Дисертації з теми "Transmission mitochondriale"

L'ensemble de notre travail concerne trois aspects de la recherche en génétique mitochondriale humaine. Notre premier axe d'étude a été la transmission de l'ADN mitochondrial des parents aux enfants conçus par injection intracytoplasmique de spermatozoi͏̈de (ICSI). Si les risques de transmission de défauts de l'ADN nucléaire paternel sont reconnus depuis les débuts de cette technique de procréation médicalement assistée, aucune étude n'avait recherché à l'aide de techniques hautement sensibles chez les enfants conçus par ICSI la présence de molécules d'ADN mitochondrial d'origine paternelle. Nous avons montré qu'il n'existait pas, dans le sang circulant des enfants étudiés, d'ADN mitochondrial paternel détectable par les techniques utilisées. Notre deuxième axe d'étude avisé à préciser la responsabilité d'une classe de gènes de l'ADN mitochondrial, les gènes d'ARN de transfert, dans certaines maladies mitochondriales. Nous avons mis au point un outil d'analyse de l'ADN mitochondrial permettant d'analyser rapidement la séquence des 22 gènes d'ARN de transfert à la recherche de mutations de ces gènes. Appliqué à l'investigation d'une vaste cohorte de patients, cet outil a permis de détecter de très nombreuses variations de séquence, certaines déjà connues pour être pathogènes ou au contraire anodines, d'autres nouvelles et suspectes d'être pathogènes. Un travail complémentaire d'analyse des données et de validation des mutations a été nécessaire à l'interprétation des résultats. Il a également permis de mieux définir les indications d'une telle recherche. En troisième lieu, nous nous sommes intéressés à la part que pouvaient avoir les lésions de l'ADN mitochondrial dans la physiopathologie du vieillissement musculaire, et plus particulièrement dans la genèse des fibres négatives pour l'activité cytochrome oxidase. Nous avons recherché des mutations de l'ADN mitochondrial dans ces fibres, et avons pu montrer que, dans un certains nombre d'entre elles, une expansion clonale de molécules d'ADN mitochondrial porteuses de mutations ponctuelles des gènes d'ARN de transfert était responsable du déficit enzymatique
Mitochondrial genetics is important to consider when dealing with infertility, mitochondrial diseases or ageing. Our work contributes to the clarification of the role and behaviour of mitochondrial DNA (mtDNA) in those three circumstances. First, we studied mtDNA inheritance in children born after a particular in vitro fertilisation technique, i. E. Intracytoplasmic injection of spermatozoon (ICSI). Although the risk of transmission of a paternal infertility-linked nuclear defect by this technique is well known, the possible transmission of the patemal mtDNA had never been addressed by means of highly sensitive detection assays. By using different sensitive techniques, we showed that there was no detectable paternally inherited mtDNA in the peripheral blood of the 27 children who were studied. Second, we aimed at determining the contribution of mtDNA tranfer RNA (tRNA) gene defects to the pathogenesis ofmitochondrial disorders. We set up an exhaustive scanning method to screen ah tRNA genes for mutations, and applied it to a large number of selected patients with mitochondrial disorders. We found numerous sequence variations of those genes, some of them already known to be pathogenic or polymorphie, others being questionable from a functional point of view. We performed an evaluation of each questionable sequence variation by all possible means, and were able to assign a precise significance to most of them. In retrospect, we tried to delineate the best indications for the screening ofmtDNA tRNA genes. Third, we wanted to determine the contribution of mtDNA mutations to the ageing process of human muscle, at a single fibre level. We looked for large-scale rearrangements and tRNA gene point mutations in a large number of fibres defective in cytochrome c oxidase (COX- fibres) activity and an equal number of normal fibres (COX+ fibres) from normal biopsy samples taken from ageing subjects. We detected large scale rearrangements in several fibres. Most interestingly, we detected, characterised and quantified tRNA gene point mutations in several COX- fibres, such mutations being absent from COX+ fibres. We showed that clonally expanded point mutations contribute toageing process in muscle, by a segmental alteration of the respiratory chain activity

Depuis quelques années, de nombreux travaux suggèrent que des perturbations des fonctions mitochondriales contribuent aux maladies neurodégénératives. Les mitochondries sont particulièrement importantes pour les neurones en raison à leur rôle dans la régulation calcique, la signalisation redox, la plasticité synaptique et, in fine, la survie cellulaire. La dynamique mitochondriale contrôle la morphologie de l'organelle via un équilibre délicat entre deux forces opposées : la fusion et la fission régulées par des dynamines de la grande famille des GTPases. Notre équipe a montré que la perte ou des mutations de la protéine de fusion OPA1 entraînent des dysfonctionnements de la membrane interne mitochondriale pouvant mener à l'apoptose, qui revêtent une importance particulière dans l'atrophie optique autosomale dominante (ADOA-1). Pour comprendre les mécanismes par lesquels des altérations de la dynamique mitochondriale pourraient contribuer à des dysfonctionnements mitochondriaux et éventuellement à l'origine de la neurodégénérescence, nous avons étudié les effets de la perte d'OPA1 dans des neurones corticaux ex vivo. La perte de fonction à l'interférence à l'ARN mène à la fragmentation mitochondriale sans perturbation de la distribution mitochondriale, ni mort neuronale. Si l'arborescence dendritique est inchangée, la quantité de plusieurs protéines synaptiques est réduite, suggérant une déficience synaptique. De plus, dans ces conditions, l'état redox est altéré et la quantité protéique de complexes respiratoires spécifiques est réduite. Enfin, l'enregistrement des propriétés électrophysiologiques montrent des changements dans la transmission synaptique, notamment par une diminution de la fréquence des courants excitateurs et une augmentation de la fréquence des courants inhibiteurs. De façon intéressante, un traitement à la forskoline permet de restaurer un fonctionnement électrophysiologique normal. Pour conclure, nos données offrent de nouvelles pistes non seulement dans la compréhension de maladies neurodégénératives liées directement à la dynamique mitochondriale comme l'ADOA1, mais aussi d'autres pathologies neurodégénératives liées à un défaut du métabolisme oxydatif comme les maladies d'Alzheimer, Parkinson ou Huntington
In the past few years, multiple findings have suggested that disruptions of mitochondrial functions and dynamics contribute to neurodegenerative diseases. Mitochondrial functions in neurons include regulation of calcium and redox signaling, developmental and synaptic plasticity as well as the arbitration of cell survival and death. Mitochondrial dynamics controls the organelle's morphology via a delicate balance of two opposing forces: mitochondrial fusion and fission that are regulated by large dynamin-related GTPases evolutionary conserved from yeast to human. We have previously demonstrated that the fusion protein OPA1 loss or mutations led to mitochondrial inner membrane dysfunctions and apoptosis of particular importance in optic nerve pathologies like ADOA1 (autosomal dominant optic atrophy). While links emerge between defects in mitochondrial fusion and neurodegeneration, the processes involved are still largely unknown. To understand the mechanisms by which alterations of mitochondrial dynamics could contribute to mitochondria dysfunction, eventually leading to neurodegeneration, we studied the effects of OPA1 loss of function in neurons ex vivo. In cortical neurons, RNA interference of the fusion protein OPA1 led to mitochondrial fragmentation without altering neither mitochondrial distribution nor neuronal death rate. While there was no incidence on dendrites and axon size and numbers, the quantity of several synaptic proteins was reduced, suggesting synaptic impairment. In these conditions, the redox state of OPA1 depleted-neurons was impaired and specific respiratory complex proteins quantities were decreased. Finally, electrophysiological recordings showed that OPA1 depletion induced changes in synaptic transmission, particularly in decreasing of EPSC frequency and by increasing IPSC frequency. Interestingly, forskolin treatment rescue these electrophysiological defaults. In conclusion, our data may offer new insights not only into mitochondrial dynamics-linked neurodegenerative diseases like ADOA1 but to other neurodegenerative pathologies correlated with oxidative metabolism such as Huntington's, Parkinson's and Alzheimer's diseases

