Дисертації з теми "Tissu adipeux – Régénération (biologie)"

La première partie de ce travail introduit un nouveau concept d'analyse des enregistrements des essais cliniques et de la dynamique de leur évolution, aussi bien thématique que temporelle. Ce concept a été appliqué à la médecine régénérative, démontrant l'absence de corrélation entre la source de cellules souches et le champ d'application. Les pathologies odonto-stomatologiques sont très peu concernées par les essais cliniques en thérapie cellulaire par cellules souches. Pourtant les parodontites, pathologies immuno-infectieuses responsables de la destruction du tissu de soutien des dents, constituent un enjeu majeur de santé publique. Bien que les auteurs s'accordent sur la responsabilité de l'écologie immunitaire et microbienne dans la physiopathologie de la maladie, les raisons de la dysbiose, de la susceptibilité individuelle sont encore mal connues. La greffe de cellules stromales mésenchymateuses (CSM) permettrait le retour à l'homéostasie en favorisant l'activation des CSM endogènes. La deuxième partie de ce travail démontre que les parodontites ont été potentiellement associées avec 57 pathologies systémiques ; le registre des essais cliniques de l'Organisation Mondiale de la Santé ayant été analysé. L'efficacité et la sureté de l'utilisation des CSM pour la régénération parodontale dans des modèles animaux ont été également démontrées. Pourtant, les modèles utilisés souffraient de problèmes méthodologiques dont la faible représentativité physiopathologique des lésions parodontales générées. Cette deuxième partie apporte donc des données quant à l'efficacité des ASC (CSM du tissu adipeux) pour améliorer de manière quantitative et qualitative la régénération des tissus de soutien parodontaux dans un modèle murin où les lésions parodontales ont été générées par l'administration répétée de bactéries parodonto-pathogènes. Il s'agit donc d'un modèle dont la physiopathologie est plus proche de celle retrouvée chez l'Homme. Enfin, la deuxième partie démontre un effet antibactérien à large spectre des ASC dont l'effet est à la fois direct (effet macrophage-like) et indirect (via la sécrétion de facteurs antibactériens)
The first part of this work introduces a new concept of analysis of clinical trial records and the dynamics of their evolution, both thematic and temporal. This concept has been applied to regenerative medicine, showing the lack of correlation between the source of stem cells and the fields of application. The stomatognathic diseases are few involved in clinical trials for stem cells therapy. Yet periodontitis, immuno-infectious diseases responsible for the destruction of the tooth supporting tissues, are a major public health issue. While the authors agree on the responsibility of the immune and microbial ecology in the pathophysiology of the disease, the reasons for dysbiosis, individual susceptibilities, are still unclear. Graft of mesenchymal stromal cells (MSCs) would return to homeostasis by promoting the activation of endogenous MSCs. The second part of this work shows that periodontitis were potentially associated with 57 systemic diseases; the clinical trials registry of the World Health Organization have been analyzed. The efficacy and safety of the use of MSCs for periodontal regeneration in animal models have also been demonstrated. Yet the models suffered from methodological problems, periodontal lesions are few representative of the pathophysiology. This second part thus provides data on the effectiveness of ASC (CSM from adipose tissue) to improve quantitative and qualitative regeneration of periodontal supporting tissues in a mouse model where periodontal lesions were generated by repeated administration of parodonto-pathogenic bacteria. It is therefore a model whose pathophysiology is closer to that found in humans. Finally, the second part demonstrates broad antibacterial spectrum of ASC whose effect is both direct (macrophage-like effect) and indirect (via the secretion of antibacterial factors)

Le muscle squelettique fait partie des rares organes doués de régénération chez le mammifère. Dans le cadre d'une lésion musculaire, les processus de régénération mis en place par le muscle impliquent des interactions finement régulées entre les cellules immunitaires, les cellules satellites et les progéniteurs fibro-adipeux (FAPs) qui communiquent entre elles via des sécrétions paracrines de cytokines et de facteurs solubles afin de réaliser de façon optimale le programme de régénération. Au cours des premiers jours suivant la lésion du muscle, le nombre de FAPs augmente rapidement. Pourtant cette augmentation n'est pas le résultat d'une prolifération des FAPs résidentes. Se pose ainsi la question de l'origine de cette augmentation de FAPs. Les travaux précédents du laboratoire montrent que les cellules stromales adipeuses (ou ASCs) quittent le tissu adipeux en réponse à une inflammation (lors d'une vaccination de la patte chez la souris). Or, les ASCs présentent un immunophénotype et des fonctions biologiques semblables aux FAPs. Ainsi, nous avons cherché à déterminer si l'augmentation des FAPs en réponse à la lésion musculaire n'était pas la conséquence d'une libération d'ASCs par le tissu adipeux suivie de leur infiltration dans le muscle lésé. Nos résultats montrent que dès les premières 24H suivant la lésion musculaire, le nombre de FAPs augmente sans que leur prolifération ne soit activée. En accord avec notre hypothèse, le nombre d'ASCs dans le tissu adipeux sous cutané (ScAT) diminue alors que leur apoptose/nécrose n'est pas activée, ce qui suggère une mobilisation des ASCs en réponse à la lésion musculaire. Pour réellement démontrer cette mobilisation, un modèle de greffe de tissu adipeux provenant d'une souris CD34-GFP (marqueur des ASCs) a été mis au point. Dans ce modèle, nos résultats montrent que la lésion musculaire déclenche la mobilisation et l'infiltration des ASCs dans le muscle lésé. Les mécanismes responsables de cette mobilisation impliquent par ailleurs les plaquettes. Ainsi, nous montrons pour la première fois que le tissu adipeux agit comme un réservoir de cellules progénitrices capables de migrer de façon endogène pour rejoindre le site de la lésion musculaire et jouer un rôle majeur dans les processus de régénération mis en place par l'organisme
Skeletal muscle is one of the few organs able to regenerate in mammals. After muscle injury, close interactions between muscle stem cells (the so-called satellites cells), immune cells and fibro-adipogenic progenitors (FAPs) via secreted chemokines and soluble factors are needed for optimal muscle regeneration. In the first days after muscle injury, the number of FAPs dramatically increases in the injured muscle. However, the biological origin of such early FAPs increase is unknown. We previously demonstrated that adipose stromal cells (ASCs) egress adipose tissue under inflammatory conditions (such as hind limb vaccination in mice). Interestingly, ASCs exhibit similar characteristics and biological properties with FAPs. Thus, we hypothesized that the early FAP increase observed after muscle injury was the result of ASCs mobilization from adipose tissue followed by their infiltration into the injured muscle. Our results show that 24 hours after muscle injury, FAP number increases in the injured muscle while no proliferation is observed. According to our hypothesis, the content of ASCs in the sub-cutaneous adipose tissue (ScAT) decreases though neither their apoptosis nor their necrosis was observed, suggesting that ASCs are mobilized from ScAT in response to muscle injury. To indeed demonstrate that ASCs exit ScAT and infiltrate the injured muscle we set up a murine model of adipose tissue grafting from CD34-GFP mouse (an ASCs marker) into wild type C57BL/6J mouse. Our results show that muscle injury triggers ASCs mobilization from ScAT and infiltrate the injured muscle. Furthermore, we described that blood platelets are involved in the mechanisms controlling ASCs trafficking. Altogether, our results show for the first time that adipose tissue is a reservoir of progenitor cells able to migrate endogenously to reach the injured muscle and to play a crucial role in its regeneration

Le tissu osseux est caractérisé par sa matrice minéralisée qui est soumise à des activités de formation et de résorption assurant son renouvellement et son remaniement tout au long de la vie. En cas de lésions, l’os est capable de se réparer naturellement de façon à rétablir son intégrité et ses propriétés physiques. Cependant, certaines pathologies ou interventions chirurgicales peuvent aboutir à des pertes massives de substance osseuse et le processus naturel d’autoréparation est alors insuffisant. En première intention, la greffe osseuse est envisagée (autogreffe et allogreffe), néanmoins, du fait d’une disponibilité réduite et des risques de rejet et de transmission d’agents infectieux, cette technique n’est pas réalisable dans toutes les situations cliniques. Le chirurgien peut alors avoir recours à des biomatériaux ostéoconducteurs mais ceux-ci ne sont utilisables que dans le cas de comblement de défauts de petite taille car ils sont simplement un support passif à la néoformation osseuse. Ces limites pourraient être dépassées grâce au concept d’ingénierie tissulaire, en concevant des biomatériaux innovants ayant un fort pouvoir ostéogène conféré notamment par des facteurs de croissance ou des cellules ostéoprogénitrices. Dans notre travail, nous avons cherché à mettre au point un nouveau produit d’ingénierie tissulaire permettant la réparation de défauts osseux. La stratégie envisagée repose sur l’association d’un support tridimensionnel et de cellules souches adultes dérivées du tissu adipeux humain (ASC). L’originalité du système provient de la matrice tridimensionnelle, qui est un hydrogel thermosensible composé de monomère synthétique Glycosyl-Nucléoside-Fluoré (GNF) de faible poids moléculaire. Dans le domaine de la régénération osseuse, les hydrogels cellularisés sont généralement utilisés comme matrice associée à des molécules ostéogéniques (BMP2, Béta-Glycérophosphate) ou à des ions (Calcium : Ca2+, Phosphate : PO42-) pour permettre la differenciation ostéoblastique des cellules encapsulées dans le gel. Cependant, dans notre travail, nous n’avons pas fait appel à ces facteurs ostéogéniques. Notre étude a révélé que l’hydrogel de GNF possède les critères essentiels pour être utilisé en clinique : la non-toxicité, la biocompatibilité, la biodégradabilité, l’injectabilité et la biointégration. Des injections de complexe gel/ASC réalisées en site ectopique chez l’animal ont démontré que le gel se forme in situ en moins de 20 minutes et que les cellules encapsulées ont survécu pendant plusieurs mois. In situ, les ASC se sont différerenciées en ostéoblastes matures, exprimant la phosphatase alcaline et l’ostéocalcine et synthétisant une matrice extracellulaire riche en phosphate de calcium. Ces travaux ont donc permis de développer un produit d’ingénierie tissulaire innovant, associant un support tridimensionnel, l’hydrogel de GNF, à une composante cellulaire, les ASC. Cette matrice cellularisée apparaît prometteuse comme système injectable pour des applications cliniques de régénération osseuse
Bone tissue is characterized by its mineralized matrix which is subject to formation and resorption activities ensuring its renewal and remodeling throughout the life. In case of damage, the bone can repair itself naturally to restore its integrity and its physical properties. Nevertheless, some pathologies or surgical procedures can lead to massive loss of bone and the natural process of self-repair is insufficient. First line, the bone graft is considered (autograft and allograft), however, due to reduced availability and risks of rejection and transmission of infectious agents, this technique is not feasible in all clinical situations. The surgeon can then make use of osteoconductive biomaterials but these are only usable in the case of filling of small defects because they are simply passive scaffold for bone formation. These limits may be exceeded through the concept of tissue enginee- ring, designing innovative biomaterials with high osteogenic power conferred by particular growth factors or osteoprogenitor cells. In our work we seek to develop a new product of tissue engineering to repair bone defects. The proposed strategy is based on the combination of a three-dimensional scaffold and adult stem cells derived from human adipose tissue (ASC). The originality of this system comes from the three-dimensional matrix, which is a thermosensitive hydrogel composed of synthetic monomeric Glycosyl-Nucleoside-Fluorinated (GNF) low molecular weight. In the field of bone regeneration, hydrogels are generally used as cellularized matrix molecules associated with osteogenic (BMP2, Beta-Glycerophosphate) or ions (Calcium : Ca2+, Phosphate : PO42-) to allow osteoblast differentiation of cells encapsulated in the gel. However, in our work, we have not used these osteogenic factors. Our study revealed that the hydrogel of GNF has the essential criteria to be used in clinical practice : non-toxicity, biocompatibility, biodegradability, injectability and biointegration. Injections of gel/ASC complex performed in animal ectopic site have showed that the gel is formed in situ within 20 minutes and encapsulated cells survived and proliferated for several months. In situ, ASC were differentiated into mature osteoblasts expressing alkaline phosphatase and osteocalcin and synthesizing an extracellular matrix rich in calcium phosphate. So, this work has allowed the development of an innovative product for tissue engineering, combining a three-dimensional scaffold, the GNF based hydrogel, a cellular component, the ASC. This cellularized matrix appears promising as injection system for clinical applications of bone regeneration

De nos jours, les patients qui ont la totalité de l'épaisseur de la peau détruite, dont l'hypoderme, disposent des solutions cliniques avec un certain nombre de limitations. Actuellement, le lipofilling est la principale solution pour la reconstruction de l'hypoderme grâce à la grande disponibilité du tissu adipeux autologue et au pouvoir de comblement de larges volumes. Cependant, le taux de résorption est de 80-90% dû à l'absence de vascularisation. L'ingénierie tissulaire peut être un outil efficace pour le développement d'une solution prometteuse pour améliorer l'efficacité du lipofilling. Cette thèse a pourobjectif de développer un scaffold poreux et résorbable par impression 3D pour soutenir la régénération vasculaire et du tissu adipeux. Les polymères synthétiques biorésorbables offrent de nombreux avantages tels que la facilité de mise en ouvre et leur adaptabilité (structure, propriétés, comportement, etc.) les rendant compatibles avec la réparation de l'hypoderme. De plus, leur association à l'impression 3D permet de créer des structures poreuses adaptées au tissu adipeux. Les travaux ont été menés sur 3 axes: le choix du matériau de conception, du design et la validation pré-clinique. Des études in vitro, avec le PLCL et le PDO, ont montré que le PLCL est plus adapté pour la conception du scaffold 3D. Le motif SCO a été choisi pour le design du scaffold 3D dont les propriétés mécaniques et la porosité sont compatibles avec les tissus mous. Ensuite, la validation pré-clinique du scaffold 3D en PLCL, sur le modèle murin, a prouvé qu'il peut être utilisé pour améliorer la survie et la vascularisation du tissu adipeux
Nowadays, patients who have had the entire thickness of their skin destroyed, including the hypodermis, have access to clinical solutions with a number of limitations. At present, lipofilling is the main solution for hypodermis reconstruction, thanks to the wide availability of autologous adipose tissue and its ability to fill large volumes. However, the resorption rate is 80-90% due to the absence of vascularization. Tissue engineering can be an effective tool for developing a promising solution to improve the efficacy of lipofilling. The aim of this thesis is to develop a 3D-printed porous and resorbable scaffold to support vascular and adipose tissue regeneration. Synthetic bioresorbable polymers offer numerous advantages, such as ease of processing and adaptability (structure, properties, behavior, etc.), making them suitable for hypodermis repair. What's more, their combination with 3D printing makes it possible to create porous structures adapted to adipose tissue. Studies were carried out in 3 axes: choice of material, design and pre clinical validation. In vitro studies with PLCL and PDO showed that PLCL was more suitable for the development of the 3D scaffold. The SCO pattern was chosen for the design of the 3D scaffold, whose mechanical properties and porosity are compatible with soft tissue. Next, pre-clinical validation of the PLCL 3D scaffold, in the mouse model, proved that it can be used to improve survival and vascularization of adipose tissue

L’ingénierie du tissu osseux vise à concevoir un substitut tissulaire associant des cellules ostéoprogénitrices à une matrice tridimensionnelle capable de promouvoir la reconstruction osseuse, ouvrant la voie au développement de thérapeutiques substitutives à la pratique de la greffe dont les limitations sont bien connues.Le but de ce travail a été de développer un nouveau produit d’ingénierie tissulaire (PIT) destiné à la régénération osseuse constitué i) d’une matrice tridimensionnelle poreuse constituée de polysaccharides naturels biodégradables, ii) de cellules souches adultes issues du tissu adipeux humain (ADSCs) et d’identifier les conditions de culture optimales permettant le développement d’un produit fonctionnel pour une utilisation clinique. Nos résultats montrent que l’architecture et la composition de la matrice macroporeuse polysaccharidique permet de guider la différenciation ostéoblastique des ADSCs, en l’absence de facteurs ostéogéniques, et notamment en conditions de culture dynamique, grâce à l’organisation cellulaire en agrégats promouvant les interactions cellulaires. Les ADSCs peuvent être marquées à l’aide de nanoparticules superparamagnétiques et suivies in vivo de façon non invasive par imagerie par résonnance magnétique (IRM) au sein des matrices après leur implantation en site sous-cutané chez la souris. Les images IRM montrent que le matériau permet de délivrer une partie des cellules au niveau du site d’implantation participant probablement à un processus de réparation tissulaire. Enfin, en vue d’applications cliniques, un milieu de culture sans sérum répondant aux conditions GMP (Good Manufacturing Practices) pour la différenciation ostéoblastique a été développé par un industriel et validé au cours de ce travail de thèse.En conclusion de ces travaux, l’association d’une matrice macroporeuse composée de polysaccharides avec des ADSCs dans des conditions de culture spécifiques, en conditions dynamiques, semble pertinente et prometteuse pour des applications cliniques en ingénierie du tissu osseux
Bone tissue engineering may associate osteoprogenitor cells to a tridimensional scaffold that can promote tissue reconstruction in order to replace bone grafting strategies whose limitations are well known. This study aims to develop a new tissue-engineered construct for bone regeneration constituted by i) a tridimensional polysaccharide-based scaffold, ii) adult stem cells extracted from human adipose tissue and identify the best culture conditions needed to develop a functional construct for clinical use. Our results show that this macroporous scaffold offers, without any osteoinductive factors, a suitable architecture and composition for driving osteoblastic differentiation of ADSCs especially when placing the tissue-engineered construct in dynamic conditions, thanks to cell aggregate conformation promoting cell-to-cell interactions. Thanks to ADSCs labeling, the tissue-engineered construct can be tracked in vivo in a non invasive way by magnetic resonance imaging (MRI), after their subcutaneous implantation. Results evidenced that this scaffold behaves as a cell carrier for of holding in its own cell fraction and delivering another fraction to the site of implantation for inducing a better tissue regeneration process. Finally, a serum free medium meeting standards GMPs (Good Manufacturing Practices) has been developed for inducing ADSCs osteoblastic differentiation as a first step towards clinical application.In conclusion, this polysaccharide-based scaffold associated with ADSCs, cultured under low fluid flow in a new bioreactor device, could be a relevant and promising tissue engineered construct for bone tissue engineering applications

