Добірка наукової літератури з теми "Transcriptomique single-cell"

L'épithélium des voies respiratoires est un écosystème complexe composé de cellules basales, de cellules à gobelet et de cellules multiciliées (MCC), ainsi que d'autres types cellulaires plus rares. Les cils motiles des MCC permettent d'éliminer le mucus piégeur d'agents pathogènes produit par les cellules à gobelet. Dans l'asthme, l'épithélium subit une inflammation chronique et un remodelage, menant à une diminution du nombre de MCC et à une hyperplasie des cellules à gobelet, ce qui altère la clairance mucociliaire et aggrave les symptômes. L'interleukine 13 (IL-13), produite par les lymphocytes T helper de type 2 (Th2), les mastocytes, les basophiles et les cellules innées lymphoïdes de type 2, est un médiateur clé de l'asthme de type 2. L'IL-13 cause l'hyperplasie des cellules à gobelet, tandis que les rhinovirus, principales causes d'exacerbation de l'asthme, augmentent la production de mucus et réduisent la fonction ciliaire. Outre l'implication déjà caractérisée du système immunitaire dans l'asthme, la contribution des mécanismes propres à l'épithélium restait à élucider.Pour étudier les événements moléculaires contrôlant l'équilibre des cellules épithéliales et leur dérèglement dans l'asthme, des biopsies bronchiques de donneurs sains et d'asthmatiques sévères ont été reconstruites in vitro grâce à un modèle d'interface air-liquide (ALI), traitées avec l'IL-13 ou le rhinovirus A16 (RVA16), et analysées par séquençage d'ARN sur cellule unique (scRNA-seq). Plus de 260 000 cellules de 9 donneurs sains et 11 asthmatiques sévères ont été étudiées. Les épithéliums asthmatiques ont présenté une hyperplasie des cellules basales et une signature inflammatoire même en condition contrôle. L'IL-13 a provoqué un remodelage épithélial après 8 jours et a induit le facteur de transcription des cellules à gobelet SPDEF dans une sous-population de MCC que nous avons nommées "cellules mucociliées". L'infection par RVA16 a déclenché une réponse interféron et chimiokine 4,7 fois plus importante dans les épithéliums sains que dans les asthmatiques, selon le nombre de gènes différentiellement exprimés. Deux semaines après retrait de l'IL-13 ou du RVA16, les épithéliums ont retrouvé leur expression génique et/ou composition cellulaire initiales, indiquant des capacités de récupération similaires entre donneurs sains et asthmatiques sévères. Des gènes potentiellement régulateurs de l'asthme et du remodelage épithélial ont été identifiés. Leur rôle est exploré par invalidation via CRISPR-Cas9 et analyse scRNA-seq.Le modèle ALI joue un rôle central dans toutes les études in vitro et repose sur différents milieux commerciaux ou « maison » dont l'impact sur la différenciation épithéliale au niveau de la cellule unique n'a jamais été étudié. J'ai utilisé le scRNA-seq pour comparer 4 milieux différents et découvert des variations dans la composition cellulaire, dans l'expression des gènes avec notamment une expression différentielle du facteur d'entrée du SARS-CoV-2 ACE2, ainsi que dans les transcrits du sécrétome. La prolifération en PneumaCult-Ex Plus a favorisé un profil sécrétoire, soulignant l'influence clé des milieux de prolifération sur les caractéristiques de différenciation épithéliale. Mes données fournissent un répertoire détaillé pour évaluer les effets des conditions de culture sur la différenciation épithéliale des voies respiratoires.Enfin, j'ai participé à la caractérisation de la différenciation des cellules multiciliées en étudiant le locus génomique MIR34B/C, hôte des gènes BTG4, LAYN et HOATZ. Les microARN miR-34b/c sont étroitement liés à la famille miR-449 connus comme régulateurs de la multiciliogenèse. En utilisant le scRNA-seq et la microscopie à super-résolution, nous avons démontré que le locus MIR34B/C, comme son homologue MIR449, est un locus multiciliaire englobant des gènes qui sont des régulateurs potentiels de la multiciliogenèse
The airway surface epithelium is a complex cellular ecosystem that includes basal, goblet, multiciliated cells, as well as other rarer cell types. Motile cilia on multiciliated cells clear the pathogen-trapping mucus secreted by goblet cells. In asthma, the epithelium undergoes chronic inflammation and remodeling, which results in a decreased number of multiciliated cells and a goblet cell hyperplasia that impairs mucociliary clearance and worsen symptoms. Interleukin 13 (IL-13), produced by type-2 lymphocyte T helper (Th2) cells, mast cells, basophils, and type-2 innate lymphoid cells, is a major mediator of type 2 high asthma, the most common asthma endotype. IL-13 directly causes goblet cell hyperplasia, while rhinovirus infections, the leading causes of asthma exacerbation, increase mucus production and reduce ciliary function. Apart from the already well-characterized implication of the immune system in asthma, the underlying contribution of epithelium-specific mechanisms remained so far unresolved.To investigate the molecular events controlling airway epithelial cells balance and their dysregulation in asthma, bronchial biopsies from healthy and severe asthma donors were reconstructed in vitro using an Air-Liquid Interface (ALI) model. They were treated with IL-13 or rhinovirus A16 (RVA16) and analyzed by single-cell RNA sequencing (scRNA-seq). Over 260,000 cells from 9 healthy and 11 severe asthma donors were analyzed. Severe asthma epithelia showed basal cell hyperplasia and an inflammatory signature, even under control conditions. IL-13 treatment caused significant epithelial remodeling after 8 days in both healthy and severe asthma epithelia and induced expression of the goblet-specific transcription factor SPDEF in a multiciliated cell subpopulation that we labeled “mucous-ciliated cells.” RVA16 infection triggered an interferon and chemokine response 4.7 times greater in healthy epithelia than in asthmatic ones, assessed by the number of differentially expressed genes. Two weeks after IL-13 or RVA16 removal, epithelia recovered their initial cell composition and/or gene expression, indicating similar recovery capacities between severe asthmatic and healthy donors. A set of genes was identified as potential regulators of the asthmatic phenotype and airway epithelial remodeling. Their putative role in remodeling is currently investigated by CRISPR-Cas9 invalidation and scRNA-seq analysis.The ALI model plays a central role in all in vitro studies and its careful characterization is essential. It relies on different commercial and home-made media, but their impact on epithelial cell differentiation at the single-cell level had never been evaluated. I used scRNA-seq to quantify cell type distribution and gene expression variations across 4 distinct media. I found variations in cell composition, gene expression, and secretome transcripts that I illustrated more precisely with the differential expression of the SARS-CoV-2 entry factor ACE2. Proliferation in PneumaCult-Ex Plus favored secretory cell fate, highlighting the key influence of proliferation media on epithelial differentiation. My data provide a comprehensive repertoire for evaluating culture condition influence on airway epithelial differentiation.Lastly, I participated in the characterization of multiciliated cell differentiation by investigating the MIR34B/C genomic locus, host to the genes BTG4, LAYN, and HOATZ. The miR-34b/c microRNAs are closely related to the miR-449 family known as multiciliogenesis regulators. Using scRNA-seq and super-resolution microscopy, we demonstrated that the MIR34B/C locus, like its homolog MIR449, is a multiciliary locus encompassing genes that are potential regulators of multiciliogenesis

