou aminoacylation) specifique d'un acide amine sur son arn de transfert apparente est catalyse par les aminoacyl-trna synthetases (aarss). La structure du domaine c-terminal de la tyrosine trna synthetase (tyrrs) de bacillus stearothermophilus est etudiee par rmn heteronucleaire et l'analyse des spectres tridimensionnelles ( 1 3c- 1 5n- 1h) nous a permis d'identifier les elements de structure secondaire qu'une etude cristallographique n'avait pas pu reveler.

Les aminoacyl-trna synthetases (aars) sont des enzymes impliquees dans les premieres etapes de la synthese proteique. Elles catalysent le chargement d'un trna par son acide amine specifique. La purification de la tyrosyl-trna synthetase (tyrrs) cytoplasmique de germe de ble est decrite. Le cycle de purification permet a partir de 100 g de germe de ble d'obtenir 100 g a 200 mg d'enzyme pure et active. La tyrrs de germe de ble possede une structure de type 2 et un poids moleculaire de 110000 (=55000). Les constantes cinetiques et les optimums de concentration en atp/mg et kcl, ainsi que le ph optimum de la reaction enzymatique sont determines. Le rna constituant le genome du virus de la mosaique du brome (bmv) possede a son extremite 3-oh une structure en trna-like qui peut etre charge par la tyrosine par la tyrrs de la cellule hote. Le role de cette structure pour le cycle viral est etudie au niveau de la traduction du rna en proteines virales. Le modele experimental consiste a faire interagir le rna vital et la tyrrs de germe de ble pure, pendant ou avant la traduction in vitro du rna viral dans le systeme de synthese proteique acellulaire de germe de ble, et a mesurer l'efficacite de cette synthese proteique. Les resultats obtenus montrent que la propriete de tyrosylation ne semble pas etre importante pour la traduction in vitro du rna viral. La recherche du gene de la tyrrs de germe de ble est discutee. Des sondes oligonucleotidiques ainsi que le gene d'une tyrrs d'eucaryote inferieur utilises pour cribler des banques de dna genomique (embl 3) et de cdna (lambda gt-11) de ble, ainsi qu'un criblage immunologique de la banque d'expression lambda gt-11 n'ont pas permis d'obtenir des clones dont la sequence permettrait d'affirmer qu'il s'agit de la tyrrs. Des reactions de pcr effectuees sur du dna genomique et sur du cdna de ble (obtenu a partir de la banque lambda gt-11) se sont revelees infructueuses. Neanmoins, au cours d'un criblage de la banque de cdna, clone obtenu semble contenir environ 50% de la partie codante d'un gene d'aminotransferase

In bacteria, tRNA molecules are produced as precursors with additional nucleotides both upstream and downstream of the tRNA coding sequence. To generate a mature tRNA, the endoribonuclease RNase P removes the upstream sequence, while a number of enzymes can remove the downstream sequence. In this thesis, the influence of such upstream and downstream sequences on the expression of mature functional tRNA was studied. It was found that in Escherichia coli, the presence of an upstream sequence positively influences tRNA expression. Furthermore, it was shown that the identity of the nucleotide immediatedly 5' of the canonical RNase P cleavage site in a tRNA precursor influenced RNase P cleavage site selection in vivo in E. coli, but not in Pseudomonas aeruginosa. Additionally, a stem-loop in the precursor just downstream of the tRNA increased this "miscleavage". This stem-loop resembled a rho-independent transcription terminator and overlapped the trpT gene in P. aeruginosa, but it only marginally influenced the expression of the downstream secE gene. The trpT and secE genes were found to be cotranscribed. The trpT-secE gene order was also conserved in the majority of bacteria investigated. The expression of tRNA genes during development in Streptomyces coelicolor was also studied. Here, the expression of most tRNA genes tested increased with time during development. Similarly, the expression of the RNase P RNA increased. The relative increase was quantified and correlated with different criteria related to gene structure and gene organisation, but no significant differences could be found. Moreover, a tRNALeuCAA UUA codon suppressor as well as the cognate bldA tRNA could restore differentiation to a developmentally blocked bldA deletion strain. For both tRNAs, the efficiency of restoration depended on the 5'- and 3'-flanks. In conclusion, both 5'- and 3'-flanking sequences influence tRNA expression, and bacteria respond differently to changes in their tRNA gene structures.