Bien que la reproduction sexuée soit prédominante chez les eucaryotes, plusieurs centaines d’organismes ont opéré une transition vers la reproduction asexuée. Les transitions entre reproduction sexuée et asexuée peuvent avoir une importance et des conséquences évolutives mais elles restent largement peu décrites au niveau écologique, moléculaire, génétique ou cytologique. La reproduction asexuée par parthénogenèse correspond au développement d’un organisme à partir de gamètes sans fécondation. Bien que beaucoup d’eucaryotes soient parthénogénétiques, nous connaissons très peu les bases génétiques, les causes et les conséquences évolutives conduisant à ce mode de reproduction asexuée. Les algues brunes sont un groupe d’eucaryotes multicellulaires qui présentent une incroyable diversité en termes de cycle de vie, de systèmes sexués ou mode de reproduction. Elles représentent d’excellents modèles pour étudier l’origine, l’évolution et les mécanismes de la parthénogenèse. Dans cette thèse, les nombreux outils génétiques et cellulaires développés pour l’algue brune modèle Ectocarpus ont permis de caractériser les loci impliqués dans la parthénogenèse et de mettre en lumière les causes et les conséquences de ce développement à l’échelle de l’organisme. Nos résultats soulignent le rôle clé des chromosomes sexuels en tant que régulateur majeur de la reproduction asexuée, ainsi que deux loci autosomaux. Des effets négatifs de la parthénogenèse sur la fitness des mâles ont été identifiés ainsi que des effets sur la fitness des générations du cycle de vie. Ces résultats indiquent que la parthénogenèse pourrait être à la fois sous sélection sexuelle et sous sélection antagoniste par rapport aux générations (polyploidallie) (Chapitre 2). La croissance des zygotes est significativement affectée par la capacité parthénogénétique des parents mâles et la transmission des mitochondries a été suivie afin de caractériser les retards de croissances observés (Chapitre 2 et 3). En parallèle, la transmission mitochondriale chez Ectocarpus sp.7 s’est révélé être non usuelle (Chapitre 3). Enfin, la carte génétique générée (Chapitre 2) pour l’espèce Ectocarpus siliculosus a été comparée à celle d’Ectocarpus sp.7 (génome de référence séquencé en 2010) et a révélé une synténie fortement conservé entre les deux espèces (Chapitre 4). En étudiant la parthénogenèse chez un organisme multicellulaire qui a évolué indépendamment des plantes et des animaux, ce travail a participé à approfondir les connaissances sur les mécanismes évolutifs conduisant à la parthénogenèse
Although sexual reproduction predominates in eukaryotes, several hundred lineages have undergone the transition from sexuality to asexuality. Transitions between sexual and asexual reproduction are believed to have important evolutionary and ecological consequences, yet the molecular, genetic, and cytological foundations of such transitions remain elusive. One type of asexual reproduction is parthenogenesis, i.e., the development of an adult organism directly from gametes in the absence of fertilisation. Although many eukaryotes are capable of reproducing by parthenogenesis, we know very little about its genetic basis, and the evolutionary causes and consequences of transitions to asexuality are poorly understood. The brown algae are a group of multicellular eukaryotes, that show an extraordinary diversity of types of life cycle, sexual systems, modes of reproduction, and they provide excellent models to look at the origins, evolution and mechanisms underlying parthenogenesis. In this thesis, we have used a wide array of genomic and cell biology tools available for the model brown alga Ectocarpus to identify and characterize loci involved in parthenogenesis, shedding light on the causes and consequences of parthenogenesis at the organism level. Our results highlight the key role of the sex chromosome as a major regulator of asexual reproduction, together with two autosomal loci. Importantly, we identify several negative effects of parthenogenesis on male fitness, but also different fitness effects between parthenogenesis and life cycle generations, supporting the idea that parthenogenesis may be under both sexual selection and generation/ploidally-antagonistic selection (Chapter 2). Zygotic growth was significantly affected by the parthenogenetic capacity of the male parent and the putative role of mitochondrial inheritance patterns on the fitness of sporophytes was also investigated (Chapter 2 and 3). This work revealed an unusual transmission pattern of mitochondria specifically in Ectocarpus species 7 (Chapter 3). Finally, the QTL analysis (Chapter 2) required the construction of a genetic map for Ectocarpus siliculosus and a comparison with Ectocarpus species 7 genetic map (reference genome sequenced in 2010) showed that the synteny was highly conserved between the two species (Chapter 4). By investigating parthenogenesis in a multicellular organism that has independently evolved from plants and animals, the work presented in this thesis has helped to assess the diversity of evolutionary mechanisms that lead to parthenogenesis

Direct studies of speciation are possible in the superspecies complex of Drosophila paulistorum, which consists of six different semispecies undergoing incipient speciation. Strict maternal inheritance of mitochondria is the most common pattern of mitochondrial inheritance in animals. Here I show that paternal transmission of mitochondrial DNA occurs in the heteroplasmic Orinocan semispecies and is not limited to hybrid offspring. Inheritance of one mitotype is mainly maternal while the other is mainly paternal; a highly unusual pattern of mitochondrial inheritance. I used absolute quantification real-time PCR on DNA extracted from eggs and imagoes from the Amazonian and Orinocan semispecies, as well as hybrids between these two semispecies. In crosses performed between F1 hybrids with a combination of mitotypes not found in any of the parents, no F2 hybrids were acquired. One possible explanation for this is that differences in mitotypes and inheritance patterns of mitochondrial DNA may cause incompatibilities between the genomes of D. paulistorum. This may be one cause of hybrid inviability and genetic isolation between semispecies, a necessary part of the speciation process. This further complicates the story of the ongoing speciation process in the D. paulistorum superspecies complex, which offers much to learn about speciation, mitochondrial inheritance and interactions between multiple genomes in the same organism.