Les sarcomes épithélioïdes (SE) sont un sous-type très rare de sarcome agressif, affectant tous les groupes d’âge et classiquement divisé en deux entités clinico-pathologiques – les sous-types distal et proximal – suggérant la présence d’une hétérogénéité inter-tumorale. Comme les tumeurs rhabdoïdes affectant les jeunes enfants, les SE sont caractérisés par la perte de SMARCB1, une sous- unité centrale du complexe de remodelage de la chromatine SWI/SNF. En utilisant des données de bulk multi-omique et transcriptomique sur cellule unique, nous avons mis en évidence l’existence de deux sous-types moléculaires transcriptomiques – « distal-like » et « proximal-like » – distincts de la classification clinico-pathologique traditionnelle. Les tumeurs du sous-type moléculaire distal-like qui comprenaient les sous-types morphologiques distaux et certains sous-types proximaux ou mixtes, exprimaient des marqueurs spécifiques de transition épithélio-mésenchymateuse dont DSG2 (desmogléine 2) qui pourrait être évalué en routine en immunohistochimie. Elles étaient caractérisées par une densité accrue en lymphocytes T CD8+ et cellules myéloïdes pro- tumorales localisées à la périphérie tumorale. A l’inverse, les tumeurs du sous-type moléculaire proximal-like qui étaient plus agressives, étaient caractérisées par une densité accrue en macrophages M2 pro-tumoraux localisés au sein des nodules tumoraux et une importante hétérogénéité inter-tumorale. Certaines de ces tumeurs ressemblaient, par leurs profils de méthylation de l'ADN, à d'autres tumeurs déficientes en SMARCB1. L’identification de ces deux sous-types moléculaires ouvre de nouvelles opportunités pour le traitement, la compréhension de la biologie et les futures recherches translationnelles sur les SE
Epithelioid sarcoma (EpS) is an ultra- rare, aggressive sarcoma, occurring in all age groups, with two traditionally recognized clinicopathological entities – the distal and proximal subtypes – suggesting the presence of inter-tumor heterogeneity. Like rhabdoid tumors in infants, EpS is characterized by the loss of SMARCB1, a core subunit of the SWI/SNF chromatin-remodeling complex. Using bulk multi-omics and single-cell transcriptomic data, we identified two molecular transcriptomic subtypes – “distal-like” and “proximal-like" – which only partly overlap with the traditional clinicopathological entities. The distal-like molecular subtype of tumors, which included all distal morphological subtypes and a subset of proximal and mixed subtypes, expressed specific epithelial to mesenchymal transition markers including DSG2 (desmoglein 2), which might be routinely assessed by immunohistochemistry. They also displayed higher density of peritumoral CD8+ T cells and pro-tumoral myeloid cells. By contrast, the proximal-like molecular subtype of tumors, which was associated with worse outcome, displayed a higher density of intratumoral pro-tumoral M2 macrophages and high inter-tumoral heterogeneity, with some cases resembling other SMARCB1-deficient tumors by DNA methylation profiling. The identification of these two molecular subtypes open new opportunities for treatment, understanding of biology and future translational research in EpS

Le super-groupe des Rhizaria est l'un des plus diversifiés et le moins décrit parmi le monde microbien eucaryote. Bien que les rhizaires aient attiré l'attention des biologistes pendant plus d'un siècle, leur conservation fastidieuse en laboratoire a entravé une compréhension adéquate de leur cycle de vie. C'est le cas des Radiolaires, une lignée non cultivée d'amibes planctoniques marines à squelette minéral, qui a établi une symbiose réussie avec une diversité de microalgues au cours de son évolution et contribue de manière significative au cycle des nutriments dans l'océan mondial. À ce jour, la description des cycles de vie des radiolaires est fragmentaire et repose principalement sur les connaissances acquises dans les années 80-90. L'un des aspects clés qui reste énigmatique concerne la transition d'une génération à l'autre. Les observations accumulées sur le terrain ont conduit à la suggestion de diverses stratégies de recombinaison et reproduction pour les quatre groupes de radiolaires existants (Acantharia, Spumellaria, Nassellaria, Collodaria). Pour les Acanthaires, deux stratégies recombinatives présumées ont été proposées en fonction de la modalité de libération de petites cellules flagellées, appelées swarmers, impliquant ou non une étape intermédiaire sous forme de kyste. Les Collodaires peuvent passer d'un stade solitaire à un stade colonial, tandis que chez les Nassellaires et les Spumellaires, la production de swarmers n'a été observée que pour un nombre limité d'espèces. Il est supposé que le stade commun de swarmer est lié à la recombinaison sexuée. Néanmoins, à ce jour, la ploïdie des swarmers reste indéterminée et leur fusion n'a pas été documentée. Pour surmonter les obstacles actuels liés à l'étude des cycles de vie des radiolaires en culture, ma thèse combine des observations in situ sur des organismes vivants, l'analyse de nouveaux transcriptomes de cellules uniques et des analyses phylogénétiques de gènes de référence spécifiques aux gamètes. Plus particulièrement, je me concentre sur les stades de vie impliqués dans le cycle sexué hypothétique des Radiolaires en recherchant des gènes de référence des protistes impliqués dans les processus sexués, tels que la méiose et la fusion des gamètes, parmi les transcriptomes de stades de vie présumés méiotiques et gamétiques. Pour faire face à la proportion massive de données non référencées, j'ai utilisé des approches de réseaux de gènes pour identifier et annoter de novo les gènes spécifiquement enrichis à chaque stade de vie, révélant ainsi de nouvelles fonctions spécifiques à ces stades. Mes analyses mettent en évidence des gènes essentiels des gamètes parmi les swarmers des Radiolaires, ce qui suggère que les Radiolaires sont capables de recombinaison sexuée. Ces acteurs du répertoire génétique des gamètes, le gène HAP2/GCS1 et la famille de gènes KAR5-GEX1-BMBL, ont été intégrés dans un contexte évolutif pour décrire les variations de séquences spécifiques aux Radiolaires. Enfin, les gènes spécifiques des gamètes de Radiolaires ont été comparés à des bases de données méta-transcriptomiques afin d'estimer leur abondance dans l'environnement. L'intégration du cycle de vie des Radiolaires dans un cadre spatio-temporel permettra d'estimer leur durée de vie, d'améliorer la compréhension de l'écologie des Radiolaires à la résolution de chaque stade de leur cycle de vie, et d'élargir notre compréhension actuelle de la vie complexe et fascinante des rhizaires libres
