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Dynamic changes in spontaneous electroencephalogram (EEG) rhythms can be seen to occur with a high rate of variability. An innovative method to study brain function is by triggering oscillatory brain activity with transcranial magnetic stimulation (TMS). EEG-TMS coregistration was performed on five healthy subjects during a 1-day experimental session that involved four steps: baseline acquisition, unconditioned single-pulse TMS, intracortical inhibition (ICI, 3 ms) paired-pulse TMS, and transcallosal stimulation over left and right primary motor cortex (M1). A time-frequency analysis based on the wavelet method was used to characterize rapid modifications of oscillatory EEG rhythms induced by TMS. Single, paired, and transcallosal TMS applied on the sensorimotor areas induced rapid desynchronization over the frontal and central-parietal electrodes mainly in the alpha and beta bands, followed by a rebound of synchronization, and rapid synchronization of delta and theta activity. Wavelet analysis after a perturbation approach is a novel way to investigate modulation of oscillatory brain activity. The main findings are consistent with the concept that the human motor system may be based on networklike oscillatory cortical activity and might be modulated by single, paired, and transcallosal magnetic pulses applied to M1, suggesting a phenomenon of fast brain activity resetting and triggering of slow activity.

Coregistration of transcranial magnetic stimulation (TMS) and electroencephalography (EEG) allows non-invasive probing of brain circuits: TMS induces brain activation due to the generation of a properly oriented focused electric field (E-field) using a coil placed on a selected position over the scalp, while EEG captures the effects of the stimulation on brain electrical activity. Moreover, the combination of these techniques allows the investigation of several brain properties, including brain functional connectivity. The choice of E-field parameters, such as intensity, orientation, and position, is crucial for eliciting cortex-specific effects. Here, we evaluated whether and how the spatial pattern, i.e., topography and strength of functional connectivity, is modulated by the stimulus orientation. We systematically altered the E-field orientation when stimulating the left pre-supplementary motor area and showed an increase of functional connectivity in areas associated with the primary motor cortex and an E-field orientation-specific modulation of functional connectivity intensity.

The human brain is a complex network in which hundreds of brain regions are interconnected via thousands of axonal pathways. The capability of such a complex system emerges from specific interactions among smaller entities, a set of events that can be described by the activation of interconnections between brain areas. Studies that focus on brain connectivity have the aim of understanding and modeling brain function, taking into account the spatiotemporal dynamics of neural communication between brain regions. Much of the current knowledge regarding brain connectivity has been obtained from stand-alone neuroimaging methods. Nevertheless, the use of a multimodal approach seems to be a powerful way to investigate effective brain connectivity, overcoming the limitations of unimodal approaches. In this review, we will present the advantages of an integrative approach in which transcranial magnetic stimulation–electroencephalography coregistration is combined with magnetic resonance imaging methods to explore effective neural interactions. Moreover, we will describe possible implementations of the integrative approach in open- and closed-loop frameworks where real-time brain activity becomes a contributor to the study of cognitive brain networks.

When linking in time electrical stimulation of the peripheral nerve with transcranial magnetic stimulation (TMS), the excitability of the motor cortex can be modulated to evoke clear inhibition, as reflected by the amplitude decrement in the motor-evoked potentials (MEPs). This specific property, designated short-latency afferent inhibition (SAI), occurs when the nerve–TMS interstimulus interval (ISI) is approximately 25 ms and is considered to be a corticothalamic phenomenon. The aim of the present study was to use the electroencephalographic (EEG) responses to navigated-TMS coregistration to better characterize the neuronal circuits underlying SAI. The present experimental set included magnetic resonance imaging (MRI)–navigated TMS and 60-channel TMS-compatible EEG devices. TMS-evoked EEG responses and MEPs were analyzed in eight healthy volunteers; ISIs between median nerve and cortical stimulation were determined relative to the latency of the individual N20 component of the somatosensory-evoked potential (SEP) obtained after stimulation of the median nerve. ISIs from the latency of the N20 plus 3 ms and N20 plus 10 ms were investigated. In all experimental conditions, TMS-evoked EEG responses were characterized by a sequence of negative deflections peaking at approximately 7, 44, and 100 ms alternating with positive peaks at approximately 30, 60, and 180 ms post-TMS. Moreover, ISI N20+3 ms modulated both EEG-evoked activity and MEPs. In particular, it inhibited MEP amplitudes, attenuated cortical P60 and N100 responses, and induced motor cortex beta rhythm selective decrement of phase locking. The findings of the present experiment suggest the cortical origin of SAI that could result from the cortico–cortical activation of GABAergic-mediated inhibition onto the corticospinal neurons modulated by cholinergic activation able to reducing intralaminar inhibition and promoting intracolumnar inhibition.

Agricultural terraced landscapes, which are important historical heritage sites (e.g., UNESCO or Globally Important Agricultural Heritage Systems (GIAHS) sites) are under threat from increased soil degradation due to climate change and land abandonment. Remote sensing can assist in the assessment and monitoring of such cultural ecosystem services. However, due to the limitations imposed by rugged topography and the occurrence of vegetation, the application of a single high-resolution topography (HRT) technique is challenging in these particular agricultural environments. Therefore, data fusion of HRT techniques (terrestrial laser scanning (TLS) and aerial/terrestrial structure from motion (SfM)) was tested for the first time in this context (terraces), to the best of our knowledge, to overcome specific detection problems such as the complex topographic and landcover conditions of the terrace systems. SfM–TLS data fusion methodology was trialed in order to produce very high-resolution digital terrain models (DTMs) of two agricultural terrace areas, both characterized by the presence of vegetation that covers parts of the subvertical surfaces, complex morphology, and inaccessible areas. In the unreachable areas, it was necessary to find effective solutions to carry out HRT surveys; therefore, we tested the direct georeferencing (DG) method, exploiting onboard multifrequency GNSS receivers for unmanned aerial vehicles (UAVs) and postprocessing kinematic (PPK) data. The results showed that the fusion of data based on different methods and acquisition platforms is required to obtain accurate DTMs that reflect the real surface roughness of terrace systems without gaps in data. Moreover, in inaccessible or hazardous terrains, a combination of direct and indirect georeferencing was a useful solution to reduce the substantial inconvenience and cost of ground control point (GCP) placement. We show that in order to obtain a precise data fusion in these complex conditions, it is essential to utilize a complete and specific workflow. This workflow must incorporate all data merging issues and landcover condition problems, encompassing the survey planning step, the coregistration process, and the error analysis of the outputs. The high-resolution DTMs realized can provide a starting point for land degradation process assessment of these agriculture environments and supplies useful information to stakeholders for better management and protection of such important heritage landscapes.

