Добірка наукової літератури з теми "Tomographie cryo-électronique"

Les microtubules (MTs) sont des constituants hautement dynamiques du cytosquelette, impliqués dans de nombreux processus cellulaires tels que la division cellulaire ou le transport d'organites. Leur comportement dynamique est régulé par différents facteurs tels que les +TIPs, qui présentent la particularité de cibler les extrémités en croissance des MTs. Une de ces protéines, EB1, cible de façon autonome ces extrémités et y recrute un grand nombre d'autres +TIPs. Néanmoins, les mécanismes moléculaires impliqués dans cette reconnaissance restent imprécis. Afin de mettre en évidence une caractéristique structurale présente à l'extrémité des MTs en croissance et préférentiellement reconnue par EB1, nous avons utilisé deux approches de cryo-microscopie électronique. Nous avons tout d'abord utilisé une approche d'analyse par particules isolées, dans le but de comparer les reconstructions 3D de MTs assemblés en présence de GTP ou de GMPCPP, analogue lentement hydrolysable du GTP. Par la suite, nous avons utilisé la cryo-tomographie électronique couplée au marquage d'EB1 avec des nanoparticules d'or fonctionnalisées. Nos résultats nous permettent de proposer un modèle de ciblage impliquant une relocalisation de l'extrémité C-terminale d'EB1 lors de la fermeture des feuillets en tube. Cette relocalisation permettrait de recruter les autres +TIPs, et entraînerait une perte d'affinité d'EB1 pour la paroi des microtubules. La comparaison de ces résultats avec des études récentes effectuées par d'autres équipes, et concernant le rôle de l'hydrolyse du GTP dans la liaison d'EB1 avec les MTs, nous permet de proposer un modèle global incluant l'ensemble de ces données
Microtubules (MTs) are highly dynamic cytoskeleton polymers, involved in many cellular processes, including cell division and intracellular transport. Their dynamic behavior is regulated by numerous factors, such as +TIPs that preferentially target MT growing ends

Le centrosome est un organite cellulaire qui joue un rôle majeur dans l'organisation spatiale du réseau de microtubules. Le centrosome est composé de deux centrioles qui ne se dupliquent qu'une seule fois pendant le cycle cellulaire, générant un procentriole en région proximale des centrioles matures. En dépit des rôles essentiels du centrosome, les mécanismes structuraux impliqués dans la duplication du centriole restent largement mal connus. Cette thèse décrit l’assemblage du procentriole humain en utilisant la cryo-tomographie électronique. Dans les centrosomes isolés de cellules KE37, nous observons que chacun des neuf triplets de microtubules croît indépendamment des autres autour d’une structure périodique. L’extrémité proximale du microtubule A est fermée par une structure conique et les microtubules B et C s’allongent bidirectionellement à partir de la paroi du microtubule A et B respectivement. Ces observations suggèrent que le complexe de γ-tubuline en forme d’anneau (γ-TuRC) joue un rôle fondamental dans la formation du procentriole en nucléant le microtubule A, lequel sert de support à l’élongation du microtubule B qui, à son tour, supporte la croissance du microtubule C. Ce travail apporte un nouveau regard sur les évènements structuraux précoces impliqués dans l’assemblage du procentriole et établit les bases pour déterminer le mécanisme moléculaire de la duplication du centriole à une échelle nanométrique.

La cryo-microscopie électronique à particules isolées est une modalité d’imagerie permettant d’estimer la structure 3D de molécules. L’obtention d’un volume 3D est effectué par des algorithmes de reconstruction tomographique après acquisition par un microscope électronique à transmission d’un ensemble d’images de projection de l’objet observé. Les méthodes de reconstruction tomographique existantes permettent de déterminer la structure des molécules avec des résolutions proches de l’angström. Cependant la résolution est dégradée lorsque les molécules observées sont déformables. Les travaux réalisés au cours de cette thèse contribuent au développement de méthodes de traitement informatique des données (projections) dans le but de prendre en compte les déformations de l’objet observé dans le processus de reconstruction tomographique ab initio. Les problématiques principales abordées dans ce mémoire sont l’estimation des paramètres de projection basée sur la réduction de dimension non-linéaire, la détection des arêtes erronées dans les graphes de voisinages pour l’amélioration de la robustesse au bruit des méthodes de réduction de dimension, et la reconstruction tomographique basée sur un modèle paramétrique du volume
Single particle cryo-electron microscopy is a technique that allows to estimate the 3D structure of biological complex. The construction of the 3D volume is performed by computerized tomography applied on a set of projection images from transmission electron microscope. Existing tomographic reconstructionalgorithms allow us to visualize molecular structure with a resolution around one angstrom. However the resolution is degraded when the molecules are deformable. This thesis contributes to the development of signal processing method in order to take into account the deformation information of the observed object for the ab initio tomographic reconstruction. The main contributions of this thesis are the estimation of projection parameters based on non-linear dimensionreduction, the false edges detection in neighborhood graphs to improve noise robustness of dimension reduction methods, and tomographic reconstruction based on a parametric model of the volume