The super-group Rhizaria is one of the most diverse and least described among the eukaryotic microbial word. Even though rhizarians have captured biologists' attention for over a century, their tedious maintenance has hindered a proper comprehension of their life cycle. This is the case of Radiolaria, an uncultivated lineage of marine planktonic shell-bearing amoebas, that has established a successful symbiosis with a diversity of microalgae during its evolution and contributes significantly to nutrient cycling in the global ocean. Up to date, description of radiolarian life cycles is fragmentary and mainly based on knowledge acquired in the 80's-90's. One of the key aspects that remains enigmatic encompasses the transition from one generation to another. Accumulating observations on the field have led to suggest diverse recombinative and reproductive strategies for the 4 extant radiolarian groups (Acantharia, Spumellaria, Nassellaria, Collodaria). For Acantharia, two putative recombinative strategies were proposed relative to the release modality of small flagellated cells, called swarmers, involving or not an intermediate cyst stage. Collodaria can transit from solitary to colonial stages, while among Nassellaria and Spumellaria swarmer production has been witnessed only for a limited number of species. The common life stage of swarmers is hypothesised to be linked to sexual recombination. Nevertheless, up to date swarmer ploidy remains undetermined and their fusion undocumented. In order to overcome the current culture bottlenecks related to the study of radiolarian life cycles, my PhD combines live in situ observations, the analysis of novel single-cell transcriptomes and phylogenetic analyses of reference gamete-specific genes. More particularly, I focus on the life stages involved in the hypothetical sexual cycle of Radiolaria by searching for reference protist genes mediating sexual processes, like meiosis and gamete fusion, among single-cell transcriptomes of putative meiotic and gamete life stages. To cope with the massive proportion of unreferenced data, I have employed gene-network approaches to identify and annotate de novo genes enriched specifically in each life stage, thereby revealing novel life stage specific functions. My analyses highlight essential gamete genes among radiolarian swarmers, implying that radiolarians are capable of sexual recombination. Recovered sexual genetic toolkit actors, HAP2/GCS1 gene and KAR5-GEX1-BMBL gene family, were integrated in an evolutive context, for further describing radiolarian specific sequence variations. Finally, the recovered radiolarian gamete-specific genes were compared to meta-transcriptomic databases in order to estimate their abundance in the environment. Integrating the radiolarian life cycle within a spatiotemporal framework will enable the estimation of its lifespan, enhance the comprehension of radiolarian ecology at a finer life stage resolution and broaden our current understanding of the intricate and fascinating life of free-living rhizarians

L'inférence des réseaux de régulation de gènes (RRG) à partir de données d'expression est un défi majeur en biologie. L’arrivée des technologies de mesure de transcriptomique à l’échelle de la cellule a suscité de nombreux espoirs, mais paradoxalement elles montrent une nouvelle complexité du problème d’inférence des RRG qui limite encore les approches existantes. Nous avons commencé par montrer, à partir de données d'expression en cellules uniques acquises sur un modèle aviaire de différenciation érythrocytaire, que les RRG sont des systèmes stochastiques à l'échelle de la cellule et qu'il y a une évolution dynamique de cette stochasticité au cours du processus de différenciation (Richard et al, PLOS Comp.Biol., 2016). C'est pourquoi nous avons développé par la suite un modèle de RRG mécaniste qui inclus cette stochasticité afin d'exploiter au maximum l'information des données expérimentales à l'échelle de la cellule (Herbach et al, BMC Sys.Biol., 2017). Ce modèle décrit les interactions entre gènes comme un couplage de processus de Markov déterministes par morceaux. En régime stationnaire une formule explicite de la distribution jointe est dérivée du modèle et peut servir à inférer des réseaux simples. Afin d'exploiter l'information dynamique et d'intégrer d'autres données expérimentales (protéomique, demi-vie des ARN), j’ai développé à partir du modèle précédent une approche itérative, intégrative et parallèle, baptisée WASABI qui est basé sur le concept de vague d'expression (Bonnaffoux et al, en révision, 2018). Cette approche originale a été validée sur des modèles in-silico de RRG, puis sur nos données in-vitro. Les RRG inférés affichent une structure de réseau originale au regard de la littérature, avec un rôle central du stimulus et une topologie très distribuée et limitée. Les résultats montrent que WASABI surmonte certaines limitations des approches existantes et sera certainement utile pour aider les biologistes dans l’analyse et l’intégration de leurs données
Inference of gene regulatory networks from gene expression data has been a long-standing and notoriously difficult task in systems biology. Recently, single-cell transcriptomic data have been massively used for gene regulatory network inference, with both successes and limitations.In the present work we propose an iterative algorithm called WASABI, dedicated to inferring a causal dynamical network from timestamped single-cell data, which tackles some of the limitations associated with current approaches. We first introduce the concept of waves, which posits that the information provided by an external stimulus will affect genes one-byone through a cascade, like waves spreading through a network. This concept allows us to infer the network one gene at a time, after genes have been ordered regarding their time of regulation. We then demonstrate the ability of WASABI to correctly infer small networks, which have been simulated in-silico using a mechanistic model consisting of coupled piecewise-deterministic Markov processes for the proper description of gene expression at the single-cell level. We finally apply WASABI on in-vitro generated data on an avian model of erythroid differentiation. The structure of the resulting gene regulatory network sheds a fascinating new light on the molecular mechanisms controlling this process. In particular, we find no evidence for hub genes and a much more distributed network structure than expected. Interestingly, we find that a majority of genes are under the direct control of the differentiation-inducing stimulus. Together, these results demonstrate WASABI versatility and ability to tackle some general gene regulatory networks inference issues. It is our hope that WASABI will prove useful in helping biologists to fully exploit the power of time-stamped single-cell data