The present thesis comprises two main parts: one theoretical and one experimental. The first part, composed of two chapters, is an in-depth introduction to transcranial magnetic stimulation (TMS) and its simultaneous use with neuroimaging techniques (coregistration). The second part is composed of some of the studies I conducted during my PhD. I chose to include three studies representing the different aspects of my research in the last three years, mainly regarding the study and the application of TMS-EEG coregistration in research (study 1), clinics (study 2) and technical methodology (study 3). The first study (study 1), conducted at the Department of General Psychology of Padova, was aimed to investigate the neuromodulatory effects of an rTMS protocol on healthy volunteers. The second study (study 2) was conducted at the Institute of Neurology of University College London in the context of the international “TrackOnHD” longitudinal project aimed to investigate Huntington disease (HD) in a multimodal approach. The target of this study was to investigate possible TMS-EEG markers of inhibition deficits in Huntington patients. The third study (study 3), conducted in collaboration with the Department of Information Engineering of Padova, was aimed to develop an algorithm of correction to remove an artefact induced by TMS during EEG recordings. CHAPTER I – TRANSCRANIAL MAGNETIC STIMULATION In the last twenty years the development of new techniques able to investigate the brain function in vivo during cognitive and motor tasks lead to impressive advances in understanding the human brain. Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a tool whose popularity has grown progressively thanks to its ability to stimulate the brain in a focal and non-invasive way (Barker et al., 1985), permitting to establish a causal link in the brain-cognition/motor-behaviour relationship (Pascual-Leone et al., 2000). In the first chapter of this thesis the possible applications of TMS in the field of cognition, physiology and rehabilitation are discussed. Specifically, the first part focuses on the operating mechanisms of TMS and on the different stimulation parameters that define the effects of the stimulation. In the second part of the first chapter, the three main TMS protocols are discussed: single-pulse TMS, which is used in the temporal and spatial characterization of cognitive processes, in the study of motor cortex reactivity, and in the investigation of the cortico-spinal tract functioning; paired-pulse TMS, that investigates the connectivity and the interaction of cerebral networks at rest or during a task performance; and repetitive TMS (rTMS), that explores the cerebral plasticity processes both in relation to cognitive processing and for rehabilitation treatments. CHAPTER II – THE SIMULTANEOUS USE OF TRANSCRANIAL MAGNETIC STIMULATION WITH EEG AND OTHER NEUROIMAGING TECHNIQUES Despite the widespread use of TMS in current research, its mechanism of action is still poorly understood (Miniussi et al., 2010). This lack in comprehension results from missing a firsthand “visible” marker of cortical response and a need for secondary measures of primary motor and visual cortex stimulation. In the last twenty years, thanks to the progressive improvements in neuroimaging technology, the first attempts to simultaneously use TMS with other neuroimaging techniques have been made possible (e.g. TMS-EEG, Ilmoniemi et al., 1997; TMS-PET, Paus et al., 1997). On one hand, the possibility to actively stimulate the brain with TMS allows to establish “causal” inferences in neuroimaging studies, in which, traditionally, only “correlational” inferences were possible. On the other hand, neuroimaging techniques potentially provide an important contribution through the spatial and temporal information of the neural activation evoked by TMS. In the second chapter of this thesis, the strong and the weak points of different TMS-neuroimaging coregistration approaches are depicted. Specifically, the middle part of the chapter focuses on the main topic of this thesis, i.e. the TMS-EEG coregistration. TMS-EEG, among the different approaches, is the most successful and widespread, thanks to its promising value in the investigation of brain dynamics. Indeed, EEG is able to record the post-synaptic potentials following the neuronal depolarization evoked by TMS at a high temporal resolution (Ilmoniemi et al., 1997). The analysis of the TMS-evoked EEG activity in terms of time, space, frequency and power, potentially provides important and accurate information in the local activation induced by the stimulation (cerebral reactivity), in the spread of such activation (cerebral connectivity), and in the long-lasting neuromodulatory effects following rTMS protocols (cerebral plasticity). On the other hand, the TMS-EEG coregistration, presents several technical difficulties mainly due to the different artefacts that electromagnetic stimulation induces in the EEG signal. These aspects are discussed thoroughly in the second chapter. Finally, the last part of the second chapter is dedicated to the other TMS coregistration approaches with magnetic resonance imaging (MRI), functional magnetic resonance imaging (fMRI), positron emission tomography (PET), single-photon emission computed tomography (SPECT) and near-infrared spectroscopy (NIRS). CHAPTER III – STUDY 1: NEUROMODULATORY EFFECTS OF LOW-FREQUENCY RTMS: INSIGHTS FROM TMS-EEG The neuromodulatory effects of rTMS have been mostly investigated by means of peripheral motor-evoked potentials (MEPs). However, MEPs are an indirect measure of cortical excitability, also being affected by spinal excitability. The development of new TMS-compatible EEG systems allowed the direct investigation of the stimulation effects through the cortical responses evoked by TMS (TEPs). In this study, we investigated the effects of a repetitive TMS (rTMS) protocol delivered at low frequency (1 Hz), which is known to produce an inhibitory effect on cortical excitability (Chen et al., 1997). The protocol was applied over the primary motor cortex of 15 healthy volunteers and, as a control, over the primary visual cortex of 15 different healthy volunteers to examine the spatial specificity of the stimulation. The effects of the stimulation were analyzed in both groups through the single-pulse stimulation of the primary motor cortex, before and immediately after the rTMS protocol. Different measures were tested: MEPs, TEPs, local mean field power and scalp maps of the activity distribution. Results on MEPs amplitude showed a significant reduction following the rTMS over the primary motor cortex. Results on TEPs, showed a well-known TEPs pattern evoked by single-pulse stimulation of the motor cortex: P30, N45, P60 and N100. Following the motor cortex rTMS, we observed a significant increase of P60 and N100 amplitude, whose origin has been linked to the GABAb-mediated inhibitory post-synaptic