In mammals, mitochondria and mitochondrial DNA (mtDNA) are transmitted through the female germline. Mature oocytes contain nearly 200,000 copies of mtDNA, organized at 1-2 copies per organelle. Despite the high genome copy number, mtDNA sequence variants are observed to segregate rapidly between generations, and this has led to the concept of a genetic bottleneck for the transmission of mtDNA. In this thesis, I demonstrate that a subgroup of replicating genomes in the early post-natal ovary is responsible for the rapid segregation of mtDNA. I show that the rate of segregation of mtDNA can be accelerated when mtDNA copy number is further reduced in heteroplasmic germline-specific knockout mouse models, yet very extreme reductions in germ cell mtDNA content seem to cause female-specific infertility. Low copy number embryos can be fertilized and proceed through preimplantation development yet fail to develop normally after implantation. Tracking the developmental outcome of embryos containing a range of mtDNAs points to a developmental threshold of about 50,000 copies of mtDNA in the oocyte In this thesis I advance the hypothesis that the large number of mitochondria and mtDNAs present in the oocyte represent a genetic mechanism to ensure their distribution to the gametes and somatic cells of the next generation. If true, mtDNA copy number may be the most important determinant of oocyte quality not because of the effects on oocyte metabolism, but because too few would result in a maldistribution in the embryo.
Les mitochondries et l’ADN mitochondrial (ADNmt) sont des organites cellulaires qui ne sont transmis que par l'ovule de la mère. Chez les mammifères, l’ovocyte contient presque 200 000 copies d’ADNmt, avec 1-2 copies au sein de chaque mitochondrie. Malgré la grande quantité d’ADNmt, nous observons une ségrégation rapide des variants de séquences entre les générations qui nous amène à l’hypothèse d’un goulot d’étranglement génétique pour l’ADNmt. Par cette thèse, je démontre que ce phénomène est dû à un sous-groupe de génomes mitochondriaux qui se multiplient dans l’ovocyte postnatal de la souris. En outre, je démontre qu’une réduction d’ADNmt dans les cellules de souche germinale peut augmenter la vitesse à laquelle ces génotypes se séparent. Une très importante réduction d’ADNmt dans les ovocytes de ces souris mutantes les rend stériles. Or la fertilisation de ces ovocytes ainsi que le développement pré-implantatoire se déroulent normalement, par contre l’embryon qui provient d’un ovocyte avec une très faible quantité d’ADNmt ne peut compléter son développement post-implantatoire. Par cette thèse, je propose l’hypothèse suivante : que la grande quantité de mitochondries et génomes mitochondriaux sert à distribuer un nombre suffisant de ces organites aux cellules somatiques et germinales de la prochaine génération. Si cela est vrai, la quantité d’ADNmt pourrait être le plus important déterminant quant à la qualité de l’ovocyte, pas à cause de ses effets sur le métabolisme de l’ovocyte, mais par le fait qu’une quantité insuffisante empêcherait sa distribution dans les cellules de l’embryon.

Mitochondria are essential for cellular processes such as energy provision and Ca2 + buffering. Due to the highly polarized architecture of neurons, the positioning of mitochondria to areas of high activity is crucial for normal neuronal function. It has previously been shown that mitochondria are trafficked dependent upon neuronal activity. In this thesis, the role of mitochondria at the presynaptic terminal is investigated in order to determine whether the presence of mitochondria in turn influences neuronal transmission. Dual-colour live imaging reveals that terminals occupied by a mitochondrion show lower Ca2 + responses and that transmitter release is reduced. Furthermore, evidence for a role of activity-dependent positioning of mitochondria in homeostatic plasticity is shown, which is dependent upon the function of the Ca2 + -sensitive mitochondrial protein Miro1. Furthermore, the role of Miro1 in positioning mitochondria at presynaptic terminals is investigated in a knockout mouse system. This shows that calcium buffering seems to be changed in the Miro1 knockout neurons and that activity-dependent positioning of mitochondria to presynaptic terminals is affected. Taken together, this thesis examines the functions of mitochondria in the presynaptic terminal and sheds light on how their presence in the terminal may be regulated.

Donor cell mitochondrial DNA (D-mtDNA) outcomes in somatic cell nuclear transfer (SCNT)-embryos, foetuses and offspring are variable. The factors that regulate D-mtDNA transmission and its influence ,post-SCNT are uncertain. Therefore, ovine primary foetal fibroblast (PDFF2 and SSFl) cells were depleted of their mtDNA to varying degrees using low concentrations of ethidium bromide. JC 1 staining, transmission electron microscopy, reverse transcription PCR, immunocytochemistry and Western blotting were used to determine the effects of mtDNA-depletion on the ovine cells prior to SCNT. PDFF2 cells containing full (PDFF2 mtDNA), partially-depleted (PDFF2 mtDNAPD ) and almost completely depleted (PDFF2 mtDNA 0) mtDNA complements were used successfully to produce SCNT -embryos up to the hatched blastocyst stage. Quantitative allele-specific-real time PCR analysis revealed that 74% of the PDFF2 SCNT-embryos contained D-mtDNA (range 0.01 to 8.72%). Furthermore, the persistence (P < 0.002) and amount of D-mtDNA (P < 0.007) was significantly reduced in PDFF2 mtDNA 0 embryos compared to PDFF2 mtDNA+ embryos, although their blastocyst formation rates and number of cell per blastocyst were similar. In order to verify the PDFF2 SCNT-embryo outcomes, another set of SCNTembryos was produced using SSFI cells ~ontaining full (SSFI mtDNA+) and almost completely depleted (SSFI mtDNAo) mtDNA complements. 86% of the SSFI SCNT-embryos contained D-mtDNA (range 0.01 to 1.19%) and the amount ofD-mtDNA was reduced, though not significantly, in the SSFI mtDNAo embryos compared to the SSFI mtDNA + embryos. Interestingly, the SSFI mtDNA 0 blastocysts contained significantly more cells than SSFI mtDNA+ blastocysts (P < 0.05). Taken together, these data show that: I) persistent D-mtDNA is a common feature following ovine SCNT; 2) D-mtDNA outcomes in ovine SCNT -embryos are influenced by the amount of mtDNA in the nuclear donor cells, 3) small amounts of D-mtDNA « 9%) in ovine SCNT-embryos do not influence their blastocyst formation rates, and finally 4) depending on the cell line, using nuclear donors almost completely depleted ofmtDNA increases ovine SCNT -blastocyst cell number and therefore could enhance their developmental competence.

Maintaining mitochondrial genome sequence integrity is essential for preserving normal mitochondrial function. Several human diseases have been associated with heteroplasmic mitochondrial genome mutations, but few genetic systems can simultaneously represent pathogenic mitochondrial genome evolution and inheritance. The nematode Caenorhabditis briggsae is one such model. Natural C. briggsae isolates are globally-distributed and phylogenetically grouped into three distinct clades, with isolates exhibiting varying levels of a large-scale mtDNA deletion, nad5∆. Furthermore, a small subset of clade II isolates exhibits putative compensatory mutations that may reduce the risk of deletion formation and accumulation in those populations. In this thesis, the author characterizes the dynamics of nad5∆ heteroplasmy levels during both development and transmission in several C. briggsae natural isolates, including two containing putatively protective compensatory mutations (C+). For all isolates tested, nad5∆ heteroplasmy levels increased across nematode development, with L1 (first larval stage) exhibiting the lowest deletion load for all but one isolate that exhibited highly variable nad5∆ levels, while the increase was slowest and overall nad5∆ levels remained relatively low in C+ isolates. These results support previous work suggesting that nad5∆ is a selfish element and demonstrate the protective nature of compensatory mutations in inhibiting mtDNA deletion accumulation. In nad5∆ inheritance assays, C+ isolates displayed a strong pattern of reversion to wildtype mtDNA levels that was not seen in isolates lacking compensatory mutations (C-). These assays also showed that nad5∆ inheritance was not well predicted by total maternal nad5∆ proportion in either C+ or C- isolates; offspring nad5∆ levels were generally much lower than maternal levels, consistent with some form of negative selection operating between generations. Assays of both maternal somatic and gonadal tissues had slightly more power to predict offspring deletion levels than did assays of whole-worm maternal samples; this result likely points to variance in deletion levels originating from an untested parental tissue type present within the whole-worm samples. This thesis provided deeper insights into the patterns of mtDNA deletion transmission and age-associated dynamics. It was the first project of its type to survey mutation dynamics and heteroplasmy levels of a naturally-occurring large-scale mtDNA deletion. Thus, this work serves to further develop C. briggsae for use as an experimental model of human mtDNA deletion dynamics and mitochondrial dysfunction.