Ces dernières années, l’émergence des approches en cellules uniques (scRNA-seq) a favorisé la caractérisation de l’hétérogénéité cellulaire avec une précision inégalée. Malgré leur démocratisation, l’analyse de ces données reste complexe, en particulier pour les organismes dont les annotations sont incomplètes. Au cours ma thèse, j’ai observé que les annotations génomiques du poulet sont lacunaires, ce qui engendre la perte d’un grand nombre de lectures de séquençage. J’ai évalué à quel point une annotation améliorée affecte les résultats biologiques et les conclusions issues de ces analyses. Nous proposons une nouvelle approche basée sur la ré-annotation du génome à partir de données scRNA-seq et de RNA-seq bulk en lectures longues. Ce projet de biologie computationnelle s’appuie sur une étroite collaboration avec l’équipe expérimentale de Xavier Morin (IBENS). Le principal objectif biologique est la recherche de signatures de mode de division symétrique et asymétrique au sein de progéniteurs neuronaux. Afin d’identifier les principaux changements transcriptionnels, j’ai mis en place des approches dédiées à la recherche de signatures géniques à partir de données scRNA-seq
In recent years, single-cell RNA-seq (scRNA-seq) has fostered the characterization of cell heterogeneity at a remarkable high resolution. Despite their democratization, the analysis of scRNA-seq remains a challenge, particularly for organisms whose genomic annotations are partial. During my PhD, I observed that the chick genomic annotations are often incomplete, thus resulting in a loss of a large number of sequencing reads. I investigated how an enriched annotation affects the biological results and conclusions from these analyses. We developed a novel approach based on the re-annotation of the genome with scRNA-seq data and long reads bulk RNA-seq. This computational biology project capitalises on a tight collaboration with the experimental team of Xavier Morin (IBENS). The main biological focus is the search for signatures of symmetric versus asymmetric division mode in neural progenitors. In order to identify the key transcriptional switches that occur during the neurogenic transition, I have implemented bioanalysis approaches dedicated to the search for gene signatures from scRNA-seq data

Les pathogènes bactériens cytosoliques S. flexneri et L. monocytogenes échappent à l'immunité extracellulaire de la muqueuse en induisant leur entrée et leur mode de vie intracellulaire dans l'épithélium intestinal. Dans leur cellule hôte, ils peuvent rapidement s’échapper de leur vacuole d'internalisation, envahir le cytosol et éviter l’élimination par la dégradation cellulaire en se propageant directement de cellule à cellule.Afin d’initier l’invasion intestinale, ces deux pathogènes ciblent les cellules M préleveusesd'antigènes qui recouvrent les sites d'induction immunitaire. Toutefois le mode de vie de ces pathogènes dans les cellules M, le mécanisme de propagation de l'infection à partir de ce pointd’entrée vers les entérocytes voisins ainsi que le mécanisme d'évasion de l'induction de l'immunité adaptative sont très peu caractérisés. Dans cette étude, nous présentons un nouveau modèle physiologique d'infection apicale par S. flexneri de cellules M humaines in vitro, qui récapitule les étapes précoces de l'invasion de l’épithelium intestinal par le pathogène. Nous montrons qu'une population de S. flexneri est rapidement transcytosée, en 15 minutes, à travers les cellules M. Nous amenons une nouvelle approche microscopie en temps réel de l'infection des cellules M, qui révèle qu'une deuxième sous-population de bactéries induit son entrée plus tardivement dans les cellules M, accompagnée de projections membranaires apicales, suivie par une rupture vacuolaire et l’initiation de la réplication cytosoliique des bactéries dans les cellules M. Nous découvrons que S.flexneri a également la capacité de se propager des cellules M aux cellules voisines par la motilité liéeà l'actine, qui constitue la voie principale de propagation basolatérale de l'infection. En étendant notre étude à L. monocytogenes, nous observons qu’à la différence de S. flexneri, cette bactérie détourne le processus de transcytose à travers les cellules M en utilisant le facteur de virulence ActA. Cependant, nous notons que L. monocytogenes se propage dans l'épithélium exclusivement par la motilité liée à l'actine, de façon similaire à S. flexneri. Nous proposons que la subversion de la voie de transcytose au travers des cellules M et l'évitement des tissus immunitaires sous-jacents sont des caractéristiques partagées par les pathogènes cytosoliques, leur permettant d'échapper à l'induction de l'immunité adaptative.Par ailleurs, nous présentons une approche de tri basée sur la fluorescence d’entérocytes individuels aux stades successifs de l'infection par S. flexneri, combinée avec une analyse transcriptomique parPCR quantitative en multiplex. Cette méthode révèle la production de réponses distinctes chez les entérocytes hôtes en fonction de la localisation subcellulaire du pathogène. Nous observons la production d'une réponse bystander forte, impliquant de multiples voies de signalisation corrélées chez les enterocytes non infectés. De plus nous détectons la production de profils de réponses distincts chez l’hôte en fonction de la localisation vacuolaire ou cytosolique de la bactérie chez les entérocytes infectés. Nous montrons que le facteur de virulence OspF contribue à atténuer les réponses des entérocytes infectés et à perturber des voies de signalisation autrement corrélées chez l’hôte.En conclusion, nos études exposent de nouvelles stratégies de subversion immunitaire liées aux modes de vie intracellulaires de bactéries entériques cytosoliques, soulignant l'importance des cellules M dans la propagation bactérienne initiale et le détournement de l'immunité adaptative, ainsi que l'organisation et la perturbation des réponses immunitaires innées chez les entérocytes au cours de l’infection