potentials (Ferreri et al., 2011; Premoli et al, 2014). Results on LMFP, showed an increase of general activity induced by the single-pulse stimulation of the motor cortex, starting from 90 ms after the TMS pulse. This latency actually corresponds to the peak of GABAb inhibition. No significant effects were detected after rTMS of the primary visual cortex. The results of this study are relevant in three main aspects: (1) we confirmed the inhibitory effect of 1-hz rTMS, also providing a central correlate of such effect (TEPs); (2) we defined the spatial specificity and the origin of the inhibitory effect of 1-Hz rTMS; (3) we confirmed the possible role of the TMS-evoked N100 as a cortical inhibitory marker. The present findings could be of relevance both for therapeutic purposes, especially for pathologies characterized by inhibitory deficits (e.g. Parkinson’s disease; Huntington’s disease); and for basic research, especially in studies aimed to correlate a behavioral performance to the amount of cerebral excitability. CHAPTER IV – STUDY 2: TMS-EEG MARKERS OF INHIBITORY DEFICIT IN HUNTINGTON’S DISEASE Recent studies have shown the potential value of combining TMS and EEG for clinical and diagnostic purposes. Several TMS-EEG measures in terms of evoked potentials (i.e. TEPs), brain sources analysis, oscillatory activity and global power has been used in the assessment of brain dynamics deficits in several pathologies, such as: schizophrenia (Ferrarelli et al., 2008); psychotic disorders (Hoppenbrouwers et al., 2008); depression (Kähkönen et al., 2005); awareness disorders (Massimini et al., 2005); epilepsy (Rotenborg et al., 2008) and autism (Sokhadze et al., 2012). For instance, the potential contribution of TEPs in the investigation of the cerebral facilitatory/inhibitory balance has been demonstrated, given their origin from different GABAergic neuronal populations (Ferreri et al., 2011; Premoli et al., 2014). In particular, the TMS-evoked N100 has been related to the amount of GABAergic inhibition, as shown by pharmacological (e.g. Kähkönen et al., 2003) and behavioral research (e.g. Bender et al., 2005; Bonnard et al., 2009) as well as studies in patients (e.g. Helfrich et al., 2013). As a part of the multi-site international “TrackOnHD” project, we used TMS-EEG to investigate the electrophysiological markers of motor cortex stimulation in Huntington patients. In Huntington’s disease (HD) the progressive degeneration of GABAergic neurons in the striatum lead to a strong reduction of inhibition, resulting in an excessive increase in glutamatergic excitability (i.e. excitoxicity). Our study compared a group of 12 HD patients with a group of 12 healthy volunteers over several different TMS-EEG, EMG, fMRI and clinical measures (in the chapter only the TMS-EEG results are reported). We found a specific and significant decrease of the N100 as assessed by the time point-by-time point permutation analysis of TEPs and from the analysis of the global activity from 90 to 104 ms after the TMS pulse. Scalp maps of the activity distribution showed a bilateral decrease of negativity, such effect was stronger over the site of stimulation. Event-related spectral perturbation and inter-trial coherence analysis showed a significant difference in the oscillatory activity of the two groups within the GABAb-ergic time window (i.e. 60-110 ms after the TMS pulse). We speculated that the observed results might be produced by the deficit in GABAergic inhibition as a consequence of the striatum neuronal degeneration in HD patients. Although preliminary, these results provided potentially useful TMS-EEG markers for inhibitory deficits in HD patients. Further analyses are needed to correlate the present findings with the other measures collected. CHAPTER V – STUDY 3: TMS-EEG ARTIFACTS: A NEW ADAPTIVE ALGORITHM FOR SIGNAL DETRENDING During EEG recording the discharge of the TMS coil may generate an artefact that can last for tens of milliseconds, known as “decay artefact” (Rogasch et al., 2014). This can represent a problem for the analysis of the TMS-evoked potentials (TEPs). So far, two main strategies of correction have been proposed involving the use of a linear detrend or independent component analysis (ICA). However, none of these solutions may be considered optimal: firstly, because in most of the cases the decay artefact shows a non-linear trend; secondly, because the ICA correction (1) might be influenced by individual researcher’s choices and (2) might cause the removal of physiological responses. Our aim is to verify the feasibility of a new adaptive detrend able to discriminate the different trends of the decay (linear or non-linear). Forty healthy volunteers were stimulated with 55 TMS pulses over the left M1. The TMS-EEG responses were compared among five conditions: RAW (no correction of the decay artefact was applied); INFOMAX29 (the decay components were extracted and removed by the INFOMAX ICA algorithm, using 31 electrodes); FASTICA (the decay components were extracted and removed by the fastICA ICA algorithm, using 31 electrodes); INFOMAX15 (the decay components were extracted and removed by the INFOMAX ICA algorithm, using 15 electrodes) and ALG (the decay artefact was corrected through the use of an adaptive algorithm). To assess whether the artefact correction significantly affected the physiological responses to TMS as well, we examined the differences in the -100 + 400 ms time window around the TMS pulse by means of a non-parametric, cluster-based, permutation statistical test. Then we compared the peak-to-peak TEPs amplitude within the detected time windows. The grand-averaged EEG response revealed five main peaks: P30, N45, P60, N100 and P180. Significant differences (i.e. Monte Carlo p-values < 0.05) were detected in a cluster nearby the TMS coil, and specifically over FC1, CP1, C3 and FC2. Repeated-measures ANOVA revealed a significant corruption of the peak-to-peak amplitude after INFOMAX29 (3 TEPs out of 8), FASTICA (4 TEPs out of 12), INFOMAX15 (5 TEPs out of 15) and ALG correction (2 TEPs out of 15), compared to the original signal. Furthermore, abnormal LMFP and TEPs scalp distribution were detected following the INFOMAX29 and FASTICA correction. When our algorithm was used, however, the TEPs amplitude, morphology and distribution was in line with the literature and not significantly different from the original signal. Also the decay artefact was correctly removed. The main contribution of this study is the proposal of a new adaptive algorithm to correct the decay artefact induced by TMS in the EEG signal. Our results demonstrated that the proposed adaptive detrend is a reliable solution for the correction of this artefact, especially considering that, contrary to ICA, (1) it is not dependent from the number of recording channels; (2) it does not affect the physiological responses and (3) it is completely independent from the experimenter’s choices.