L'hétérochromatine constitutive est une forme condensée de chromatine, essentielle au maintien de la stabilité du génome et à la défense contre les rétrotransposons et les rétrovirus endogènes. À l'échelle moléculaire, elle se caractérise par des réseaux réguliers de nucléosomes, la méthylation de l'ADN et des histones et la liaison de protéines spécifiques associées à l'hétérochromatine (famille HP1). Cependant, la manière dont ces caractéristiques moléculaires conduisent à l'état condensé et définissent les propriétés fonctionnelles de l'hétérochromatine constitutive n'est pas encore claire. Le projet abordera cette question en déterminant la structure de l'hétérochromatine constitutive péricentrique directement à l'intérieur de son contenu cellulaire en utilisant la cryotomographie in situ de pointe. Les embryons de drosophile sont utilisés comme modèle expérimental, car dans leurs noyaux, les régions d'hétérochromatine péricentrique coalescent en chromocentres ronds de l'ordre du micron. Nous utilisons la cryosection avec des couteaux diamantés pour l'amincissement de l'échantillon, puis les tomogrammes des chromocentres, ainsi que d'autres domaines de la chromatine, seront enregistrés et reconstruits. Cela nous permettra de définir l'arrangement caractéristique des fibres de nucléosomes pour l'hétérochromatine péricentrique constitutive par comparaison avec l'empaquetage de la chromatine dans d'autres compartiments chromatiniens
Constitutive heterochromatin is a condensed form of chromatin, essential for the maintenance of genome stability and the defense against retrotransposons and endogenous retroviruses. At the molecular scale, it is characterized by regular nucleosome arrays, DNA and histone methylation and binding of specific heterochromatin-associated proteins (HP1 family). However, it remains unclear how these molecular features lead to the condensed state and define the functional properties of constitutive heterochromatin. The project will address this question by determining the structure of pericentric constitutive heterochromatin directly within its cellular content by using state-of-the-art in situ cryo-electron tomography. Drosophila embryos are used as the experimental model, because in their nuclei, the pericentric heterochromatin regions coalesce into round micron-scale chromocenters. We use cryo-sectioning with diamond knives for sample thinning, and then tomograms of chromocenters, as well as other chromatin domains will be recorded and reconstructed. This will enable us to define the characteristic nucleosome fiber arrangement for the constitutive pericentric heterochromatin by comparison with the chromatin packing in other chromatin compartments

Le travail présenté dans ce manuscrit a montré l’importance du développement méthodologique et technique pour identifier et débloquer les verrous empêchant l’analyse de matériaux hybrides et complexes qui se dégradent sous irradiation par un faisceau d’électrons. Nous avons mis en évidence que des dégâts sur l’échantillon produits par les électrons n’apparaissent qu’au-dessus d'un certain seuil de densité de courant électronique qui dépend de la nature du matériau et de ses caractéristiques morphologiques et structurales. Ces développements couplés à la Cryo-EM, nous ont permis de mettre en évidence l’architecture des matériaux hybrides à base de carbone, la variation de la distance lamellaire dans une pérovskite en fonction de la molécule insérée et le positionnement du métal, d’identifier les interactions à l’interface entre deux cristaux moléculaires et la quantification 3D de la fonctionnalisation d’un MOF. Dans la dernière partie, nous avons mis en évidence les processus de nucléation et de croissance d’oxyde de fer par MET in-situ en phase liquide
The present manuscript shows the importance of methodological and technical development to identify and to unblock locks preventing the analysis of hybrid and complex materials that undergo degradation under electron beam irradiation. We have shown that beam-induced damage to the sample only appears above some specific threshold of current density. Such a threshold depends on the nature of the material and on its morphological and structural characteristics. These developments in synergy with the use of Cryo-EM, allowed us to expose the architecture of carbon-based hybrid materials, measure the variation of the lamellar distance in a perovskite according to the molecular spacer and to the positioning of the metal, identify the interactions at the interface between two molecular crystals, and the 3D quantification of the functionalization within a MOF. Lastly, we brought to light the processes of nucleation and growth of iron oxide by in-situ liquid phase TEM