Cytosolic bacterial pathogens S. flexneri and L. monocytogenes subvert extracellular mucosal immunity by inducing their uptake and intracellular lifestyle in the intestinal epithelium. Within the host, they are able to rapidly escape their internalization vacuole, invade the cytosol and escape cellular degradation by spreading from cell-to-cell. Antigen sampling M cells overlying immune induction sites are targeted by these pathogens to initiate intestinal invasion. However, the intracellular lifestyle of these pathogens within M cells, the mechanism of spread of the infection toneigh boring enterocytes from this entry point and the mechanism of S. flexneri evasion of adaptive immunity is poorly characterized. We present a novel physiologic model of apical S. flexneri infection of human in vitro M cells which recapitulates the early steps of epithelial invasion. We show that a subset of S. flexneri is rapidly transcytosed, within 15 minutes, through M cells. We establish a newtime-lapse imaging approach of M cell infections, which reveals that another subset of bacteriainduces apical ruffling upon entry, vacuolar rupture and replicates within the M cells at later timepoints. Remarkably, these bacteria are able to spread from M cells to neighboring cells by actinbased-motility, which we show constitutes the main route of basolateral spreading of the infection.As we extend our study to L. monocytogenes, we observe that unlike S. flexneri, the bacterium diverts M cell transcytosis via the virulence factor ActA. However, we discover that L. monocytogenes spreads within the epithelium exclusively by actin-based motility, similar to S. flexneri. We propose that subversion of M cell transcytosis and avoidance of underlying immune tissues are features shared by cytosolic pathogens, allowing their escape from induction of adaptive immunity.In addition, we submit a pipeline of fluorescence-based single cell sorting of enterocytes atsuccessive stages of infection combined with transcriptional analysis by multiplex qPCR. This methodreveals the production of distinct responses in host enterocytes according to subcellular pathogen localizations. We observe the production of a strong bystander response involving multiplecorrelated host pathways in non-infected enterocytes. Moreover, we detect the output of distinct host response patterns according to vacuolar or cytosolic bacterial localizations in infectedenterocytes. We further show that the virulence effector OspF contributes to dampen infected host responses and disrupt otherwise correlated host signaling pathways. To conclude, our studies expose new immune subversion strategies linked to the intracellular life styles of cytosolic enteric bacteria, highlighting the importance of M cells in initial bacterial dissemination and diversion of adaptive immunity, and the organization and disruption of innate immune responses provoked in enterocytes during infection

Les voies aériennes humaines sont bordées d'un épithélium pseudostratifié composé principalement de cellules basales et de cellules pyramidales parmi lesquelles figurent les cellules sécrétrices de mucus et les cellules multiciliées. Toutes ces cellules contribuent à la clairance mucociliaire des voies respiratoires. Cet épithélium se régénère lentement dans des conditions homéostatiques, mais il est capable de se régénérer rapidement après agression grâce à des processus de prolifération, de migration, de polarisation et de différenciation. Chez les patients atteints de maladies respiratoires chroniques telles que la broncho-pneumopathie chronique obstructive, l'asthme ou la mucoviscidose, la réparation tissulaire est souvent défectueuse, caractérisée par une perte de cellules multiciliées et une hyperplasie des cellules sécrétrices, ayant pour conséquence une clairance mucociliaire affectée. La séquence des événements cellulaires conduisant à un tissu fonctionnel ou remodelé est encore mal décrite. Notre principal objectif a été d’identifier les types cellulaires successifs mis en jeu lors de la régénération tissulaire et les événements moléculaires responsables d'une régénération saine ou pathologique. Nous avons analysé la composition cellulaire de l’épithélium des voies respiratoires à plusieurs stades de différenciation en utilisant un modèle de culture 3D in vitro qui reproduit la composition cellulaire in vivo. En appliquant une méthode de transcriptomique sur cellule unique couplée à des méthodes bioinformatiques, nous avons établi les hiérarchies cellulaires permettant de reconstruire les différentes trajectoires cellulaires mises en jeu lors de la régénération de l’épithélium des voies respiratoires humaines. Après avoir confirmé les lignages cellulaires qui ont été précédemment décrits, nous avons découvert une nouvelle trajectoire reliant les cellules sécrétrices de mucus aux cellules multiciliées. Nous avons également caractérisé de nouvelles populations cellulaires et de nouveaux acteurs moléculaires impliqués dans le processus de régénération de l'épithélium des voies respiratoires humaines. Enfin, grâce à ces approches, nous avons mis en évidence des réponses spécifiques de chaque type cellulaire survenant dans des situations pathologiques d’hyperplasie sécrétoire. Ainsi, nos données, en apportant d'importantes contributions à la compréhension de la dynamique de différenciation de l’épithélium des voies respiratoires humaines, ouvrent de nouvelles voies vers l’identification de cibles thérapeutiques
Human airways are lined by a pseudostratified epithelium mainly composed of basal and columnar cells, among these cells we can find multiciliated, secretory cells and goblet cells. All these cells work together in the mucociliary clearance of the airways. This epithelium regenerates slowly under homeostatic conditions but is able to recover quickly after aggressions through proliferation, migration, polarization and differentiation processes. However, in patients with chronic pulmonary diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, asthma or cystic fibrosis, epithelial repair is defective, tissue remodeling occurs, leading to loss of multiciliated cells and goblet cell hyperplasia, impairing correct mucociliary clearance. The sequence of cellular events leading to a functional or remodelled tissue are still poorly described. Hence, we aim at identifying the successive cell types appearing during tissue regeneration and the molecular events that are responsible for healthy or pathological regeneration. We have analysed airway epithelial cell composition at several stages of differentiation using an in vitro 3D culture model which reproduces in vivo epithelial cell composition. Applying single cell transcriptomics and computational methods, we have identified cell lineage hierarchies and thus constructed a comprehensive cell trajectory roadmap in human airways. We have confirmed the cell lineages that have been previously described and have discovered a novel trajectory linking goblet cells to multiciliated cells. We have also discovered novel cell populations and molecular interactors involved in the process of healthy human airway epithelium regeneration. Using these approaches, we have finally shed light on cell-type specific responses involved in pathological goblet cell hyperplasia. Our data, by bringing significant contributions to the understanding of differentiation’s dynamics in the context of healthy and pathological human airway epithelium, may lead to the identification of novel therapeutic targets