La presente tesi si compone di due parti principali: una teorica e una sperimentale. La prima parte, suddivisa in due capitoli, è un approfondimento teorico sullo strumento stimolazione magnetica transcranica (TMS) e sul suo utilizzo simultaneo (ossia, in coregistrazione) con le tecniche di neuroimaging. La seconda parte comprende alcuni degli studi condotti durante il mio dottorato. Nello specifico, si tratta di tre studi che coprono i diversi aspetti applicativi delle ricerche che ho condotto in questi tre anni, ossia lo studio e l’utilizzo della coregistrazione TMS-EEG in ricerca (studio 1), in ambito clinico (studio 2) e per aspetti tecnico-metodologici (studio 3). Il primo studio (studio 1), condotto nel Dipartimento di Psicologia Generale di Padova, era volto all’analisi degli effetti neuromodulatori di un protocollo rTMS su volontari sani. Il secondo studio (study 2) è stato condotto all’Istituto di Neurologia dello University College London (Londra, Regno Unito) all’interno del progetto internazionale “TrackOnHD”, uno studio longitudinale avente come obiettivo l'indagine approfondita della Malattia di Huntington (HD) attraverso un approccio multimodale. L’obiettivo di questo studio era la ricerca di potenziali marker TMS-EEG che riflettessero il deficit di inibizione cerebrale che caratterizza questa patologia. Il terzo studio (study 3), svolto in collaborazione col Dipartimento di Ingegneria dell’Informazione di Padova, aveva l’obiettivo di sviluppare un algoritmo di correzione in grado di rimuovere un artefatto indotto dalla TMS durante la registrazione EEG. CAPITOLO I - LA STIMOLAZIONE MAGNETICA TRANSCRANICA (TMS) Negli ultimi anni lo sviluppo di nuove tecniche in grado di analizzare l’attivazione cerebrale durante processi cognitivi e motori, ha portato ad un avanzamento progressivo delle conoscenze sul cervello umano. La stimolazione magnetica transcranica (TMS) è stata uno degli strumenti la cui popolarità è cresciuta in questi ultimi anni, grazie alla possibilità di stimolare, in modo focale e non invasivo, il cervello in vivo (Barker et al., 1985). Tale capacità ha consentito, per la prima volta, la straordinaria possibilità di inferire delle relazioni causali tra cervello, processi cognitivi e motori, e comportamento (Pascual-Leone et al., 2000). Nel primo capitolo della presente tesi vengono passate in rassegna tutte le possibili applicazioni della TMS in campo cognitivo, fisiologico e riabilitativo. Nello specifico, la prima parte è dedicata ai meccanismi di funzionamento della TMS e ai parametri di stimolazione che ne definiscono i diversi effetti sul cervello. Nella seconda parte vengono invece passati in rassegna i tre principali protocolli di stimolazione: la TMS a singolo impulso, utilizzata per la caratterizzazione spaziale e temporale dei processi cognitivi, per analizzare la reattività della corteccia motoria primaria, e per verificare l’integrità del tratto cortico-spinale; la TMS a doppio impulso, per studiare la connettività e l’interazione di network cerebrali a riposo e durante lo svolgimento di un task; e la TMS ripetitiva (rTMS), utilizzata per analizzare i fenomeni di plasticità cerebrale sia durante processi cognitivi, sia in relazione a trattamenti riabilitativi. CAPITOLO II - L’UTILIZZO SIMULTANEO DELLA TMS CON L’EEG ED ALTRE TECNICHE DI NEUROIMAGING Nonostante la grande popolarità che la TMS ha conosciuto negli ultimi anni, molti aspetti del suo meccanismo d’azione sono ancora poco chiari (Miniussi et al., 2010). Tale ambiguità è dovuta al fatto che, fatta eccezione per la corteccia motoria e visiva primaria, la stimolazione TMS non fornisce dei marker “visibili” di eccitabilità corticale. Negli ultimi anni, grazie al miglioramento tecnologico degli strumenti di indagine neuroscientifica, si è iniziato a utilizzare simultaneamente (in coregistrazione) la TMS con diverse tecniche di neuroimaging. Ciò ha consentito di trarre delle inferenze di tipo “causale” e non più solo “correlazionale” (come nei tradizionali studi di neuroimaging) grazie alle informazioni spaziali e temporali sull’effetto della TMS che le tecniche di neuroimaging offrono. Nel secondo capitolo della presente tesi, vengono trattati dettagliatamente le potenzialità e i limiti delle diverse coregistrazioni TMS-neuroimaging. In particolare, nella parte centrale del capitolo è dato ampio spazio all’argomento centrale di questa tesi, ossia la coregistrazione TMS-EEG. L’approccio TMS-EEG, tra i vari metodi di coregistrazione, è stato quelli che negli ultimi anni ha riscontrato maggiore successo e diffusione, dovuto all’enorme potenzialità che questo metodo garantisce nello studio delle dinamiche cerebrali. L’EEG, infatti, è in grado di registrare, ad altissima risoluzione temporale, i potenziali post-sinaptici indotti dalla depolarizzazione neuronale evocata dalla TMS (Ilmoniemi et al., 1997). L’analisi dell’attività EEG indotta dalla TMS - in termini di tempo, spazio, frequenza e potenza - è in grado di fornire delle preziose informazioni sia sull’attivazione locale indotta dalla stimolazione (reattività cerebrale), sia su quella distale (connettività cerebrale), sia sulle modificazioni a seguito di protocolli di stimolazione ripetitiva (plasticità cerebrale). D’altra parte, la coregistrazione TMS-EEG presenta numerose difficoltà