Le tissu adipeux (TA) est connu pour sa plasticité puisqu'il est capable de s'hypertrophier ou de s'atrophier, en fonction de la situation métabolique de l'individu. Cette plasticité est liée au fait que le TA joue un double rôle dans le maintien de la balance énergétique : il est à la fois i) réserve d'énergie mobilisable (adipocytes blancs) mais également ii) consommateur d'énergie via la thermogénèse (adipocytes bruns, adipocytes beiges). En raison de l'évolution croissante des maladies métaboliques dites de surcharge dans lesquelles ce TA va s'hypertrophier, la majorité des études abordent cette notion de plasticité à l'échelle cellulaire, et se focalise ainsi sur les adipocytes (prolifération, différenciation, activité) et les autres populations cellulaires résidant dans le TA, capables d'interagir avec eux. En revanche, il y a très peu d'études sur cette plasticité à l'échelle tissulaire. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée i) à l'organisation tissulaire d'un dépôt de TA blanc (dépôt sous-cutané inguinal) et ii) les conséquences d'une ablation massive du TA blanc. L'ensemble de ce travail a été réalisé chez la souris.A l'aide de l'imagerie 3D sur tissu entier, nous montrons que ce dépôt est hétérogène : il est composé d'une partie dans laquelle il est possible de segmenter des entités fonctionnelles (lobules ?), située au cœur du dépôt, et d'une partie non segmentable, située à la périphérie du dépôt. Cette hétérogénéité structurale est associée à une hétérogénéité fonctionnelle : les deux régions se distinguent en termes de morphologie adipocytaire et de pattern d'expression génique. De plus, seule la partie segmentable répond à la mise au froid des animaux par une up-régulation du niveau d'expression d'Ucp1 et d'autres gènes marqueurs du " brunissement ". Parallèlement à cela, nous montrons que selon la souche de souris (C57bl6 et MRL), la réponse du TA inguinal à une ablation partielle n'est pas la même : chez la souris MRL (rare mammifère capable de régénération), ce dépôt adipeux est capable de régénérer, ce qui n'est pas le cas chez la souris C57Bl/6. La régénération est inhibée chez la souris MRL par un traitement avec un agoniste des récepteurs aux opioïdes (tramadol) alors qu'elle peut être induite chez la souris C57Bl/6 par un antagoniste de ces récepteurs (naloxone). Cette régénération est dépendante d'une forte et intense production d'espèces actives de l'oxygène par les granulocytes. L'utilisation de souris invalidées pour le récepteur mu démontre l'implication de cette sous-famille de récepteurs. Enfin, cet effet des opioïdes est majoritairement le fait des cellules immunitaires, et plus particulièrement les granulocytes. Ces données mettent en exergue une nouvelle vision du TA blanc sous - cutané, qui ne doit pas être considéré comme un tissu inerte mais bel et bien comme un tissu hétérogène complexe (structurellement et fonctionnellement) pouvant être capable de régénération
Adipose tissue (AT) is very plastic tissue. During metabolic disease, it would be overdeveloped or atrophy. It is due to the fact that AT is i) energy storage thanks to white adipocyte and ii) energy consumer thanks to brown or brite adipocyte. The cellular composition is very well studied (adipocytes activity, proliferation, differenciation, link between AT stromal cells / adipocytes) but the tissue organization of AT is not known. During my thesis work, we study the i) tissular organization of white AT and ii) AT response after massive removal of white AT. Mice are used for this work. In the first step, our 3 dimensional imaging of white AT shows that AT is heterogeneous tissue: AT has 2 components: segmentable area, in the AT core and non-segmentable area, in the AT periphery. This structural heterogeneity is correlated with functional heterogeneity because segementable area differs to non-segmentable area from adipocyte shape and pattern genic expression. Furthermore, only segmentable area can be respond to cold exposure by Ucp1 up-regulation and browning genes markers. In the second step, massive ablation of subcutaneous white AT is performed on two mice strains: C57Bl/6 and MRL (known to be able to regenerate). MRL mice inguinal AT regenerate, unlike inguinal AT of C57Bl/6 mice. The use of antagonist of opioid receptor (naloxone) treatment leads regeneration AT in C57Bl/6. In opposite, opioid receptor agonist (tramadol) treatment in MRL mice inhibits AT regeneration. AT regeneration is dependant of burst oxydatif production by granulocytes. The use of the receptor knock down mice highlights that is the only receptor is involved in AT regeneration. More precisely, opioids effects are mediated by receptor on granulocyte immune cells

La prise en charge des pathologies malformatives ou acquises dans le cadre pédiatrique a fait des progrès considérables au cours des dernières décennies. Cependant certaines prises en charge chirurgicale ne sont toujours pas optimales. C'est pourquoi la médecine régénérative représente une voie d'intérêt en chirurgie pédiatrique. Si différents types cellulaires ont été proposés, les cellules stromales issues du tissu adipeux sont une source intéressante de cellules pour l'ingénierie tissulaire car elles sont abondantes, faciles à prélever et sans problème éthique sous jacent, tout en conservant de multiples potentialités de différenciation. Si de nombreuses publications rapportent l'utilisation des ASC issues de donneurs adultes pour des protocoles précliniques ou cliniques, peu d'études se sont intéressées aux cellules issues de donneurs pédiatriques. L'objectif de ce travail était donc d'obtenir des données exhaustives sur les cellules d'enfant et notamment en fonction de leur âge. Outre les données in vivo, nous avons mis en place un protocole d'étude dans deux modèles murins. 77 enfants ont été prélevés de 1 g de tissu adipeux sous cutané selon les protocoles de collection biologique ASChild 1 et 2. Les cellules ont été séparées en 2 groupe (> et <à 1 an) et mis en culture afin d'étudier différents paramètres (taux d'extraction et de prolifération, phénotype, immunomodulation, formation de CFU-F, potentiel de différenciation en différentes lignées). Peu de différences ont pu être mis en évidence en fonction de l'âge si ce n'est un taux d'extraction cellulaire et une prolifération légèrement plus importante chez les donneurs les plus jeunes. De plus, une étude globale de l'expression génique en utilisant une technique de puce microarray n'a décelé une expression différentielle dans seulement 305 gènes (217 down et 8 up regulés) des pASC par rapport aux ASC adultes, sans différence notée entre les différents groupes d'âge. Afin d'évaluer le potentiel angiogénique des cellules pédiatriques (caractéristique bien connue des ASC), nous avons utilisé un modèle d'ischémie aigue de membre murin. Une ligature du pédicule fémoral était réalisée puis les cellules préalablement mises en culture étaient injectées au sein des loges musculaires de la patte (1 million de cellules dans 60 microl). 29 souris ont pu être traitées selon ces modalités par 6 prélèvements pédiatriques (2 du groupe 1, n=9 et 4 du groupe 2, n=20) et comparées à 30 souris injectées avec du Nacl. Le suivi longitudinal sur 14 jours a mis en évidence une amélioration de la microvascularisation grâce à l'étude microangiographique. D'autre part l'étude histologique a confirmé la viabilité des cellules au terme du suivi ainsi que la proximité des cellules avec les structures vasculaires. Afin de préciser le potentiel des pASC dans la cicatrisation cutanée, 4 prélèvements (2 groupes 1 et 2 groupes 2, n=20) ont été étudiés dans notre modèle murin de brûlure par ébouillantement et comparée à des souris contrôle (n=10). Les pASC permettent une amélioration des paramètres de cicatrisation (épithélialisation, contraction) au cours du suivi de 21 jours. Une amélioration de la vascularisation cutanée évaluée par laser doppler est observée en parallèle. Enfin les cellules ont pu être suivie pendant 21 jours in vivo et possèdent là encore une bonne viabilité au terme du suivi. Ce travail a permis de définir des paramètres essentiels dans l'optique d'une utilisation future des pASC dans la prise en charge des pathologies malformatives ou acquises de l'enfant. Néanmoins certains paramètres doivent être encore précisés comme le potentiel de tumorogénicité à long terme et le mode de délivrance le plus optimal
Adipose derived mesenchymal stromal cells (ASC) are currently tested in regenerative medicine to promote tissue reconstruction after injury. In autologous purpose the possible loss of therapeutic function and cell properties during aging have been questioned in adult. To date no reliable information is available concerning ASC from pediatric patients and a better knowledge is required to intend their use for clinical applications. To address this issue, subcutaneous adipose tissue was collected from 27 donors aged 0-1 year and 50 donors aged 1-12 years and compared to adult ASC. Cells from the stromal vascular fraction (SVF) and subsequent cultured ASC were tested in vitro for their extraction and proliferation yield, phenotype, immunomodulation effect, CFU-F content, adipogenic, osteoblastic and angiogenic potentials. Only a slightly higher amount in cell number and proliferative rate were found. None of the other parameters was significantly different. In vivo, pediatric ASC induced an increase in microangiographic score in a mouse model of limb ischemia, even though improvement in vascular density was not significantly correlated to limb rescue. Finally mRNA analysis using microarray approach identified that only 305 genes were differentially expressed (217 down- and 88 up-regulated) in pediatric versus adult ASC, confirming that ASC from both groups of age shared very close intrinsic properties. Finally, we assessed the potentiality of pASC in a murine burn model, designed to cope with our daily practice as pediatric surgeons. We confirmed that cellular therapy based on pASC is effective as it improves early wound healing parameters (epithelialization, retraction). Laser Doppler analysis shows an higher local cutaneous blood flow with ASC than with NaCl. Moreover, we were able to follow the presence of the cells during 21 days. This work precises essential pASC features, which assessment was mandatory before considering a clinical use for malformative or acquired pathology during childhood. Nevertheless, precise understanding of ASC action mechanism needs to be completed as long term inocuity needs to be confirmed and mode of delivery to be adapted to a potential surgical use

Les apolipoprotéines L (APOL) forment une famille de protéines conservées chez les mammifères. L’APOL6 murine est principalement exprimée par les adipocytes présents dans le tissu adipeux. Dans un modèle de culture d’adipocytes, l’adipogénèse a causé l’induction de l’expression de l’APOL6. Celle-ci a pu encore être modulée à la hausse par de l’IFNγ, et à la baisse par du TGFβ. Des facteurs élevant la concentration en AMP cyclique ont aussi permis de diminuer l’expression d’APOL6. In vivo, lorsque des souris APOL6 KO ont été nourries par un régime riche en graisses, elles ont pris moins de poids que les souris WT correspondantes. De plus, les adipocytes des souris APOL6 KO obèses étaient plus petits que ceux des contrôles WT. Finalement, la recherche de protéines interagissant avec l’APOL6 par immunoprécipitation a permis de mettre en évidence une majorité de protéines associées au cytosquelette d’actine. En conclusion, l’APOL6 semble être associée au cytosquelette d’actine des adipocytes et permettrait la régulation de la taille de leurs gouttelettes lipidiques.
Apolipoproteins L (APOL) are a family of conserved proteins among mammals. Murine APOL6 is mainly expressed by adipocytes in the adipose tissue. In a model of in vitro adipocyte cell culture, adipogenesis induced the expression of APOL6. This expression increased with IFNγ and decreased with TGFβ. Cyclic-AMP elevating agents also decreased the expression of APOL6. In vivo, APOL6 KO mice that were fed with a high fat diet gained less weight than their wild type (WT) counterparts. Furthermore, adipocytes from obese APOL6 KO mice were smaller than those from WT controls. Finally, immunoprecipitation experiments showed that APOL6 probably interacted with actin cytoskeleton proteins within adipocytes. In conclusion, APOL6 is likely associated with the actin cytoskeleton in adipocytes and could be involved in the regulation of the size of lipid droplets.
Option Biologie moléculaire du Doctorat en Sciences
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Le tissu adipeux a longtemps été considéré comme un tissu inerte servant uniquement à la mise en réserve et à la libération des acides gras, mais nous savons maintenant qu’il possède une fonction endocrine et inflammatoire, impliquant ainsi ce tissu dans la pathophysiologie de l’obésité. En ce sens, beaucoup d’efforts sont déployés afin de minimiser son expansion, favoriser sa mobilisation ou encore améliorer l’homéostasie de ses fonctions. Notre compréhension de la nature biologique et physiologique du tissu adipeux a grandement évolué au cours des dernières décennies. De nouveaux concepts ont récemment émergé sur le tissu adipeux, notamment en ce qui concerne : 1) sa densité; et 2) sa plasticité. Dans la présente thèse, nous avons abordé ces deux concepts. L’objectif général des travaux était de caractériser les phénomènes entourant la densité et la plasticité du tissu adipeux. Afin de rencontrer cet objectif, nous avons développé une approche méthodologique nous permettant de mesurer l’accumulation des graisses et la densité radiologique du tissu adipeux, aussi appelée l’atténuation radiologique (la capacité du tissu adipeux à bloquer les rayons X) au niveau abdominal par tomographie axiale dans une cohorte de plus de 240 femmes. Nous avons démontré que l’atténuation radiologique des tissus adipeux sous-cutané et viscéral est significativement et négativement corrélée avec la taille adipocytaire dans le dépôt correspondant. De plus, nos résultats ont révélé que les femmes caractérisées par une hypertrophie des adipocytes viscéraux ont un profil lipidique altéré comparativement aux femmes ayant de plus petits adipocytes. Ces différences sont atténuées après un ajustement statistique pour la surface de tissu adipeux et éliminées après un ajustement statistique pour la surface et l’atténuation des tissus adipeux. Nous avons donc démontré que l’atténuation radiologique des tissus adipeux est un marqueur de la taille adipocytaire. Par le fait même, la taille adipocytaire est un intégrateur de la qualité et de la quantité du tissu adipeux. Nous avons étudié la plasticité des cellules de la fraction stroma-vasculaire et des adipocytes du tissu adipeux. D’abord, nous avons utilisé la cytométrie en flux pour caractériser le phénotype des précurseurs adipocytaires de la fraction stroma-vasculaire. Nous avons démontré qu’une souspopulation de précurseurs adipocytaires natifs CD45- CD31- CD34+ expriment le marqueur de surface CD38. Nous avons observé une expression plus élevée des gènes associés à l’adipogénèse dans les précurseurs CD38+ comparativement aux précurseurs CD38-. Nous avons également démontré que le développement de l’obésité par le biais d’une diète riche en gras est associé à une augmentation du nombre de précurseurs adipocytaires CD38+, particulièrement dans le dépôt intraabdominal. Nos travaux suggèrent donc que le CD38 est un marqueur d’engagement vers la ifférenciation adipocytaire. Par ailleurs, nous avons étudié un exemple de la plasticité des adipocytes matures, soit la dédifférenciation. Nous avons utilisé des puces à ADN pour examiner les changements d’expression génique au cours du processus de dédifférenciation. Nous avons observé une diminution de l’expression des gènes associés aux fonctions de l’adipocyte mature et une augmentation de l’expression des gènes associés à la reprogrammation cellulaire, au cycle cellulaire et à la matrice extracellulaire. Par ailleurs, nous avons développé un modèle de culture cellulaire nous permettant de dédifférencier les adipocytes matures et de moduler certains aspects du processus de dédifférenciation. Cela nous a permis de démontrer un rôle pour le sentier métabolique du Transforming growth factor-β dans la modulation de l’expression des différents types de collagène au cours du processus de dédifférenciation des adipocytes matures. Finalement, nous avons effectué des expériences d’immunofluorescence et de microscopie en temps réel afin de caractériser le processus de dédifférenciation des adipocytes matures. Nous avons démontré que la dédifférenciation est complètement inhibée par l’ajout d’agents bloquant la division cellulaire. Nous avons observé la présence d’adipocytes binucléiques au cours du processus de dédifférenciation, ainsi que des marqueurs de mitose. En conclusion, nos travaux ont permis de caractériser deux nouveaux aspects du tissu adipeux qui reflètent des processus biologiques précis qui ont leurs racines dans le cycle de vie de l’adipocyte, dont l’expansion hypertrophique, la prolifération et la différenciation cellulaire, ainsi que la dédifférenciation des adipocytes matures. Ces travaux proposent des avancées significatives dans notre compréhension de la nature dynamique de ce tissu.
Adipose tissue has been considered a passive reservoir for energy, but we now know that it is also a secretory and endocrine organ. Because of increasing obesity rates, a lot of ressources are being committed to prevent adipose tissue accumulation and associated biological effects. In the last years, our advance in the understanding of adipose tissue biology has greatly evolved. New paradigms on adipose tissue have emerged, especially regarding: 1) its radiologic density (or radiologic attenuation); and 2) its plasticity. In this thesis, we studied these two concepts. The overall objective of this thesis was to characterize the phenomena surrounding adipose tissue density and plasticity. To achieve our objective, we have applied methodological approaches that allowed us to measure abdominal adipose tissue accumulation and attenuation using computed tomography in a cohort of 240 women. We showed that subcutaneous and visceral adipose tissue attenuation is negatively and significantly associated with adipocyte size in the corresponding depot. Our results also demonstrated that women with adipocyte hypertrophy are characterized by an altered lipid profile compared to women with smaller adipocytes. Satistical adjustment for visceral adipose tissue area minimized these differences while subsequent adjustment for adipose tissue attenuation eliminated all differences. Our results suggest that fat cell size is a marker of adipose tissue radiologic attenuation and area, and therefore, an integrator of adipose tissue quality and quantity. We also studied the plasticity of the adipocyte precursors contained in the stromal-vascular fraction of adipose tissue and of mature adipocytes. To do so, we used flow cytometry analysis to characterize the phenotype of adipocyte precursors. We demonstrated that a subpopulation of CD45- CD31- CD34+ adipose progenitors express the cell surface protein CD38. These cells have higher levels of adipogenic genes compared to the CD45- CD31- CD34+ CD38- population. When cultivated, CD38+ cells show a greater adipogenic potential than the CD38- cells. We also found that obesity is associated with an increase in the number of CD38+ adipose progenitors, particularly in the intra-abdominal depot. Our results suggest that CD38 is a marker of commitment toward adipogenesis. Furtheremore, we studied the process of mature adipocyte dedifferentiation as a good example of adipose tissue plasticity. We examined changes in gene expression during the dedifferentiation process using microarray analysis. We found a decrease in the expression of genes associated with mature adipocyte functions and an increase in the expression of genes associated with cellular reprogramming, cell cycle and extra-cellular matrix. We have also developed a cellular culture system that allows us to dedifferentiate mature adipocytes and to modulate various aspects of the process. This allowed us to demonstrate a role for the Transforming growth factor β signaling in modulating collagen gene expression during dedifferentiation. Finally, we performed immunofluorescence and time-lapse microscopy experiments to characterize the process of mature adipocyte dedifferentiation. We demonstrated that adipocyte dedifferentiation is completely prevented by agents blocking cell division. We also observed binucleated adipocytes throughout the ceiling culture process and markers of mitosis. In conclusion, our studies allowed us to characterize various novel aspects of adipose tissue related to specific biological process, which have their roots in the adipocyte life cycle. They include hypertrophic expansion, cellular proliferation and differentiation, and adipocyte dedifferentiation. This is of significant importance in our understanding of adipose tissue dynamics.