Lors du développement, la coordination d’évènements moléculaires et cellulaires mène à la production du cortex qui orchestre les fonctions sensori-motrices et cognitives. Son développement s’effectue par étapes : les cellules gliales radiaires (RGs) – les cellules souches neurales (NSCs) du cerveau en développement – et les cellules progénitrices de la zone ventriculaire (VZ) et de la zone sous ventriculaire (SVZ) génèrent séquentiellement des vagues distinctes de nouveaux neurones qui formeront les différentes couches corticales. Autour de la naissance, les RGs changent de devenir et produisent des cellules gliales. Cependant, une fraction persiste tout au long de la vie dans la SVZ qui borde le ventricule, perdant au passage leur morphologie radiale. Ces NSCs produisent ensuite les différents sous types d’interneurones du bulbe olfactif ainsi que des cellules gliales en fonction de leur origine spatiale dans la SVZ. Ces observations soulèvent d’importantes questions non résolues sur 1) le codage transcriptionnel régulant la régionalisation de la SVZ, 2) le potentiel des NSCs postnatales dans la réparation cérébrale, et 3) le lignage et les spécificités transcriptionnelles entre les NSCs et leur descendants. Mon travail de doctorat repose sur une étude transcriptionnelle des domaines de la SVZ postnatale. Celle-ci soulignait le fort degré d’hétérogénéité des NSCs et progéniteurs et identifiait des régulateurs transcriptionnels clés soutenant la régionalisation. J’ai développé des approches bio-informatiques pour explorer ces données et connecter l’expression de facteurs de transcription (TFs) avec la genèse régionale de lignages neuraux distincts. J’ai ensuite développé un modèle d’ablation ciblée pour étudier le potentiel régénératif des progéniteurs postnataux dans divers contextes. Finalement, j’ai participé au développement d’une procédure pour explorer et comparer des progéniteurs pré et postnataux à l’échelle de la cellule unique. Objectif 1 : Des expériences de transcriptomique et de cartographie ont été réalisées pour étudier la relation entre l’expression régionale de TFs par les NSCs et l’acquisition de leur devenir. Nos résultats suggèrent un engagement précoce des NSCs à produire des types cellulaires définis selon leur localisation spatiale dans la SVZ et identifient HOPX comme un marqueur d’une sous population biaisé à générer des astrocytes. Objectif 2 : J’ai mis au point un modèle de lésion corticale qui permet l’ablation ciblée de neurones de couches corticales définies pour étudier la capacité régénérative et la spécification appropriée des progéniteurs postnataux. Une analyse quantitative des régions adjacentes, incluant la région dorsale de la SVZ, a révélé une réponse transitoire de progéniteurs définis. Objectif 3 : Nous avons développé la lignée de souris transgénique Neurog2CreERT2Ai14, qui permet le marquage de cohortes de progéniteurs glutamatergiques et de leurs descendants. Nous avons montré qu’une large fraction de ces progéniteurs persiste dans le cerveau postnatal après la fermeture de neurogénèse corticale. Ils ne s’accumulent pas pendant le développement embryonnaire mais sont produits par des RGs qui persistent après la naissance dans la SVZ et qui continuent de générer des neurones corticaux, bien que l’efficacité soit faible. Le séquençage d’ARN sur cellule unique a révélé une dérégulation transcriptionnelle qui corrèle avec le déclin progressif observé in vivo de la neurogénèse corticale. Ensemble, ces résultats soulignent le potentiel des études transcriptomiques à résoudre mais aussi à soulever des questions fondamentales comme les changements trancriptionnels intervenant dans une population de progéniteurs au cours du temps et participant aux changements de leur destinée. Cette connaissance sera la clé du développement d’approches novatrices pour recruter et promouvoir la génération de types cellulaires spécifiques, incluant les sous-types neuronaux dans un contexte pathologique
During development, a remarkable coordination of molecular and cellular events leads to the generation of the cortex, which orchestrates most sensorimotor and cognitive functions. Cortex development occurs in a stepwise manner: radial glia cells (RGs) - the neural stem cells (NSCs) of the developing brain - and progenitor cells from the ventricular zone (VZ) and the subventricular zone (SVZ) sequentially give rise to distinct waves of nascent neurons that form cortical layers in an inside-out manner. Around birth, RGs switch fate to produce glial cells. A fraction of neurogenic RGs that lose their radial morphology however persists throughout postnatal life in the subventricular zone that lines the lateral ventricles. These NSCs give rise to different subtypes of olfactory bulb interneurons and glial cells, according to their spatial origin and location within the postnatal SVZ. These observations raise important unresolved questions on 1) the transcriptional coding of postnatal SVZ regionalization, 2) the potential of postnatal NSCs for cellular regeneration and forebrain repair, and 3) the lineage relationship and transcriptional specificities of postnatal NSCs and of their progenies. My PhD work built upon a previously published comparative transcriptional study of defined microdomains of the postnatal SVZ. This study highlighted a high degree of transcriptional heterogeneity within NSCs and progenitors and revealed transcriptional regulators as major hallmarks sustaining postnatal SVZ regionalization. I developed bioinformatics approaches to explore these datasets further and relate expression of defined transcription factors (TFs) to the regional generation of distinct neural lineages. I then developed a model of targeted ablation that can be used to investigate the regenerative potential of postnatal progenitors in various contexts. Finally, I participated to the development of a pipeline for exploring and comparing select populations of pre- and postnatal progenitors at the single cell level. Objective 1: Transcriptomic as well as fate mapping were used to investigate the relationship between regional expression of TFs by NSCs and their acquisition of distinct neural lineage fates. Our results supported an early priming of NSCs to produce defined