di tipo tecnico, dovuto ai numerosi artefatti che la stimolazione elettromagnetica induce sul segnale EEG (così come sui segnali delle altre tecniche di neuroimaging), questi aspetti sono trattati in maniera dettagliata all’interno del capitolo. Infine, l’ultima parte del capitolo è dedicata agli altri metodi di coregistrazione TMS con risonanza magnetica (MRI), risonanza magnetica funzionale (fMRI), tomografia a emissione di positroni (PET), tomografia a emissione di fotone singolo (SPECT) e spettroscopia del vicino infrarosso (NIRS). CAPITOLO III – STUDIO 1: EFFETTI NEUROMODULATORI DELLA RTMS A BASSA FREQUENZA: EVIDENZE DALL’APPROCCIO TMS-EEG Tradizionalmente gli effetti neuromodulatori della rTMS sono stati studiati attraverso l’analisi dei potenziali motori evocati (MEP). Tuttavia, come noto, i MEP sono una misura indiretta dell’eccitabilità corticale avendo una forte componente anche spinale. Con lo sviluppo di nuovi sistemi EEG compatibili con la TMS, è stato possibile analizzare gli effetti della stimolazione in modo più diretto, tramite l’analisi dei potenziali corticali evocati dalla TMS (TEPs). In questo studio abbiamo analizzato l’effetto di un protocollo di TMS ripetitiva (rTMS) a bassa frequenza (1 Hz) molto noto, soprattutto in ambito riabilitativo, per sortire un effetto di inibizione dell’eccitabilità corticale. Il protocollo è stato applicato sulla corteccia motoria primaria di quindici volontari sani e sulla corteccia visiva primaria di altri quindici volontari sani, assunti come gruppo di controllo per analizzare la specificità spaziale della stimolazione. Gli effetti della stimolazione ripetitiva sono stati testati su diverse misure elettrofisiologiche evocate da una stimolazione a singolo impulso della corteccia motoria, prima e subito dopo il protocollo rTMS, ossia: MEP, TEPs, local mean field power (LMFP) e distribuzione dell’attività sullo scalpo. I risultati sui MEP hanno mostrato una diminuzione significativa dell’ampiezza a seguito del protocollo rTMS sulla corteccia motoria. I risultati sui TEP hanno mostrato un pattern noto composto di quattro principali picchi: P30, N45, P60 e N100. A seguito del protocollo rTMS sulla corteccia motoria si è osservato un incremento significato dell’ampiezza dei TEP P60 e N100, la cui origine è legata all’attività dei potenziali post-sinaptici inibitori GABAb (Ferreri et al., 2011; Premoli et al., 2014). I risultati sul LMFP hanno mostrato un incremento di attività generale indotta dalla TMS sulla corteccia motoria a partire da circa 90 ms dalla stimolazione, ossia la latenza del picco massimo di inibizione GABAb. A seguito del protocollo di stimolazione di controllo, applicato sulla corteccia visiva, non si è riscontrato nessun cambiamento significativo. I risultati di questo studio hanno una rilevanza su tre aspetti: (1) si è confermato l’effetto inibitorio del protocollo rTMS a 1-Hz, offrendo anche un correlato centrale di inibizione (TEPs) oltre che periferico (MEPs); (2) sono state definite la spazialità e l’origine dell’inibizione indotta dalla rTMS a bassa frequenza; (3) la N100 evocata dalla TMS si conferma essere un marker affidabile del grado di inibizione corticale. I risultati di questo studio potrebbero avere una rilevanza sia in campo terapeutico e riabilitativo, specie per i disturbi alla cui base si suppone vi sia un deficit di inibizione corticale (ad es. malattia di Parkinson, malattia di Huntington); sia in campo di ricerca, specie in studi in cui si vogliano correlare performance a task cognitivi o motori con il grado di eccitazione/inibizione corticale. CAPITOLO IV – STUDIO 2: DEFICIT DI INIBIZIONE NELLA MALATTIA DI HUNTIGTON: EVIDENZE DALLA COREGISTRAZIONE TMS-EEG Evidenze recenti hanno mostrato le potenzialità dell’utilizzo della coregistrazione TMS-EEG in ambito clinico e diagnostico. Diverse misure TMS-EEG in termini di potenziali evocati (TEPs), analisi di sorgenti, attività oscillatoria e potenza dell’attività globale, sono state utilizzate per lo studio di dinamiche cerebrali deficitarie in diverse patologie, come: schizofrenia (Ferrarelli et al., 2008); disordini psicotici (Hoppenbrouwers et al., 2008); depressione (Kähkönen et al., 2005); disturbi di coscienza (Massimini et al., 2005); epilessia (Rotenborg et al., 2008) e autismo (Sokhadze et al., 2012). Ad esempio, diverse evidenze hanno mostrato il potenziale contributo dei TEPs nello studio degli equilibri eccitatori/inibitori corticali, data la loro origine GABAergica (Ferreri et al., 2011; Premoli et al., 2014). In particolare, la N100 TMS-evocata sembra essere strettamente correlata al grado di inibizione GABAergica, come mostrato da evidenze a carattere farmacologico (ad es. Kähkönen et al., 2003; Premoli et al., 2014); studi comportamentali (ad es. Bender et al., 2005; Bonnard et al., 2009) e studi in pazienti (ad es. Helfrich et al., 2013). Nel presente studio, facente parte di un ampio progetto internazionale multicentrico (“TrackOnHD”), abbiamo utilizzato la coregistrazione TMS-EEG per analizzare dei possibili marker elettrofisiologici della malattia di Huntington, tramite stimolazione della corteccia motoria primaria. La malattia di Huntington (HD) è caratterizzata da una progressiva degenerazione dei neuroni striatali di natura GABAergica. Tale degenerazione porta a un