Les techniques classiquement utilisées pour l’extraction des précurseurs myogéniques, les cellules satellites, conduisent en réalité à une population composite de cellules mononucléées parmi lesquelles des cellules progénitrices à caractère souche. Nous avons montré, par l’utilisation de la technique d’élutriation, que la taille des cellules extraites du muscle permet de trier une population minoritaire de progéniteurs immatures ou peu engagés dans le programme myogénique, et ce sur la base de la petite taille. La technique d’ensemencements successifs (dite de « preplating ») nous a permis de sélectionner après 6 jours des cellules progénitrices, par un retard initial d’adhérence. La combinaison de ces deux approches expérimentales rend possible l’obtention en seulement 24 heures d’une population fortement enrichie en progéniteurs myogéniques, qui pourrait présenter une efficacité supérieure aux myoblastes dans une utilisation en thérapie cellulaire des maladies génétiques du muscle
The experimental procedures classically used to isolate the myogenic precursors, i. E. , the satellite cells, in fact supply a heterogeneous population of mononucleated cells among whom are progenitor cells with stem cell features. By using counterflow centrifugal elutriation, we showed that muscle-extracted cell size allow to sort a marginal population of immature progenitors or poorly committed cells in the myogenic program, on the basis of the small cell size. The successive plating technique (called “preplating technique”) allowed us to select progenitor cells after 6 days in culture, using initial adhesion delay. Combination of these two experimental approaches allowed us to obtain, after only 24 hours, a highly enriched population in myogenic progenitors that could display a higher efficiency compared to myoblasts in cell therapy experiments for muscle genetic diseases

Le développement et le remodelage du tissu osseux dépendent d'une étroite coordination entre les cellules ostéoblastiques et ostéoclastiques, responsables de la formation et résorption osseuse respectivement, mais aussi entre les cellules osseuses et les cellules endothéliales présentes dans les vaisseaux sanguins environnants. Le but de ce travail est d'étudier la communication entre les ostéoprogéniteurs issus de la moelle osseuse (human osteoprogenitors : HOPs) et les cellules endothéliales (human ombilical cord endothelial cells : HUVECs). Cette communication ostéo-endothéliale a été analysée dans un modèle de co-culture in vitro en 2D mais aussi en 3D au sein de microsphères d'alginate qui ont été ensuite implantées in vivo dans une lésion osseuse chez la souris nude. Dans un premier temps, nous avons complété la caractérisation des HOPs. Le phénotype de ces cellules est régulé lorsqu'elles sont soumises à des contraintes mécaniques, paramètre fondamental in situ. En co-culture avec les HUVECs, le phénotype ostéoblastique des HOPs est également régulé et le VEGF (vascular endothelial growth factor) participe de façon étroite à cette régulation. Le phénotype endothélial semble lui aussi modifié en co-culture puisque la migration des HUVECs semble être à l'origine d'un réarrangement cellulaire proche de capillaires. Au sein de microsphères d'alginate cultivées in vitro, les HUVECs stimulent le phénotype ostéoblastique des HOPs. De même, la présence des HUVECs active la minéralisation induite par les HOPs dans une lésion osseuse réalisée in vivo. Cette étude montre que ces cellules sont capables de communiquer et pourraient être à la base de nouvelles stratégies d'ingénierie tissulaire
Bone development and remodelling are dependant on a tight cell cooperation between osteoblastic and osteoclastic cell types, responsible for bone formation and degradation, respectively. Angiogenesis is also a key process involved in these mechanisms and cell communication between osseous and endothelial cells is fundamental This work aims to study the cell communication between human osteoprogenitors (HOPs) arising from bone marrow and human endothelial cells (human umbilical cord endothelial cells : HUVECs). This osteo-endothelial communication was analysed using a well defined in vitro co-culture model in 2D but also into a 3D system into alginate microsphères which were then implanted in vivo in a bone defect in nude mice. In a first part, the HOPs were submitted to a mechanical stress which is an important parameter for the physiology of bone. Their ability to regulate their phenotype was demonstrated under shear stress. In co-culture wuth HUVECs, the phenotype was regulated and VEGF (vascular endothelial growth factor seems to be involved in this regulation. The endothelial phenotype was also regulated in co-culture since HUVECs migration led to a tubular-like cell rearrangement. Into alginate microspheres cultured in vitro, the HUVECs stimulated the osteoblastic phenotype of HOPs. Moreover, after implantation in a bone defect in vivo, the HUVECs enhanced the HOP-induced mineralization. This work shows that the cells are able to communicate and seems promising for the development of new tissue engineering strategies

Utilisée depuis plus d'un siècle en chirurgie esthétique, la greffe autologue de tissu adipeux, ou lipofilling, est une technique sûre permettant le comblement des tissus mous. Cependant, bien que la technique ait connue de nettes améliorations au cours du temps, les chirurgiens font toujours face à une résorption du greffon qui oblige dans la majorité des cas à planifier plusieurs autres interventions afin que le résultat esthétique soit en adéquation avec les attentes du patient. Le procédé MICROFILL® a été développé dans le but d'augmenter le taux de prise de greffe en favorisant la survie cellulaire au sein du greffon. Cette dernière est optimisée par : un prélèvement et une réinjection de lobules adipeux de petite taille permettant de diminuer l'ischémie et la mauvaise nutrition des cellules - une élimination des éléments délétères (anesthésiques, cytokines inflammatoires) par un protocole de lavages et centrifugations non traumatique. D'autre part, au cours de ces dernières années, le tissu adipeux s'est révélé posséder un pouvoir thérapeutique plus important par l'hébergement de cellules souches mésenchymateuses au fort potentiel. Ces cellules sont présentes en grande quantité et facilement accessibles à partir d'une simple lipoaspiration. Cependant, la lipoaspiration implique bien souvent l'usage d'un anesthésique local et d'un vasoconstricteur qui peuvent nuire aux cellules. Nos études ont en effet montré que la lidocaïne, un anesthésique couramment utilisé, est cytotoxique pour les cellules souches du tissu adipeux, ayant pour effets l'inhibition de la prolifération cellulaire (arrêt du cycle cellulaire en phase G0-G1) et la nécrose des cellules. En revanche, une manipulation appropriée du tissu adipeux, se rapprochant du protocole MICROFILL®, permet de diminuer la mortalité cellulaire. L'effet délétère de la lidocaïne semble lié à l'apparition d'une vacuolisation cytoplasmique dont la nature est à ce jour non élucidée. De plus, la lidocaïne induit également un processus d'autophagie, dont les mécanismes moléculaires d'induction sont eux aussi inconnus et dont la finalité physiologique serait le maintien en vie de la cellule malgré le stress provoqué. Les conclusions de ces études mènent à certaines recommandations à suivre quant à l'usage de la lidocaïne en vue de la réinjection extemporanée de cellules souches adipeuses chez un patient. Aussi, dans le but de traiter les tendinopathies équines, ces études ont permis d'optimiser le protocole de prélèvement du tissu adipeux chez le cheval ainsi que le protocole d'extraction des cellules souches du tissu adipeux. Cette thèse a finalement permis de développer un kit à usage vétérinaire permettant de traiter les tendinopathies équines. Ce nouveau procédé de thérapie cellulaire a été testé chez des chevaux et s'est avéré très prometteur, permettant la régénération de la structure tendineuse et un retour au travail rapide des chevaux
Despite the dark side of obesity in the pathogenesis of metabolic diseases, adipose tissue has been shown to be a good therapeutic tool. First, autologous fat grafting, also named lipofilling, has been used for over a century and represents a safe technique for soft tissue filling. However, although the technique has seen marked improvements over time, surgeons are still facing graft resorption that often requires overcorrection of the treated area or other interventions so that the aesthetic result is in line with expectations of the patient. Thus, MICROFILL® process has been developed in order to increase the rate of engraftment by promoting cell survival within the graft. The latter is enhanced by: - sampling and reinjection of small fat lobules in order to reduce ischemia and poor nutrition of the cells- elimination of deleterious elements (anesthetics, inflammatory cytokines) by a non-traumatic protocol involving soft centrifugations and washings. Furthermore, in recent years, adipose tissue has been found to have a greater therapeutic power by hosting mesenchymal stem cells with great potential. These adipose stem cells (ASCs) are present in large quantities and can be easily obtained from a simple liposuction. However, liposuction procedure often involves the use of a local anesthetic and a vasoconstrictor that can harm cells. Our studies have shown that lidocaine, an anesthetic commonly used, exerts cytotoxic effects on adipose stem cells, inhibiting cell proliferation (cell cycle arrest in G0-G1 phase) and inducing necrosis. Nonetheless, appropriate handling of adipose tissue, quite similarly to MICROFILL® protocol, reduces cell death. The deleterious effects of lidocaine appear to be related to the occurrence of cytoplasmic vacuolization whose nature is so far unclear. In addition, lidocaine also induces a process of autophagy, including molecular mechanisms of induction also unknown and whose physiological purpose could be cell survival despite the stress. The findings of these studies lead to some recommendations to follow regarding the use of lidocaine for the extemporaneous reinjection of ASCs in a patient. Also, in order to treat equine tendinopathy, these studies have been used to optimize adipose tissue harvest by liposuction on horses and the protocol of extraction of ASCs.Finally, this thesis has allowed developing a kit for veterinary use to treat equine tendinopathy. This new method of cell therapy has been tested in horses and has shown very promising results for tendon regeneration, knowing that treated horses could rapidly return to work

L’ingénierie tissulaire osseuse est un nouveau domaine visant à restaurer, à maintenir ou à améliorer la fonction tissulaire. Elle implique la présence de trois éléments : des cellules souches, des molécules de signalisation (facteurs de croissance) et un matériau de support tridimensionnel. L’utilisation de produits autologues est de plus en plus favorisée afin d’éliminer tout risque lié à l’utilisation de produits allogènes ou xénogènes. Les extraits sanguins représentent une source autologue potentielle de facteurs de croissance et d’autres molécules qui peuvent être utilisés en ingénierie tissulaire. Notre objectif était d’évaluer, in vitro, les effets de deux extraits sanguins sur le comportement des cellules ostéogéniques de calvaria de rat. Dans la première partie, nous nous sommes intéressés à étudier les effets d’un sérum homologue sur la prolifération et la différenciation ostéoblastique. Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons évalué, in vitro, les effets d’un nouveau matériau de support d’origine sanguine, la globine, sur les cellules ostéogéniques. L’ensemble des résultats montre que ces 2 extraits sanguins sont capables de stimuler la prolifération et la différenciation ostéoblastique, et donc pourraient trouver des applications dans le domaine de l’ingénierie tissulaire du tissu osseux chez l’humain
Tissue engineering is a new domain developed in the aim of restoring, replacing or maintaining biological functions and tissue integrity. H implies the seeding of stem cells on 3D scaffolds in the presence of proper signaling molecules to promote cellular activity. The use of autologous products is preferred, when possible, in order to avoid ail risk associated with the use of allogenous or xenogenous products. Blood derivatives represent a potential autologous source for growth factors as well as other moiecules that couid be used in tissue engineering. Our objective was to evaluate, in an in vitro model, the effects of 2 blood derivatives on the behavior of rat calvaria osteoblastic cells. In the first part, we evaluated the effects of a homologous serum on osteoblastic ce11 proliferation and differentiation. In the second part of this work, we studied the in vitro effects of a new 3D scaffold of blood origin, globin, on osteoblastic cells. Our results show that these 2 blood derivatives are capable of stimulating osteoblastic cell activity and could find, in the future, clinical applications in the field of human bone tissue engineering

La vessie est un organe qui est sujet à diverses maladies ou malformations nécessitant parfois des chirurgies pour remédier aux problèmes. Ces chirurgies ont souvent pour but d’augmenter le volume utile de la vessie pour protéger les reins. Plusieurs substituts de tissu urologique existent, mais aucun ne possède les qualités suffisantes pour répondre aux conditions physiologiques auxquelles ces tissus seront soumis. L’objectif du projet consiste à créer un substitut entièrement humain par la méthode d’auto-assemblage et à caractériser ce tissu. De plus, la possibilité de produire ce substitut à l’aide des cellules stromales isolées du tissu adipeux a été étudiée. Le potentiel de ces cellules pourrait permettre d’optimiser la greffe de ces substituts. Nos résultats montrent qu’il est possible de reconstruire un substitut entièrement humain par la méthode d’auto-assemblage et que les cellules stromales isolées du tissu adipeux peuvent être utilisées pour participer à la reconstruction d’un substitut vésical.

Toutes les cellules de l’organisme relarguent de façon constitutive des nucléotides dans l’espace extracellulaire. Ces nucléotides extracellulaires agissent comme des molécules de signalisation, entre autres, via les récepteurs P2Y (P2YRs) qui sont des récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs). Les P2YRs sont exprimés, pour la majorité, de façon ubiquitaire dans l’organisme. L’analyse phénotypique des lignées de souris knockout pour les P2YRs (P2YR-/-) a permis de confirmer l’importance de cette voie de communication dans différents processus physio/pathologiques. Au sein de notre laboratoire, grâce à l’utilisation de souris P2YR-/-, nous étudions depuis quelques années le rôle de ces récepteurs dans la biologie des cellules stromales mésenchymateuses multipotentes (MSCs). Ces cellules se caractérisent par une faible immunogénicité et surtout par la propriété de multipotence, i.e. capacité de se différencier en plusieurs types cellulaires (adipocytes, chondroblastes, ostéoblastes). Cette dernière propriété suscite l’intérêt de la médecine régénérative qui vise à exploiter la multipotence de ces cellules en thérapie cellulaire. Toutefois, leur utilisation à des fins thérapeutiques est encore limitée, notamment parce que les mécanismes régulateurs de ces processus de différenciation sont encore mal compris. Il est donc fondamental de continuer à étudier les voies de signalisation régulant les processus de différenciation de ces cellules pour leurs applications cliniques.Dans ce travail de recherche, nous avons investigué l’implication de la signalisation dépendant des P2YR dans le modèle expérimental des MSCs dérivées du tissu adipeux sous-cutané inguinal (ATMSCs) murin. D’abord, nous avons montré que parmi les 7 sous-types connus de récepteur P2Ys, les ATMSCs expriment le P2Y2R (récepteur à l’ATP et l’UTP) et le P2Y6R (récepteur à l’UDP) et que ces récepteurs sont fonctionnels. Par une approche combinant l’analyse quantitative de leur expression, l’effet de leur activation pharmacologique et enfin l’effet de l’invalidation de leur gène (P2ry2 ou P2ry6), nous avons montré que ces deux récepteurs influencent à des degrés divers le processus de différenciation adipogénique et ostéoblastogénique des ATMSCs in vitro.Concernant le P2Y2R, nos données montrent que l’expression de son messager diminue dans les ATMSCs différenciées en adipocytes tandis que son activation et que l’invalidation de son gène sont sans effet sur l’intensité de différenciation adipogénique. Par ailleurs, après une différenciation ostéoblastogénique, le niveau d’expression du messager codant P2Y2R n’est pas modifié. Par contre, les ATMSCs P2Y2R-/- ont un potentiel de différenciation ostéoblastogénique diminué par rapport aux WT. Cet effet pourrait être lié à une diminution de l’expression de gènes codant des facteurs de signalisation des voies Wnt et/ou BMP, connues pour contrôler la production d’ostéoblastes à partir des MSCs.Le récepteur P2Y6R semble intervenir à la fois dans l’adipogénèse et l’ostéoblastogénèse des ATMSCs. En effet, l’expression du messager codant P2Y6R n’est pas modulée dans les adipocytes matures et l’activation du récepteur n’a pas d’effet sur le processus de différenciation adipogénique. Par contre, les ATMSCs P2Y6R-/- ont un potentiel de différenciation adipogénique réduit ce qui est corrélé à une diminution de l’expression du messager codant PPARγ2. D’autre part, nous avons constaté que l’augmentation de tissu adipeux est moindre chez les souris P2Y6R-/- âgées sous régime normal ou riche en graisse. Par ailleurs, l’expression du messager codant P2Y6R est diminuée après différenciation ostéoblastogénique. L’activation de P2Y6R par l’UDP altère la maturation complète des ATMSCs en ostéoblastes et l’invalidation du gène P2ry6 augmente l’activité principale de cette phase tardive, c’est-à-dire la production de minéralisation. Ces données suggèrent que la voie UDP-P2Y6R régule négativement le processus de différenciation ostéoblastogénique dans le modèle cellulaire étudié dans ce travail.Avec le modèle pathologique des cellules musculaires lisses vasculaires (VSMCs), modélisant une différenciation ectopique, nous avons montré que l’invalidation des gènes P2ry2 et P2ry6 affecte la transdifférenciation de ces cellules en cellules minéralisantes.En résumé, notre travail a permis de définir les rôles des P2Y2R et P2Y6R dans les processus de différenciation adipogénique et ostéoblastogénique des ATMSCs et de transdifférenciation des VSMCs en cellules calcifiantes. Des études complémentaires devront être réalisées pour établir la signification physio/pathologique de ces données expérimentales.
Doctorat en Sciences
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Dans différentes situations cliniques, la mise en place d'implants dentaires est parfois impossible du fait d'un volume osseux limité. Les méthodes actuelles de régénération de l'os alvéolaire ne sont pas toujours satisfaisantes et la mise au point de méthodes alternatives est nécessaire pour les cas les plus complexes. De nombreux matériaux de substitution osseuse sont disponibles. Cependant ils ne possèdent pas toutes les propriétés nécessaires pour une régénération osseuse complète, du fait de leur faible potentiel ostéoinducteur et ostéogénique.L’ingénierie tissulaire peut apporter des solutions aux problèmes actuellement rencontrés en reconstruction osseuse. Ces stratégies de régénération tissulaire reposent sur la combinaison d’un biomatériau macroporeux (scaffold) avec des cellules et des biomolécules utilisées pour stimuler la formation tissulaire. Pour fabriquer le scaffold plusieurs techniques existent. Ces dernières années les technologies de prototypage rapide ont gagné en intérêt, car elles offrent une bonne reproductibilité et une grande résolution. Il subsiste la problématique du « chargement » des cellules dans le scaffold macroporeux. L’approche conventionnelle implique de déposer les cellules sur le scaffold et d’espérer sa colonisation par les cellules pour former une construction tissulaire. Plusieurs limites ont été observées dans ce modèle : une faible vascularisation, une diffusion limitée des nutriments et une densité cellulaire faible et inhomogène.L'objectif de ce projet de thèse est de résoudre une partie des limites des biomatériaux macroporeux, en organisant l'ensemencement de cellules ostéoprogénitrices au sein du biomatériau. Basé sur de précédents résultats, nous avons choisi d’adopter une approche d'assemblage couche par couche également appelée « sandwich ». Cette approche devrait permettre de favoriser les interactions entre cellules et de faciliter la maturation des constructions tissulaires. Finalement la qualité et la quantité des tissus produits devraient être améliorées.La première partie du projet a consisté à fabriquer des membranes poreuses. Nous avons développé un nouveau matériau imprimable, fait d’acide poly(lactique-co-glycolique) (PLGA) mixé avec des nanoparticules d’hydroxyapatite (nHA). Le matériau fabriqué sous forme de filament a pu être utilisé pour l’impression 3D par extrusion à chaud (Fused Deposition Modeling = FDM). Le PLGA a été choisi pour son temps de dégradation adapté à la reconstruction osseuse et ses propriétés mécaniques qui sont proches de celles de l’os humain cortical. Les nanoparticules d’HA ont été incluses afin d’améliorer la bioactivité du matériau pour des applications en ingénierie tissulaire osseuse. Ensuite, ces matériaux ont été caractérisés d’un point de vue mécanique et physicochimique, avant les études in vitro et in vivo. Pour ces parties, nous avons travaillé avec la fraction vasculaire stromale issue du tissu adipeux, pour se rapprocher d’une potentielle application clinique. La survie, la prolifération et la différenciation des cellules a été évaluée. Enfin, la régénération osseuse a été observée après implantation des scaffolds dans un défaut de calvaria chez le rat
In several clinical cases, dental implant placement can be hindered if the alveolar bone volume is limited. Current surgical methods for alveolar bone regeneration are not fully satisfying, and more reliable methods to regenerate bone is needed. Several biomaterials for bone substitution are available. However, they do not possess all the necessary properties for complete bone regeneration, as they lack osteoinductive and osteogenic potential.Tissue engineering can provide solutions for current issues in bone reconstruction. Tissue engineering strategies combine engineered scaffold with cells and suitable biochemical soluble factors. To produce the scaffold several techniques are available. These last years rapid prototyping technologies gained a huge interest, as they offer reproducibility and important resolution. The current issues remaining to produce living tissue constructs by bone tissue engineering techniques are related to cell seeding inside the macroporous scaffold. The conventional approach involves seeding cells onto a macroporous scaffold and expects cell colonization to form composite tissue constructs. Many limitations have been observed using this approach, due to slow vascularization, limited diffusion of nutrients, low cell density and non-uniform cell distribution.This project aims to address the limitations of scaffold-based bone tissue engineering, by organizing osteoprogenitor cells inside the scaffold. Based on previous results, we choose to use a layer-by-layer approach. This layer-by-layer fabrication method, also called “sandwich” in this work, should favor cell-material interaction and facilitate the maturation of these constructs. Finally, the amount and quality of tissue regenerated should be enhanced.The first part of the project consisted in the fabrication of scaffolds membranes. We have developed a new material, made of medical-grade poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA) mixed with hydroxyapatite nanoparticles (nHA), in the shape of a filament for 3D printing by Fused Deposition Modelling (FDM). PLGA was chosen for its biodegradation rate and its mechanical properties close to human cortical bone. Nanoparticles of HA were included to improve the bioactivity of the material for bone tissue engineering applications. Then, these materials were characterized for mechanical and physico-chemical properties before in vitro and in vivo studies. In these parts, we used the stromal vascular fraction of adipose tissue, to be closer to a potential clinical translation. The survival, proliferation and differentiation of the cells were evaluated. Finally, bone regeneration was observed after implantation of the constructs in a rat bone calvaria defect model