La grande majorité des essais cliniques de transfert de gènes in vivo utilise des vecteurs viraux. Si ces derniers sont efficaces, ils présentent des risques immunogènes, toxiques, voire mutagènes avérés. Les vecteurs synthétiques (non viraux), par leur grande modularité et leur faible toxicité représentent une alternative très prometteuse. Le principal frein à leur utilisation est leur manque d’efficacité. L’objectif majeur de ce travail de thèse a été de comprendre le mécanisme de transfert de gènes associé à différents complexes vecteurs synthétiques/ADN plasmidique, ce qui est indispensable pour une conception rationnelle de nouveaux vecteurs. Nous avons étudié, sur cellules en culture, le mécanisme de transfert de gènes associé à deux lipides cationiques ; le BGTC (bis(guanidinium)-tren-cholesterol) et la DOSP (DiOleylamine A-Succinyl-Paromomycine) qui sont connus pour être des vecteurs efficaces in vitro. Nous avons ainsi pu visualiser par microscopie électronique leurs voies d’entrée, leurs remaniements structuraux ainsi que leur échappement endosomal qui représente une étape clé du processus de transfert de gènes. L’identification non ambigüe des lipoplexes tout au long de leur trafic intracellulaire a été rendue possible grâce au marquage de l’ADN par des nanoparticules de silice dotées d’un cœur de maghémite (Fe2O3) dense aux électrons. Cette stratégie de marquage a également été appliquée à l’étude du mécanisme d’action d’un autre vecteur synthétique de type polymère, le copolymère à blocs non ionique P188 ou Lutrol. Contrairement à la plupart des vecteurs synthétiques, celui-ci présente une efficacité de transfection in vivo chez la souris par injection in situ pour le tissu musculaire ou en intra trachéale dans le poumon. En revanche, il est totalement inefficace in vitro. Nous avons montré que le Lutrol permet une augmentation de l’internalisation d’ADN par les cellules mais n’induit pas son échappement endosomal, ce qui expliquerait son absence d’efficacité in vitro. D’autres voies d’entrée sont alors à envisager in vivo pour comprendre son mécanisme d’action
The vast majority of clinical trials of gene transfer in vivo use viral vectors. Although they are effective, they induce immunogenic, toxic or mutagenic risks. Due to their high modularity and low toxicity, synthetic vectors (non viral), represent a promising alternative despite their lack of effectiveness. The major objective of this work was to understand the mechanism of gene transfer using two prototypic synthetic vectors, in the context of a rational design of new vectors. We studied on cultured cells, the mechanism of action of two cationic lipids; BGTC (bis(guanidinium)-tren-cholesterol) and DOSP (DiOleylamine A-Succinyl-Paromomycine) formulated with plasmid DNA (lipoplexes) which are in vitro efficient vectors. We have been able to visualize by electron microscopy, their intracellular pathways, their structural alterations and their endosomal escape, the latter being a key step in the process of gene transfer. The unambiguous identification of lipoplexes throughout their intracellular trafficking has been made possible thanks to the labelling of DNA by core-shell silica nanoparticles with an electron dense maghemite core (Fe2O3). The labeling strategy has also been applied to study the mechanism of action of a nonionic block copolymer (P188 or Lutrol). Interestingly, these synthetic vectors have an in vivo transfection efficiency in mice lung and muscle tissue while they are totally inefficient in vitro. We have shown that Lutrol induces an increase of DNA internalization into cells and fails to trigger endosomal escape, which would explain the lack of in vitro efficacy. These findings suggest that the in vivo mechanism of action of Lutrol would involve other internalization pathways

Des colloïdes à base de silice et de polystyrène ont été synthétisés. Les particules d’oxyde ont d’abord été élaborées et modifiées en surface, puis ont servi de germes au cours d’une étape de polymérisation du styrène. Deux procédés de polymérisation en phase hétérogène ont été utilisés (émulsion ou dispersion) menant à des colloïdes aux morphologies originales et contrôlées. Une étude morphologique par tomographie électronique a permis de mieux comprendre les mécanismes de croissance et d’organisation des particules de latex autour des germes de silice. La synthèse de particules Janus pour l’imagerie biomédicale est aussi décrite. Ces particules de silice ont été modifiées en surface par un chromophore biphotonique et un agent de reconnaissance de certaines cellules tumorales. Des études spectroscopiques et des tests de cytotoxicité ont été entrepris
Hybrid colloids based on silica and polystyrene have been synthesized. Oxide particles were first elaborated, surface modified, and then used as seed in a styrene polymerization step. Two heterogeneous polymerisation proceeds were employed (emulsion or dispersion) leading to colloids with original and controlled morphologies. A morphological study by electronic tomography enabled to better understand growth and organisation mechanisms of latexes around silica seeds. Janus particles synthesis for biomedical imaging is also described. Silica particles were surface modified with a biphotonic chromophore and a tumor cells targeting agent. Spectroscopic studies and cytotoxicity tests were investigated