eccessivo incremento del tono eccitatorio mediato dal glutammato, un fenomeno noto come eccitossicità. Nel presente studio sono stati analizzati dodici pazienti HD e dodici volontari sani su varie misure TMS-EEG, EMG, fMRI e cliniche (nel capitolo sono riportati solo i risultati relativi alle misure TMS-EEG). I risultati hanno mostrato una riduzione significativa e specifica della N100, come rilevato dall’analisi dei TEP per permutazioni punto-per-punto e dall’analisi dell’attività media globale da 94 a 104 ms dopo l’impulso TMS. Le mappe dello scalpo della distribuzione dell’attività hanno mostrato una riduzione della negatività su entrambi gli emisferi, con un effetto maggiore sul sito di stimolazione. Le analisi di perturbazione dello spettro evento-relata e della coerenza inter-trial hanno mostrato una differenza significativa nell’attività oscillatoria dei due gruppi all’interno della finestra di interesse GABAb-ergico (60-110 ms dopo l’impulso TMS). I risultati osservati potrebbero essere prodotti dal deficit di inibizione GABAergica nei pazienti HD conseguente alla degenerazione neuronale nello striato. Anche se preliminari, i risultati dello studio hanno rilevato dei marker TMS-EEG potenzialmente d’interesse per la valutazione dei deficit inibitori in pazienti HD. Ulteriori analisi sono necessarie per correlare i risultati ottenuti con le altre misure raccolte all’interno del progetto. CAPITOLO V – STUDIO 3: ARTEFATTI TMS-EEG: UN NUOVO ALGORITMO ADATTATIVO PER IL DETREND DEL SEGNALE Durante un EEG, la stimolazione TMS può generare un artefatto a lunga latenza, noto come artefatto “decay”. Tale artefatto rappresenta un problema per l’analisi dei potenziali evocati dalla TMS (TEP). In letteratura, per risolvere il problema, sono comunemente utilizzate due principali strategie: l’utilizzo di un detrend lineare e l’utilizzo dell’independent component analysis (ICA). Tuttavia, nessuna di queste soluzioni può essere considerata ottimale. Per quanto riguarda l’utilizzo di un detrend lineare, dal momento che nella maggior parte dei casi l’artefatto decay non segue un andamento lineare, questo tipo di correzione risulta inefficiente. Per quanto invece riguarda l’ICA, anche questa procedura presenta dei limiti intrinseci: (1) può essere eccessivamente influenzato dalle scelte dello sperimentatore e (2) può causare la rimozione di componenti fisiologiche, oltre che artefattuali. Il nostro obiettivo è di verificare l’efficienza di un nuovo detrend adattivo, sviluppato su MATLAB, in collaborazione col dipartimento di Ingegneria Informatica di Padova, capace di discriminare i diversi trend dell’artefatto decay (ossia lineare e non-lineare). Quaranta volontari sani sono stati stimolati con 55 impulsi TMS singoli sulla corteccia motoria primaria di sinistra. Le risposte EEG indotte dalla TMS sono state analizzate in cinque condizioni: RAW (in cui non veniva applicata nessuna correzione dell’artefatto decay); INFOMAX29 (in cui l’artefatto decay veniva corretto con un algoritmo ICA-INFOMAX, considerando tutti i 29 canali); FASTICA (in cui l’artefatto decay veniva corretto con un algoritmo fastICA, considerando tutti i 29 canali); INFOMAX15 (in cui l’artefatto decay veniva corretto con un algoritmo ICA-INFOMAX, considerando solo 15 canali) e ALG (in cui l’artefatto decay veniva corretto tramite il nostro algoritmo adattivo). Per verificare se la correzione dell’artefatto avesse influenzato anche i TEP, sono state analizzare le differenze in una finestra temporale da -100 a +400 ms dall’impulso TMS attraverso l’utilizzo di un test per permutazioni, non-parametrico e corretto per cluster. Successivamente, sono state comparate le ampiezze e le latenze picco-picco dei TEP all’interno delle finestre temporali negli elettrodi risultati significativi. La risposta grand-average ha rilevato cinque picchi principali: P30, N45, P60, N100 e P180. Sono state rilevate delle differenze significative (i.e. Monte Carlo p < 0.05) in un cluster di elettrodi vicino alla stimolazione, comprendente i canali FC1, CP1, C3 e FC2. Le analisi sull’ampiezza picco-picco hanno rilevato una significativa modulazione dell’ampiezza dopo la correzione INFOMAX29 (in 3 TEP su 8), FASTICA (in 4 TEP su 12), INFOMAX15 (in 5 TEP su 15) e ALG (in 2 TEP su 15), rispetto al segnale RAW originale. I risultati LMFP e delle mappe di distribuzione sullo scalpo hanno rilevato diverse anomalie a seguito della correzione INFOMAX29 e FASTICA. I risultati hanno mostrato che la correzione ICA modifica in modo significativo l’ampiezza, la morfologia e la distribuzione di una parte dei TEP analizzati e nello stesso tempo non garantisce una completa rimozione dell’artefatto decay. Al contrario, a seguito della correzione col nostro algoritmo (condizione ALG), l’ampiezza, la morfologia e la distribuzione dei TEP rimanevano fedeli a quella originale, con una rimozione pressoché completa dell’artefatto decay. Il principale contributo di questo studio è stato la proposta di un nuovo algoritmo di correzione per un artefatto a lunga latenza che la TMS induce sul segnale EEG (artefatto decay) rendendo difficoltosa l’analisi. I risultati hanno dimostrato che questo metodo è più efficiente delle strategie attualmente in utilizzo in letteratura, non avendo i limiti intrinseci presentati dall’algoritmo ICA.