L’universalisation des traitements antirétroviraux (ARV) couplée à l’augmentation de la couverture ARV chez les femmes enceintes et allaitantes infectées par le VIH voit l’émergence d’une population grandissante d’enfants non infectés nés de mères séropositives, exposés à la fois au VIH et aux ARV maternels de la conception à la petite enfance. Si l’impact de ces expositions questionne sur la santé de ces enfants et fait l’objet de maintes études, la prophylaxie ARV postnatale qui leur ait administrée dans le cadre de la prévention de la transmission mère-enfant (TME) du VIH nécessite elle aussi être rigoureusement évaluée, ces ARV restant donnés à des enfants non infectés. Dans ce contexte, ces travaux de thèse ont consisté à évaluer la toxicité génomique aigüe et sur le long terme du lopinavir/ritonavir (LPV/r) ou de la lamivudine (3TC) utilisés en prophylaxie infantile pendant un an pour prévenir la TME du VIH par l’allaitement lors de l’essai PROMISE PEP mené dans quatre pays d’Afrique Sub-saharienne (Afrique du Sud, Burkina Faso, Ouganda et Zambie) entre novembre 2009 et mai 2012. Si cette prophylaxie étendue à toute la période de l’allaitement a montré son efficacité, avec des taux de transmission à un an de 1.4% et 1.5% pour le LPV/r et le 3TC respectivement, les recommandations actuelles de l’Organisation Mondiale de la Santé préconisent cependant une prophylaxie à base de névirapine (NVP) ou d’azidothymidine combinée à la NVP plafonnée à 12 semaines. Nos travaux indiquent que les deux prophylaxies se trouvaient associées à une prévalence importante d’enfants exposés non infectés présentant une déplétion de l’ADN mitochondrial (diminution du nombre de copies supérieure ou égale à 50% de la valeur initiale) au cours de la première année de vie. Ils ont également mis en évidence la présence d’ADN mitochondrial délétés chez la quasi-totalité des enfants dès l’initiation de la prophylaxie, démontrant ainsi une forte instabilité génomique. Toutefois, aucune association avec la croissance et le développement neuro-psychomoteur de ces enfants à 6 ans n’a été mise en évidence, alors que la déplétion ne persistait plus à cet âge-là et que les délétions sont irréversibles. Le raccourcissement de la longueur des télomères observé à un an n’a quant à lui montré aucune association avec les deux ARV et n’a eu aucun impact sur la santé des enfants à 6 ans. Ces travaux de thèse contribuent à l’évaluation globale de l’innocuité de la prophylaxie ARV utilisée chez les enfants exposés non infectés mais sont également d’intérêt pour ceux qui sont infectés et dont le traitement de première intention intègre le LPV/r et/ou le 3TC
The universalization of antiretroviral (ARV) treatment coupled with increased ARV coverage among HIV-infected pregnant and lactating women is contributing to an emerging population of uninfected children born to HIV-positive mothers, exposed to both maternal HIV and ARVs from conception to early childhood. If the impacts of these exposures on the health of these children is questionable and the subject of many studies, the post-natal ARV prophylaxis given to them as part of the prevention of mother-to-child transmission (PMTCT) of HIV also needs to be rigorously evaluated, as these ARVs continue to be given to uninfected children. In this context, this thesis work consisted of evaluating the acute and long-term genomic toxicity of lopinavir/ritonavir (LPV/r) or lamivudine (3TC) used as infant prophylaxis for one year to prevent MTCT of HIV through breastfeeding in the PROMISE PEP trial conducted in four sub-Saharan African countries (South Africa, Burkina Faso, Uganda and Zambia) between November 2009 and May 2012. While this extended prophylaxis during the entire breastfeeding period has shown its efficacy, with transmission rates at one year of life of 1.4% and 1.5% for LPV/r and 3TC respectively, current World Health Organization guidelines recommend prophylaxis with nevirapine (NVP) or azidothymidine combined with NVP for a maximum of 12 weeks. Our work indicates that both prophylaxis regimens were associated with a significant prevalence of mitochondrial DNA depletion (decrease of mitochondrial copy number greater than or equal to 50% of the initial value) in the first year of life in children who are HIV-exposed uninfected. Our work also demonstrated the presence of deleted mitochondrial DNA in almost all children from the initiation of prophylaxis, thus indicating strong genomic instability. However, we found no association with the growth and neuropsychomotor development of these children at 6 years, at which point the depletion no longer persists and the deletions are irreversible. The shortening of telomere length observed at one year of age showed no association with the two ARVs and had no impact on the health of the children at 6 years. This thesis work contributes to the overall evaluation of the safety of ARV prophylaxis used in children who are HIV-exposed uninfected, but is also of interest to those who are infected and whose first-line treatment includes LPV/r and/or 3TC

Andrologische Forschungsarbeiten der letzten Jahre beweisen, dass einzelne, aus somatischen Zellen bekannte Apoptose-typische Veränderungen bei humanen Spermien einen negativen Einfluss auf die Fertilität des Mannes haben. Umstritten ist, ob es sich dabei nur um einen abortiven Zelltod als Zeichen einer Reifungsstörung während der Spermatogenese handelt oder ob Apoptose auch in reifen Spermien induzierbar ist. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, durch Untersuchungen zur Induzierbarkeit der Apoptose in reifen und unreifen Spermatozoen die vollständige Funktionalität verschiedener Signalkaskaden sowie deren Umsetzung in morphologische Veränderungen aufzudecken. Darüber hinaus sollte die Rolle des intrazellulären Calciumspiegels als möglicher Interaktionspartner zwischen Akrosomreaktion und Apoptose geklärt werden, um Informationen über die Zukunft der nicht fertilisierenden Spermien im weiblichen Genitaltrakt zu erlangen. In den vorliegenden Versuchsreihen konnte erstmals die gezielte Induktion der Apoptose in reifen und unreifen Spermatozoen anhand biochemischer und elektronenmikroskopischer Untersuchungen nachgewiesen werden. Dabei wurde ausführlich die erfolgreiche Aktivierung mehrerer intrinsischer Apoptosesignalwege in reifen Spermien gezeigt, deren Initiation entweder auf den Zusammenbruch innerer Mitochondrienmembranen, auf eine veränderte intrazelluläre Calciumkonzentration oder auf das Einwirken von oxidativem Stress zurückzuführen war. Zudem konnten Erkenntnisse zum antioxidativen Schutzmechanismus von Spermien gewonnen werden, welcher die Spermien gegenüber einer spezifischen Menge an H2O2 vor oxidativem Stress-bedingter Apoptose bewahrt. Sowohl die Apoptose als auch die Akrosomreaktion waren durch die Zugabe eines Calciumchelators blockierbar. Die Initiation des programmierten Zelltodes in Spermien durch einen Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration erklärt zudem eine weitere wichtige Funktion dieses Prozesses: das Absterben von akrosomenreagierten Spermien bei nicht erfolgter Fertilisation im weiblichen Genitaltrakt. Die Theorie einer rein abortiven Apoptose als Folge einer Spermatogenesestörung ist damit widerlegt.