L'aminoacide selenocysteine represente la forme biologique du selenium incorpore cotraductionnellement dans les selenoenzymes. Chez les procaryotes, l'incorporation de selenocysteine fait appel au trna selenocysteine, au codon uga situe dans un contexte particulier et a un facteur d'elongation specifique nomme selb. Le systeme eucaryote est moins bien connu et le but de ma these etait d'aider a une meilleure comprehension des mecanismes presidant au decodage de la selenocysteine chez les eucaryotes. Mes travaux de these ont porte essentiellement sur l'etude du trna selenocysteine eucaryote. J'ai, dans un premier temps, determine la structure secondaire et tertiaire de ce trna. Ceci a ete realise sur des trna transcrits in vitro, en utilisant une large panoplie de sondes de structure, enzymatiques et chimiques. La deuxieme partie de mon travail de these a consiste a etablir la liste des nucleotides modifies du trna#s#e#c en utilisant le systeme de microinjection de genes du trna#s#e#c ou de transcrits radioactifs dans les oocytes de xenopus laevis. J'ai montre notamment que u34, premiere base de l'anticodon du trna#s#e#c, est modifie en mcm#5u34, dans le cytoplasme des oocytes et ce, de maniere assez complexe. La derniere partie de mon travail de these porte davantage sur l'aspect fonctionnel de la molecule. Nous avons montre que les deux paires de bases non canoniques de l'helice acceptrice ainsi que la longueur exceptionnelle de l'helice d semblent avoir ete conservees au cours de l'evolution, pour la reconnaissance du trna par les facteurs agissant dans les etapes posterieures a la charge. Enfin, en collaboration avec l'equipe du dr. Bock, nous avons demontre que le trna#s#e#c eucaryote fonctionne de facon parfaitement correcte dans le systeme d'incorporation de selenocysteine chez les procaryotes

