Дисертації з теми "Tertiary lymphoid structure"

Une tumeur est un environnement complexe comprenant à la fois des composants immunitaires et non immunitaires. Dans notre équipe, nous avons démontré précédemment le rôle des structures lymphoïdes tertiaires (TLS) dans les cancers du poumon, dans la génération de réponses anti-tumorales protectrices. Cependant, les tumeurs peuvent se développer en utilisant des mécanismes d’immunosuppression tels que l’infiltration des cellules T régulatrices (Tregs) dans le microenvironnement tumoral. Cette thèse a étudié le mécanisme présumé des Tregs dans la régulation des réponses immunitaires dans le cancer du poumon. Cette étude démontre la présence de Tregs FoxP3+ dans les TLS aussi bien que dans les autres régions tumorales. Les Tregs infiltrant la tumeur (Ti-Tregs) présentent un phénotype de lymphocytes T à mémoire centrale, et effecteur mémoire. Ces cellules expriment un vaste répertoire de molécules d’activation et de « chekpoints » immunologiques. L’analyse de l’expression des gènes et des résultats de cytométrie en flux a montré que les Tregs expriment des marqueurs de co-stimulation et de co-inhibition. Une forte densité de Ti-Tregs dans les TLS ou les autres régions tumorales, est associée à une faible survie des patients. Lorsqu’on combine ce résultat avec la densité de DC matures ou lymphocytes B associés aux TLS ou CD8+, un groupe de patients présentant de faible densités de ces cellules mais de fortes densités en Tregs a le pronostic le moins favorable avec le plus grand risque de décès. Les Tregs créent un environnement immunosuppresseur dans les cancers pulmonaires. Ce mécanisme pourrait être une explication de la réduction observée de la survie de ces patients
Tumor comprise complex niche of the immune and non-immune components. The complex interaction between the tumor cells with its environment turns into either eradication or the growth and metastasis of the tumors. We have previously demonstrated the role of TLS (tertiary lymphoid structures) in lung tumors, in protective anti-tumor responses. Despite of this, tumors do develop via exploiting the regulatory mechanisms, particularly includes, infiltration of the Tregs (regulatory T cells). The aim of thesis was to study the putative role of Tregs in regulating the immune responses in lung cancer. This study strongly demonstrates the presence of FoxP3+ Tregs in the TLS as well as non-TLS areas of the lung tumors. Tregs mainly exhibit central and effector memory phenotype expressing vast repertoire of the activation and immune checkpoint molecules. The gene expression and flow cytometry data showed that Tregs express the co-stimulatory and inhibitory markers which are known to be involved in the their activation and immune suppression. The high density of the Ti-Tregs either in TLS or in nonTLS areas is associated with the poor survival of the NSCLC patients. When combined with the density of TLS mature DC or B cells or CD8+ T cells, a group of patients with the low DC, B cells and CD8+ T cells but high Tregs densities, had the worst clinical outcome. This allowed, to identify the NSCLC patients with highest risk of death. Thus, it be concluded that the Tregs create the immunosuppressive environment in the lung tumors by acting in both TLS and nonTLS areas of the tumors and thus could be possible reason for the reduced survival of the lung cancer patients

Le microenvironnement tumoral est un acteur majeur du contrôle immunitaire du développement tumoral. Ce contrôle commence à distance des cellules tumorales, dans le stroma tumoral, au sein de structures appelées structures lymphoïdes tertiaires (TLS), composées d'une zone de lymphocytes B (LB) où se trouvent principalement des lymphocytes B (LB) adjacents à une zone T. Nos précédents résultats ont mis en évidence que la zone B des TLS peut être un site de différenciation des LB en LB mémoires et plasmocytes (PC), sécrétant principalement des IgA et IgG chez les patients atteints de cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC). Nous avons donc émis l'hypothèse que ces PC à IgA et IgG peuvent être impliqués dans la génération de réponses immunitaires anti-tumorales. Nous avons démontré que de fortes densités de PC à IgA et IgG sont associées à une meilleure survie chez les patients NSCLC. Une co-localisation entre les PC à IgA et IgG et les LT CD8+stromales a été observée dans le stroma tumoral, suggérant un dialogue entre ces deux types cellulaires pouvant influencer la survie des patients. En effet, nous montrons que la combinaison de fortes densités en PC et LT CD8+ stromales détermine un groupe de patients de meilleur pronostic. L’ensemble de ces résultats fournit de nouvelles connaissances quant au rôle des plasmocytes intra-tumoraux dans le microenvironnement tumoral des patients NSCLC
The tumor microenvironment plays a major role in the immune control of the tumor development. This control starts at a distance from the tumor cells, in the tumor stroma, within structures called tertiary lymphoid structures (TLS), composed of a B-cell zone where B lymphocytes (LB) are mainly found, and a T-cell area that is adjacent to the B-cell zone. Our previous results in non-small cell lung cancer patients (NSCLC) showed that the TLS-associated B-cell zone could be a site of B cell differentiation into memory B cells and IgA and IgG secreting plasma cells (PC). We therefore hypothesized that these IgA and IgG PC could be involved in the generation of the anti-tumor immune response. We demonstrated that high densities of IgA and IgG PC are associated with increased survival of NSCLC patients. A co-localization between PC and stromal CD8+ T cells was observed in the tumor stroma, strongly suggesting the presence of a crosstalk between these immune cell types which positively influences patient survival. Furthermore, we reported that the combination of high density of PC and stromal CD8+ T cell determines the group of patients with the lowest risk of death. Altogether, this study gives new insights in the role of tumor-infiltrating plasma cells in the tumor microenvironment of NSCLC patients

Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) sont des agrégats organisés de cellules immunitaires qui se développent dans les tissus non-lymphoïdes à la suite d'une inflammation chronique. Les TLS matures, dont l'organisation est proche de celle d'un ganglion, sont associées à un bon pronostic dans les cancers à tumeurs solides et servent de prédicteur efficace de la réponse des patients traités par immunothérapie. Notre objectif a été d'étudier la virothérapie oncolytique comme stratégie pour induire des TLS dans le microenvironnement tumoral (TME) afin d'intensifier les réponses antitumorales.Les virus oncolytiques (OV) ont la capacité d'infecter et de se répliquer spécifiquement dans les cellules cancéreuses, induisant leur lyse directe ainsi que leur destruction par le système immunitaire via la mort immunogène. Nous supposons que la modulation du microenvironnement tumoral suite à l'infection par des OV, ainsi que la production locale de chimiokines exprimées par ces derniers, pourrait favoriser la néogenèse de TLS et amplifier les réponses antitumorales.Mes travaux ont alors consisté à générer et caractériser des virus de la vaccine oncolytiques (oVV) recombinants, armés avec trois chimiokines, CCL20, CCL21 et CXCL13, que nous supposons impliquées dans la néogenèse de TLS.J'ai observé que l'expression des chimiokines par les oVV recombinants n'affectait pas leurs propriétés oncolytiques et que les chimiokines étaient bien fonctionnelles in vitro. Bien que la réplication des oVV fût réduite dans les modèles murins syngéniques, j'ai détecté les chimiokines murines dans les tumeurs infectées avec les oVV armés ainsi que la formation d'agrégats immunitaires dans les modèles de tumeur chaude. Néanmoins, aucune amélioration thérapeutique n'a été observée avec l'oVV armé avec les chimiokines par rapport au virus non armé.J'ai alors étudié la capacité de TLS induites par un oVV, à établir des réponses antitumorales, dans le modèle orthotopique TC-1 luc qualifié de chaud. Dans ce modèle, j'ai observé que l'administration intranasale de l'oVV induisait plus de TLS que l'administration d'un virus de la vaccine non oncolytique, le MVA. De plus, j'ai observé que les TLS induites par l'infection virale par le MVA n'étaient pas associées à une réponse antitumorale alors que j'ai détecté à long terme la présence de lymphocytes T spécifiques antitumoraux et un contrôle de la tumeur pulmonaire chez une souris infectée par l'oVV. Ainsi, nous supposons que les propriétés oncolytiques des oVV peuvent induire des TLS efficaces contre les tumeurs.Pour favoriser la réplication des oVV et l'expression des chimiokines, ainsi que pour faciliter l'observation des réponses antitumorales tardives avec des cinétiques de croissance tumorale plus lentes, nous avons évalué l'efficacité d'une souche recombinante armée avec les trois chimiokines humaines (oVV-3hCK) dans un modèle de souris humanisées HIS-NXG greffées avec des tumeurs humaines.Dans ce modèle, les oVV (oVV-3hCK et oVV non armé) ont été particulièrement efficaces, ce qui n'a pas permis d'observer des différences d'efficacité thérapeutique entre les deux souches. Néanmoins, une augmentation significative de l'infiltration en cellules immunitaires CXCR5+ et en lymphocytes T et B naïfs a été observée dans les tumeurs infectées avec l'oVV-3hCK, confirmant l'activité chimiotactique des chimiokines et laissant supposer la présence de TLS dans les tumeurs.En conclusion, mes travaux de thèse ont confirmé que les trois chimiokines CCL20, CCL21 et CXCL13 exprimées par un oVV sont capables d'induire des agrégats immunitaires (ou TLS) dans le TME, et ont démontré la pertinence de cette stratégie pour améliorer la réponse antitumorale à long terme
Tertiary lymphoid structures (TLS) are organized aggregates of immune cells that develop in non-lymphoid tissues as a result of chronic inflammation. Mature TLS, which resemble lymph nodes in their organization, are associated with favorable prognoses in solid tumor cancers and serve as effective predictors of patient responses to immunotherapy. Our objective was to investigate oncolytic virotherapy as a strategy to induce TLS in the tumor microenvironment (TME) to enhance anti-tumor responses.Oncolytic viruses (OV) have the ability to specifically infect and replicate within cancer cells, inducing their direct lysis as well as their destruction by the immune system through immunogenic cell death. We hypothesize that the modulation of the TME following OV infection, along with the local production of chemokines expressed by these viruses, could promote TLS neogenesis and amplify anti-tumor responses.My work involved generating and characterizing recombinant oncolytic vaccinia viruses (oVV) armed with three chemokines, CCL20, CCL21, and CXCL13, which we hypothesize are involved in TLS neogenesis.I observed that the expression of chemokines by the recombinant oVVs did not affect their oncolytic properties and that the chemokines were functional in vitro. Although the replication of the oVVs was reduced in syngeneic murine models, I detected the murine chemokines in tumors infected with the armed oVVs and observed the formation of immune aggregates in hot tumor models. However, no therapeutic improvement was observed with the chemokine-armed oVV compared to the non-armed virus.I then studied the ability of TLS induced by an oVV to establish anti-tumor responses in the hot orthotopic TC-1 luc model. In this model, I observed that intranasal administration of the oVV induced more TLS than administration of a non-oncolytic vaccinia virus, MVA. Furthermore, I observed that TLS induced by MVA infection were not associated with an anti-tumor response, whereas I detected long-term presence of tumor-specific T lymphocytes and tumor control in the lungs of a mouse infected with oVV. Thus, we hypothesize that the oncolytic properties of oVVs can induce TLS that are effective against tumors.To promote oVV replication and chemokine expression, as well as to facilitate the observation of late anti-tumor responses with slower tumor growth kinetics, we evaluated the efficacy of a recombinant strain armed with the three human chemokines (oVV-3hCK) in a HIS-NXG humanized mouse model grafted with human tumors.In this model, the oVVs (oVV-3hCK and non-armed oVV) were particularly effective, making it difficult to observe differences in therapeutic efficacy between the two strains. Nonetheless, a significant increase in the infiltration of CXCR5+ immune cells and naïve T and B lymphocytes was observed in tumors infected with oVV-3hCK, confirming the chemotactic activity of the chemokines and suggesting the presence of TLS in the tumors.In conclusion, my thesis work confirmed that the three chemokines CCL20, CCL21, and CXCL13 expressed by an oVV are capable of inducing immune aggregates (or TLS) in the TME, and demonstrated the relevance of this strategy to improve long-term anti-tumor responses