cell types depending of their spatial location in the SVZ and identified HOPX as a marker of a subpopulation biased to generate astrocytes. Objective 2: I established a cortical lesion model, which allowed the targeted ablation of neurons of defined cortical layers to investigate the regenerative capacity and appropriate specification of postnatal cortical progenitors. Quantitative assessment of surrounding brain regions, including the dorsal SVZ, revealed a transient response of defined progenitor populations. Objective 3: We developed a transgenic mouse line, i.e. Neurog2CreERT2Ai14, which allowed the conditional labeling of birth-dated cohorts of glutamatergic progenitors and their progeny. We used fate-mapping approaches to show that a large fraction of Glu progenitors persist in the postnatal forebrain after closure of the cortical neurogenesis period. Postnatal Glu progenitors do not accumulate during embryonal development but are produced by embryonal RGs that persist after birth in the dorsal SVZ and continue to give rise to cortical neurons, although with low efficiency. Single-cell RNA sequencing revealed a dysregulation of transcriptional programs, which correlates with the gradual decline in cortical neurogenesis observed in vivo. Altogether, these data highlight the potential of transcriptomic studies to unravel but also to approach fundamental questions such as transcriptional changes occurring in a population of progenitors over time and participating to changes in their fate potential. This knowledge will be key in developing innovative approaches to recruit and promote the generation of selected cell types, including neuronal subtypes in pathologies

Les voies aériennes humaines sont bordées d'un épithélium pseudostratifié composé principalement de cellules basales et de cellules pyramidales parmi lesquelles figurent les cellules sécrétrices de mucus et les cellules multiciliées. Toutes ces cellules contribuent à la clairance mucociliaire des voies respiratoires. Cet épithélium se régénère lentement dans des conditions homéostatiques, mais il est capable de se régénérer rapidement après agression grâce à des processus de prolifération, de migration, de polarisation et de différenciation. Chez les patients atteints de maladies respiratoires chroniques telles que la broncho-pneumopathie chronique obstructive, l'asthme ou la mucoviscidose, la réparation tissulaire est souvent défectueuse, caractérisée par une perte de cellules multiciliées et une hyperplasie des cellules sécrétrices, ayant pour conséquence une clairance mucociliaire affectée. La séquence des événements cellulaires conduisant à un tissu fonctionnel ou remodelé est encore mal décrite. Notre principal objectif a été d’identifier les types cellulaires successifs mis en jeu lors de la régénération tissulaire et les événements moléculaires responsables d'une régénération saine ou pathologique. Nous avons analysé la composition cellulaire de l’épithélium des voies respiratoires à plusieurs stades de différenciation en utilisant un modèle de culture 3D in vitro qui reproduit la composition cellulaire in vivo. En appliquant une méthode de transcriptomique sur cellule unique couplée à des méthodes bioinformatiques, nous avons établi les hiérarchies cellulaires permettant de reconstruire les différentes trajectoires cellulaires mises en jeu lors de la régénération de l’épithélium des voies respiratoires humaines. Après avoir confirmé les lignages cellulaires qui ont été précédemment décrits, nous avons découvert une nouvelle trajectoire reliant les cellules sécrétrices de mucus aux cellules multiciliées. Nous avons également caractérisé de nouvelles populations cellulaires et de nouveaux acteurs moléculaires impliqués dans le processus de régénération de l'épithélium des voies respiratoires humaines. Enfin, grâce à ces approches, nous avons mis en évidence des réponses spécifiques de chaque type cellulaire survenant dans des situations pathologiques d’hyperplasie sécrétoire. Ainsi, nos données, en apportant d'importantes contributions à la compréhension de la dynamique de différenciation de l’épithélium des voies respiratoires humaines, ouvrent de nouvelles voies vers l’identification de cibles thérapeutiques
Human airways are lined by a pseudostratified epithelium mainly composed of basal and columnar cells, among these cells we can find multiciliated, secretory cells and goblet cells. All these cells work together in the mucociliary clearance of the airways. This epithelium regenerates slowly under homeostatic conditions but is able to recover quickly after aggressions through proliferation, migration, polarization and differentiation processes. However, in patients with chronic pulmonary diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, asthma or cystic fibrosis, epithelial repair is defective, tissue remodeling occurs, leading to loss of multiciliated cells and goblet cell hyperplasia, impairing correct mucociliary clearance. The sequence of cellular events leading to a functional or remodelled tissue are still poorly described. Hence, we aim at identifying the successive cell types appearing during tissue regeneration and the molecular events that are responsible for healthy or pathological regeneration. We have analysed airway epithelial cell composition at several stages of differentiation using an in vitro 3D culture model which reproduces in vivo epithelial cell composition. Applying single cell transcriptomics and computational methods, we have identified cell lineage hierarchies and thus constructed a comprehensive cell trajectory roadmap in human airways. We have confirmed the cell lineages that have been previously described and have discovered a novel trajectory linking goblet cells to multiciliated cells. We have also discovered novel cell populations and molecular interactors involved in the process of healthy human airway epithelium regeneration. Using these approaches, we have finally shed light on cell-type specific responses involved in pathological goblet cell hyperplasia. Our data, by bringing significant contributions to the understanding of differentiation’s dynamics in the context of healthy and pathological human airway epithelium, may lead to the identification of novel therapeutic targets