L'analyse des différent états complexés de la ThrRS montre que la fixation de l'acide aminé déclenche un mouvement coordonné de la chaîne principale correspondant à 50 acides aminés. La fixation de l'ATP implique un mouvement important de la chaîne principale de l'autre côté du site catalytique et la rupture d'un pont salin. La boucle du motif 2, essentielle pour la première étape de la réaction, est également concernée. La fixation de l'ARNt requiert l'adaptation des régions déjà impliquées dans la fixation des petits substrats ainsi que d'une boucle qui vient stabiliser la conformation du complexe actif. La structure de la région N-terminale de la ThrRS de E. Coli a permis de localiser le site de fixation de la sérine dans le site de correction des erreurs d'aminoacylation de l'ARNt spécifique de la thréonine par la sérine, mais son orientation exacte reste ambigüe, ce qui suggère le faible affinité du site. Dans la structure cristalline à 2. 8 ? de résolution de la ThrRS de S. Aureus, ce domaine contiendrait un ion métal. La ThrRS de E. Coli réprime sa propre traduction en se fixant à un opérateur situé en amont du codon d'initiation. La structure du complexe entre le cœur catalytique de la ThrRS et le domaine essentiel de l'opérateur montre que le mode de reconnaissance de la boucle de l'anticodon de l'ARNt a été utilisé par le mRNA pour initier la fixation par l'enzyme. La position finale de l'opérateur repose sur un motif caractéristique du RNA, qui s'est adapté à la surface de l'enzyme pour générer un mécanisme de contrôle basé sur l'empêchement par gêne stérique de la fixation du ribosome. La structure de la sous-unité a de la GlyRS (tétramérique) d'E. Coli montre que cette protéine consiste en une partie importante du cœur catalytique d'une aminoacyl-ARNt synthétase de classe II. Les motifs 1 et 2, qui n'étaient pas mis en évidence par l'alignement de séquences, y sont clairement présents. La structure se distingue de celle des autres enzymes de classe II par la présence de trois hélices situées au-dessus du feuillet ß antiparallèle canonique. La structure quaternaire de cette enzyme serait a2ß2, à la différence du cas (aß)2 représenté par la phénylalanyl-ARNt synthétase
The analysis of different complexed states on the system of ThrRS shows that the binding of the amino acid promotes a movement in the Ca position of 50 amino acids in one side of the catalytic domain. The binding of ATP triggers a movement in the Ca position of a salt bridge-locked region that is part of the core b-sheet cradling the small substrates. Two other small regions that surround the catalytic site move due to the small substrate binding in a cooperative way. The tRNA interacts with all four of these loops and several residues initially bound to threonine or ATP switch to a position in which they can contact the tRNA. The crystal structures of S. Aureus ThrRS and of the N-terminal region of E. Coli ThrRS show the presence of one metal ion and of a putative serine in the editing site, respectively. The role of the metal ion and the exact orientation of the amino acid could not be determined unambiguously, suggesting the low affinity of the sites. E. Coli ThrRS represses its own translation by binding to an operator located upstream of the initiation codon. The crystal structure of the complex between the core of ThrRS and the essential domain of the operator shows that the recognition mode of the tRNA anticodon loop has been utilized by the mRNA to initiate the binding. The final position of the operator, upon which the control mechanism is based, relies on a characteristic RNA motif adapted to the enzyme surface. The crystal structure of the a-subunit of E. Coli GlyRS shows that this protein forms most of the canonic catalytic core of the class II tRNA synthetases. This subunit shows unambiguously the presence of motif 1 and 2, difficult to infer at the sequence level. The structure differs from the core of other class II aaRS by the presence of three helices covering 80 residues of the C-terminal region and situated on top of the antiparallel b strand. The quaternary structure of this enzyme would be a2b2, in contrast with the (ab)2 case presented in PheRS