La transmission aux semences est l’un des moyens les plus efficaces de survie et de dispersion pour les champignons phytopathogènes. Les semences ainsi contaminées sont altérées dans leur germination et leur viabilité. De ce fait, nous avons cherché à identifier des mécanismes moléculaires qui pourraient être impliqués dans cette capacité de transmission en utilisant le pathosystème modèle Alternaria brassicicola - Arabidopsis thaliana. Pour cela, nous avons analysé la réponse d’A. brassicicola soumis à différentes contraintes in vitro et in vivo :l’exposition à des métabolites de défenses de la famille des Brassicacées (brassinine,camalexine et isothiocyanate) et à des perturbations de la balance hydrique (dessiccation,sorbitol and PEG) ainsi que lors de la colonisation de la semence à partir des siliques. Nous avons montré que la cible probable des phytoalexines indoliques était la mitochondrie avec notamment une altération de la respiration et du potentiel membranaire mitochondrial après une courte exposition. Nos analyses ont aussi révélé que plusieurs protéines de type hydrophilines-like ou en lien avec formation des eisosomes, semblaient être impliquées dans la réponse au stress hydrique. Nous avons également montré que l’expression de la majorité des gènes codant ces protéines était dépendante d’au moins une des trois protéines kinases,AbSch9, AbNik1 and AbHog1. Enfin, nos analyses in planta ont permis d’identifier un mécanisme inattendu, impliquant le remodelage de la chromatine comme élément potentiel,de la régulation de l’expression génique du champignon lors de l’infection
Seed transmission is one of the most effective means of survival and dispersal for plant pathogenic fungi. The contaminated seeds are altered in their germination and viability. As a result, we have sought to identify molecular mechanisms that could be involved in this transmission capacity using the Alternaria brassicicola - Arabidopsis thaliana pathosystem model. To do this, we analyzed the response of A. brassicicola subjected to different stresses in vitro and in vivo: exposure to defence metabolites of the Brassicaceae family (brassininin, camalexin and isothiocyanate) and to perturbations of the water balance (desiccation, sorbitol and PEG) as well as during seed colonization from silicics. We have shown that the likely target of indolic phytoalexins is mitochondria, including impaired respiration and mitochondrial membrane potential after short exposure. Our analyses also revealed that several hydrophiline-like proteins or proteins related to eisosome formation appeared to be involved in the response to water stress. We have also shown that the expression of the majority of genes encoding these proteins is dependent on at least one of the three protein kinases, AbSch9, AbNik1 and AbHog1. Finally, our in planta analyses identified an unexpected mechanism, involving the remodelling of chromatin as a potential element in regulating the gene expression of the fungus during infection

Les mitochondries sont les organites qui produisent la quasi-totalité de l'énergie consommée par les cellules animales. Une de leurs particularités est de posséder leur propre génome (ADN mitochondrial ou ADNmt) qui, avec la collaboration indispensable du génome du noyau (ADNnu), code pour les enzymes responsables de la production d'énergie. Pour que ces organites fonctionnent adéquatement, la co-adaptation des génomes nucléaire et mitochondrial a donc été fortement sélectionnée au cours de l'évolution. Chez les animaux, l'ADNmt est, contrairement à l'ADNnu, transmis uniquement par la mère. L'hypothèse principale pour expliquer cette transmission maternelle est qu'en ayant un seul type d'ADNmt, la cellule évite un conflit génomique dans l'association intime entre les protéines codées par l'ADNnu et l'ADNmt. Autrement dit, la sélection naturelle doit nécessairement prévenir toute modification du dialogue entre les mitochondries et le noyau, ce qui risquerait de provoquer l'apparition de phénotypes indésirables. Exceptionnellement, un seul système mitochondrial «défie» les lois naturelles de transmission des mitochondries chez les animaux, soit celui observé chez les moules marines et d'eau douce. Les espèces possédant ce système atypique, qui est désigné sous le nom de double transmission uniparentale (doubly uniparental inheritance ou DUI), sont caractérisées par la présence de 2 ADNmt distincts qui sont hérités de façon maternelle (ADNmt F) ou paternelle (ADNmt M). Généralement, les femelles ne contiennent que le génome F, tandis que les mâles contiennent le génome F dans leurs tissus somatiques et le génome M dans leur gonade. Les divergences observées entre les ADNmt F et M chez les moules peuvent atteindre plus de 20%. Les produits des deux différents ADN mitochondriaux peuvent-ils interagir normalement avec les protéines d'un seul système génétique nucléaire (en raison de la co-adaptation intergénomique), ou certaines fonctions mitochondriales ont-elles été compromises dans une ou l'autre des lignées (c'est-à-dire, lignée paternelle M ou maternelle F)? Le grand attrait du système de double transmission uniparentale est qu'il est le seul modèle animal où deux variantes mitochondriales fortement divergentes coexistent et s'adaptent simultanément à un génome nucléaire. Cette situation se traduit probablement par la conservation d'une intégrité relative de certaines portions du génome mitochondrial afin de maintenir une cohésion fonctionnelle dans les interactions structurales entre les peptides mitochondriaux et nucléaires. L'objectif principal de mon doctorat était d'étudier l'évolution moléculaire des génomes mitochondriaux F et M chez les espèces du genre Mytilus et de vérifier si les gènes nucléaires et les gènes F et M mitochondriaux qui interagissent pour former le système de la phosphorylation oxydative co-évoluent. Spécifiquement, l'objectif premier du chapitre 1 a été d'analyser les ADNmt M et F complets chez trois espèces de moules marines (Mytilus edulis, M trossulus, et M galloprovincialis) afin de vérifier si leur évolution dans un environnement nucléaire commun (ou différent) se traduit par la conservation (ou non) de certaines de leurs portions (c'est-à-dire, évolution congruente des génomes M et F). Pour ce faire, les ADNmt ont été amplifiés par PCR et séquencés à l'aide d'un séquenceur d'ADN automatique. Les principaux résultats ont effectivement démontré que le fait de co-exister dans un même environnement nucléaire contraint les ADNmt F et M à expérimenter des pressions sélectives similaires, ce qui se traduit par une évolution congruente des différentes portions des ADNmt M et F (c'est-à-dire la corrélation positive des patrons de taux de substitution protéiniques). L'objectif du chapitre 2 a été de déterminer, chez les spermatozoïdes, si le remplacement d'un génome M par un génome F avait un effet sur les capacités métaboliques des mitochondries. L'étude visait à déterminer si la co-évolution du génome nucléaire avec deux types d'ADNmt différents avait été favorisée dans une où l'autre des lignées. Pour ce faire, des dosages enzymatiques (activité des complexes mitochondriaux I+Ill, II et IV et de la citrate synthase) ont été réalisés par spectrophotométrie. Les résultats ont démontré que la combinaison «ADNmt récemment-masculinisé -ADNnu» (qui est essentiellement une combinaison ADNmtF -ADNnu) performe mieux au niveau enzymatique que la combinaison «ADNmt M -ADNnu». Le troisième volet a été consacré à l'étude de l'évolution moléculaire des protéines interactives du système énergétique (c'est-à-dire, produits nucléaires et mitochondriaux en contact physique) afin de vérifier si les portions génétiques qui interagissent co-évoluent. Pour ce faire, le gène nucléaire codant pour le transporteur mobile d'électron cytochrome c (CYC) et des gènes mitochondriaux et nucléaires codant pour des sous-unités protéiques des complexes III (ADNmt = CYTB; ADNnu = C3S6) et IV (ADNmt = COX1 et COX2; ADNnu = COX4) du système de la phosphorylation oxydative ont été amplifiés par PCR et séquencés à l'aide d'un séquenceur d'ADN automatique. Les données moléculaires semblent démontrer que la co-évolution entre le génome F et le génome nucléaire est mieux couplée, ce qui vient appuyer les résultats enzymatiques du chapitre 2. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : ADN mitochondrial, Génomique comparative, ADN nucléaire, Mytilus, Co-évolution intergénomique.