L'hypothèse centrale du travail de recherche a consisté à supposer que la modélisation explicite des intéractions mécanobiologiques pouvait permettre d'aider dans la compréhension des phénomènes de cicatrisation périprothétique. La mécanique des milieux continus associée aux concepts de migrations cellulaires en présence de facteur de croissance a permis de développer un modèle de transport réactif en milieux poreux déformable. Le rôle de l'implant dans le phénomène de cicatrisation a été évalué à partir d'une application de référence. Une approche multi-échelle permettant l'étude locale de l'interaction cellulaire a été proposée. Ont été particulièrement étudiés, le rôle ostéogénique local de la surface d'implant, l'instabilité de l'implant sous stimuli mécanique et l'évaluation du geste clinique. Les résultats obtenus ont été en bon accord avec les problématiques de cicatrisation observées en expérimentation mais également en environnement clinique
We hypothesized that explicitmodeling of mechanobiological interactions could be helpful to make progress in the investigation of periprosthetic healing. The governing equations were based upon the coupling of poroelasticity with cellular migrations in presence of growth factors to obtain a multiphasic model of reactive transport. The role of implant in tissue healing was evaluated using a dedicated experimental implant as reference. A multiscale approach allowed cellular interaction to be locally studied. We focused on local osteogenic role of implant surface, mechanical unstability stimuli and clinical aspects through defects of localization and shape of interface. The results were in good agreement with healing patterns observed in experiments and clinical setting. This confirmed the reliability of our original research approach

Le besoin clinique de nouvelles stratégies pour pallier les limites des techniques actuelles dans le cas de régénération osseuse a permis l’émergence de l’ingénierie tissulaire osseuse. Les stratégies basées sur les techniques d’ingénierie tissulaire semblent être une alternative à l’utilisation de greffes et ainsi de s’affranchir des limites qu’elles présentent. L’approche adoptée dans le cadre de cette thèse consiste en le développement et l’utilisation d’hydrogels comme matériaux d’échafaudage pour le comblement et la régénération de tissus osseux. De nombreuses approches utilisant elles aussi des hydrogels existent, chacune possède ses avantages et limites. Dans ce contexte, nos travaux ont consisté en l’utilisation d’un hydrogel non-polymérique comme matériau de base dans le développement des stratégies. Brièvement, plusieurs types cellulaires sont présents au sein du tissu osseux et vont participer aux processus de formation et de régénération osseuse. L’objectif de nos stratégies a été l’apport de cellules souches exogènes puis leur différenciation en cellules ostéoformatrices, ou le recrutement et la différenciation des cellules de l’hôte en cellules ostéoformatrices. Le gel de GNF a été utilisé comme matrice tridimensionnelle pour ses propriétés d’injectabilité, de gélification en l’absence d’agent de réticulation toxique et son potentiel ostéoinducteur. Ce travail a consisté au développement de stratégies pour l’ingénierie tissulaire osseuse en associant le gel de GNF à une matrice naturelle de collagène cellularisée ou à des molécules bioactives pour promouvoir la régénération de lésions osseuses. Ces travaux ont permis de développer et caractériser des stratégies pertinentes pour la régénération de lésions osseuses basées sur l’utilisation d’hydrogels
New strategies to overcome the clinical limitations of current techniques for bone defect filling and regeneration has led to the involvement of bone tissue engineering. Indeed, strategies based on tissue engineering techniques seem to be an alternative to the use of grafts and thus to defeat their limits. The approach employed in this thesis consists in development and use of hydrogels as scaffold materials for bone defect filling and regeneration. There are many approaches that also use hydrogels, each one with its advantages and limitations. In this context, our work consisted in the use of a non-polymeric hydrogel as basic material in the development of strategies for bone tissue engineering. Briefly, several cell types are present within bone tissue and will participate in the processes of bone formation and regeneration. The objective of our strategies was the contribution of exogenous stem cells and then their differentiation into osteogenic cells or the recruitment and differentiation of the host cells into osteogenic cells within the material. The GNF gel was used as a three-dimensional matrix considering its properties of injectability, gelation in the absence of toxic crosslinking agent and its osteoinductive potential. The goal was to develop strategies for bone tissue engineering by combining the GNF gel with a natural matrix of cellular collagen or bioactive molecules to promote the regeneration of bone lesions. This work allowed to develop and characterize strategies relevant to the regeneration of bone lesions based on the use of hydrogels

Multipotent mesenchymal stromal cells (MSC) were first discovered in bone marrow and can be isolated from “virtually all organs”. They could participate in tissue maintenance and self-renewing process. They are able to adhere to plastic surfaces and acquire a fibroblastic shape when isolated. They are characterized by a particular phenotype and are able to differentiate into several cell types if cultivated in a specific induction medium. These characteristics were defined on MSC in culture and do not represent how they may be in situ.MSC present particular properties. They can secrete growth factors and several cytokines that give them a trophic activity on one hand and the ability to modulate the immune system on the other hand. They are also able to differentiate. These different properties make them an attractive candidate for cell therapy.MSC are already the focus of several pre-clinical and clinical studies. Nevertheless, the results of these studies are difficult to interpret due to limited understanding of their basic biology. MSC are poorly defined in situ and are heterogeneous. Their heterogeneity is dictated by their tissue of origin and cell preparation. To date, there is no standard protocol for MSC isolation and culture. This leads to numerous questions regarding patient safety, and these questions require answers.The first part of the work deals with the methods used to optimize the extraction of MSC and purification from adipose tissue, one of the main sources of autologous MSC with bone marrow. Classical methods require an enzymatic digestion step. The enzyme used and the duration of adipose tissue digestion time can induce cellular alterations and modify cell functions. Moreover, the addition of a xenobiotic increases the risk of contamination and complicates the monitoring of good manufacturing practices (GMP). We propose a method that does not require this enzymatic digestion step while being easier, safer, faster, gentler and less expensive. Compared to the classical enzymatic method, our method yields an equivalent number of MSC from adipose tissue while preserving their properties.The second part of this work focuses on the characterization of the MSC subpopulations from adipose tissue and compares them to those from bone marrow, which are the historical gold standard. The study made it possible to deepen the knowledge of MSC surface markers in situ from these 2 sources. It also evaluated the various properties of the isolated subpopulations thanks to the cell surface markers CD271, SUSD2, MSCA-1, CD44 and CD34. We showed that MSC from bone marrow express MSCA-1, CD271 and SUSD2 markers in situ. We also found that a population clearly positive for the CD34 does exist in situ with different properties compared to those of the unselected populations or the negative counterpart. 2 populations that are negative and positive for CD44 also exist with similar properties.In contrast to bone marrow MSC, only one selection was able to effectively isolate MSC from adipose tissue by a positive selection based on the expression of CD34. We also isolated a CD271+ population but only from lipoaspirate samples and not from abdominoplasty samples. Collectively, our results suggest that MSCA-1 seems to be the best marker through which to isolate MSC from bone marrow and that CD34 is the only marker able to positively isolate cells from adipose tissue. Thus, we show that the MSC from the different sources share similar properties although they have specific characteristics. The choice of the source and of the marker with which to isolate a particular subpopulation is important depending on their intended clinical use.
Les cellules stromales mésenchymateuses multipotentes (CSM) ont été mises en évidence dans la moelle osseuse et peuvent être isolées de « virtuellement tous les organes ». Elles participeraient à la maintenance et au renouvellement des tissus. Une fois isolées, elles sont capables d’adhérer à des surfaces en plastique en prenant une forme fibroblastique. Elles sont caractérisées par un phénotype particulier et peuvent se différencier en divers types cellulaires lorsque cultivées dans un milieu d’induction spécifique. Ces caractéristiques ont été définies sur les CSM en culture et ne reflètent pas forcément ce qui se passe in situ.Les CSM présentent des propriétés particulières. Elles peuvent sécréter des facteurs de croissance ainsi que de nombreuses cytokines qui leur permettent d’une part d’avoir une activité trophique et d’autre part de moduler le système immunitaire. Elles sont aussi capables de se différencier. Ces différentes propriétés les rendent particulièrement attractives pour la thérapie cellulaire.Les CSM font déjà l’objet de nombreuses études pré-cliniques et cliniques dont les résultats sont difficilement interprétables car nous n’avons à l’heure actuelle qu’une compréhension limitée de leur biologie de base. Les CSM sont encore mal définies in situ et sont hétérogènes. Cette hétérogénéité provient de leur différence d’origine et de leur préparation cellulaire :il n’existe aucune standardisation des protocoles d’isolation et de culture. Cette hétérogénéité entraine de nombreuses questions relatives à la sécurité du patient qui doivent être élucidées.La première partie de ce travail cherche à optimiser les méthodes d’extraction et de purification des CSM du tissu adipeux humain, la principale source de CSM autologues avec la moelle osseuse. Les méthodes classiques requièrent une étape de digestion enzymatique dont l’enzyme utilisée et le temps de digestion du tissu adipeux peuvent induire des altérations cellulaires et modifier leurs fonctions. De plus, l’adjonction de xénobiotiques augmente le risque de contamination et complique le suivi des bonnes pratiques de fabrication (BPF). Nous proposons une méthode qui s’affranchit de cette étape de digestion enzymatique tout en étant plus facile, plus sûre, plus rapide, moins chère et moins traumatisante pour les cellules. Elle permet d’obtenir un nombre tout aussi important de CSM du tissu adipeux que la méthode enzymatique classique en préservant leurs propriétés.La deuxième partie de ce travail vise à caractériser les sous populations de CSM du tissu adipeux humain en les comparant à celles de la moelle osseuse, source de référence historique. Cette étude a permis d’approfondir la connaissance des marqueurs de surface des CSM de ces 2 sources in situ, tout en évaluant les différentes propriétés des sous-populations isolées grâce aux marqueurs de surface CD271, SUSD2, MSCA-1, CD44 et CD34. Nous avons montré que les CSM de la moelle osseuse expriment les marqueurs MSCA-1, CD271 et SUSD2 in situ et qu’il existait une sous-population clairement positive pour le CD34 avec des propriétés différentes de celles de la population non sélectionnée ou négative pour ce marqueur. Il existe aussi 2 sous-populations positive et négative pour le CD44 avec des propriétés similaires.Contrairement aux CSM de la moelle osseuse, une seule sélection a permis d’isoler efficacement les CSM du tissu adipeux par une sélection positive sur base de l’expression du CD34. Nous avons pu aussi isoler une population CD271+ mais seulement des prélèvements de lipoaspirations et non des abdominoplasties.Au vu de nos résultats, MSCA-1 semble le meilleur marqueur pour isoler les CSM de la moelle osseuse tandis que le CD34 est le seul marqueur capable d’isoler positivement celles du tissu adipeux. Ainsi, nous montrons que les CSM issues de différentes sources partagent des propriétés similaires avec cependant des caractéristiques propres. Le choix de la source et du marqueur pour isoler une sous-population sont donc importants en fonction de leur utilité clinique envisagée.
Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine)
info:eu-repo/semantics/nonPublished

Etude longitudinale, a partir de donnees recueillies au cours de biopsies (diametre moyen et distribution du diametre des adipocytes), pour etudier la variation individuelle dans le developpement cellulaire des tissus chez le lapin

L'exercice physique se caractérise par ses effets bénéfiques sur l'organisme humain. Au niveau osseux, il se traduit par une action ostéogénique permettant d'améliorer la qualité du tissu osseux. Elle se détermine entre autres par la vascularisation et l'angiogenèse. Le réseau vasculaire assure au tissu osseux les apports en oxygène et en nutriments dont les cellules osseuses ont besoin pour leur bon fonctionnement. L'effet de l'exercice physique sur ces différents paramètres dépend de l'intensité, de la fréquence et du type de l'exercice. L'exercice physique en continu n'a que peu d'effet sur le tissu osseux. L'exercice de type intermittent a des effets bénéfices en termes d'ostéogenèse dans des modalisations chez les rats Wistar. Cependant aucune étude, à notre connaissance, ne s'est intéressée à l'effet de l'exercice combiné sur la qualité de tissu osseux et sa vascularisation. Notre objectif est d'analyser les effets de ces différentes modalités d'exercice continu, intermittent et le combiné sur les paramètres architecturaux et micro-architecturaux du tissu osseux, tout en tenant compte des différents mécanismes de mécano-transduction et de vascularisation. Cette étude montre que l'entraînement combiné tend à favoriser l'angiogenèse du fémur distal. Ce phénomène est associé à un effet ostéogénique au niveau de l'os trabéculaire fémoral. La course intermittente, antérieurement connu dans la littérature par son effet ostéogénique, tend à avoir un léger effet angiogénique. La course continue à intensité modérée semble ne pas affecter l'ensemble des paramètres au niveau de l'os fémoral
Physical exercise is characterized by its beneficial effects on the human body. At the bone level, it results in an osteogenic action that improves the quality of the bone tissue. This is determined by vascularization and angiogenesis, among other things. The vascular network provides the bone tissue with the oxygen and nutrients that the bone cells need for their proper functioning. The effect of exercise on these different parameters depends on the intensity, frequency and type of exercise. Continuous exercise has little effect on bone tissue. Intermittent exercise has beneficial effects in terms of osteogenesis in Wistar rats. However, no study, to our knowledge, has investigated the effect of combined exercise on bone tissue quality and vascularization. Our objective is to analyze the effects of these different modalities of continuous, intermittent and combined exercise on the architectural and micro-architectural parameters of bone tissue, while taking into account the different mechanisms of mechano-transduction and vascularization. This study shows that combined training tends to promote angiogenesis of the distal femur. This phenomenon is associated with an osteogenic effect on the femoral trabecular bone. Intermittent running, previously known in the literature for its osteogenic effect, tends to have a slight angiogenic effect. Continuous running at moderate intensity does not seem to affect all the parameters in the femoral bone

L'ingénierie tissulaire osseuse est un domaine multidisciplinaire qui vise à produire des substituts tissulaires pour la médecine régénératrice. Ce travail visait à produire des substituts osseux structurés tridimensionnels grâce à un système d'impression d'éléments biologiques par laser développé au laboratoire Inserm U577 (Projet LASIT: LASer pour L'Ingénierie Tissulaire). Les étapes de la thèse ont consisté tout d'abord à préparer des matériaux adaptés à l'impression par laser et à les caractériser au niveau physico-chimique et biologique. Il s'agissait d'hydroxyapatite nano-cristalline, de cellules humaines et d'hydrogels (alginate, matrigel). Ensuite des impressions structurées combinant ces matériaux ont été réalisées en 3 dimensions avant d'être implantés in vivo chez la souris. Les résultats ont montré que l'impression par laser d'éléments biologiques est une méthode efficace pour organiser des matériaux tridimensionnels à plusieurs composants pour l'ingénierie tissulaire
Bone Tissue Engineering is a multidisciplinary field which aims to produce artificial tissues for regenerative medicine. The purpose of this work was to produce three-dimensional bone substitute using a laser-assisted bioprinting (LAB) workstation developped in the laboratory INSERM U577 (TEAL Project: Tissue Engineering Assisted by Laser). The first step of the work consisted in the synthesis of specific materials for LAB and in the characterization of their biological and physico-chemical properties. We have prepared a nano-hydroxyapatite bioink, human cells bioinks and hydrogels bioinks. Then, three-dimensional materials have been prepared using LAB and have been implanted in vivo in mice. The results have shown that Laser Assisted Bioprinting is an efficient method fo patterning 3-D materials using biolgical elements

En l'absence de toute maladie osseuse, l'os presente une architecture et une densite bien determinees, qui lui permettent de s'adapter aux sollicitations mecaniques qui lui sont appliquees. L'objectif principal de l'etude etait d'etudier le metabolisme osseux pour deux categories de sujets possedant des specificites biomecaniques propres, chez l'athlete masculin d'une part et d'autre part, au cours d'un suivi longitudinal d'environ 18 mois, chez le patient blesse medullaire. L'absorptiometrie biphotonique a rayon-x a ete utilisee pour mesurer la densite minerale osseuse (dmo), tandis que les marqueurs biochimiques ont permis d'evaluer le remodelage osseux. Enfin, nous avons etudie l'implication de parametres hormonaux sur l'homeostasie calcique. Nos resultats indiquent, que chez l'athlete, la dmo est augmentee au niveau des sites osseux mecaniquement sollicites par des impacts au sol, c'est-a-dire principalement pour des activites mettant en jeu le poids du corps. [. . . ] bien que diminuant avec le temps, la demineralisation etait toujours observee a la fin de l'etude. La perte osseuse affectait specifiquement les territoires sous-lesionnels au niveau des membres inferieurs. La colonne lombaire n'etait pas affectee et aucune redistrisbution de la masse osseuse n'etait observee au niveau du crane et des membres superieurs. Si la diminution des sollicitations mecaniques semble jouer un role fondamental dans la perte osseuse, l'alteration de la secretion des androgenes pourrait etre consideree comme un facteur additionnel au cours de la phase aigue. L'axe somatotrope ne semble pas etre implique dans le processus de demineralisation. Il reste neanmoins a determiner si ces variations endocriniennes sont permanentes.