Questa tesi di dottorato si focalizza sullo studio sperimentale dei correlati neurali relativi alla percezione visiva e spaziale nell’uomo. Nello specifico, l’obiettivo di questo progetto è quello di identificare i marker elettrofisiologici della consapevolezza, sia in condizioni normali, sia quando la consapevolezza viene persa a causa di una lesione cerebrale reale o “virtuale”. In entrambi gli studi condotti è stato adottato un approccio causale multimodale, ovvero la coregistrazione dell’elettroencefalogramma durante la Stimolazione Magnetica Transcranica (EEG-TMS), che è in grado di fornire importanti informazioni rispetto ai correlati neurali della consapevolezza visiva e spaziale. Il primo studio condotto è centrato sula consapevolezza spaziale, e in particolare si focalizza sullo studio dei meccanismi alla base della sindrome del neglect. Il neglect viene definito come un deficit di consapevolezza in cui il paziente ignora gli stimoli che vengono presentati nel lato opposto rispetto a quello della lesione cerebrale. Uno dei modelli più influenti di spiegazione della disfunzione alla base di questa sindrome prende in considerazione il concetto di rivalità interemisferica, secondo cui l’emisfero intatto risulterebbe patologicamente iperattivato a causa della riduzione di inibizione precedentemente esercitata da parte dell’emisfero leso. L’obiettivo del presente studio è quello di testare questi modelli di rivalità interemisferica, investigando l’effetto che l’applicazione della TMS ripetitiva (rTMS) a bassa frequenza esercita sull’emisfero stimolato e su quello controlaterale nel processamento di stimoli visivi. In particolare, questo studio si pone l’obiettivo di indagare il contributo della corteccia parietale destra e sinistra in un funzionamento deficitario tipo neglect indotto attraverso l’applicazione della rTMS a bassa frequenza in un campione di soggetti sani. A quattordici volontari sani è stato richiesto di eseguire un test di bisezione di linee e un compito di detezione di stimoli visivi lateralizzati. Entrambi i compiti sono stati somministrati sia prima che dopo 30 minuti di rTMS a bassa frequenza (1 Hz) applicata sulla corteccia parietale posteriore destra. Il segnale EEG è stato registrato continuativamente per tutta la durata dell’esperimento. L’efficacia della rTMS nell’indurre sintomi tipo neglect è stata confermata dai risultati del compito di bisezione di linee, in cui i partecipanti hanno mostrato una performance simile a quella dei pazienti con neglect in questo test, ovvero con una deviazione verso destra del punto di bisezione dopo la rTMS. Considerando il compito di detezione, i risultati hanno mostrato come l’effetto della rTMS sia un rallentamento dei tempi di reazione sia per gli stimoli presentati a sinistra che per quelli presentati a destra e una riduzione dell’ampiezza della componente P200 registrata sui siti parietali sia sinistri che destri. I potenziali evocati dalla TMS (TEPs) registrati durante i 30 minuti di stimolazione hanno mostrato come la rTMS a bassa frequenza abbia indotto una riduzione dell’eccitabilità corticale sia della corteccia parietale destra (quella direttamente stimolata), sia delle aree omologhe controlaterali. Di conseguenza, i nostri risultati non hanno evidenziato una iperattivazione dell’emisfero sinistro conseguente all’inibizione dell’emisfero destro (come postulato dai modelli di rivalità interemisferica). Al contrario, l’inibizione della corteccia parietale destra ha indotto una propagazione dell’inibizione alle aree omologhe dell’emisfero sinistro. Il secondo studio condotto è focalizzato sulla consapevolezza visiva e, in particolare, si pone l’obiettivo di indagare i correlati neurali della percezione di fosfeni. La TMS a singolo impulso applicata sulla corteccia visiva primaria è in grado di indurre delle sensazioni visive, chiamate appunto fosfeni, che appaiono come brevi lampi di luce senza che effettivamente l’occhio venga stimolato da una luce. Recenti studi hanno dimostrato come la TMS possa produrre delle sensazioni visive non soltanto quando applicata sulle aree visive primarie, ma anche quando viene stimolata la corteccia parietale. Poiché le basi neurali coinvolte nella percezione dei fosfeni parietali sono tuttora sconosciute, rimane da capire se i fosfeni parietali siano generati direttamente da meccanismi locali o se invece la loro generazione dipenda dall’attivazione indiretta di altre aree visive. Al fine di caratterizzare i correlati elettrofisiologici della percezione dei fosfeni occipitali e parietali, abbiamo analizzato i TEPs in un campione di soggetti sani, confrontando i trials in cui i partecipanti riportavano di percepire un fosfene, con i trials in cui all’impulso della TMS non seguiva alcuna sensazione visiva. Quando viene stimolata la corteccia occipitale sinistra, la percezione dei fosfeni inizia a modulare i TEPs ad una latenza tardiva, mentre i fosfeni indotti dalla stimolazione della corteccia parietale sinistra iniziano a modulare i TEPs a delle latenze più precoci. Questa differenza tra fosfeni occipitali e parietali nell’andamento temporale dell’attivazione corticale potrebbe identificare un diverso meccanismo implicato nella loro generazione. L’effetto di latenza precoce osservato quando la TMS viene applicata sulla corteccia parietale potrebbe suggerire che i fosfeni parietali siano il risultato diretto dell’attivazione dell’area stimolata, e non la conseguenza di un’attivazione di tipo feedback della corteccia visiva primaria. Inoltre, abbiamo indagato i correlati elettrofisiologici della percezione di fosfeni parietali in una paziente emianopsica (SL) con una distruzione completa della corteccia visiva primaria sinistra. La percezione di fosfeni indotti dalla stimolazione della corteccia parietale ipsilaterale alla lesione ha mostrato lo stesso pattern di risultati rispetto alla stimolazione parietale del campione di soggetti sani, con una modulazione dei TEPs che emerge ad uno stadio di latenza precoce. Questi risultati supportano quindi la visione della corteccia parietale come un generatore indipendente di esperienze visive consce indotte dalla stimolazione magnetica.