Les mitochondries, organites essentiels à la production d'énergie, possèdent leur propre matériel génétique : l'ADN mitochondrial (ADNmt). Chaque produit des gènes de I'ADNmt interagit avec des protéines codées par l'ADN nucléaire pour assurer la respiration mitochondriale. Dans le règne animal, I'ADNmt est transmis exclusivement de façon maternelle. La transmission maternelle permettrait d'éviter les conflits intergénomiques. Il existe un seul système mitochondrial qui transgresse singulièrement les lois de la transmission et de la génétique de I'ADNmt, il s'agit de la double transmission uniparentale [doubly uniparental inheritance (DUI)]. L'existence de la DUI a été démontrée chez sept familles de mollusques bivalves, dont les moules marines : Mytilidae; les palourdes marines : Veneridae, Solenidae et Donacidae et les moules d'eau douce : Unionidae, Margaritiferidae et Hyriidae. Les espèces possédant ce système atypique sont caractérisées par la présence de deux ADNmt distincts qui sont hérités de façon maternelle (ADNmt F) et paternelle (ADNmt M). Typiquement, les femelles sont homoplasmiques et contiennent uniquement I'ADNmt F tandis que les mâles sont hétéroplasmiques. Chez ces derniers, I'ADNmt F domine dans les tissus somatiques alors que la gonade contient presque exclusivement I'ADNmt M. Les divergences observées entre les ADNmt F et M chez les moules peuvent atteindre ~50% en acides aminés. Ce haut niveau de divergence observée entre les génomes M et F, coexistant à l'intérieur d'un même individu soulève de nombreuses questions d'ordre évolutives. La double transmission uniparentale représente, certes, un système atypique, mais les descriptions, les comparaisons et les analyses qu'elle permet contribuent à développer une image plus exacte de l'évolution non seulement au niveau de l'évolution de la DUI, mais aussi au niveau de l'évolution du génome mitochondrial dans son ensemble. L'objectif de la présente thèse est d'utiliser une approche comparative de données moléculaires pour mettre en évidence l'évolution des génomes mitochondriaux mâle et femelle du système de la double transmission uniparentale chez les moules unionoïdes. Chez ce groupe, la double transmission uniparentale semble évolutivement plus stable (aucun évènement de recombinaison ou de masculinisation n'a été recensé) et la divergence entre les ADNmt M et F est significativement plus élevée que chez les taxons marins. Le chapitre II est une revue de littérature sur le système de la double transmission uniparentale. Les observations qui ont menées à la découverte de la DUI y sont présentées de même que le modèle et les mécanismes de la DUI. Cette revue propose la DUI comme un système modèle qui pourrait permettre d'acquérir de nouvelles connaissances sur les interactions et la coadaptation des génomes nucléaires et mitochondriaux. L'objectif du chapitre III était de séquencer, d'annoter et de publier pour la toute première fois des génomes mâles complets d'Unionoïdés. Six nouveaux génomes mitochondriaux complets d'espèces d'Unionoïdés, soit le génome F et M de Venustaconcha ellipsiformis (Unionoida: Unionidae: Ambleminae: Lampsilini), Pyganodon grandis (Unionoida: Unionidae: Unioninae: Anodontini) et Quadrula quadrula (Unionoida: Unionidae: Ambleminae: Quadrulini) ont été séquencés avec succès et les caractéristiques génomiques propres à chaque lignée mâle ont été présentées et ont fourni un contexte pour les comparaisons des génomes mitochondriaux chez les lignées de bivalves possédant et ne possédant pas la DUI. La position basale des Unionoïdés à l'intérieur des autolamellibranches ainsi que la probable origine unique de la DUI suggère que la DUI serait apparue chez un ancêtre des autolamellibranches et aurait été subséquemment perdue chez plusieurs descendants. Les caractéristiques de la DUI observées chez les Unionoïdés s'approcheraient donc davantage de l'état ancestral de la DUI. Le chapitre IV est une étude phylogéographique du genre Pyganodon (Unionidae, Bivalvia) dans le nord-est de l'Amérique du Nord. Le genre Pyganodon a été choisi entre autres en raison de sa richesse taxonomique et de sa vaste répartition géographique dans le nord-est de l'Amérique du Nord. Cette analyse phylogéographique est basée sur l'étude du polymorphisme de gènes des ADNmt M et F ce qui a permis de comparer et confronter les signaux phylogénétiques rendus par les génomes M et F à l'intérieur de ce groupe. L'exploration de la distribution de la variation génétique entre et à l'intérieur des populations et des espèces de Pyganodon a permis de mettre en évidence la complexité du système, mais aussi de distinguer les processus démographiques des processus sélectifs. Ce chapitre renforce l'hypothèse de l'action de la sélection adaptative sur le génome mitochondrial mâle. Très tôt après la découverte du système du la DUI, un possible rôle de la sélection positive comme pression sélective majeure a été soupçonnée. Malgré l'accumulation de certains indices, un tel processus n'avait jamais été démontré. Dans le chapitre V de la présente thèse, en utilisant les données recueillies et cumulées dans le chapitre III soit l'ensemble des gènes mitochondriaux codants (sauf I'ATP8) de 29 espèces de mollusque bivalves de différentes familles, un test de sélection positive en maximum de vraisemblance a été effectué. Les résultats de ce test suggèrent que de nombreux sites d'acides aminés sont positivement sélectionnés sur le génome mâle des Unionoïdés. Quelques sites seraient également positivement sélectionnés dans I'ADNmt F des Unionoïdés et témoignent probablement de la coévolution cytonucléaire. Le test n'a pas mis en évidence de sélection positive dans les ADNmt M ni F de Mytilidés et confirment que les forces évolutives n'agissent pas de manière identique dans les différents groupes de bivalves possédant la DUI. Les résultats du test révèlent que des sites d'acides aminés seraient également positivement sélectionnés dans le troisième groupe de bivalves testé soit les Vénéridés. Toutefois, la concentration de ces sites sur certains gènes spécifiques de I'ADNmt F pourrait témoigner de l'action de la sélection positive suite à une réorganisation structurale du génome. Compte tenu du profond impact que peut avoir l'ensemble des résultats de ce chapitre sur notre compréhension actuelle des forces sélectives agissant sur le génome mitochondrial, la prudence est toutefois de mise dans leurs interprétations. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : ADN mitochondrial, génomique comparative, phylogéographie, sélection positive, double transmission uniparentale, bivalves