La modification posttranscriptionnelle des acides ribonucléiques (ARNs) est une étape de maturation conservée dans tous les domaines du vivant. Mes travaux de thèse ont porté sur la caractérisation fonctionnelle et structurale de flavoenzymes impliquées dans la modification des ARN de transfert (ARNt) : les dihydrouridines synthases (Dus) dictant la formation de dihydrouridine via la flavine mononucléotide (FMN) et TrmFO responsable de la méthylation en C5 de l'uridine 54 via la flavine adénosine dinucléotide (FAD) ainsi que le methylènetétrahydrofolate. Afin d'élucider le mécanisme de TrmFO, nous avons élaboré une apoenzyme grâce à une simple mutation qui est efficacement reconstituée in vitro. Nous avons chimiquement synthétisé l'intermédiaire catalytique qui consiste en un FAD-iminium comportant un methylène sur le N5 de l'isoalloxazine. Cette espèce synthétique a été caractérisée par spectrométrie de masse et absorption UV-visible. La reconstitution de TrmFO avec cette molécule restore l'activité in vitro sur un ARNt transcrit prouvant le rôle du FAD comme agent méthylant via une méthylation réductrice. Dus2 réduit spécifiquement U20 et est constituée d'un Dus domaine néanmoins, chez les mammifères un double-stranded RNA-binding domaine (dsRBD) est présent. Afin de comprendre la fonction de cette organisation modulaire, nous avons montré que seule l'enzyme sauvage est active contrairement aux domaines isolés. Nous avons résolu les structures cristallographiques des deux domaines suggérant une redistribution des charges positives en surface. Ce dsRBD dicte la reconnaissance de l'ARNt en se fixant à la tige acceptrice/Tpsi. Ceci est régulé par une extension N-terminal, mis en évidence par des mutations, des titrations RMN ainsi qu’une structure cristallographique en complexe avec un ARN de 22 nucléotides. Ce travail illustre l’acquisition d’un dsRBD au cours de l’évolution dont la fonction est étendu à la reconnaissance des ARNts
Posttranscriptional modification of ribonucleic acids (RNAs) is a crucial maturation step conserved in all domains of life. During my thesis, I have brought structural and functional insights on flavoenzymes involved in transfer RNA (tRNA) modifications: dihydrouridine synthase (Dus) responsible for dihydrouridine formation using flavin mononucleotide (FMN) and TrmFO responsible for C5 methylation of uridine position 54 relying on flavin adenosine dinucleotide (FAD) and methylenetetrahydrofolate. To elucidate the chemical mechanism of TrmFO we designed an apoprotein via a single mutation that could be reconstituted in vitro with FAD. Furthermore, we chemically synthesized the postulated intermediate active species consisting of a flavin iminium harboring a methylene moiety on the isoalloxazine N5 that was further characterized by mass spectrometry and UV-visible spectroscopy. Reconstitution of TrmFO with this molecule restored in vitro activity on a tRNA transcript proving that TrmFO uses FAD as a methylating agent via a reductive methylation.Dus2 reduces U20 and is comprised of a canonical Dus domain however, mammals have an additional double-stranded RNA-binding domain (dsRBD). To bring functional insight for this modular organization, we showed that only full length human Dus2 was active while its isolated domains were not. tRNA recognition is driven by the dsRBD via binding the acceptor and TΨ stem of tRNA with higher affinity then dsRNA as evidenced by NMR. We further solved the X-ray structures for both domains showing redistribution of surface positive charges justifying the involvement of this dsRBD for tRNA recognition in mammalian Dus2. This was attributed to a peculiar N-terminal extension proven by mutational analysis and an X-ray structure of dsRBD in complex with 22-nucleotide dsRNA. Altogether our work illustrates how during evolution, Dus2 enzymes acquired an engineered dsRBD for efficient tRNA binding via a ruler mechanism

Adenosine deaminase acting on tRNAs (ADAT) is a eukaryotic heterodimer, composed by ADAT2 and ADAT3, that catalyses the deamination of adenosine-to-inosine in the anticodon loop of tRNAs. ADAT proteins are essential for the cell, as the adenosine-to-inosine modification enables the proper recognition of all the codons during translation. Indeed, a single point mutation in one of the subunits of the heterodimer is causing mental retardation in some patients. However, there is no structural information of any eukaryotic deaminase, thus hampering the development of any kind of treatment. In this work, we have studied the human ADAT2-ADAT3-tRNA complex using cryo-EM and SAXS, proposing a model of the ternary complex which sheds light on the molecular insights of the deamination and paves the way for further structural studies. Also, the emergence of ADAT proteins in eukaryotes entails the enrichment of potential ADAT-substrates within tRNA pools. The only exception to this evolutionary trend is the tRNAGlyACC, which is not transcribed in humans. In this thesis, we have determined the atomic structure of the tRNAGlyACC by X-ray crystallography, which presents a typical L-shape conformation but with a cleaved anticodon loop, probably digested by a RNase. This finding supports the hypothesis of a disordered structure in the tRNAGlyACC anticodon loop nucleotides, and it may explain its absence in the human transcriptome.

L'etude structurale de l'aspartyl-trna synthetase (asprs) de thermus thermophilus a fait l'objet de ce memoire de these. Dans une introduction generale le point est fait sur l'etat des connaissances concernant les aminoacyl-trna synthetases. Dans une deuxieme partie sont decrits les aspects biochimiques du travail: clonage du gene codant pour l'asprs, sequencage, surproduction et purification. Les aspects cristallographiques relatifs a ce travail sont ensuite exposes: cristallisation, enregistrement de donnees, construction et affinement modele. Enfin dans une derniere partie est analysee la structure: aspect modulaire des asprs, caracteristique des asprs procaryotes, etude du site actif et des relations structure-fonction