This PhD thesis focuses on attempting to experimentally investigate the neural correlates of awareness related to visual and spatial perception in humans. Specifically, this project aimed at looking into the electrophysiological markers of awareness in normal conditions and when awareness is lost due to a real or a “virtual” lesion. In both the studies conducted we adopted a causal multimodal approach, namely Transcranial Magnetic Stimulation and EEG (TMS-EEG) co-registration, which can provide insights into the neural correlates of visual and spatial awareness. The first study focuses on spatial awareness and specifically on the investigation of the mechanisms underlying neglect syndrome. Neglect is defined as a disorder of consciousness in which patients fail to report, respond to, or orient to stimuli presented on the opposite side of the brain lesion. One of the most influential models to explain the dysfunction underlying this syndrome takes into account the concept of inter-hemispheric rivalry, which postulates a pathological hyperactivation of the unaffected hemisphere due to the reduced inhibitory influences from the lesioned hemisphere. The aim of the present study is to test these models analyzing the effect that low frequency repetitive TMS (rTMS) exerts on the stimulated and contralateral hemispheres in the processing of visual stimuli. Specifically we aim at assessing the contribution of left and right parietal cortices in an impaired neglect-like functioning induced by means of low frequency rTMS in healthy participants. Fourteen healthy volunteers performed a Line Bisection task and a simple detection task of unilateral checkerboards stimuli. Both tasks were performed either before and after 30 minutes of low frequency rTMS (1 Hz) over the right posterior parietal cortex. The EEG signal was continuously recorded throughout the experiment. The efficacy of rTMS in inducing neglect-like phenomena was confirmed by the results of the Line Bisection task where participants showed a rightward deviation after rTMS, a performance comparable to that of neglect patients. Detection task results showed that the effect of rTMS was a lengthening of reaction times for both left and right visual stimuli and a reduction of the amplitude of P200 component registered both on left and right parietal sites. TMS-evoked potentials recorded during 30 minutes of stimulation, showed that low frequency rTMS induced a reduction of cortical excitability both of the stimulated right parietal cortex and of the left contralateral homologous area. Therefore, our results did not show a hyperactivation of the left hemisphere due to the inhibition of the right hemisphere (as theorized by “rivalry models”). Conversely, the inhibition of the right parietal cortex induced a spreading of the inhibition to the homologous area of the left hemisphere. The second study focuses on visual awareness and specifically aimed at investigating the neural correlates of phosphene perception. Single-pulse TMS of the visual cortex is known to induce visual sensations, i.e. phosphenes, which appear as brief flashes of light without light actually entering the eyes. Recent studies have shown that TMS can produce visual sensations not only when it is applied over early visual areas but also when parietal cortex is stimulated. As the pivotal neural basis involved in the perception of parietal phosphenes still remain unknown, the main question is whether parietal phosphenes are generated directly by local mechanisms or emerge through indirect activation of other visual areas. To characterize the electrophysiological correlates of occipital and parietal phosphene perception we investigated TMS-evoked potentials in a sample of healthy participants by comparing trials in which a phosphene was perceived with trials in which no visual percept was reported. When the left occipital cortex was stimulated, phosphene perception started to affect TMS-evoked potentials at a late latency, whereas phosphenes elicited by left parietal cortex stimulation modulated TMS-evoked potentials at an earlier latency. This difference in the time-course of cortical activation between occipital and parietal phosphenes could underlie a different mechanism in their generation. The early latency of the phosphene effect observed when TMS was applied over the parietal cortex might suggest that parietal phosphenes should be considered as the direct result of the activation of the stimulated area, rather than the consequence of a feedback activation of the early visual cortex. Furthermore, we investigated electrophysiological correlates of parietal phosphene perception in a hemianopic patient (SL) who suffered from a complete destruction of the left primary visual cortex. Ipsilesional parietal phosphene perception in patient SL showed a similar pattern of results to that of parietal phosphene perception in healthy participants, starting to affect TMS-evoked potentials at an early stage of latency. This evidence might thus support the idea of parietal cortex as an independent generator of magnetically induced conscious visual experiences.