Le cancer colorectal est devenu un défi majeur pour les systèmes de santé en raison de sa prévalence croissante et de son impact sur la qualité de vie des patients. L'analyse anatomopathologique des prélèvements de cancer colorectal, désormais enrichie de données de pathologie moléculaire, est cruciale pour orienter le traitement des patients. Malgré les avancées dans les outils pronostiques et les traitements, les interactions entre les cellules tumorales et immunitaires du microenvironnement tumoral ne sont souvent pas évaluées de manière exhaustive en pratique diagnostique quotidienne. Cette thèse aborde l'importance de l’étude du microenvironnement tumoral dans le cancer colorectal et notamment la nécessité de mieux comprendre le rôle de structures y résidant, les structures lymphoïdes tertiaires (TLS). Les nouvelles techniques telles que la pathologie digitale et l'immunomarquage multiplexe offrent des perspectives pour une analyse plus approfondie et accessible de ce microenvironnement. Ce travail de thèse s’est donc intéressé à caractériser les TLS par imagerie multiplexe, développer des stratégies d'analyse pathomique et explorer leurs corrélations cliniques pour proposer un score utilisable en routine clinique. Ce travail vise à fournir des critères diagnostiques et pronostiques robustes, implémentables dans les services numérisés de pathologie pour guider les décisions thérapeutiques dans le cancer colorectal, contribuant ainsi à une meilleure prise en charge des patients
Colorectal cancer has become a major challenge for healthcare systems today due to its increasing prevalence and its impact on patients' quality of life. The anatomopathological analysis of colorectal cancer specimens, now enriched with molecular pathology data, is crucial for guiding patient treatment. However, despite advances in prognostic tools and treatments, interactions between tumor and immune cells in the tumor microenvironment are often not thoroughly evaluated in daily diagnostic practice. This thesis addresses the importance of studying the tumor microenvironment in colorectal cancer, particularly the need to better understand the role of residing structures, tertiary lymphoid structures (TLS). New techniques such as digital pathology and multiplex immunostaining offer perspectives for a more in-depth and accessible analysis of this microenvironment. Therefore, this thesis focused on characterizing TLS through multiplex imaging, developing pathomic analysis strategies, and exploring their clinical correlations to propose a clinically applicable score. This work aims to provide robust diagnostic and prognostic criteria, implementable in digitized pathology services to guide therapeutic decisions in colorectal cancer, thereby contributing to better patient management

The accumulation of leukocytes in non-lymphoid tissues and their structural organization into tertiary lymphoid structures (TLS), a process known as ectopic lymphoid neogenesis (ELN), is observed in response to chronic inflammation and in the target organ of several autoimmune diseases. TLS strongly resemble secondary lymphoid organs with specialised high-endothelial venules (HEV), segregated B/T cell areas and presence of follicular dendritic cells (FDC) networks promoting in situ affinity maturation of the antibody response. TLS have been associated with a growing number of autoimmune conditions and usually their presence is prognostic for undesirable disease progression. In Sjögren’s syndrome (SS), an autoimmune disease affecting the salivary and lachrymal glands leading to exocrine dysfunction, TLS develop in the salivary glands (SG) of around one-third of the patients. The immunobiology of the SG and the pathogenesis of SS have been poorly clarified and to date a robust and reproducible inducible animal model of SS and TLS in the SG is still absent. In my PhD, I developed and validated a novel inducible model of ELN in murine SG that also reproduces several features of SS. The retrograde administration of a replication-deficient adenovirus (AdV) in the SGs of wild-type C57Bl/6 mice was able to induce within three weeks fully formed TLS that displayed B/T cell segregation, FDC networks, HEVs and were positive for markers of germinal centres. Moreover, the AdV-treated mice showed a significant reduction of salivary flow and in 75% of the cases development of anti-nuclear antibodies.

Breast cancer (BC) is the most common cancer in women. It is a highly heterogeneous disease in terms of histology, therapeutic response and patient outcomes. Early and accurate detection of breast cancer is crucial as the patient prognosis varies greatly depending on the diagnosis of the disease. Patient outcomes have been linked to the presence of tumor infiltrating lymphocytes (TIL) in solid tumors. In human BC, higher TIL infiltration is associated with a better prognosis and also predicts relevant responses to pre-operative chemotherapy. TIL are primarily composed of T cells, albeit around 20% of BC patients (pts) show significant B cell infiltration, and can organize in tertiary lymphoid structures (TLS) located in the peritumoral stroma, which are associated with survival in HER2+ and triple negative BC patients. Further, these studies revealed that CD4+ follicular helper T (Tfh) cells producing CXCL13 were specifically associated with peritumoral TLS. CXCL13 is an important B cell chemoattractant whose function is to recruit B cells to the germinal center (GC) in secondary lymphoid organs and TLS, where they can mature and differentiate into memory or antibody-producing B cells. The principal objective of this thesis project was to investigate the role of CXCL13 and Tfh cells play in the development and/or maintenance of GC-like structures in BC-associated TLS.Further understanding of the factors that promote TLS formation in vivo could provide important insight for treatment decisions in BC. CXCL13 expression was originally identified as an important signal associated with TLS that was predictive for patient outcomes. We investigated factors capable of inducing CXCL13 expression in CD4+ T cells isolated from peripheral blood, using flow cytometry analysis. Treatment with TGFβ1 alone, or together with several cytokines (IL12, IL21, and in particular IL2 blockade), increased CXCL13 expression in activated CD4+ T cells. Similar to our characterization of Tfh TIL in fresh tumor tissues, these CXCL13-producing CD4+ T cells were CXCR5 negative and expressed the Tfh markers PD-1 and ICOS. The positive correlation, in treated cells and fresh TIL, between CXCL13-producing CD4+ T cells and FoxP3-expressing regulatory CD4+ T cells, and the diminished chemokine production upon depletion of the latter population, suggest a possible positive relationship between regulatory CD4+ T cells and CXCL13-producing CD4+ T cells.We then derived a GC-associated B cell gene signature for integration in our previously published Tfh cell gene signature, including CXCL13 gene. The combined GC gene signature was tested for its ability to sensitively detect BC-associated TLS using a qRT-PCR-based assay on two different cohorts, a primary BC set (n=83) and a retrospective series (n=52) of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) BC tissues. These data revealed a correlation between gene signature expression and the extent of TLS scored by trained pathologists on dual-immunohistochemistry stained (CD3+CD20 for T and B cells, respectively) FFPE tissue sections. In addition, the high GC signature expression predicted better overall and disease-free survival of BC pts in our retrospective BC cohort, as well as in public microarray data.This thesis research has demonstrated that CXCL13-producing CD4+ T cells lacking CXCR5 differentiate and exert their function in IL-2-limited but TGF-β1-rich conditions. Furthermore, we developed a GC-associated gene signature able to detect TLS in BC and predict BC pts better survival.
Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine)
info:eu-repo/semantics/nonPublished