L’ostéoporose est un enjeu majeur de santé publique, tant par le nombre de personnes touchées que par le coût financier qu’elle engendre. L’arrêt brutal de la production de 17β-estradiol (E2) par les ovaires à la ménopause, se traduit en autre par une forte augmentation de l’incidence de l’ostéoporose, une pathologie marquée par la déminéralisation du tissu osseux à l’origine d’une fragilisation du squelette et d’un risque de fracture important. Bien loin d’être inerte, l’os est un tissu dynamique en remaniement constant. Le remodelage osseux permet à l’os de s’adapter aux contraintes mécaniques qu’il subit mais aussi de réparer le tissu lésé par des micro fractures. Cette fonction est essentiellement assurée par deux types cellulaires, les ostéoclastes responsables de la résorption de la matrice osseuse, et les ostéoblastes chargés de la synthèse de nouveau tissu osseux ; la différenciation et l’activité de ces cellules sont largement modulées par le récepteur des œstrogènes ER, qui relaie les effets de l’E2 dans l’os. Comme les autres membres de la famille des récepteurs nucléaires, ER contient deux fonctions d’activation, AF1 située en N-terminal et AF2 en C-terminal, toutes deux impliquées dans les effets transcriptionnels. De plus, une fraction du ERα est localisée au niveau de la membrane plasmique suite à la palmitolyation de la cysteine 447 chez l’homme (ou 451 chez la souris), modulant ainsi les effets de l’E2 à travers les effets membranaires ou MISS pour « membrane initiated steroid signals ». L’objectif de ce travail de thèse a été dans un premier temps de progresser dans l’étude des fonctions impliquées dans les effets ostéoprotecteurs de l’E2. Ainsi, en combinant des approches d’invalidation géniques des fonctions MISS (ER-C451A) et AF1 (ERAF1°) du ER dans des modèles de souris transgéniques, et des outils pharmacologiques modulant le récepteur, nos résultats ont contribué à mettre en évidence le rôle respectif des sous-fonctions du ER, tant dans les compartiments osseux concernés (i.e. cortical versus trabéculaire), que dans les cibles cellulaires impliquées (ostéoblastes versus ostéoclastes). Dans un deuxième temps, nous avons étendu les travaux réalisés jusqu’alors sur les effets bénéfiques des œstrogènes sur le squelette appendiculaire et les vertèbres aux maxillaires. En effet, du plus en plus d’élément convergent en la faveur d’une association entre l’ostéoporose et une déminéralisation des os maxillaires chez la femme ménopausée. Nous avons ainsi étudié les effets de l’ovariectomie sur des mandibules de souris de façon durée-dépendante, puis les effets de l’E2 sur des souris déficientes pour le récepteur ERα (ERα-/-). D’après nos résultats, l’os mandibulaire semble se comporter de façon similaire au squelette appendiculaire et on peut donc s’attendre chez la femme à ce que les traitements de l’ostéoporose aient aussi un effet favorable sur les maxillaires
The expending incidence and the financial cost of osteoporosis make this pathology a major public-health issue. The brutal disruption of 17β-estradiol (E2) production by the ovaries wich occurs at menopause is responsible for a dramatic increase of osteoporosis incidence. This bone pathology is characterized by a global bone tissue demineralization leading to a weakening of the entire skeleton and a high risk of fracture. Far from being inert, bone is a highly dynamic tissue which undergoes a perpetual remodeling throughout life. Bone remodeling is a unique feature that allows bone to accommodate mechanical strength and repair microfractures. This process is essentially ensured by two cell types, bone-resorbing osteoclasts and bone-forming osteoblasts, the differentiation and the activity of which beinghighly regulated by E2 through estrogen receptor ERα. As the other member of the nuclear receptor family, ERα harbors two independent activating functions, (AF)-1 localized at the N-terminal extremity and AF2 at the C-terminal one of the receptor, both involved in transcriptional effects. Moreover, a fraction of ERα is located at the plasma membrane after cysteine 447 in human (or 451 in mice) palmitoylation. where it activates membrane initiated steroid signals” (MISS) effects. The aim of this thesis has been first to gain insight ER subfunctions involved in estrogen bone sparing effects. Thus, by combining the use of knock-out mice models targeting MISS (ERα –C451A) and AF1 (ERα-AF10) of ER with pharmacological tools, our results have contributed to highlight the role of these ERα sufunctions in different bone compartments (i.e. cortical versus trabecular) and cell types (osteoclasts versus osteoblasts). In addition, we extended previous work regarding beneficial estrogens effects on vertebrae and on the appendicular skeleton to the jaws. Indeed, increasing evidence support an association between osteoporosis and jaw bone demineralization in postmenopausal women. To this aim, impact of bilateral ovariectomy on mice mandibular bone was first evaluated in a time-depend matter. Then, exogenous E2 effect on mice mandibular bone from different knock-out mice models targeting ERα or ER (ERα-/-, ERβ-/-, ERαAF2°, ERαAF1°, ERα-C451A) was evaluated. In addition to their beneficial role to prevent osteoporosis, estrogens also decrease climacteric symptom, atheroma and type 2 diabetes incidences. However, estrogens also favor the promotion of uterus and breast cancer growth. Thus, the major challenge consists in uncoupling some beneficial actions from other deleterious ones, that is, selective ER modulation. Results obtained during this thesis provide a better understanding of the ERα signaling pathways involved in bone sparing effect and thus may contribute to the design of new, bone-specific treatment strategies or menopause treatment with minimal adverse effects

Malgré le développement de biomatériaux de plus en plus nombreux dans le domaine des greffes osseuses et de la préservation alvéolaire, les résultats sont toujours insuffisants pour assurer des reconstructions ad integrum du tissu osseux. Les techniques d’ingénieries osseuses semblent être la piste à privilégier pour améliorer nos techniques chirurgicales. Le silicium poreux est un matériau prometteur pour l’ingénierie tissulaire et notamment pour la régénération osseuse. En effet, son état de surface permet une adhésion cellulaire importante et ses propriétés non toxique et résorbable en fond un matériau porteur de cellules souches intéressant. Les cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC) sont des cellules facilement accessibles dans la cavité buccale. Leurs capacités de prolifération et de différenciation associées au silicium poreux semblent être un atout pour les applications thérapeutique pour la régénération osseuse. Des résultats d’études ultérieures in vitro ont montré leur fort intérêt à une application in vivo. Dans ce travail thèse, nous avons tester l’association silicium poreux et cellules souches de la pulpe dentaire, aux même caractéristiques énoncées dans l’étude de référence in vitro, chez l’animal. Pour cela, le matériau a été produit sous forme de particules de manière a être utilisé comme moyen de comblement osseux, associé ou non à des DPSC. Le modèle de queue de rat a été développé et tester pour diminuer le nombre d’animaux nécessaire à l’étude tout en conservant la puissance statistique des résultats. Les études ont montré la possibilité d’utiliser ce modèle pour la régénération de défauts osseux crées chirurgicalement. De plus, il semblerait que ce modèle puisse également être utile pour les études sur l’ostéointégration de système implantables et sur la régénération osseuse autour de ces implants. Le silicium poreux a ensuite été testé dans ces conditions, associé ou non aux DPSC, en comparaison avec un témoin positif et un témoin négatif. Cette association est apparue comme une piste prometteuse pour la régénération osseuse in vivo
Despite the development of biomaterials in the field of bone grafts and alveolar preservation, the results are no sufficient to made reconstructions ad integrum of bone tissue. Bone engineering techniques seem to be the preferred way to improve our surgical techniques. Porous silicon is a promising material for tissue engineering and especially for bone regeneration. Indeed, its surface allows cell adhesion. And then, it’s a non-toxic and bioresorbable interesting material properties carrying stem cells. Dental pulp stem cells (DPSC) are easily accessible cells in the oral cavity. Their proliferation and differentiation capacities associated with porous silicon appear to be attractive for therapeutic applications in bone regeneration. The results of the in vitro studies have shown the interest for in vivo application. In this thesis, we have tested the combination of porous silicon and dental pulp stem cells in vivo experimentation, using the same characteristics of the in vitro reference study. For this, the material was produced in particle form to be used as bone filling material, associated or not with DPSC. The rat-tail model was developed and tested to reduce the number of animals needed for the study while maintaining the statistical power of the results. Studies have shown the possibility of using this model for bone regeneration defects surgically created. In addition, it seems that this model can also be useful for studies on osseointegration of implantable systems and bone regeneration around these implants. Then, the porous silicon was tested under these conditions, with or without DPSC, in comparison with a positive control and a negative control. This association has emerged as a promising approach for bone regeneration in vivo

Cette thèse porte sur l'hypothèse que des interactions mécaniques locales simples entre un nombre limité de composants puissent régir l'émergence de l'architecture 3D des tissus biologiques. Pour explorer cette possibilité, nous développons deux modèles mathématiques. Le premier, ECMmorpho-3D, vise à reproduire un tissu conjonctif non-spécialisé réduit à la matrice extra-cellulaire, c'est-à-dire à un réseau 3D de fibres interconnectées dynamiquement. Le second, ATmorpho-3D, est obtenu par ajout de cellules sphériques apparaissant et croissant spontanément dans ce réseau de fibres afin de modéliser la morphogenèse du tissu adipeux, un tissu conjonctif spécialisé ayant une grande importance sur le plan biomédical. Pour analyser les données produites par ces deux modèles, nous construisons un outil générique permettant de visualiser en 3D des systèmes composés d'un mélange d'éléments sphériques (cellules) et de bâtonnets (fibres) et de détecter automatiquement dans de tels systèmes des amas d'objets sphériques séparés par des bâtonnets. Cet outil peut également être utilisé pour traiter des images biologiques issues de microscopie en 3D, permettant ainsi une comparaison directe entre les structures in vivo et in silico. L'étude des structures produites par le modèle ECMmorpho-3D via des simulations numériques montre que ce modèle peut générer spontanément différents types d'architectures, que nous identifions et caractérisons grâce à notre outil d'analyse. Une analyse paramétrique approfondie nous permet d'identifier une variable émergente, le nombre de liens par fibre, qui explique et, dans une certaine mesure, prédit le devenir du système modélisé. Une analyse temporelle révèle que l'échelle de temps caractéristique de ce processus d'auto-organisation est fonction de la vitesse de remodelage du réseau et que tous les systèmes suivent la même trajectoire évolutive. Enfin, nous utilisons le modèle ATmorpho-3D pour explorer l'influence de cellules sphériques sur l'organisation d'un réseau de fibres dynamique, en prenant comme référence le modèle ECMmorpho-3D. Nous montrons que le nombre de cellules influence l'alignement local des fibres mais pas l'organisation globale du réseau. Par ailleurs, les cellules s'organisent spontanément en amas entourés de feuillets de fibres, dont les caractéristiques morphologiques sont très proches de celles des structures cellulaires in vivo. De plus, la distribution des différentes morphologies d'amas cellulaires est similaire dans les systèmes in silico et in vivo. Ceci suggère que le modèle est capable de produire des morphologies réalistes non seulement à l'échelle d'un amas mais aussi à l'échelle du système entier, en reproduisant les variabilités structurelles observées dans les échantillons biologiques. Une analyse paramétrique révèle que la proportion de chaque morphologie dans un système in silico est gouvernée principalement par les capacités de remodelage du réseau de fibres, pointant le rôle essentiel des propriétés de la matrice extra-cellulaire dans l'architecture et le fonctionnement du tissu adipeux (ce qui concorde avec plusieurs constatations biologiques ainsi que des résultats antérieurs en 2D). Le fait que ces modèles mathématiques très simples puissent générer des structures réalistes corrobore notre hypothèse selon laquelle l'architecture des tissus biologiques pourrait émerger spontanément à partir d'interactions mécaniques locales entre les composants du tissu, indépendamment des phénomènes biologiques complexes se déroulant dans ce tissu. Ce travail ouvre de nombreuses perspectives quant à notre compréhension des principes fondamentaux gouvernant la manière dont l'architecture d'un tissu émerge durant l'organogenèse, est maintenue au cours de la vie et peut être affectée par diverses pathologies. Les applications potentielles vont de l'ingénierie tissulaire à la possibilité de promouvoir la régénération chez les mammifères adultes
In this thesis, we investigate whether simple local mechanical interactions between a reduced set of components could govern the emergence of the 3D architecture of biological tissues. To explore this hypothesis, we develop two mathematical models. The first one, ECMmorpho-3D, aims at reproducing a non-specialised connective tissue and is reduced to the Extra-Cellular Matrix (ECM) component, that is a 3D dynamically connected fibre network. The second, ATmorpho-3D, is built by adding to this network spherical cells which spontaneously appear and grow in order to mimic the morphogenesis of Adipose Tissue (AT), a specialised connective tissue with major biomedical importance. We then construct a unified analysis framework to visualise, segment and quantitatively characterise the fibrous and cellular structures produced by our two models. It constitutes a generic tool for the 3D visualisation of systems composed of a mixture of spherical (cells) and rod-like (fibres) elements and for the automatic detection of in such systems of clusters of spherical objects separated by rod-like elements. This tool is also applicable to biological 3D microscopy images, enabling a comparison between in vivo and in silico structures. We study the structures produced by the model ECMmorpho-3D by performing numerical simula- tions. We show that this model is able to spontaneously generate different types of architectures, which we identify and characterise using our analysis framework. An in-depth parametric analysis lead us to identify an intermediate emerging variable, the number of crosslinks per fibre, which explains and partly predicts the fate of the modelled system. A temporal analysis reveals that the characteristic time-scale of the organisation process is a function of the network remodelling speed, and that all systems follow the same, unique evolutionary pathway. Finally, we use the model ATmorpho-3D to explore the influence of round cells over the organisation of a fibre network, taking as reference the model ECMmorpho-3D. We show that the number of cells can influence the local alignment of the fibres but not the global organisation of the network. On the other hand, the cells inside the network spontaneously organise into clusters with realistic morphological features very close to those of in vivo structures, surrounded by sheet-like fibre bundles. Moreover, the distribution of the different morphological types of clusters is similar in in silico and in vivo systems, suggesting that the model is able to produce realistic morphologies not only on the scale of one cluster but also on the scale of the whole system, reproducing the structural variability observed in biological samples. A parametric analysis reveals that the proportion in which each morphology is present in an in silico system is governed mainly by the remodelling characteristic of the fibres, pointing to the essential role of the ECM properties in AT architecture and function (in agreement with several biological results and previous 2D findings). The fact that these very simple mathematical models can produce realistic structures supports our hypothesis that biological tissues architecture could emerge spontaneously from local mechanical inter- actions between the tissue components, independently of the complex biological phenomena taking place around them. This opens many perspectives regarding our understanding of the fundamental principles governing how biological tissue architecture emerges during organogenesis, is maintained throughout life and can be affected by various pathological conditions. Potential applications range from tissue engineering to therapeutic treatment inducing regeneration in adult mammals

Le basculement de paradigme apporté par l'ingénierie tissulaire et de la médecine régénérative par rapport à l'approche thérapeutique utilisant les biomatériaux, questionne aujourd'hui les méthodes d'évaluation de ces thérapies avancées en histopathologie. Les outils d'évaluation actuellement disponibles en histopathologie ne sont pas pleinement satisfaisants pour l'évaluation locale de ces thérapies avancées, notamment en matière d'évaluation de leur performance. Nous avons développé une nouvelle méthode quantitative numérique, simple, peu coûteuse fournissant des indicateurs clés pour la caractérisation structurelle et compositionnelle des tissus régénérés. Cet indicateur mesure le taux de croissance tissulaire (TIR) en intégrant deux autres indicateurs, le taux de croissance cellulaire (CIR) et le contenu total en collagène (TCC). Il se traduit par l'équation suivante TIR (%) = CIR (%) + TCC (%). D'autre part, un sous-ensemble d'indicateurs quantitatifs décrivant l'organisation directionnelle du collagène (relation entre structure et propriétés mécaniques des tissus), le ratio collagène I / collagène III (qualité du remodelage) et la propriété anisotropique optique du collagène (indicateur de maturité), a également été produit automatiquement. A l'aide d'un analyseur d'images assisté par ordinateur tous les indicateurs sont extraits uniquement à partir de deux lames sériées colorées soit avec du Feulgen & Rossenbeck (spécificité cellulaire) ou à l'aide de la coloration au rouge picrosirius F3BA (spécifique du collagène). Pour valider cette nouvelle approche, des échafaudages 3D identiques ont été implantés en site intrapéritonéal chez un groupe de rats sains et chez un groupe de rats diabétiques. L'hypothèse émise était que quantitativement la régénération tissulaire serait significativement retardée et défectueuse chez les rats diabétiques par rapport aux rats sains. De plus, un échafaudage 3D chimiquement modifié a été similairement implanté chez un troisième groupe de rats sains avec l'hypothèse qu'une modulation de la croissance tissulaire serait mise en évidence quantitativement par rapport au groupe de rats sains portant l'échafaudage 3D non-modifié. Après 21 jours d'implantation, les deux hypothèses ont été vérifiées, validant cette nouvelle approche d'analyse quantitative computationnelle. Les résultats quantitatifs ont révélé des différences tissulaires fines qui n'ont pas été détectées à l'évaluation semi-quantitative conduite en parallèle. Cette méthode automatisée et supervisée réduit la dépendance à l'opérateur à un minimum et s'est montrée sensible, simple, peu coûteuse et permet de gagner du temps. Elle offre le double avantage d'objectiver les comparaisons thérapeutiques et de comprendre la régénération des tissus fonctionnels localement et dans le temps
The paradigm shift brought about by the expansion of tissue engineering and regenerative medicine away from the use of biomaterials, currently questions the value of histopathologic methods in the evaluation of biological changes. To date, the available tools of evaluation are not fully consistent and satisfactory for these advanced therapies. We have developed a new, simple and inexpensive quantitative digital approach that provides key metrics for structural and compositional characterization of the regenerated tissues. For example, metrics provide the tissue ingrowth rate (TIR) which integrates two separate indicators; the cell ingrowth rate (CIR) and the total collagen content (TCC) as featured in the equation, TIR%=CIR%+TCC%. Moreover a subset of quantitative indicators describing the directional organization of the collagen (relating structure and mechanical function of tissues), the ratio of collagen I to collagen III and the optical anisotropy property of the collagen (maturity indicator) was automatically produced as well. Using an image analyzer, all metrics were extracted from only two serial sections stained with either Feulgen & Rossenbeck (cell specific) or Picrosirius Red F3BA (collagen specific). To validate this new procedure, 3D scaffolds were intraperitoneally implanted in healthy and diabetic rats. It was hypothesized that quantitatively; the healing tissue would be significantly delayed and of poor quality in diabetic rats in comparison to healthy rats. In addition, a chemically modified 3D scaffold was similarly implanted in a third group of healthy rats with the assumption that modulation of the ingrown tissue would be quantitatively present in comparison to the 3D scaffold-healthy group. After 21 days of implantation, both hypotheses were verified by use of this novel computerized approach. When the two methods were run in parallel, the quantitative results revealed fine details and differences not detected by the semi-quantitative assessment, demonstrating the importance of quantitative analysis in the performance evaluation of soft tissue healing. This automated and supervised method reduced operator dependency to a minimum and proved to be simple, sensitive, cost-effective, time-effective, a way of doing objective therapeutic comparisons and a way to elucidate regeneration and the dynamics of a functional tissue

Cette thèse traite de la modélisation du remodelage osseux. Nous présentons tout d'abord un modèle général continu tenant compte de la réponse cellulaire à un stimulus mécanique. Ce modèle est appliqué à des géométries 2D et 3D macroscopiques afin de se rapprocher des problématiques réelles, ainsi que sur des géométries mésoscopiques d'os trabécullaires en 2D. Cependant la complexité du remodelage osseux ne permet pas d'avoir une approche unique de modélisation. Ainsi, dans un second temps, le cas particulier du remodelage osseux orthodontique est étudié. Un nouveau modèle spécifique est développé tenant compte de l'influence du ligament parodontal sur le remodelage osseux, et intégrant l'influence du taux d'oxygène qui contrôle les évolutions de densités cellulaires. Des données expérimentales in vitro sont extraites de la littérature et servent de données d'entrées du modèle développé afin d'obtenir l'évolution de la densité osseuse alentours d'une racine dentaire cylindrique en 3D
This work deals with modelization of bane remodeling. We present first a madel thal accounts for the cellular res panse to a mechanical stimulus in a general case at a continuous scale. This madel is applied to 2D and 3D geometries at macroscopic scale to mimic real cases, as weil as 2D trabecular-type geometries at mesoscopic scale. However, the complexity of bane remodeling does not allow a unique approach. Th us, the thesis work is focused on the particular case of orthodontie bane re mode ling. A new specifie madel is developed accounting for the influence of the periodontal ligament on orthodontie bane remodeling by integrating the oxygen concentration effect controling the evolutions of cellular densities. The cellular experimental data in vitro are extracted from the literature, and serve as input data of the developed madel in arder to ablain the evolution of bane density around the root of a 3D cylindrical tooth

L’ingénierie tissulaire osseuse a pour objectif de repousser les limitesexistantes de la régénération osseuse. Les stratégies proposées consistent àassocier à une matrice tridimensionnelle (3D) des cellules autologues, capables derégénérer en 3D un tissu fonctionnel. Le but de ce travail a été d’étudier l’importancede la communication cellulaire entre les cellules du compartiment stromal et lescellules endothéliales au sein d’une matrice tridimensionnelle poreuse constituée depolysaccharides naturels biodégradables. Nos résultats montrent que l’architecture etla nature de cette matrice permettent de guider la différenciation ostéoblastique descellules humaines mésenchymateuses issues de la moelle osseuse. L’organisationcellulaire en agrégats observée stimule les interactions cellulaires, et plusparticulièrement la formation de jonctions communicantes de type GAP et l’activitédes Connexines 43. Nous avons en également étudié la fonction des Pannexines 1et 3 dans la culture 3D. En conclusion, l’ensemble de nos travaux démontre que lesinteractions cellule-cellule constituent des événements majeurs dans cesmécanismes de régénération tissulaire. Les données cellulaires et expérimentalestémoignent de l’intérêt d’utiliser la totalité de la suspension de moelle osseuse pourfavoriser à la fois l’ostéoformation et la vascularisation du tissu
Bone tissue engineering aims to resolve the existing limitations of boneregeneration methods. One of the proposed strategies consists on the association,within a three-dimensional (3D) matrix, with autologous cells able to regenerate afunctional 3D tissue. The purpose of this study was therefore to investigate theimpact of cellular communication, between cells of the stromal compartment andendothelial cells, within the three-dimensional porous matrix made of biodegradablenatural polysaccharides, focusing on bone repair. Our results show that thearchitecture and the nature of the 3D macroporous matrix promotes the guidance ofmesenchymal stems cells, derived from human bone marrow, towards theosteoblastic lineage. Also, that the organization in aggregates, promoted by the 3Dmatrices, stimulated cell communication, evidenced by the formation of GAPjunctions and activity of Connexins 43. We also focused on the function ofPannexines 1 and 3 for the 3D culture in these matrices of polysaccharides. Inconclusion, this work shows that cell-cell interactions play a major role in order toimprove bone tissue regeneration. Also, cellular and experimental data demonstratesthe advantage of using a total fraction of bone marrow cells to promote both boneformation and vascularization