Les systèmes sexuels et les mécanismes responsables de la détermination du sexe chez les animaux sont issus de stratégies diverses. Cette incroyable diversité se reflète notamment chez les bivalves, où autant les facteurs génétiques qu’environnementaux y jouent un rôle, avec des espèces utilisant divers modes de reproduction, tels que le gonochorisme ou l’hermaphroditisme simultané ou séquentiel. La découverte la plus notable est celle d’un système de déterminisme sexuel unique qui impliquerait les mitochondries. Spécifiquement, un système de transmission sexe-spécifique de l’ADN mitochondrial, connu sous le nom de DUI (« Double Uniparental Inheritance » ou double transmission uniparentale), serait lié au maintien du gonochorisme chez certaines espèces de bivalves. La DUI implique un ADN mitochondrial qui est transmis de façon maternelle (ADNmt F) aux femelles et aux mâles, et l’autre transmis de façon paternelle (ADNmt M) aux mâles seulement. Les ADNmt F et M chez les espèces à DUI sont caractérisés par des traits uniques, comme une modification du gène cox2, ou encore la présence de nouveaux gènes associés à chacun des génomes mitochondriaux (des gènes sexe-spécifiques) qui ont une fonction autre que la production d’énergie contrairement aux autres gènes mitochondriaux typiques. Le lien entre la DUI et la détermination du sexe étant encore flou, trois approches ont été proposées pour aider à le démystifier, chacune des approches constituant un chapitre de cette thèse. Les deux premiers chapitres se sont concentrés sur des espèces de moules d’eau douce de l’ordre des Unionida, où une corrélation entre gonochorisme et DUI et hermaphroditisme et SMI (« Strictly Maternally Inheritance » ou transmission strictement maternelle) a été décrite. La première approche consistait à produire une analyse transcriptomique comparative entre les gonades mâles et femelles de deux espèces à DUI gonochoriques, Venustaconcha ellipsiformis et Utterbackia peninsularis (famille Unionidae), pour mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à la détermination du sexe et à la DUI chez ces bivalves. Cette étude a révélé 12 000 gènes orthologues, avec 2 583 gènes différentiellement exprimés chez les deux espèces, dont les gènes Sry, Dmrt1 et Foxl2 connus pour être des éléments clés dans la détermination du sexe chez les vertébrés et d’autres bivalves. Nos résultats ont aussi été comparés avec d’autres espèces à DUI, notamment avec la palourde marine Ruditapes philippinarum, pour identifier des éléments partagés entre des espèces éloignées qui pourraient être responsables de la régulation de la DUI. Globalement, ces résultats corroborent l'hypothèse selon laquelle un mécanisme d'ubiquitination modifié pourrait être responsable de la rétention de l'ADNmt paternel chez les bivalves mâles. Les analyses ont aussi révélé que la méthylation de l'ADN pourrait être impliquée dans la régulation de la DUI. Une deuxième analyse transcriptomique comparative a été réalisée afin de discerner les mécanismes sous-jacents à la détermination du sexe et à la DUI, mais cette fois-ci entre l’espèce à DUI gonochorique U. peninsularis et l’espèce proche parente à SMI hermaphrodite U. imbecillis. Cette étude a permis de supporter l’hypothèse d’une implication des mécanismes d’ubiquitination et de méthylation dans la régulation de la DUI, ainsi que de confirmer un rôle des gènes conservés liés à la détermination du sexe également chez les bivalves hermaphrodites. Nos résultats ont également révélé de nouveaux gènes candidats ayant des rôles potentiels dans la DUI, y compris des nucléases et des facteurs impliqués dans l’autophagie / mitophagie. Finalement, afin d’identifier des éléments génétiques mitochondriaux qui pourraient faire partie des mécanismes sous-jacents à la DUI et la détermination du sexe chez les bivalves, nous avons séquencé les ADNmt F et M complets de deux nouvelles espèces à DUI de deux familles de l’ordre des Venerida, Scrobicularia plana (famille Semelidae) et Limecola balthica (famille Tellinidae). En effet, la description complète des ADNmt chez les espèces à DUI a été effectuée chez plusieurs espèces de moules d’eau douce (ordre Unionoida), mais peu d’espèces l’ont été pour les ordres Mytilida et Venerida. Ces études sont essentielles pour retracer des signatures génétiques mitochondriales partagées par différentes espèces à DUI. Nos résultats ont révélé les plus grosses différences de taille (>10kb) et de divergence nucléotidique (jusqu’à 50% de divergence) entre les ADNmt M et F, parmi toutes les espèces à DUI. Ces différences de taille sont principalement dues à une immense insertion (>3.5kb) dans la séquence du gène cox2 du génome mitochondrial M, chez nos deux espèces, un trait précédemment décrit chez les moules d’eau douce. Le gène cox2 des mâles de S. plana est la plus longue séquence à travers le règne animal. Une autre fonctionnalité importante portés par les ADNmt F et M est la présence de nouveaux gènes spécifiques au sexe, comme reportée chez toutes les autres espèces à DUI jsuqu’à maintenant. Les résultats combinés de cette thèse soutiennent le partage de plusieurs éléments génétiques clés entre les espèces à DUI. De plus, un parallèle avec le système CMS (« Cytoplasmic Male Sterility » ou stérilité cytoplasmique mâle) chez les plantes, les seuls autres organismes possédant un déterminisme sexuel qui implique les mitochondries, est proposé pour expliquer le rôle de l’ADNmt dans la détermination du sexe chez les espèces de bivalves à DUI.
Sexual systems and sex determining mechanisms described among animals are extraordinarily diverses. This amazing diversity is present in bivalves where both environment and genetic factors occur, leading to, among others, gonochoric and simultaneous or sequential hermaphroditic species. The most impressive discovery is a sex-determining system that would involve mitochondria. Specifically, a unique mitochondrial DNA inheritance system, known as Doubly Uniparental Inheritance (DUI), would be related to the maintenance of gonochorism in some bivalve species. DUI involves two mitochondrial DNA lineages, one that is maternally transmitted (F mtDNA) to females and males, and the other that is transmitted paternally (M mtDNA) to males only. The F and M mtDNAs, in DUI species, are characterized by unique traits, such as a modification of the cox2 gene, or the presence of new genes associated with each of the mitochondrial genomes (sex-specific genes) that have a function other than energy production, unlike other typical mitochondrial genes. Since the link between DUI and sex determination is still unclear, three approaches have been proposed to help demystify it, with each of the approaches constituting a chapter of this thesis. The first two chapters focused on freshwater mussel species of the order Unionida, where a correlation between gonochorism and DUI and hermaphroditism and SMI (Strictly Maternally Inheritance) was described. The first approach was to produce a comparative transcriptomic analysis between the male and female gonads of two gonochoric DUI species; Venustaconcha ellipsiformis and Utterbackia peninsularis (Unionidae family), to better understand the mechanisms underlying sex determination and DUI in these bivalves. This study revealed 12,000 orthologous genes, with 2 583 genes differentially expressed in both species, including Sry, Dmrt1, and Foxl2 known to be key sex-determining genes in vertebrates and other bivalve species. Our results were also compared with other DUI species, including the marine clam Ruditapes philippinarum, to identify shared elements between distant species that may be responsible for DUI regulation. Overall, these results support the hypothesis that a modified ubiquitination mechanism may be responsible for the retention of paternal mtDNA in male bivalves. The analyzes also revealed that DNA methylation could be involved in DUI regulation. 7 A second comparative transcriptomic analysis was performed to discern the mechanisms underlying sex determination and DUI between the gonochoric DUI species, U. peninsularis, and the closely related SMI hermaphroditic species, U. imbecillis. This study supported the hypothesis of an involvement of ubiquitination and methylation mechanisms in DUI regulation, as well as confirmed a role of conserved genes related to sex determination in hermaphroditic bivalves. Our results also revealed novel candidate genes with potential roles in DUI, including nucleases and factors involved in autophagy / mitophagy mechanisms. Finally, to identify mitochondrial genetic elements that could be part of the mechanisms underlying DUI and sex determination in bivalves, we sequenced the complete F and M mtDNAs of two new DUI species, from two families of the order Venerida; Scrobicularia plana (Semelidae family) and Limecola balthica (Tellinidae family). The complete description of mtDNAs in DUI species has been carried out for several species of freshwater mussels (Unionoida order), but very few species have been described for the orders Mytilida and Venerida. Such studies are essential for tracing mitochondrial genetic signatures shared by different DUI species. Our results revealed the largest differences in size (>10kb) and nucleotide divergence (up to 50% divergence) between M and F mtDNAs, among all DUI species. These differences in size are mainly due to a huge insertion (> 3.5kb) in the cox2 gene of the M mtDNA from both species, a trait previously described in freshwater mussels. The cox2 gene in S. plana males represents the longest cox2 sequence across the animal kingdom. Another important feature of F and M mtDNAs is the presence of new sex-specific genes, as reported in all other DUI species so far. The combined results of this thesis support the sharing of several key genetic elements among DUI species. In addition, a parallel with the Cytoplasmic Male Sterility (CMS) system in plants, the only other organisms with a sex determination system that involves mitochondria, is proposed to explain the role of mtDNA in sex determination in DUI bivalve species.