Das kolorektale Karzinom (KRK) zählt zu den immunogenen Tumoren und zeichnet sich durch eine ausgeprägte Infiltration von verschiedenen Immunzell-Populationen aus. Dabei scheinen insbesondere CD8+ T-Lymphozyten und CD4+ T-Helfer-Zellen Typ 1 das Tumorwachstum zu beeinflussen und spielen somit eine zunehmende Rolle als prognostische Marker. Dementsprechend ergaben sich mehrere Hinweise, dass eine hohe Frequenz dieser beiden T-Zell-Populationen in KRK-Geweben mit einer erhöhten Überlebensrate assoziiert ist. Diese neuen Erkenntnisse könnten zukünftig in die Klassifikation des KRKs einfließen und therapeutische Entscheidungen beeinflussen. Im Gegensatz zu Tumor-infiltrierenden T-Zellen ist jedoch über die Frequenz und die Eigenschaften von nativen humanen dendritischen Zellen (DCs) in Kolonkarzinom-Geweben und deren mögliche Rolle in der immunologischen Abwehr von Tumoren nur sehr wenig bekannt. Als professionelle antigenpräsentierende Zellen spielen DCs eine Schlüsselrolle bei der Induktion und Aufrechterhaltung einer Tumor-gerichteten Immunantwort und können dadurch die Tumorentwicklung wesentlich beeinflussen. Daher wurden im Rahmen dieser Dissertation erstmalig Frequenz, Verteilung, Reifestatus und Zytokinexpression von 6-sulfo LacNAc+ (slan) DCs in Kolonkarzinom-Geweben sowie in korrespondierenden tumorfreien Kolon-Geweben untersucht. SlanDCs stellen eine große Subpopulation von humanen Blut-DCs dar, die nach Aktivierung hohe Konzentrationen von verschiedenen proinflammatorischen Zytokinen sezernieren. Darüber hinaus sind sie effizient in der Lage, die antitumoralen Eigenschaften von CD8+ T-Lymphozyten und CD4+ T-Helfer-Zellen sowie von Natürlichen Killer-Zellen zu fördern. Ausgehend von diesen Eigenschaften könnten slanDCs einen Beitrag zur Immunabwehr des Kolonkarzinoms leisten und somit das Tumorwachstum beeinflussen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst mit Hilfe immunhistochemischer Färbungen der Nachweis von slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben erbracht. In diesem Zusammenhang konnte eine höhere Frequenz von slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben (Mittelwert: 16,69 slanDCs/mm2, n=38) im Vergleich zu den korrespondierenden tumorfreien Geweben (Mittelwert: 9,25 slanDCs/mm2, n=38) detektiert werden. Des Weiteren wurde eine höhere Dichte von infiltrierenden slanDCs in Kolonkarzinom-Gewebeproben (Mittelwert: 18,85 slanDCs/mm2, n=20) im Vergleich zu plasmazytoiden DCs (Mittelwert: 4,86 pDCs/mm2, n=20), welche eine andere Subpopulation von humanen DCs im Blut repräsentieren, nachgewiesen. Ausgehend von diesen Erkenntnissen erfolgten verschiedene Immunfluoreszenzfärbungen zur Untersuchung des Reifestatus und der Zytokinexpression der Kolonkarzinom-infiltrierenden slanDCs. Dabei konnten in allen zehn untersuchten Tumorgeweben CD83-exprimierende slanDCs detektiert werden (Mittelwert: 46,7 % CD83+ slanDCs), was auf einen reifen Phänotyp dieser DCs hinweist. Zudem erfolgte der Nachweis einer Interleukin (IL)-23-Expression in variabler Ausprägung durch infiltrierende slanDCs in zehn von elf analysierten Kolonkarzinom-Geweben (Mittelwert: 33,8 % IL-23+ slanDCs). Dabei stellte sich heraus, dass slanDCs einen wesentlichen Anteil der IL-23-exprimierenden Zellen in einigen untersuchten Gewebeproben darstellen. Eine Expression von Tumornekrosefaktor durch Kolonkarzinom-infiltrierende slanDCs wurde hingegen nur in einer geringen Frequenz detektiert. Weitere Untersuchungen identifizierten slanDCs als neue zelluläre Komponente der T-Zell-Zone von tertiären lymphoiden Strukturen (TLS) der Tumorumgebung des Kolonkarzinoms. Darüber hinaus wies ein deutlicher Anteil der dort lokalisierten slanDCs einen reifen Phänotyp oder eine Expression von IL-23 auf. Ausgehend von diesen neuen Ergebnissen könnten die infiltrierenden slanDCs an der Modulation einer adaptiven Immunantwort in der T-Zell-Zone Kolonkarzinom-assoziierter TLS beteiligt sein und einen Einfluss auf das Tumorwachstum ausüben. Weiterhin könnte die Expression des proinflammatorischen Zytokins IL-23 durch slanDCs im Tumor-umgebenden Stroma und in den TLS eine Induktion IL-17-produzierender Zellen fördern und damit auf eine Beteiligung der slanDCs an einem entzündungsbedingten Fortschreiten der Tumorerkrankung über die IL-23/IL-17-Achse hindeuten. Insgesamt leisten die gewonnenen Erkenntnisse einen Beitrag zum Verständnis der Rolle von humanen nativen DCs im Kolonkarzinom und könnten die Entwicklung neuer immuntherapeutischer Strategien in der Behandlung dieser Tumorerkrankung fördern
Colorectal cancer as an immunogenic tumor is characterized by a marked infiltration of different immune cell populations. Especially CD8+ T-lymphocytes and CD4+ T helper cells type 1 seem to influence tumor growth and therefore play an increasing role as prognostic markers. Thus, it has been shown that high densities of these T cell subsets are associated with improved survival of colorectal cancer patients. These new insights could become part of the classification of colorectal cancer and influence therapeutic decisions. Despite these studies, little is known about the frequency and properties of native human dendritic cells (DCs) in colon cancer tissues and their potential role in antitumor immunity. DCs as professional antigen-presenting cells are critical for the induction and maintenance of antitumor immunity and can essentially influence tumor progression. Thus, the frequency, distribution, maturation, and cytokine expression of 6-sulfo LacNAc+ (slan) DCs in colon cancer tissues as well as in corresponding tumor-free colon specimens were investigated. SlanDCs represent a subset of human blood DCs that secrete large amounts of proinflammatory cytokines upon activation. Furthermore slanDCs are able to efficiently activate CD4+ T cells, tumor-reactive CD8 + T cells, and natural killer cells. Due to these functional properties, slanDCs may contribute to antitumor immunity and may influence tumor growth. Within this doctoral thesis the presence of slanDCs in primary colon cancer samples was immunohistochemically verified. In this context, a higher frequency of slanDCs in colon cancer tissues (mean: 16,69 slanDCs/mm2, n=38) in comparison to the corresponding tumor-free specimens (mean: 9,25 slanDCs/mm2, n=38) could be detected. Moreover, higher frequencies of infiltrating slanDCs in colon cancer tissues (mean: 18,85 slanDCs/mm2, n=20) were detectable compared to plasmacytoid DCs (mean: 4,86 pDCs/mm2, n=20), representing another human blood DC-subset. Based on these results, various immunofluorescence stainings were performed to investigate maturation and cytokine expression of the infiltrating slanDCs. SlanDCs expressing the maturation marker CD83 were detected in all 10 analyzed colon cancer tissues (mean: 46,7% CD83+ slanDCs). In addition, IL-23-expressing slanDCs were present at varying percentages in 10 of 11 evaluated colon cancer samples (mean: 33,8% IL-23+ slanDCs). Interestingly, in several tissues slanDCs represented a marked proportion of all IL-23-expressing cells. However, slanDCs expressing tumor necrosis factor could only be detected in low frequencies in the analyzed colon cancer specimens. Further studies revealed that slanDCs are a novel component of the T-cell zone of colon cancer-associated tertiary lymphoid structures (TLS). A proportion of these TLS-associated slanDCs displays a mature phenotype or express IL-23. These novel findings indicate that slanDCs may modulate adaptive immune responses in the T-cell zone of colon cancer-associated TLS and may contribute to the regulation of tumor progression. Furthermore the IL-23-expressing slanDCs in the tumor-surrounding stroma and the TLS may promote the generation of IL-17-producing cells and may participate in inflammation-related cancer progression mediated by the IL-23/IL-17 axis. These novel observations can help to decipher the role of human native DCs in colon cancer and may have implications for the design of therapeutic strategies against this tumor entity