Manipuler génétiquement ou physiquement des cellules présente un très grand intérêt pour l'ingénierie tissulaire mais soulève encore de nombreux challenges. Les technologies actuelles pour la fabrication de tissus, comme l'assemblage de micro-gels, le remplissage de matrice 3D, le modelage ou l'impression biocompatible sont limités dans leur capacité à organiser spatialement des cellules, souffrent d'un temps de manipulation conséquent, d'effets secondaires potentiellement cytotoxiques et d'une grande complexité de mise en œuvre, empêchant leur utilisation à grande échelle. Nous nous sommes intéressés dans cette thèse à développer des techniques biocompatibles, faciles à implémenter, rapides et facilement transférables dans des laboratoires de biologie. Nous les avons orientées vers deux applications stimulantes car en grand essor et pour lesquelles les techniques actuelles ne permettent pas encore une utilisation grande échelle : la réparation osseuse et l'ingénierie tissulaire neuronale
Genetic or physical cells manipulation aspires to be new challenges in tissue engineering. Current technologies to generate tissues, such as micro-scale hydrogels (microgel) assembly, scaffold seeding, molding or bio-printing suffer from the difficulty to control cells organization, multi-steps time consuming procedures and/or potentially cytotoxic side effects. In this PhD, we aimed at developing cell-friendly and rapid techniques, easily transferable to biological laboratories, for two broadly challenging applications: bone healing and neural tissue engineering, for which the above-mentioned techniques cannot yet provide widely reliable models. In case of a bone critical size defect, external help is often needed for bone healing, and gold-standard for care is bone autograft. Alternatively, the fracture healing process can be stimulated and restored by the implantation at the fracture site of hydrogels embedding growth factors. Both technologies suffer however from side effects such as donor site morbidity or cells over-proliferation in the hydrogel proximity. Moreover, the kinetic of growth factors release cannot be temporally controlled. In this work, we aim at developing an alternative method using ultrasound to spatially and temporally control growth factors release within a biocompatible material: fibrin hydrogels. Towards this goal, we encapsulated, in lipoplexes, plasmids that are under the control of a heat-shock promoter. We then transfected cells, stimulate the production of the targeted protein by heat shock and reported its expression. We also optimized an encapsulation protocol for cells within fibrin gels. This proof of concept demonstrates the feasibility of transfection by lipoplexes with a plasmid under control of heat shock, and pave the way for future developments of in situ transfection of autologous cells, for a tight temporal and spatial control of therapeutic proteins expression using ultrasound-induced hyperthermia

Introduction : les lésions médullaires sont sources de déficits et souvent de handicap majeur. Afin de limiter les conséquences de ces traumatismes la recherche scientifique expérimente des stratégies thérapeutiques visant à réduire la lésion et à régénérer le tissu nerveux. Malheureusement la neuroprotection seule n'a jusqu'à présent pu démontrer de réel bénéfice clinique et actuellement de nombreux espoirs reposent sur la neurorégénération via les thérapies cellulaires. Dans cet esprit nous avons développé et validé un modèle lésionnel chez le rat puis réalisé dans la lésion des greffes de cellules progénitrices embryonnaires humaines afin de promouvoir la régénération du tissu nerveux. Matériel et méthode : nous avons développé chez le rat un modèle de compression médullaire par inflation d'un ballonnet dans l'espace épidural en région thoracique (T9). Les animaux lésés présentent initialement une paraplégie sensitivo-motrice complète suivi d'une faible récupération neurologique spontanée (10%) à J7. Grâce à ce modèle nous avons étudié les stratégies de régénération du tissu par la transplantation in situ dans la moelle lésée de cellules progénitrices. Des greffes de cellules progénitrices neurales embryonnaires ont ainsi été réalisées en région lésée ainsi que dans les métamères sus et sous jacents. Les cellules souches provenant d'embryons humains étaient préalablement transduites in vitro pour exprimer la Neurogénine 2. La Neurogénine 2 est un facteur neurotrophique permettant d'influencer la différenciation cellulaire en neurones.Résultats : le modèle de compression développé est fiable et reproductible. La validation pharmaceutique réalisée par l'administration d'une molécule neuroprotectrice: un antagoniste des récepteurs à NMDA (Gacyclidine), confirme d'une part sa pertinence pour l'évaluation de stratégies thérapeutiques et d'autre part que l'excitotoxicité est un élément majeur des processus physiopathologiques survenant dans la phase secondaire de la lésion. Sur un suivi de 35 jours, les animaux greffés avec des cellules transduites pour exprimer la Neurogénine 2 présentent une récupération motrice significative. Cette récupération est corrélée à la restauration partielle des fibres sérotoninergiques et de la localisation membranaire de leur récepteur en sous lésionnel. Les groupes contrôles et greffés uniquement avec des cellules souches non transduites n'atteignent pas, quant à eux, des scores efficaces et présentent une récupération fonctionnelle inférieure à celle des animaux non greffés. L'identification des cellules transplantées dans le tissu lésé grâce à des différents marquages (EGFP et HuNu) ne permet pas de retrouver ces cellules un mois après la transplantation.Conclusion : ces résultats sont encourageants et sont en faveur d'un bénéfice supporté par la greffe de cellules transduites pour exprimer la Neurogénine 2. Ces cellules sans survivre au delà de un mois apporteraient un support trophique permettant une régénération et une récupération fonctionnelle. La restauration du système sérotoninergique dont on connaît l'implication dans la locomotion expliquerait ces résultats qui méritent cependant une validation sur un modèle gros animal (singe, porc) avant une application clinique
Spinal cord injuries (SCI) lead to deficits and often to major handicaps. To limit consequences of SCI, research focuses on the development of therapeutic strategies that aimed either at the reduction of the lesion and/or nervous tissues regeneration. Unfortunately, up to now the sole neuroprotective strategy did not demonstrate beneficial effects at the clinical level and there is thus more and more hopes based on neuroregenerative strategy in particular based on cell transplantation. In that aim, we have developed and characterized a rat injury model and grafted in the lesion site human embryonic progenitors to promote regeneration of nervous tissues.We have set up a rat model of spinal cord compression using an inflated balloon in the epidural space at the thoracic level (T9). Injured animals presented an initial complete sensory-motor paraplegia followed by a limited spontaneous neurological recovery (10%) one week after traumatism. Using this model, we have studied a regenerative strategy based on in situ progenitor cells transplantation in the injured spinal cord. Grafting of human embryonic progenitors had been done in the lesion site and in metamers located bellow and above the lesion. Human embryonic progenitors had been previously engineered in vitro to produce Neurogenin 2, a neurotrophic factor, that favours cell differentiation into neural lineages. The developed spinal cord compression model is reliable and reproducible. Pharmacological validation using a neuroprotective molecule, an antagonist of NMDA receptors (Gacyclidin), not only confirmed the pertinence of this model for the evaluation of therapeutic strategies but also that excitotoxicity plays a major role in the physiopathological processes involved in the secondary phase after lesion.Thirty five days after transplantation, rats that had been grafted with Neurogenin 2 expressing human embryonic progenitors demonstrated a significant motor recovery. This recovery was associated with a partial restoration of serotonin innervations bellow the lesion site and translocation of 5HT1A receptors to the plasma membrane of motoneurons. Animals transplanted with naïve cells presented a lower functional recovery than injured rat that had not been grafted. Moreover, one month after transplantation, grafted cells were not identifiable in the injured spinal cord. These encouraging results favour a beneficial effect of Neurogenin 2-expressing cells transplantation. One month after grafting, hENPs were undetectable in the injured spinal cord, thus functional recovery appears to be indirect and is likely due to trophic support supply. Partial restoration of serotonin innervations, whose role is well known in the locomotor function, may explain part of the observed functional recovery. These results clearly require to be validated in bigger animal models (monkey, pig) before any translation to the clinic

Manipuler génétiquement ou physiquement des cellules présente un très grand intérêt pour l'ingénierie tissulaire mais soulève encore de nombreux challenges. Les technologies actuelles pour la fabrication de tissus, comme l'assemblage de micro-gels, le remplissage de matrice 3D, le modelage ou l'impression biocompatible sont limités dans leur capacité à organiser spatialement des cellules, souffrent d'un temps de manipulation conséquent, d'effets secondaires potentiellement cytotoxiques et d'une grande complexité de mise en œuvre, empêchant leur utilisation à grande échelle. Nous nous sommes intéressés dans cette thèse à développer des techniques biocompatibles, faciles à implémenter, rapides et facilement transférables dans des laboratoires de biologie. Nous les avons orientées vers deux applications stimulantes car en grand essor et pour lesquelles les techniques actuelles ne permettent pas encore une utilisation grande échelle : la réparation osseuse et l'ingénierie tissulaire neuronale
Genetic or physical cells manipulation aspires to be new challenges in tissue engineering. Current technologies to generate tissues, such as micro-scale hydrogels (microgel) assembly, scaffold seeding, molding or bio-printing suffer from the difficulty to control cells organization, multi-steps time consuming procedures and/or potentially cytotoxic side effects. In this PhD, we aimed at developing cell-friendly and rapid techniques, easily transferable to biological laboratories, for two broadly challenging applications: bone healing and neural tissue engineering, for which the above-mentioned techniques cannot yet provide widely reliable models. In case of a bone critical size defect, external help is often needed for bone healing, and gold-standard for care is bone autograft. Alternatively, the fracture healing process can be stimulated and restored by the implantation at the fracture site of hydrogels embedding growth factors. Both technologies suffer however from side effects such as donor site morbidity or cells over-proliferation in the hydrogel proximity. Moreover, the kinetic of growth factors release cannot be temporally controlled. In this work, we aim at developing an alternative method using ultrasound to spatially and temporally control growth factors release within a biocompatible material: fibrin hydrogels. Towards this goal, we encapsulated, in lipoplexes, plasmids that are under the control of a heat-shock promoter. We then transfected cells, stimulate the production of the targeted protein by heat shock and reported its expression. We also optimized an encapsulation protocol for cells within fibrin gels. This proof of concept demonstrates the feasibility of transfection by lipoplexes with a plasmid under control of heat shock, and pave the way for future developments of in situ transfection of autologous cells, for a tight temporal and spatial control of therapeutic proteins expression using ultrasound-induced hyperthermia

Ce travail a consisté à optimiser la synthèse de phosphates de calcium (CaP) déposés sur tissus de fibres de carbone (TFC) par procédé de sono-électrodéposition afin d’obtenir des revêtements uniformes. Les paramètres électrochimiques clés optimisés sont le type et la durée de polarisation cathodique ainsi que la température de l’électrolyte. Pour un potentiel constant de -1 V à 70 °C, un régime d’électrolyse contrôlé de l’eau conduit à la formation d’un revêtement plaquettaire d’hydroxyapatite déficitaire en calcium (CDA) carbonatée. Les plaquettes sont composées de particules lamellaires (de quelques dizaines à centaines de nm) constituées de CDA carbonatée de structure ordonnée au coeur et de structure désordonnée car hydratée en surface des particules, organisation typique des apatites biomimétiques. Le matériau hybride a été dopé en strontium, engendrant la formation de revêtements où les ions Ca²+ sont substitués par des ions Sr²+ de manière contrôlée, conférant au biomatériau de nouvelles propriétés en vue d’une application en régénération osseuse. Ce travail a aussi démontré la possibilité d’adsorber de façon sélective des principes actifs ciblés (tétracycline, naproxène, aspirine) dans chaque constituant du matériau hybride. Les courbes de désorption ont mis en évidence deux modes de libération selon le principe actif.Une évaluation biologique des différentes matériaux hybrides a été réalisée. L’étude in vitro a porté sur la viabilité et la prolifération d’ostéoblastes humains en surface des biomatériaux hybrides, démontrant leur biocompatibilité. L’intérêt d’un dopage (Sr²+, aspirine et naproxène) sur l’activité des ostéoblastes a été démontré. Une expérience pilote in vivo a été menée, consistant à créer un défaut osseux dans des fémurs de rats et à étudier l’influence du type de biomatériaux TFC/CaP sur les évolutions quantitative et qualitative de la régénération osseuse
Optimization of the synthesis of calcium phosphates (CaP) on carbon fiber cloths (TFC) was performed in using sono-electrodeposition process in order to obtain uniform coatings. The electrochemical potential applied and the electrolyte temperature during the synthesis were determined as being key parameters. For a constant potential of -1 V at 70 ° C, a controlled water electrolysis regime results in the deposit of plate-like calcium-deficient apatite (CDA). This plate-like particles (from a few tens to hundreds of nm in length) consist in an ordered structure of carbonated CDA in their core and in a disordered structure in the hydrated surface, a typical organization of biomimetic apatites. The hybrid material was doped with strontium, resulting in a carbonated CDA coating where the Ca²+ ions are controllably substituted by Sr²+ ions, leading to new properties for a bone regeneration application. This work has also shown the possibility of selectively adsorb targeted active molecules (tetracycline, naproxen, aspirin) in each component of the hybrid material. The desorption curves revealed two modes of release depending on the active molecule.A biological evaluation of the different hybrid materials was carried out. The in vitro study investigated the viability and proliferation of human osteoblasts at the surface of hybrid materials, demonstrating their biocompatibility. The interest of a doping (Sr²+, aspirin and naproxen) on osteoblast activity was demonstrated. An in vivo pilot experiment was conducted, through the creation of a bone defect in rat thighbones to study the influence of TFC/CaP biomaterials on the quantitative and qualitative evolutions of bone regeneration

V. carteri f. nagariensis est un modèle établi pour l'étude des bases génétiques à l'acquisition de la multicellularité et la différenciation cellulaire. Cette algue constitue, une sphère structurée autour et stabilisée par une matrice extracellulaire primitive. Employant sa capacité à supporter l'adhésion cellulaire, j’ai développé une approche modulaire d'ingénierie des tissus mous par empilement compact de colonies de V. carteri. L’algue a démontré une cytocompatibilité, une promotion de l'histogenèse et une réponse non inflammatoire in vitro permettant d'envisager l'utilisation de V. carteri pour l'augmentation des tissus mous et lancer l’étude de sa biocompatibilité in vivo. Elle a présenté des propriétés de direction du devenir cellulaire, amenant les fibroblastes à adopter un phénotype de cellules souches à phosphatase alcaline+ et les cellules souches humaines et les cellules souches embryonnaires murines à se différencier en préadipocytes à adipocytes. Ses capacités de soutien de l'histogenèse et l'adipogenèse ont été confirmées in vivo par augmentation de tissu en sous-cutané sur souris athymiques, soutenant et influençant la régénération tissulaire. V. carteri a inspiré le développement d’autres matériaux alternatifs, d'origine végétale sous la forme d'hydrogel composite à base de cellulose caractérisé de manière approfondie pour l'augmentation des tissus mous. J’ai poursuivi l'approche biomimétique par l’étude de la faisabilité de formation d’un matériau végétal ou incluant l’algue, déclinant sa morphologie de microsphère et son contenu protéiques. Notre conclusion présente V. carteri comme un biomatériau innovant et inspirant pour l'ingénierie tissulaire et la régénération des tissus mous. Sa forme, sa structure et sa composition pourraient jouer un rôle central dans la conception d'une nouvelle génération de biomatériaux hétérogènes bio-inspirés, reflétant la complexité des tissus de l'organisme lors de leur régénération
V. carteri f. nagariensis is an established model for the study of the genetic basis underlying the acquisition of mechanisms of multicellularity and cellular differentiation. This microalga constitutes, in its most simplified form, a sphere built around and stabilised by a form of primitive extracellular matrix. Based on its structure and its ability to support surface cell adhesion most likely induced by the composition of its extracellular matrix, we have developed a modular approach to soft tissue engineering by compact-stacking of V. carteri colonies. V. carteri suspension demonstrated cytocompatibility, histogenesis promoting properties, and no induction of an inflammatory response in vitro, which allowed us to consider the use of V. carteri suspension colonies for soft tissue augmentation and to initiate the study of its in vivo biocompatibility. V. carteri exhibited cellular fate-directing properties,causing fibroblasts to take on an alkaline phosphatase+ stem-cell-like phenotype and both human adipose-derived stem cells and mouse embryonic stem cells to differentiate into preadipocytes to adipocytes. The ability of V. carteri to support histogenesis and adipogenesiswas also observed in vivo by subcutaneous tissue augmentation of athymic mice, highlighting the potential of V. carteri to support or influence tissue regeneration. The potential identified in V. carteri inspired us to develop other alternatives materials including plant-based polymers in the form of a cellulose and polyvinyl alcohol based composite hydrogel that we extensively characterised with the same intent of application as a substitute for soft tissue augmentation. We finally pursued the biomimetic approach by studying the feasibility of developing plant-based and V. carteri-based materials that would display its microsphere morphology and, additionally, its protein content. Our conclusion presents V. carteri as an innovative and inspiring biomaterial for tissue engineering and soft tissue regeneration. Its strategies in terms of shape, structure, and composition can be central in the design of a new generation of bio-inspired heterogeneous biomaterials, recapitulating more appropriately the complexity of the body tissues when guiding their regeneration