Andrologische Forschungsarbeiten der letzten Jahre beweisen, dass einzelne, aus somatischen Zellen bekannte Apoptose-typische Veränderungen bei humanen Spermien einen negativen Einfluss auf die Fertilität des Mannes haben. Umstritten ist, ob es sich dabei nur um einen abortiven Zelltod als Zeichen einer Reifungsstörung während der Spermatogenese handelt oder ob Apoptose auch in reifen Spermien induzierbar ist. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, durch Untersuchungen zur Induzierbarkeit der Apoptose in reifen und unreifen Spermatozoen die vollständige Funktionalität verschiedener Signalkaskaden sowie deren Umsetzung in morphologische Veränderungen aufzudecken. Darüber hinaus sollte die Rolle des intrazellulären Calciumspiegels als möglicher Interaktionspartner zwischen Akrosomreaktion und Apoptose geklärt werden, um Informationen über die Zukunft der nicht fertilisierenden Spermien im weiblichen Genitaltrakt zu erlangen. In den vorliegenden Versuchsreihen konnte erstmals die gezielte Induktion der Apoptose in reifen und unreifen Spermatozoen anhand biochemischer und elektronenmikroskopischer Untersuchungen nachgewiesen werden. Dabei wurde ausführlich die erfolgreiche Aktivierung mehrerer intrinsischer Apoptosesignalwege in reifen Spermien gezeigt, deren Initiation entweder auf den Zusammenbruch innerer Mitochondrienmembranen, auf eine veränderte intrazelluläre Calciumkonzentration oder auf das Einwirken von oxidativem Stress zurückzuführen war. Zudem konnten Erkenntnisse zum antioxidativen Schutzmechanismus von Spermien gewonnen werden, welcher die Spermien gegenüber einer spezifischen Menge an H2O2 vor oxidativem Stress-bedingter Apoptose bewahrt. Sowohl die Apoptose als auch die Akrosomreaktion waren durch die Zugabe eines Calciumchelators blockierbar. Die Initiation des programmierten Zelltodes in Spermien durch einen Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration erklärt zudem eine weitere wichtige Funktion dieses Prozesses: das Absterben von akrosomenreagierten Spermien bei nicht erfolgter Fertilisation im weiblichen Genitaltrakt. Die Theorie einer rein abortiven Apoptose als Folge einer Spermatogenesestörung ist damit widerlegt.

L’accroissement de la population humaine mondiale a des répercussions majeures, ce n’est donc pas surprenant, compte tenu de la nécessité de nourrir une population grandissante au niveau planétaire, que la production en conchyliculture ait augmenté au cours des dernières décennies. Or, les connaissances acquises concernant les divers facteurs du déterminisme du sexe et du rapport des sexes chez les bivalves sont très limitées et cela pourrait ralentir grandement le taux de production des éleveurs et leur capacité à intervenir si les stocks venaient à diminuer de façon inquiétante. Certains travaux mentionnent que certains facteurs environnementaux, comme la température, auraient un effet sur le rapport des sexes chez une variété de bivalves, incluant la moule bleue commerciale Mytilus edulis, quoiqu’aucune étude n’ait validé cette dernière possibilité. Cela dit, il est possible que l’environnement des adultes puisse aussi affecter le phénotype de la progéniture. En effet, une transmission intergénérationnelle a déjà été identifiée chez Mytilus, mais la possibilité que les conditions des parents affectent le rapport des sexes spécifiquement n’a jamais été abordée. Il est toutefois connu qu’un facteur maternel présent dans l’œuf affecte le sexe de la progéniture et que cette espèce de bivalve a un mode de transmission des mitochondries particulier. Ce mode de transmission appelé « transmission doublement uniparentale » a rendu possible l’identification du sexe chez les embryons. De cette façon, 1938 embryons provenant de 25 croisements artificiels réalisés à trois températures et effectués lors de trois différentes années ont été analysés. Nos analyses mettent en évidence une variation significative dans la proportion de larves femelles entre les années passant de 64 % à 98 %. Dans certains cas, la proportion de femelle varie de 0 à 100 % entre les différents traitements. Même si un effet général sur le rapport des sexes n’était pas significatif, chaque croisement s’est avéré avoir une norme de réaction qui lui est propre face aux 3 différentes températures. Cette étude met en valeur l’effet important de l’environnement sur le déterminisme du sexe chez M. edulis, autant chez les parents que lors du développement des embryons.
The factors affecting sex determination still remain unknown for most bivalve species. Some studies reported that environmental factors, such as temperature, influence sex determination in certain species, and this has been hypothesized also for the blue mussel Mytilus edulis, but not experimentally validated yet. Adult exposure to different environmental conditions during gametogenesis, which occurs seasonally, may also affect offspring phenotype, including sex determination. Intergenerational carryover effects have been reported in bivalves, but the impact of parental exposures on offspring sex determination has not been examined so far. To address these questions, artificial fertilizations were performed on individuals collected in three different years and their embryos and larvae were reared at three different temperatures to specifically test if the environment influence offspring sex ratio through effects on parental developing gametes and/or on developing embryos. We took advantage of the doubly uniparental inheritance of mitochondria in bivalves to determine the sex of the larvae. The analysis of 1938 larvae from 25 crosses revealed that the overall proportion of female larvae was significantly different among years, varying from 64 % to 98 %. While the proportion of female larvae across temperature ranged from 0 to 100 % in some cases, the reaction norms were cross-specific and there were no significant effects of rearing temperature on sex ratio. Taken together, our results suggested that sex determination in M. edulis occur during the gametogenesis according to the genotype of the parents, but could also be changed during the development. More importantly, both processes are strongly affected by environmental conditions.