Dans cette étude, nous avons tenté de décrypter les mécanismes reliant l’augmentation de lymphocytes infiltrant les tumeurs (LIT) T CD8+ et un pronostic clinique défavorable dans le cancer du rein à cellules claires (ccRCC). Pour cela, nous avons déterminé 1) la relation entre le pronostic associé à l'expression d’immune checkpoints et l’infiltrat de cellules dendritiques (DC) et de LT CD8+ et 2) les caractéristiques phénotypiques des LIT T CD8+. L’expression des immune checkpoints a été déterminée par immunohistochimie dans une cohorte de 135 ccRCC. Nous avons constaté que les densités des cellules exprimant CD8, PD-1 et LAG-3 sont corrélées, et associées à une diminution de PFS et OS. Egalement, les patients dont les tumeurs présentent des densités élevées de cellules PD-1+ et PD-L1 et/ou PD-L2 +, ont le taux de survie le plus faible. Des densités élevées de DC immatures isolées dans le stroma tumoral sont associées à une forte expression d’immune checkpoints et à un faible taux de survie chez ces patients. En revanche, les patients présentant un taux de survie prolongé ont une densité élevée de lymphocytes CD8+, des DC matures au sein de structures lymphoïdes tertiaires, ainsi qu’une faible expression d’immune checkpoints. Nous avons analysé les LIT T CD8+ chez 21 patients ccRCC par Cytométrie de Flux. On a trouvé un groupe de patients (8/21) dont les tumeurs sont caractérisées par la surexpression de marqueurs inhibiteurs (PD1 et TIM3) et de d'activation (CD69 et CD38), par l'expansion des cellules T CD8 + mémoires effectrices et un plus grand potentiel d’agressivité. En résumé, nous avons démontré qu’une densité élevée de LIT T CD8+ dans les ccRCC est accompagnée d’une forte expression d’immune checkpoints et d’une réponse immunitaire mal coordonnée dans un sous-groupe de tumeurs agressives
To decipher the potential mechanisms linking increased CD8+ T cell infiltration with an adverse clinical outcome in ccRCC, in this study we determined: 1) the prognosis associated with the expression of immune checkpoints and its coordination with dendritic cell (DC) and CD8+ cell infiltration, and 2) the phenotypic traits of CD8+ tumor infiltrating lymphocytes. The prognosis associated with CD8+ and DC infiltrations, in addition to the expression of immune checkpoints were investigated in a cohort of 135 ccRCC by quantitative immunohistochemistry. We found that the densities of CD8+, PD-1+ and LAG-3+ cells were closely correlated, and independently associated with decreased PFS and OS. In addition, patients whose tumors presented both high densities of PD-1+ cells and PD-L1+ and/or L2+ tumor cells, displayed the worst clinical outcome. High densities of immature DC isolated in the tumour stroma were associated with high expression of immune checkpoints and patients’ poor clinical outcome. In contrast, the presence of mature DC within Tertiary Lymphoid Structures identified, among the tumours with high CD8+-TIL densities, those with low expression of immune checkpoints and prolonged survival. We also investigated the phenotype of freshly isolated CD8+TIL in 21 ccRCC by flow cytometry. We found a group tumors (8/21) characterised by the over-expression of inhibitory (PD-1 and TIM-3) and activation markers (CD69 and CD38), the expansion of the effector memory cell subpopulation (CCR7-CD45RA-), and a trend toward more aggressive features. In summary, we demonstrated that the infiltration with CD8+ TIL in ccRCC is accompanied by the enhanced expression of immune checkpoints and a poorly coordinated immune response in a subgroup of aggressive tumors