Par la sécrétion d’adipokines, le tissu adipeux blanc viscéral présent chez des patients souffrant d’obésité promeut l’installation d’altérations métaboliques telles que l’intolérance au glucose, la résistance à l’insuline et le diabète de type 2. Les complications cardiovasculaires, en particulier l’athérosclérose, sont les principales causes de mortalité chez les patients atteints de diabète de type 2. Il a été démontré que la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux est composée de cellules régénératives dérivées du tissu adipeux (CRTA) et que ces cellules possèdent des caractéristiques des cellules progénitrices stromales (CPS). L’impact de l’intolérance au glucose et du diabète de type 2 sur les adipocytes sont assez bien documentés. Par contre, les conséquences de ces pathologies sur le comportement des CRTA n’ont pas été mesurées d’une façon approfondie. Plus particulièrement, l’impact de ces altérations métaboliques sur le potentiel de différenciation des CRTA en adipocytes et en cellules endothéliales n’a pas été étudié. Ce projet a pour but d’évaluer, dans un modèle murin, l’effet de ces altérations métaboliques sur l’équilibre de la différenciation in vitro des CRTA en adipocytes ou en cellules endothéliales. L’intolérance au glucose et le diabète de type 2 ont été induit chez les souris par la prise de deux diètes riches en acides gras de provenance végétale (DV) ou animale (DA). L’impact de l’origine des acides gras sur la différenciation des CRTA a également été étudié. Pour ce faire, une mise au point de la culture cellulaire des CRTA s’est avérée nécessaire et compte pour une partie de ces travaux de maîtrise. Nos travaux ont démontré en premier lieu, que le DMSO est un agent qui conserve la viabilité et les propriétés progénitrices des CRTA suite à leur congélation. De plus, parmi les matrices testées, le collagène s’est avéré être celle qui conserve le mieux les caractéristiques des progéniteurs et même, qui enrichie la population cellulaire ensemencée en cellules progénitrices. La densité cellulaire des cellules non-adipeuses du tissu adipeux s’avère être significativement plus élevée chez les souris du groupe de la DV comparativement aux souris contrôles. De plus, l’évaluation in vitro de la différenciation adipogénique démontre un potentiel de différenciation plus important pour les CRTA provenant des souris de la DV par rapport au groupe contrôle et à la DA. Cependant, la différenciation en cellules endothéliales est inhibée chez les CRTA de la DV, comparativement à un retard de ce processus pour la DA. Nos travaux suggèrent que le potentiel de différenciation adipogénique et endothéliale des CRTA est affecté par le statut métabolique des souris ainsi que par la nature de la diète. Ces résultats mettent en lumière pour la première fois l’importance d’évaluer le comportement des CRTA en fonction du statut métabolique du donneur, un paramètre pouvant avoir un impact majeur dans l’utilisation des CRTA autologues en thérapie cellulaire pour la réparation de tissus vasculaires chez des patients diabétiques.
The secretion of a large number of bioactive mediators by adipose tissue in abdominal obesity promotes metabolic diseases such as glucose intolerance, insulin resistance and type 2 diabetes. Cardiovascular complications, in particular atherosclerosis, are the leading causes of mortality in patients with type 2 diabetes. It has been shown that the stromal vascular fraction of adipose tissue comprised adipose-derived regenerative cells (ADRC) and that these cells possess progenitor cells characteristics. Effects of glucose intolerance and type 2 diabetes on adipocytes are well documented. However, consequences of these pathologies on ADRC behaviors are not well understood. Particularly, the impact of these metabolic alterations on the adipogenic and endothelial differentiation potential of ADRC has not been investigated. Aim of this project was to evaluate, in a murine model, the effect of these metabolic alterations on the balance of the in vitro ADRC differentiation into adipocytes or endothelial cells. Glucose intolerance and type 2 diabetes were induced in mice by the intake of two high-fat diets enriched in vegetal (VD) or animal (AD) fat. The impact of the fat origin on the ADRC differentiation was then evaluated. To do this, the development of cellular culture conditions of ADRC was necessary and an important part of this work. Our results suggest that DMSO is an efficient cryoprotective agent that conserves the viability and progenitor properties of ADRC following their freezing. Moreover, among tested scaffolds for the culture of ADRC, collagen is the best matrix to maintain progenitor characteristics and this matrix enriched the cellular population in progenitor cells. The cellular density of non-adipose cells fraction in the adipose tissue was significantly more elevated for VD mice than for the control group. The in vitro evaluation of adipogenic differentiation demonstrated an increase in the differentiation potential for ADRC from VD group compared to AD and control groups. In addition, the endothelial differentiation was abrogated for ADRC from VD group, compared to a delayed one for AD. These results suggest that the adipogenic and endothelial differentiation potential of ADRC and, consequently, the balance between emerging mature cells, are affected by the metabolic status of mice together with the nature of fatty acids. These results highlight, for the first time, the importance to evaluate the ADRC behavior in function to the metabolic status of donor, a parameter that could have an important impact in the use of autologous ADRC in cell-based therapy for the repair of injured vascular tissues in diabetic patients.

Le prédiabète et le diabète de type 2 (DT2) affectent approximativement 9 millions de canadiens, soit près de 30% de la population. Le DT2 est caractérisé par une résistance à l’insuline (RI) qui ne peut être compensée par une sécrétion d’insuline augmentée. La dysfonction du tissu adipeux blanc (TAB) est centrale à ce phénomène et est caractérisée par de l’inflammation et un flux augmenté de lipides vers les tissus périphériques, dont on sait qu’ils favorisent le développement de RI et une hypersécrétion d’apoB-lipoprotéines (apoB) par le foie menant à une élévation de l’apoB plasmatique. En parallèle, les études épidémiologiques montrent que l’apoB plasmatique prédit le développement du DT2 de 3 à 10 ans avant l’apparition de la maladie, indépendamment de facteurs de risque classiques. Dans cette thèse, nous avons formulé l’hypothèse que l’augmentation de la sécrétion d’apoB-lipoprotéines secondaire à un TAB dysfonctionnel contribue à aggraver cette même dysfonction. En ce sens, les apoB-lipoprotéines et le TAB seraient le centre d’un cercle vicieux menant au développement de facteurs de risque cardiométaboliques. Au courant de cette investigation, nous avons combiné des expériences in vitro, ainsi que des analyses post-hoc sur des données in vivo et ex vivo au sein d’une population d’hommes et de femmes post-ménopausées recrutés à l’Institut de recherches cliniques de Montréal pour deux études métaboliques entre 2006 et 2019. En circulation, 90% de apoB-lipoprotéines sont des LDL. Le nombre d’apoB-lipoprotéines en circulation se mesure par l’apoB plasmatique, qui est associé au développement du TAB dysfonctionnel chez l’humain via divers mécanismes. Parmi ceux-ci, l’enrichissement postprandial des lipoprotéines riches en triglycérides (TG) par l’apolipoprotéine C-I (apoC-I) sécrétées par le TAB a été suggéré comme un facteur contributoire. Dans un premier manuscrit, nous montrons que les sujets (N=39) avec un TAB dysfonctionnel sécrètent de plus grandes quantités d’apoC-I, ce qui est associé spécifiquement à une clairance postprandiale réduite des chylomicrons. Cette dysfonction semble due à une diminution de l’hydrolyse des TG secondaire à une inhibition de la lipase lipoprotéique (LPL) des adipocytes, ce qui constitue un nouveau mécanisme par lequel le TAB contribue à l’augmentation de l’apoB plasmatique. La proprotéine convertase subtilisin-kexin type 9 (PCSK9) est une enzyme circulante qui cible les récepteurs aux apoB-lipoprotéines comme le récepteur aux LDL (LDLR) et le CD36. Une PCSK9 circulante faible combinée à un haut apoB plasmatique, donc un ratio apoB-sur-PCSK9 élevé, est fortement associée au TAB dysfonctionnel et à la RI, suggérant qu’une augmentation de l’internalisation des apoB-lipoprotéines par voie de récepteurs joue un rôle dans ces pathologies. En parallèle, les apoB-lipoprotéines, principalement les LDL natifs et oxydés, activent l’inflammasome NLRP3 (Nucleotide-binding domain and Leucine-rich repeat Receptor, containing a Pyrin domain 3), le récepteur intracellulaire responsable de la sécrétion d’interleukine 1 bêta (IL-1), dont on sait qu’elle joue un rôle majeur dans le développement de l’inflammation liée au DT2. Dans un deuxième manuscrit, nous montrons que le ratio apoB-sur-PCSK9 plasmatique est un index, dans les états à jeun et postprandial, de l’expression des récepteurs aux apoB-lipoprotéines LDLR et CD36 en surface du TAB chez une population en surpoids ou obèse (N=31). Ce même ratio est aussi indicateur de la régulation à jeun et postprandial de l’expression de l’inflammasome NLRP3 et de l’infiltration de macrophages au sein du TAB. Finalement, les études épidémiologiques récentes suggèrent que le risque de DT2 est aussi augmenté chez les sujets avec un LDL cholestérol (LDL-C) faible causé par des variants génétiques perte-de-fonction dans le gène de la PCSK9 ou suite à une thérapie hypocholestérolémiante. Dans un troisième manuscrit, nous montrons que, chez les sujets avec LDL-C faible (<3.5mM, N=28), une PCSK9 plasmatique plus basse identifie les sujets avec une expression augmentée de LDLR et CD36 en surface de leur TAB. Malgré le LDL-C faible, les sujets avec une PCSK9 faible montraient une dysfonction du TAB et à un indice de disposition diminué et une sécrétion augmentée d’IL-1, suggérant une progression vers le DT2. Dans une exploration mécanistique, une exposition chronique des adipocytes humains SGBS aux LDL natifs induit une différenciation anormale, marquée par une diminution de leur fonction. Bien que ce phénomène soit indépendant de l’inflammasome NLRP3, qui n’est pas exprimé chez ces adipocytes, les LDL natifs induisent une augmentation du ratio de sécrétion d’IL-1 actif relativement à la pro-IL-1 inactive qui suggère une activation du système NLRP3 chez les macrophages humains THP-1. En conclusion, ces données suggèrent que le TAB dysfonctionnel contribue en partie via une sécrétion d’apoC-I à la clairance réduite des lipoprotéines et, donc, à l’hyperapoB et au risque cardiométabolique. En retour, une internalisation plus grande d’apoB-lipoprotéines par voie des récepteurs semble associée au développement d’un TAB dysfonctionnel et aux facteurs de risque cardiométaboliques associés. Au sein du TAB, au niveau cellulaire, ceci pourrait être dû à un effet concomitant des LDL natifs, qui induiraient une baisse de différenciation des préadipocytes menant à leur dysfonction ainsi qu’une activation de l’inflammasome NLRP3 chez les macrophages.
Prediabetes and type 2 diabetes (T2D) affect approximately 9 million Canadians, which represents close to 30% of the population. T2D is characterized by insulin resistance (IR) that cannot be compensated by increased insulin secretion. White adipose tissue (WAT) dysfunction is at the root of this pathology and is characterized by increased lipid flux to peripheral tissues causing IR and hypersecretion of apoB-lipoproteins (apoB) by the liver, contributing to increased plasma apoB. In line, epidemiological studies show that plasma apoB is an independent predictor of T2D development 3 to 10 years before onset. In this thesis, we formulated the hypothesis that increased secretion of apoB-lipoprotein secondary to WAT dysfunction promotes further development of this dysfunction in a feed-forward cycle that contributes to increased metabolic risk. To investigate this, we have combined in vitro experiments as well as post hoc analyses of in vivo and ex vivo data from a cohort of men and postmenopausal women recruited from two metabolic studies conducted at Institut de recherches cliniques de Montréal between 2006 and 2019. In circulation, more than 90% of apoB-lipoproteins are in the form of LDL. The number of apoB-lipoproteins (measured by plasma apoB), is associated to the development of WAT dysfunction in humans via different mechanisms. Postprandial enrichment of triglyceride-rich lipoproteins (TRL) by WAT-secreted apoC-I has been proposed as one of them. In a first manuscript, we show that subjects (N=39) with dysfunctional WAT secrete greater amount of apoC-I, which is associated specifically to delayed postprandial chylomicrons clearance in a mechanism that appears to be dependent on apoC-I-mediated inhibition of adipocyte lipoprotein lipase. This constitutes a new mechanism linking adipose tissue dysfunction to increased plasma apoB. Proprotein convertase subtilisin-kexin type 9 (PCSK9) is a circulatory enzyme that targets apoB-lipoprotein receptors, such as the LDLR and CD36, for degradation. Low circulating PCSK9 relative to high plasma apoB, expressed as a higher apoB-to-PCSK9 ratio, is strongly associated to WAT dysfunction and IR, suggesting that increased receptor-mediated uptake of apoB-lipoproteins plays an important role in these pathologies. In parallel, apoB-lipoproteins, mostly native and oxydized LDL, activate the NLRP3 inflammasome (Nucleotide-binding domain and Leucine-rich repeat Receptor, containing a Pyrin domain 3). The NLRP3 inflammasome is an intracellular receptor responsible for interleukin-1 beta (IL-1) secretion, which is known to be implicated in the pathogenesis of T2D. In a second manuscript, we demonstrate in overweight and obese subjects (N=31) that the apoB-to-PCSK9 is indeed an index of WAT surface-expression of LDLR and CD36 both at fasting and in the postprandial state. Similarly, the apoB-to-PCSK9 ratio is associated with chronic NLRP3 inflammasome priming at fasting and with postprandial macrophage infiltration and concomitant NLRP3 upregulation within WAT. Finally, recent epidemiological studies suggest an increased risk for T2D in subjects with low plasma LDL cholesterol (LDL-C) secondary to loss-of-function genetic variants in PCSK9, or secondary to cholesterol-lowering therapies. In a third manuscript, we show that in subjects with low LDL-C (<3.5mM, N=28), lower plasma PCSK9 identifies subjects with higher WAT LDLR and CD36 surface-expression. Despite having lower LDL-C, subjects with lower plasma PCSK9 show dysfunction WAT and decreased disposition index. Mechanistically, human SGBS adipocytes chronically exposed to native LDL show impaired differentiation and concomitant dysfunction. While this phenomenon cannot be described by NLRP3 inflammasome activation, since it is not expressed in these adipocytes, native human LDL increase the ratio of secreted active Il-1 relative to inactive pro-IL-1 suggesting activation of the NLRP3 inflammasome in human THP-1 macrophages. In conclusion, these observations suggest that dysfunctional WAT promotes delayed postprandial lipoprotein clearance via increased apoC-I secretion, thus promoting hyperapoB and increased cardiometabolic risk. In turn, upregulated receptor-mediated uptake of apoB-lipoproteins appears to be connected to the development of WAT dysfunction and associated cardiometabolic risk factors. At the cellular level within WAT, this could be secondary to a concomitant effect of LDL on preadipocytes inducing their reduced differentiation and function and on macrophage inducing activation of the NLRP3 inflammasome.

L'obésité est une épidémie mondiale qui augmente le risque de développer un diabète de type 2 ainsi que ses complications. Chez les individus obèses, le tissu adipeux sécrète de grandes quantités d'hormones et de cytokines qui affectent négativement le métabolisme du glucose et des lipides, ce qui provoque l'inflammation et la résistance à l'insuline. L'obésité augmente également l'activité du système rénine-angiotensine (RAS) localement au niveau de différents tissus et de façon systémique dans la circulation. L’angiotensinogène est convertie en angiotensine I par la rénine, ainsi que par la prorénine uniquement quand la prorénine est liée au récepteur de la rénine et prorénine [(P)RR] 1 . Ceci est la voie angiotensine-dépendante (Ang-D) du (P)RR. La liaison de la rénine et de la prorénine avec le (P)RR active également une voie angiotensine-indépendante (Ang-ND), ce qui produit une signalisation intracellulaire comportant la mitogen activated protein kinase (MAPK), la extracellular regulatory kinase 1/2 (ERK1/2), la promyelocytic leukemia zinc finger protein (PLZF) et le tumor necrosis factor alpha (TNF-a). Ceux-ci peuvent provoquer la croissance et la prolifération cellulaire, l'apoptose et la fibrose et pourraient donc être reliés aux dommages tissulaires et aux complications associées à l'obésité 1, 2. Plusieurs effets bénéfiques d’un blocage pharmacologique du (P)RR ont été rapportés tels la prévention du développement d'une fibrose cardiaque et rénale ainsi que la prévention de la néphropathie et de la rétinopathie diabétique. Cependant, les effets du (P)RR dans le tissu adipeux ont été peu étudiés. Par conséquent, notre objectif était d'étudier le rôle du (P)RR dans le développement de l'obésité et de la résistance à l'insuline par : 1) l'administration de HRP (un peptide bloquant l’effet du (P)RR) chez un modèle de souris obèse par l’administration d’une diète riche en gras (HFD), et 2) l’évaluation de souris ayant une délétion (KO) du gène (P)RR spécifiquement dans le tissu adipeux, qui a été généré dans notre laboratoire par la technologie Cre-LoxP. L'expression du gène et de la protéine du (P)RR dans les tissus adipeux était augmentée chez les souris nourries avec une HFD indépendamment du traitement au HRP. Le traitement par le HRP a réduit le poids corporel et la masse adipeuse chez les souris nourries avec une HFD alors qu’une tendance pouvait être observée chez les souris sur diète normale (ND). De façon similaire, les souris (P)RR KO spécifiquement dans le tissu adipeux avaient une réduction du poids corporel et de la masse adipeuse, même sur ND, ce qui suggère fortement l'implication du (P)RR dans le tissu adipeux dans le développement de l'obésité. Le phénotype des souris KO incluait une augmentation de l'activité horizontale uniquement dans leur période active, ce qui pourrait contribuer à augmenter leur métabolisme énergétique et ainsi réduire leur poids corporel et leur masse adipeuse. De plus, les souris KO homozygotes mâles avaient un métabolisme de base plus élevé car nous avons observé une augmentation de la consommation d'oxygène et de la production de dioxyde de carbone pendant leur période active et de sommeil. Cette augmentation du métabolisme pourrait résulter, en partie, d'une augmentation de la thermogenèse comme en témoigne l’expression accrue du gène de brunissement, PRDM16, dans le tissu adipeux péri-rénale de souris mâles KO. Conformément à cela, des résultats récents provenant de notre laboratoire ont également démontré que le HRP pouvait induire du brunissement au niveau du tissu adipeux sous-cutanée 3. Chez les souris traitées avec le HRP, bien que la glycémie eût été similaire aux souris recevant le placebo, l'insuline plasmatique et le rapport insuline/glucose était plus faible indépendamment de la diète. De façon similaire, les souris (P)RR KO avaient une insulinémie et un taux de peptide C plus faibles par rapport aux souris contrôles, sans aucune différence dans les courbes de la glycémie au cours d'un test de tolérance au glucose par voie orale. Les niveaux d'insuline dans l’état basal et stimulé étaient significativement plus faibles chez les souris KO, sans aucune modification du contenu pancréatique en insuline et du ratio insuline/peptide-C, ceci indique donc qu’il n’y a pas eu d’altération du niveau du métabolisme pancréatique de l'insuline. L’augmentation de l'adiponectine plasmatique chez les souris KO pourrait, entre autres, contribuer à une meilleure sensibilité à l'insuline observée. De plus, dans les groupes traités aux HRP, nous avons observé une amélioration du profil d'expression des gènes des transporteurs de glucose GLUT1 et GLUT4, du TNF-alpha, MCP-1, F4/80 et de la leptine dans le tissu adipeux ce qui pourrait contribuer à la meilleure sensibilité à l'insuline. Comme une meilleure sensibilité à l'insuline a été observée chez la souris suite au blocage pharmacologique et à la suppression génétique du (P)RR, ceci suggère que le (P)RR est impliqué dans la régulation de l’homéostasie du glucose. De plus, un taux circulant réduit des triglycérides (TG) a été observé chez les souris traitées au HRP, alors que des niveaux inférieurs de TG ont été trouvés seulement dans les muscles squelettiques chez les souris KO. Ces modifications du métabolisme des lipides et des taux circulants d'adiponectine résultent probablement d'un tissu adipeux plus sain tel que révélé par nos analyses histologiques démontrant une réduction de la taille des adipocytes chez les souris KO et traitées au HRP 3. Nos résultats démontrent que le (P)RR, en particulier dans le tissu adipeux, est impliqué dans la régulation du poids corporel et de l'homéostasie du glucose probablement par la modulation de la morphologie et de la fonction des adipocytes. Le développement d'une nouvelle stratégie clinique axée sur le blocage du (P)RR pourrait aider à traiter l'obésité et ses pathologies associées telles la résistance à l'insuline et le diabète de type 2.
Obesity is a worldwide epidemic and increases the risk of developing type 2 diabetes and its complications. In obesity, adipose tissue secretes large amounts of hormones and cytokines that negatively regulate glucose and lipid metabolism, causing inflammation and insulin resistance. Obesity also increases the activity of both local (tissue-specific) and circulating renin-angiotensin system (RAS). Angiotensinogen is converted to angiotensin I by renin, whereas prorenin may only do so upon binding to the (pro)renin receptor [(P)RR] 1. This is thus the angiotensin-dependent (Ang-D) pathway of the (P)RR. The binding of renin and prorenin with the (P)RR also activates an angiotensin-independent pathway (Ang-ND), leading to intracellular signaling involving, for instance, the mitogen activated protein kinase (MAPK), the extracellular regulatory kinase ½ (Erk1/2), the promyelocytic leukemia zinc finger protein (PLZF) and tumor necrosis factor alpha (TNF-a) 1, 2. These can produce cell growth and proliferation, apoptosis and fibrosis 1, 2, and as such may contribute to tissue damage and complications associated with obesity. The beneficial effects of pharmacological blockade of the (P)RR include prevention of the development of cardiac and renal fibrosis, as well as of diabetes-associated nephropathy and retinopathy. However, effects of the (P)RR in adipose tissue have been poorly investigated. Hence, our objective was to study the role of the (P)RR in the development of obesity and insulin resistance by: 1) administering HRP (a (P)RR blocker peptide) to mice fed a high-fat diet (HFD), and 2) in knock-out (KO) mice with adipose tissue-specific (P)RR gene deletion, which were generated in our laboratory by cre-loxp technology. (P)RR gene and protein expression in adipose tissue were increased in mice fed a HFD independently of HRP treatment. HRP treatment also reduced mice body weight and fat masses in HFD-fed mice while they only tended to be lower in mice on normal diet (ND). Similarly, the adipose tissue specific (P)RR KO mice had reduced body weight and fat masses, even on ND, and as such confirmed the involvement of adipose tissue (P)RR in the development of obesity. The KO phenotype included increased horizontal activity, only in the dark cycle (active period), which would increase energy expenditure and could contribute to their lower body weight and fat mass. Male hemizygous KO mice had higher basal metabolic rate as they had increased oxygen consumption and carbon dioxide production during both their active and inactive period. This increased basal metabolism may result in part from an increase in thermogenesis as increased “beiging” gene expression, PRDM16, was observed in peri-renal fat of male KO mice. In line with this, recent results from our laboratory have also shown that HRP may induce “beiging” in subcutaneous fat 3. In mice treated with the HRP, although glycemia was similar to placebo treated mice, plasma insulin and the insulin to glucose ratio were lower compared to untreated groups on both HFD or ND. Similarly, (P)RR KO mice had lower plasma insulin and C-peptide levels compared to controls, without any differences in the glycemia curves during an oral glucose tolerance test. Given that the basal and stimulated insulin levels were significantly lower in KO mice, without any changes in total pancreatic insulin content and with similar insulin to C-peptide ratio, this suggests that pancreatic insulin metabolism was not modified. The increased circulating adiponectin levels observed in KO mice may have contributed to the better insulin sensitivity present in the mice. In the HRP treated mice, we observed an improved gene expression profile of glucose transporters GLUT1 and GLUT4, TNF-alpha, MCP-1, F4/80 and leptin in adipose tissue, which may also contribute to the increased insulin sensitivity. Given that better insulin sensitivity was observed in mice with both (P)RR pharmacological blockade and genetic suppression, this suggests that the (P)RR is involved in the regulation of glucose homeostasis. In addition, lower circulating triglycerides (TG) levels were found in mice treated with HRP, whereas lower TG levels were observed only in skeletal muscles in (P)RR KO mice. Put altogether, the lower lipid content and higher plasma adiponectin levels likely result from a healthier fat tissue as revealed by histological analysis which showed a reduction in adipocytes size in KO mice and was recently revealed in HRP treated HFD fed mice 3. Our results demonstrate that the (P)RR, particularly in adipose tissue, is implicated in the regulation of body weight and glucose homeostasis via modulation of adipocytes morphology and function. The development of a new clinical strategy focused on blockade of the (P)RR specifically in adipose tissue could help to treat obesity and its associated pathologies such as insulin resistance and type 2 diabetes.