Les cancers pelviens ont une prévalence élevée et sont principalement traités par radiothérapie. Si elle permet un contrôle de la tumeur, la radiothérapie peut également provoquer des lésions aux tissus sains environnants, entrainant des complications invalidantes définies comme une maladie à part entière, la «Pelvic Radiation Disease» ou PRD. Aujourd'hui, il n'existe pas de traitement curatif pour cette pathologie fibrosante. Ce projet vise à étudier le microenvironnement du côlon après irradiation afin d'identifier, à terme, des cibles thérapeutiques pour la prise en charge des séquelles coliques de la PRD. Pour ce projet, un modèle de souris développant des lésions coliques fibrosantes similaires à celles observées chez les patients atteints de PRD a été mis au point. Il consiste en une irradiation colorectale localisée en dose unique de 26Gy. Nous avons défini 2 temps d'étude post-irradiation : à 2 semaines afin d'étudier les effets aigus de l'irradiation ainsi que le processus de régénération et 12 semaines pour étudier la fibrose. Des études histologiques ont permis de caractériser les lésions muqueuses avec un ulcère profond à 2 semaines, et des remaniements fibreux à 12 semaines. Aux 2 temps étudiés, un processus de prolifération accru et désordonné a été observé ainsi qu'un déficit en protéines de jonctions épithéliales suggérant un défaut de la fonction de barrière. Nous avons démontré l'impact du microenvironnement colique irradié sur les processus de prolifération et de différenciation épithélial par un système de coculture avec des organoïdes coliques suivi par vidéo-microscopie. Nos résultats ont permis de valider les observations in vivo, à savoir une prolifération accrue des organoïdes en présence de stroma issus de souris 12 semaines post-irradiation. Afin de caractériser les cellules mésenchymateuses du stroma après irradiation, des expériences de séquençage d'ARN sur cellule unique (à partir de cellules coliques triées EpCAM-CD45- et issues de colon total) et de transcriptomique spatiale ont été réalisées. Elles ont mis en évidence un nouveau marqueur, Edil3, spécifique de la population stromale majeure du côlon. Ce nouveau marqueur nous a permis de mieux caractériser cette population cellulaire en termes de fonction et de localisation au niveau du côlon sain. Nous avons proposé de la nommer Mésitocytes. Au temps précoce, nous avons établi que cette population pouvait se différencier vers un profil pro-inflammatoire appelé « IAF » pour «Inflammation-Associated Fibroblasts». Nous avons également observé une augmentation de l'expression de transcrits impliqués dans des fonctions cruciales telles que l'homéostasie épithéliale, l'angiogenèse et l'inflammation par la majorité des cellules mésenchymateuses. Les résultats montrent l'importance des signaux moléculaires prolifératifs issus des cellules endothéliales lymphatiques et des cellules musculaires lisses, notamment Grem-1. L'analyse de la phase chronique après irradiation, confirme l'augmentation des signaux prolifératifs par les cellules du stroma. De plus, un nouveau type de cellules fibroblastique associé à la fibrose a été observé, caractérisé par profil transcriptionnel différent des IAF observés en phase précoce. L'étude de l'impact de l'irradiation sur le compartiment épithélial a mis en évidence des modifications importantes au niveau de la population de colonocytes et l'émergence de cellules épithéliales avec un phénotype « revival », déjà décrit dans la littérature. De façon intéressante, ces populations ont des localisations spécifiques au niveau des cryptes en régénération. Nous avons également établi l'importance de gènes tels que Lypd8 et Anxa1 dans la progression des cellules épithéliales proliférantes vers un phénotype «revival». Des observations intéressantes issues des analyses de transcriptomique spatiale permettent également d'émettre des hypothèses quant au rôle des cellules immunitaires dans le processus de régénération épithélial
Pelvic cancers are highly prevalent and are mainly treated with radiotherapy. While radiation therapy may control the tumor, it can also cause damage to surrounding healthy tissue, leading to disabling complications defined as a disease “pelvic radiation disease” (PRD). Currently, there is no curative treatment for this fibrosing pathology. The aims of this project are to study the colonic microenvironment after irradiation with a view to identify new therapeutic targets to improve the management of the colonic sequelae of PRD. For this project, a mouse model developing fibrosing colonic lesions similar to those observed in PRD patients was developed. It consists of localized colorectal irradiation with a single dose of 26Gy. We defined 2 post-irradiation study periods: 2 weeks to study the acute effects of irradiation and the regeneration process, and 12 weeks to study fibrosis. Histological studies characterized the mucosal lesions, with a deep ulcer at 2 weeks and fibrous remodeling at 12 weeks. At the 2 time points studied, an increased and disorganized proliferative process was observed, as well as a deficit in epithelial junction proteins, suggesting a defect in barrier function. We demonstrated the impact of the irradiated colonic microenvironment on epithelial proliferation and differentiation processes using a co-culture system with colonic organoids monitored by video microscopy. Our results validated in vivo observations of increased organoid proliferation in the presence of stroma derived from mice 12 weeks post-irradiation.To characterize stromal mesenchymal cells after irradiation, single-cell RNA sequencing experiments (using EpCAM-CD45-sorted colonic cells and from whole colon) and spatial transcriptomics were performed. They revealed a new marker, Edil3, specific for the major stromal population of the colon. This new marker allowed us to better characterize this cell population in terms of function and localization in the healthy colon. We proposed to call them mesitocytes. In the early stages, we found that this population could differentiate towards a pro-inflammatory profile called "IAF" for "Inflammation-Associated Fibroblasts". We also observed increased expression of transcripts involved in critical functions such as epithelial homeostasis, angiogenesis and inflammation by the majority of mesenchymal cells. The results demonstrate the importance of proliferative molecular signals from lymphatic endothelial cells and smooth muscle cells, particularly Grem-1. Analysis of the chronic phase after irradiation confirms the increase in proliferative signals from stromal cells. In addition, a new fibroblast cell type associated with fibrosis was observed, characterized by a transcriptional profile different from that of the IAF observed in the early phase. The study of the effects of irradiation on the epithelial compartment revealed significant changes in the colonocyte population and the appearance of epithelial cells with a "revival" phenotype, already described in the literature. Interestingly, these populations have specific localizations in regenerating crypts. We also established the importance of genes such as Lypd8 and Anxa1 in the progression of proliferating epithelial cells towards a "revival" phenotype. Interesting observations from spatial transcriptomic analyses also allow us to hypothesize the role of immune cells in the epithelial regeneration process