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie Gram-négative qui présente une grande résistance aux antibiotiques, lui permettant de sévir dans le milieu hospitalier en infectant plus particulièrement les patients immunodéprimés. Cette résistance est principalement due au système d’efflux membranaire MexAB-OprM, capable d’exporter les antibiotiques en dehors de la cellule. Cette pompe à efflux est composée de trois protéines, MexA, MexB et OprM, incorporées dans les membranes internes et externes de la paroi bactérienne. Les structures de MexA, OprM et AcrB -une protéine présente chez E. coli, homologue de MexB- ont été déterminées individuellement par cristallographie des rayons X. Cependant, la structure du complexe entier, regroupant les trois protéines en interaction, ainsi que le mécanisme de cette pompe font toujours défaut. Le renforcement de nos connaissances structurales et fonctionnelles est donc capital pour lutter plus efficacement contre ces bactéries, par de nouvelles stratégies médicamenteuses. Ce travail porte sur l’étude de la structure et de la stœchiométrie de l’assemblage des protéines OprM et MexA au sein d’une membrane lipidique. La caractérisation du complexe OprM/MexA a été réalisée à l’aide de nouvelles techniques de caractérisation physico-chimique des surfaces, telle que la Microbalance à Cristal de Quartz avec Mesure de Dissipation (QCM-D), et par des méthodes d’imagerie, telles que la Cryo-Microscopie Electronique en Transmission (CryoMET) et la Cryo-Tomographie Electronique (CryoTE). En QCM-D, les mesures d’interaction entre OprM et MexA ont été réalisées sur support solide en contrôlant l’orientation d’OprM placée dans un environnement lipidique. Après ajout de la protéine MexA, la formation de complexes OprM/MexA a été mise évidence. Pour comprendre l’organisation de ce complexe, nous avons procédé à une étude comparative de l’organisation des protéines OprM, MexA et du complexe OprM/MexA incorporés dans une membrane lipidique, par CryoMET. Trois types d’organisation, respectivement spécifiques d’OprM, de MexA et du complexe OprM/MexA, ont été mis en évidence. Une analyse structurale de ces trois différents assemblages, pris en sandwich entre deux membranes lipidiques, a été menée par CryoTE. La reconstitution de la protéine OprM conduit à la formation de protéoliposomes, dû à des interactions intervenant entre les protéines OprM au niveau de leurs hélices périplasmiques. La protéine MexA s’organise sous forme d’une structure annulaire de 13 nm de hauteur au sein des membranes lipidiques, et d’une structure plus complexe de 26 nm de hauteur, résultant de l’empilement tête-bêche de deux structures annulaires de 13 nm. Ce travail révèle les dimensions exactes de l’assemblage formé par MexA, et permet de localiser à proximité des membranes les domaines non résolus dans la structure cristallographique. La reconstitution du complexe OprM/MexA révèle une disposition régulière des deux protéines dans les membranes lipidiques. Au sein des complexes, les protéines OprM sont présentes sous forme de trimères. Dans la membrane opposée, à l’aplomb d’une molécule d’OprM, MexA ne forme pas une structure annulaire similaire à celle décrite précédemment, indiquant un état d’oligomérisation différent de celui observé dans les assemblages MexA. Les densités de MexA sont compatibles avec la présence de quelques molécules de MexA. Cependant des structures annulaires de MexA, positionnées à l’aplomb de trois trimères d’OprM sont visibles. Notre étude montre que MexA adopte des structures oligomériques spécifiques en fonction de ses interactions avec les membranes lipidiques ou avec son partenaire OprM
The structure determination of membrane protein in lipid environment can be carried out using cryo electron microscopy combined with the recent development of data collection and image processing. We describe a protocol to study assemblies or stacks of membrane protein reconstitued into a lipid membrane using both cryo electron tomography and single particle analysis which is an alternative approach to electron crystallography for solving 3D structure. We show the organization of the successive layers of OprM molecules revealing the protein-protein interactions between OprM molecules of two successive lipid bilayers

Les molécules colloïdales peuvent être décrites comme des agrégats robustes de particules sphériques prenant la forme de certaines molécules simples. La préparation de suspensions de molécules colloïdales est étudiée afin d'obtenir de hauts rendements en morphologie et des distributions étroites en taille des objets, conditions indispensables pour envisager de futures applications comme leur assemblage et l'élaboration de matériaux. La stratégie repose sur l'introduction de germes de silice fonctionnalisés dans une polymérisation en émulsion du styrène, menant à la nucléation-croissance d'un nombre restreint de nodules sphériques de latex ancrés à la surface de la silice.Les travaux proposent une optimisation des voies de préparation (i) des germes de silice par voie sol-gel et (ii) des particules de latex de PS par polymérisation en émulsion. Les structures des clusters silice/PS sont caractérisées par cryo-tomographie électronique et leur formation fait l'objet de discussions notamment en s'appuyant sur des modèles géométriques connus et en proposant un nouveau modèle de croissance des nodules. Enfin, une étude préliminaire est menée afin de recouvrir ces clusters d'une couche d'oxyde (SiO2 et TiO2).