L'obésité est une maladie associée à de nombreuses complications comme le diabète de type 2, l'hypertension et le cancer. De nos jours, les modifications au mode de vie, tels l’alimentation et le niveau d’activité physique, ne sont pas suffisants pour combattre les effets délétères de l'obésité. La pharmacothérapie est un traitement alternatif bien que les effets bénéfiques soient temporaires et ne peuvent être maintenus à long terme. Le besoin pour un traitement bénéfique à long terme sans effet secondaire n'est pas comblé. Mieux connu pour son rôle dans la régulation de la pression artérielle, le système rénine-angiotensine favorise l'entreposage du gras. Le récepteur à la prorénine et à la rénine est une composante du système rénine-angiotensine. Ainsi, le récepteur qui amplifie l'activation de celui-ci pourrait avoir un rôle clé dans le gain de masse grasse. Le but de ce projet de thèse est d'évaluer le rôle du récepteur à la prorénine et à la rénine dans le développement de l'obésité et de ses complications chez la souris et ce, en utilisant une combinaison de diète riche en gras et en hydrates de carbone et du handle region peptide, un bloqueur du récepteur à la prorénine à la rénine. Après une période de 10 semaines, nous avons constaté que l'expression et la protéine du récepteur à la prorénine et à la rénine augmentent spécifiquement dans le tissu adipeux sous-cutané et viscéral des souris obèses. Lorsqu'administré en concomitance avec une diète riche en gras et en hydrates de carbone, le handle region peptide favorise chez la souris des diminutions des gains des masses corporelles et adipeuses viscérales. Une diminution de l'expression de l'enzyme catalysant la dernière étape de la lipogenèse pourrait être responsable de la réduction de gras viscéral. Chez les mêmes animaux, l'expression de plusieurs adipokines est également diminuée dans le tissu adipeux suggérant une réduction de la résistance à l'insuline, de l'inflammation et de l'infiltration des macrophages localement dans le gras sous-cutané et viscéral. L'augmentation de l'expression d’un marqueur de l'adipogenèse dans le tissu adipeux sous-cutané pourrait suggérer un plus grand nombre d'adipocytes. Cela pourrait tamponner l'excès d'acides gras libres circulants puisque nous avons constaté une diminution de ce paramètre chez les souris ayant une diète riche en gras et en hydrates de carbone et traitées avec le peptide. Nous avons émis l'hypothèse qu'un cycle futile pourrait être activé dans le gras sous-cutané car nous avons observé une augmentation de l'expression de plusieurs enzymes impliquées dans la lipogenèse et dans la lipolyse. Le ''brunissement'' du tissu adipeux est la présence de cellules similaires aux adipocytes bruns dans le tissu adipeux qui sont caractérisés par une grande densité mitochondriale et la thermogenèse. L'augmentation de l'expression des marqueurs de ''brunissement'' et de biogenèse de mitochondrie dans le gras sous-cutané suggère que le ''brunissement'' pourrait également être activé dans ce dépôt de gras. La sensibilité à l'insuline chez ces animaux pourrait être améliorée telle que suggérée en circulation par la diminution de l'insuline, par le glucose qui change peu, par l'augmentation du ratio glucose sur insuline ainsi que par un changement potentiel dans la corrélation entre le poids corporel de la souris et les niveaux d’adiponectine circulante. Nos travaux suggèrent que le handle region peptide pourrait augmenter la capacité du tissu adipeux sous-cutané à métaboliser les lipides circulants avec l'activation potentielle d'un cycle futile et le ''brunissement''. Cela préviendrait le dépôt ectopique de lipides vers les compartiments viscéraux comme le suggère la réduction de masse adipeuse viscérale chez les souris ayant une diète riche en gras et en hydrates de carbone et traitées avec le peptide. Utilisant un modèle de souris, cette étude démontre le potentiel pharmacologique du handle region peptide comme un nouveau traitement pour prévenir l'obésité.
Obesity is a disease associated with multiple complications such as type 2 diabetes, hypertension and cancer. Nowadays, lifestyle modifications, such as eating habits and physical activity, are simply not enough to counter the deleterious effects of obesity. Pharmacotherapy is used as an alternative treatment although beneficial effects are temporary and cannot be maintained in the long run. The current medical need for a treatment with long term beneficial outcomes devoid of side effects is unmet. Best known for its role in blood pressure regulation, the renin-angiotensin system has recently been attributed a role in favouring fat storage. The prorenin and renin receptor is a component of renin-angiotensin system that amplifies its activation. Thus, the prorenin and renin receptor might play a key role in gaining fat mass. The aim of this thesis is to investigate the role of the prorenin and renin receptor in the development of obesity and its complications in mice using a combination of high-fat and high carbohydrate diet and the handle region peptide, a blocker of the prorenin and renin receptor. After a period of 10 weeks, we have found that the prorenin and renin receptor is increased specifically in subcutaneous and visceral adipose tissue of obese mice. When administered simultaneously with a high-fat and high-carbohydrate diet, the handle region peptide reduced body weight gain in mice with similar decrease in visceral fat mass. Decreased expression of the enzyme catalyzing the last step of lipogenesis could be responsible for the reduction in visceral fat mass. In the same animals, the expressions of several adipokines were also decreased in adipose tissue suggesting reduced insulin resistance, inflammation and macrophage infiltration locally in subcutaneous and visceral fat. Increased expression of a marker of adipogenesis in subcutaneous adipose tissue could suggest higher adipocyte number. This would buffer excess circulating free fatty acid since we have noticed a reduction in the latter in mice on a high-fat and high-carbohydrate diet and treated with the peptide. We hypothesized that a futile cycle could be activated in subcutaneous fat because we have observed increased expression of several enzymes implicated in lipogenesis and lipolysis. « Beiging » is defined as the presence of brown-like adipocytes in adipose tissue which is characterized by high mitochondrial density and thermogenesis. Increased expression of markers for « beiging » and mitochondrial biogenesis in subcutaneous fat suggests that « beiging » could also be activated in this fat pad. Insulin sensitivity in these animals could be improved as suggested in the circulation by decreased insulin, similar glucose, increased glucose on insulin ratio as well as a possible change in the correlation between mouse body weight and circulating adiponectin levels. Our work suggests that the handle region peptide could increase the capacity of subcutaneous adipose tissue to metabolize circulating lipids with a potential activation of a futile cycle and « beiging ». This would prevent ectopic deposition of fat in visceral compartments as suggested by the reduction in visceral fat mass in mice on high-fat and high-carbohydrate diet and treated with the peptide. Using a mice model, this study demonstrates the pharmacological potential of the handle region peptide as a novel treatment to prevent obesity.

Le cycle glycérolipides/acides gras libres (GL/FFA) est une voie métabolique clé qui relie le métabolisme du glucose et des acides gras et il est composé de deux processus métaboliques appelés lipogenèse et lipolyse. Le cycle GL/FFA, en particulier la lipolyse des triglycérides, génère diverses molécules de signalisation pour réguler la sécrétion d'insuline dans les cellules bêta pancréatiques et la thermogenèse non-frissonnante dans les adipocytes. Actuellement, les lipides provenant spécifiquement de la lipolyse impliqués dans ce processus sont mal connus. L’hydrolyse des triglycérides dans les cellules β est réalisée par les actions successives de la triglycéride lipase adipocytaire pour produire le diacylglycérol, ensuite par la lipase hormono-sensible pour produire le monoacylglycérol (MAG) et enfin par la MAG lipase (MAGL) qui relâche du glycerol et des acides gras. Dans les cellules bêta, la MAGL classique est très peu exprimée et cette étude a démontré que l’hydrolyse de MAG dans les cellules β est principalement réalisée par l'α/β-Hydrolase Domain-6 (ABHD6) nouvellement identifiée. L’inhibition d’ABHD6 par son inhibiteur spécifique WWL70, conduit à une accumulation des 1-MAG à longues chaines saturées à l'intérieur des cellules, accompagnée d’une augmentation de la sécrétion d'insuline stimulée par le glucose (GSIS). Baisser les niveaux de MAG en surexprimant ABHD6 dans la lignée cellulaire bêta INS832/13 réduit la GSIS, tandis qu’une augmentation des niveaux de MAG par le « knockdown » d’ABHD6 améliore la GSIS. L'exposition aiguë des monoacylglycérols exogènes stimule la sécrétion d'insuline de manière dose-dépendante et restaure la GSIS supprimée par un inhibiteur de lipases appelé orlistat. En outre, les souris avec une inactivation du gène ABHD6 dans tous les tissus (ABHD6-KO) et celles avec une inactivation du gène ABHD6 spécifiquement dans la cellule β présentent une GSIS stimulée, et leurs îlots montrent une augmentation de la production de monoacylglycérol et de la sécrétion d'insuline en réponse au glucose. L’inhibition d’ABHD6 chez les souris diabétiques (modèle induit par de faibles doses de streptozotocine) restaure la GSIS et améliore la tolérance au glucose. De plus, les résultats montrent que les MAGs non seulement améliorent la GSIS, mais potentialisent également la sécrétion d’insuline induite par les acides gras libres ainsi que la sécrétion d’insuline induite par divers agents et hormones, sans altération de l'oxydation et l'utilisation du glucose ainsi que l'oxydation des acides gras. Nous avons démontré que le MAG se lie à la protéine d’amorçage des vésicules appelée Munc13-1 et l’active, induisant ainsi l’exocytose de l'insuline. Sur la base de ces observations, nous proposons que le 1-MAG à chaines saturées agit comme facteur de couplage métabolique pour réguler la sécrétion d'insuline et que ABHD6 est un modulateur négatif de la sécrétion d'insuline. En plus de son rôle dans les cellules bêta, ABHD6 est également fortement exprimé dans les adipocytes et son niveau est augmenté avec l'obésité. Les souris dépourvues globalement d’ABHD6 et nourris avec une diète riche en gras (HFD) montrent une faible diminution de la prise alimentaire, une diminution du gain de poids corporel et de la glycémie à jeun et une amélioration de la tolérance au glucose et de la sensibilité à l'insuline et ont une activité locomotrice accrue. En outre, les souris ABHD6-KO affichent une augmentation de la dépense énergétique et de la thermogenèse induite par le froid. En conformité avec ceci, ces souris présentent des niveaux élevés d’UCP1 dans les adipocytes blancs et bruns, indiquant le brunissement des adipocytes blancs. Le phénotype de brunissement est reproduit dans les souris soit en les traitant de manière chronique avec WWL70 (inhibiteur d’ABHD6) ou des oligonucléotides anti-sense ciblant l’ABHD6. Les tissus adipeux blanc et brun isolés de souris ABHD6-KO montrent des niveaux très élevés de 1-MAG, mais pas de 2-MAG. L'augmentation des niveaux de MAG soit par administration exogène in vitro de 1-MAG ou par inhibition ou délétion génétique d’ABHD6 provoque le brunissement des adipocytes blancs. Une autre évidence indique que les 1-MAGs sont capables de transactiver PPARα et PPARγ et que l'effet de brunissement induit par WWL70 ou le MAG exogène est aboli par les antagonistes de PPARα et PPARγ. L’administration in vivo de l’antagoniste de PPARα GW6471 à des souris ABHD6-KO inverse partiellement les effets causés par l’inactivation du gène ABHD6 sur le gain de poids corporel, et abolit l’augmentation de la thermogenèse, le brunissement du tissu adipeux blanc et l'oxydation des acides gras dans le tissu adipeux brun. L’ensemble de ces observations indique que ABHD6 régule non seulement l’homéostasie de l'insuline et du glucose, mais aussi l'homéostasie énergétique et la fonction des tissus adipeux. Ainsi, 1-MAG agit non seulement comme un facteur de couplage métabolique pour réguler la sécrétion d'insuline en activant Munc13-1 dans les cellules bêta, mais régule aussi le brunissement des adipocytes blancs et améliore la fonction de la graisse brune par l'activation de PPARα et PPARγ. Ces résultats indiquent que ABHD6 est une cible prometteuse pour le développement de thérapies contre l'obésité, le diabète de type 2 et le syndrome métabolique.
The glycerolipid/ free fatty acid (GL/FFA) cycle is a key metabolic pathway that links glucose and fatty acid metabolism and it consists of lipogenesis and lipolysis. GL/FFA cycling, especially in its lipolysis arm, generates various lipid signaling molecules to regulate insulin secretion in pancreatic ß-cells and non-shivering thermogenesis in adipocytes. Currently, the lipolysis-derived lipid signals involved in this process are uncertain. Triglyceride hydrolysis in mammalian cells is accomplished by the sequential actions of adipose triglyceride lipase to produce diacylglycerol, by hormone sensitive lipase to produce monoacylglycerol (MAG) and by MAG lipase (MAGL) that releases free fatty acid and glycerol. Our work shows that in pancreatic ß-cell, the classical MAGL is poorly expressed and that MAG hydrolysis is mainly conducted by the newly identified α/β-Hydrolase Domain-6 (ABHD6). Inhibition of ABHD6 by its specific inhibitor WWL70, leads to long-chain saturated 1-MAG accumulation inside the cells, accompanied by enhanced glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). Decreasing the MAG levels by overexpression of ABHD6 in the ß-cell line INS832/13 reduces GSIS, while increasing MAG levels by ABHD6 knockdown enhances GSIS. Acute exposure of INS832/13 cells to various MAG species dose-dependently stimulates insulin secretion and restores GSIS suppressed by the pan-lipase inhibitor orlistat. Also, various biochemical and pharmacological experiments show that saturated 1-MAG levels species rather than unsaturated or 2-MAG species best correlate with insulin secretion. Furthermore, whole-body and β-cell-specific ABHD6-KO mice exhibit enhanced GSIS in vivo, and their isolated islets show elevated MAG production and GSIS. Inhibition of ABHD6 in low dose streptozotocin diabetic mice restores GSIS and improves glucose tolerance. Results further show that ABHD6-accessible MAGs not only enhance GSIS, but also potentiate fatty acid and non-fuel-induced insulin secretion without alteration in glucose oxidation and utilization as well as fatty acid oxidation. We have identified that MAG binds and activates the vesicle priming protein Munc13-1, thereby inducing insulin exocytosis. Based on all these observations, we propose that lipolysis-derived saturated 1-MAG acts as a metabolic coupling factor to regulate insulin secretion and ABHD6 is a negative modulator of insulin secretion. Besides its role in ß-cells, ABHD6 is also highly expressed in adipocytes and its level is increased with obesity. Mice globally lacking ABHD6 on high fat diet (HFD) show modestly reduced food intake, decreased body weight gain, insulinemia and fasting glycemia and improved glucose tolerance and insulin sensitivity and enhanced locomotor activity. In addition, ABHD6-KO mice display increased energy expenditure and cold-induced thermogenesis. In accordance with this, these mice show elevated UCP1 level in white and brown adipocytes, indicating browning of white adipocytes. The browning phenotype is reproduced in the mice either chronically treated with the ABHD6 inhibitor WWL70 or an antisense oligonucleotides targeting ABHD6. White and brown adipose tissues isolated from whole body ABHD6 KO mice show greatly elevated levels of 1-MAG, but not 2-MAG. Increasing MAG levels by either exogenous administration of 1-MAG or ABHD6 inhibition or genetic deletion induces browning of white adipocytes in a cell-autonomous manner. Further evidence indicates that 1-MAGs can transactivate PPARα and PPARγ and the browning effect induced by WWL70 or exogenous MAG is abolished by PPARα and PPARγ antagonists. In vivo administration of the PPARα antagonist GW6471 to ABHD6 KO mice partially reversed the ABHD6-KO effects on body weight gain, and abolishes the enhanced thermogenesis, white adipose browning and fatty acid oxidation in brown adipose tissue. All these observations indicate that ABHD6 regulates not only insulin and glucose homeostasis but also energy homeostasis and adipose tissue function. Thus, ABHD6-accessible 1-MAG not only acts as a metabolic coupling factor to regulate fuel and non-fuel induced insulin secretion by activating Munc13-1 in beta cells, but also regulates glucose, insulin and energy homeostasis. The latter effects are mediated at least in part via browning of white adipocytes and enhanced brown fat function through the activation of PPARα and PPARγ. Collectively these findings suggest that ABHD6 is a promising target for developing therapeutics against obesity, type 2 diabetes and metabolic syndrome.