Bladder cancer, as one of the most common cancer types and with high recurrence risk, is considered a candidate for novel immunotherapy strategies. An important aspect of the research for immunotherapy drug development for bladder cancer is to study the tumor microenvironment (TME) and it’s immune contexture. Besides tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) as the main drivers of anti-tumor response, recent studies revealed the importance of tumor-associated tertiary lymphoid structures (TLSs) and high endothelial venules (HEVs) in the TME. Structures similar to these were found to spontaneously form in the orthotopic MB49 model used for bladder cancer research in our group. The aim of this study was to perform a deeper characterization of the TME in this model, by using immunofluorescent staining and microscopy. Specifically, the co-localization of tumor infiltrating lymphocytes (CD8+ and CD4+ T cells, CD19+ B cells), CD11c+ dendritic cells and HEVs along with CCL21 signaling were analyzed within orthotopic MB49 tumors, with and without immune stimulation. The quantification of cells expressing CD8, CD19 and CD11c immune markers, CCL21 levels, vascular density and numbers of HEVs, showed higher densities within the immune-stimulated tumors, indicating a rapid effect of immune stimulation on increasing immune cell infiltration and vascular density after only 24 hours post CpG therapy. Also, the highest frequency of TILs, CCL21 chemokine and vascular density was located in regions of the tumor border indicating that these regions should be studied further in depth as a potential target for entry of cells to the tumor with immunotherapy or as a model of the tumor microenvironment since tumor cell density is maintained high in these locations.

Over the past decade, studies using murine models have led to the demonstration that CD4+ T helper (Th) cells play a critical role in the control of cancer progression. Additional support for their importance comes from the growing body of recent clinical/translational research data demonstrating the importance of tumor-infiltrating T and B lymphocytes in long-term patient survival for various types of cancer, including breast cancer (BC). As the key population coordinating adaptive immune responses, the role(s) played by individual Th subsets in cancer immunity remains largely controversial. The Th1 subset has uniquely been shown to have a clear anti-tumor effect, guiding CD8+ cytotoxic T cells-mediated direct tumor cell lysis through IFN-γ secretion. Although the negative regulatory role played by Treg cells has been extensively studied in cancer, its prognostic value along with that of Th2 and Th17 cells have not been clearly demonstrated in patients. T follicular helper (Tfh) cells, a recently characterized Th subset that plays a primary role in the generation of B cell memory in secondary lymphoid organs, have not been previously described infiltrating solid tumors. The principal objective of this thesis was to perform an in-depth characterization of tumor-infiltrating CD4+ T cells (TIL) and Th subsets in human BC, where very little is currently known.

Using whole genome microarrays, we analyzed the gene expression profiles of TIL relative to their counterparts from the axillary lymph nodes and peripheral blood. Applying a novel approach, we compared TIL profiles with public microarray data for Th subsets, demonstrating: 1) the presence of all major Th subsets (Th1, Th2, Th17, Treg as well as Tfh) in the TIL, 2) the TIL are effector memory rather than central memory cells, 3) the TIL are concomitantly activated and suppressed and 4) TIL from tumors with extensive lymphoid infiltrates are more activated/less suppressed in the TCR/CD3 signaling pathway, producing higher levels and a wider panel of Th cytokines than TIL from minimally-infiltrated tumors.

We also performed in vitro experiments to study tumor microenvironment effects on TIL by treating normal CD4+ T cells from healthy donor blood with primary tumor supernatants (SN). Tumor SN largely reproduces the TIL profile in normal Th cells, totally suppressing their activation and inhibiting their cytokine production. Intriguingly, the highly restricted number of cytokines induced by tumor SN included several tumor-promoting factors, such as IL-8 and TNF. SN from an extensively-infiltrated tumor was found to be less immune-suppressive than SN from minimally-infiltrated tumors. In line with this, TIL from minimally-infiltrated tumors are closer to SN-treated (suppressed) activated donor cells whereas TIL from extensively-infiltrated tumors are more similar to activated cells without SN treatment.

These results led us to further investigate the observed differences between TIL from extensive and minimally-infiltrated tumors. Genes characterizing Th1 and Tfh cells were enriched in the extensively-infiltrated tumors. PD-1hiCD200hi Tfh cells were specifically detected in extensively-infiltrated tumors by flow cytometry and these cells were determined to be the major source of the chemokine CXCL13. Immunohistochemical analysis demonstrated highly-organized tertiary lymphoid structures (TLS) within the tumor, containing a CD4+/CD8+ T cell zone and a B cell zone with reactive germinal centers where Tfh cells and follicular dendritic cells (FDC) are resident. Their presence suggests the origin of an effective memory anti-tumor immune response.

Finally, we generated Tfh- and Th1-specific gene signatures reflecting differences between extensive and minimal TIL and tested their prognostic value in large-patient-scale public data sets. Our Tfh signature predicts better 10-year disease-free survival for all BC subtypes, outperforming the Th1 signature, suggesting that Tfh cells play a more central role than Th1 cells in anti-tumor immunity. CXCL13 is the determinant gene of our Tfh signature, showing particularly strong prognostic power for the HER2+ subtype. Additionally, these signatures also predict a better response to neoadjuvant chemotherapy.

This thesis research has demonstrated that a previously undetected Th subset, Tfh cells, infiltrates solid tumors and shown that their presence signals enhanced anti-tumor immunity.

Durant cette dernière décennie, des travaux menés dans des modèles murins ont permis de mettre en évidence le rôle crucial joué par les lymphocytes T auxiliaires CD4+ (Th) dans le contrôle de la progression des cancers. De plus, de nombreuses études cliniques et/ou translationnelles récentes corroborent ces observations en montrant une corrélation entre l’importance de l’infiltration intra-tumorale par les lymphocytes T et B et la survie à long terme des patients atteints de différents types de cancer, dont le cancer du sein. En tant que chefs d’orchestre de la réponse immune adaptative, les rôles spécifiques des sous-populations des cellules Th restent controversés. Les Th1 sont la seule population exerçant une claire réponse anti-tumorale, qui est liée à la sécrétion d’IFN-γ, une cytokine primordiale à l’action des lymphocytes T cytotoxiques CD8+. Bien que le rôle néfaste des T régulateurs (Treg) a été largement étudié dans le cancer, leur implication pronostique ainsi que celle des Th2 et Th17 n’ont pas encore été clairement démontrées. La présence d’une sous-population de CD4, les T auxiliaires folliculaires (Tfh), cellules clés dans la différenciation des lymphocytes B mémoires au sein des organes lymphoïdes secondaires, n’a jamais été décrite dans les cancers solides. Le but principal de ce travail est de caractériser les sous-populations des lymphocytes T CD4+ infiltrant la tumeur (TIL) en prenant comme modèle le cancer du sein humain. A l’heure actuelle, il existe très peu de données sur les TIL CD4 dans ce type de cancer.

Nous avons d’abord établi le profil génique des TIL en les comparant avec ceux provenant des ganglions axillaires ou du sang périphérique. En appliquant une nouvelle approche, nous avons comparé les profils des TIL avec les données publiques de sous-populations de Th et démontré que :1) toutes les sous-populations de cellules Th (Th1, Th2, Th17, Treg et Tfh) infiltrent la tumeur, 2) les TIL ont un phénotype plus proche de celui des cellules mémoires effectrices que des cellules mémoires centrales, 3) les TIL sont simultanément activés et supprimés et 4) les TIL provenant des tumeurs massivement infiltrées («extensives») par des lymphocytes sont mieux activés et moins supprimés que les TIL des tumeurs peu infiltrées («minimales») dans la voie de signalisation TCR et produisent des cytokines d’une quantité plus élevée et d’une répertoire plus large.

Nous avons également effectué des expériences in vitro pour étudier l’effet de l’environnement tumoral sur les TIL en traitant des CD4 normaux (provenant des donneuses saines) par le surnageant (SN) extrait des tumeurs fraiches. Le SN tumoral induit un profil génique proche de celui des TIL en inhibant l’activation et la production de cytokines de ces cellules stimulées. Curieusement, parmi le peu de cytokines induites par le SN tumoral, des facteurs pro-tumoraux comme IL-8 et TNF sont détectés. Le surnageant provenant d’une tumeur «extensive» est moins immunosuppresseur que ceux des tumeurs «minimales». Conformément, les TIL provenant des tumeurs «minimales» ont un profil génique proche des cellules normales activées et traitées (supprimées) par le SN tumoral tandis que les TIL des tumeurs «extensives» ressemblent aux cellules activées non traitées.

Ces résultats nous avaient guidés à investiguer plus profondément les différences observées entre les TIL des tumeurs «extensives» et «minimales». Les gènes caractéristiques des Th1 et Tfh sont enrichis dans les tumeurs «extensives». Les cellules Tfh PD1hiCD200hi sont spécifiquement détectées par cytométrie de flux dans les tumeurs «extensives» et sont identifiées comme les producteurs principaux de la chimiokine CXCL13. L’examen par immunohistochimie a permis de détecter des structures lymphoïdes tertiaires (TLS) dans la tumeur, composées d’une zone T (CD4 et CD8) et d’une zone B au sein de laquelle se trouve parfois un centre germinatif actif contenant des Tfh et des cellules dendritiques folliculaires (FDC). La présence de ces structures suggère l’origine d’une réponse immune mémoire anti-tumorale.

Finalement, nous avons établi des signatures géniques spécifiques aux Tfh et Th1 et recherché leur impact pronostique dans deux bases de données publiques à grande échelle. Notre signature Tfh est positivement corrélée avec la survie à 10 ans des patientes de tous les sous-types de cancer du sein, et est plus performante que la signature Th1. Ceci suggère que les Tfh pourraient jouer un rôle plus crucial que les Th1 dans la réponse immune anti-tumorale. CXCL13 est le gène déterminant de notre signature Tfh et son expression est fortement associée à une meilleure survie chez les patientes du sous-type HER2+. De plus, ces signatures prévoient également une meilleure réponse à la chimiothérapie néoadjuvante (préopératoire).

Cette étude a démontré qu’une nouvelle sous-population de CD4, les Tfh, infiltre la tumeur solide et leur présence indique l’existence d’une immunité anti-tumorale renforcée.

Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques
info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les tumeurs sont composées de cellules malignes et d'une grande variété de cellules non-tumorales, en particulier des cellules immunitaires qui forment le micro-environnement tumoral (MET). Il a été démontré que la composition du MET était associée au devenir clinique des patients, en termes de survie et de réponses thérapeutiques. Avec le développement récent des immunothérapies qui ciblent des éléments spécifiques du MET, l'immunité anti-tumorale a soulevé un intérêt majeur. Plusieurs méthodologies ont été mises au point afin d'étudier la composition du MET, avec une précision toujours plus grande. En particulier, des méthodes comme MCP-counter permettent d'exploiter les données transcriptomiques de la tumeur entière afin de quantifier les différentes populations qui composent le MET. Le volet méthodologique de ce travail de thèse a ainsi consisté à proposer une amélioration de MCP-counter, en particulier pour l'analyse de données RNA-Seq. Une adaptation de la méthode pour des données issues de modèles murins (mMCP-counter) est également proposée. MCP-counter permet d'analyser rapidement le MET de larges séries de tumeurs. Un second volet de cette thèse consiste en l'application de cette méthode pour établir une classification immunitaire des sarcomes des tissus mous, un type de cancer rare, hétérogène et agressif. Cette classification immunitaire a permis de mettre en évidence des groupes de tumeurs faiblement ou fortement infiltrés, ainsi qu'un groupe marqué par une forte vascularisation. De manière intéressante, la classification immunitaire permet de prédire la réponse des patients aux immunothérapies. Ce travail a aussi démontré un rôle important des structures lymphoïdes tertiaires (SLT). Les SLT sont des structures de type noeud lymphatique composées de lymphocytes B et T qui se forment dans la tumeur ou à proximité de celle-ci. Au sein des SLT, une réponse immunitaire anti-tumorale peut se former et maturer. L'intérêt porté aux SLT est de plus en plus important pour de nombreux types de cancers. Dans la plupart des types de cancer, une forte infiltration de la tumeur par des lymphocytes T, en particulier CD8+, est associée à une meilleure survie des patients. Cependant, le carcinome rénal à cellules claires et le cancer de la prostate sont des exceptions à cette règle. En effet, dans ces deux cancers urologiques, la présence dans la tumeur de lymphocytes T est associée à une survie plus courte des patients, ainsi qu'à une rechute et une progression plus précoce. Ces exceptions sont détaillées dans une troisième partie de cette thèse, par une description minutieuse du MET, ainsi que par l'analyse de l'implication du système du complément. Dans leur ensemble, les résultats présentés dans cette thèse démontrent qu'en combinant différentes méthodes d'analyse, in silico, in situ et in vivo, il est possible d'obtenir une vision extrêmement complète du MET. La connaissance des types cellulaires présents dans la tumeur ainsi que leur orientation fonctionnelle permet de guider le soin apporté aux patients et d'améliorer leur devenir clinique. La description complète du MET ouvre la voie à une médecine personnalisée pour les patients atteints de cancer
Tumors are composed not only of malignant cells but also contain a vast variety of non-malignant cells, notably immune cells forming the tumor microenvironment (TME). The composition of the TME was shown to be associated with clinical outcome for cancer patients, in terms of survival and therapeutic responses. With the relatively recent development of immunotherapies targeting specific elements of the TME, tumor immunology has risen a strong interest and holds a strong therapeutic potential. Several methodologies have been developed to study the composition of the TME with an increased precision. Notably, some methods such as MCP-counter enable the use of the tumor bulk transcriptome to quantify cell populations composing the TME. The methodological aspect of this PhD project consisted in setting up an enhanced version of MCP-counter that can be readily applied to RNA-Seq data, as well as propose an adaptation of the method for mouse models. Using MCP-counter, the TME of large series of tumors can be easily analyzed. The application part of this PhD work consisted of applying MCP-counter to establish an immune-based classification of soft-tissue sarcoma, a rare, aggressive and heterogeneous cancer type. The immune classification notably allowed to identify immune low and high groups, and a group characterized by a strong vasculature. Interestingly, the classification was notably found to be predictive of the patients' response to immunotherapies. It also highlighted an important role of tertiary lymphoid structures (TLS). TLS are lymph-node-like structures composed of T and B cells that form within the tumor or in close proximity. They are a site of formation and maturation of antitumoral immune responses. TLS are raising a growing interest in many malignancies. In most cancer types, a strong infiltration by T cells, in particular CD8+ T cells, is associated with a favorable clinical outcome. However, clear-cell renal cell carcinoma and prostate cancer are exceptions to this general rule. Indeed, in these urological cancers, an increased infiltration by T cells is associated with a decreased patient survival and with earlier relapse and disease progression. In a third part of this thesis, these exceptions are investigated with more details by scrutinizing the TME, and questioning the implication of the complement system. Overall, this thesis presents how the combination of several analysis methods, in silico, in situ and in vivo, can help achieve an extremely precise description of the TME. Knowing accurately what cell populations and what their functional orientation can help guide patients care and improve clinical outcome. Complete description of the TME opens the way towards personalized medicine for cancer patients

Les sarcomes sont des tumeurs conjonctives malignes rares et représentent 2/100.000 nouveaux cas par an. Il s’agit d’un groupe hétérogène de tumeurs, généralement de mauvais pronostic. La chirurgie reste à ce jour le seul traitement curatif. Ces tumeurs peuvent récidiver même après une chirurgie considérée comme optimale, classée R0 c’est à dire sans reliquat microscopique (dans environ 10% des cas). Différents facteurs anatomocliniques pronostiques de rechute sont identifiés, incluant la taille tumorale initiale, le grade histologique FNCLCC et la localisation tumorale profonde. A l’heure actuelle, on ne dispose d’aucun marqueur prédictif du risque individuel de récidive au décours d’une prise en charge chirurgicale curative de sarcome. L’identification de facteurs prédictifs de rechute permettrait de mieux cibler les traitements adjuvants sur les patients à haut risque de rechute et de proposer une surveillance radio-clinique accrue.Jusqu’ici, les études se sont concentrées sur les caractéristiques des cellules tumorales mais n’ont jamais pris en compte les marges tissulaires. La marge constitue l’interface entre le tissu tumoral et le tissu sain, il s’agit d’un tissu remanié situé au contact direct des cellules tumorales. Le mode d’infiltration des cellules tumorales diffère d’une tumeur à l’autre et pourrait moduler ou refléter le risque de rechute locale. Une signature moléculaire de tissu sain prédictive de rechute locale a ainsi été mise en évidence dans le carcinome hépatocellulaire mais aucune donnée n’est disponible dans les sarcomes. Mon projet de thèse vise à identifier des facteurs prédictifs de rechute tumorale locale en étudiant de façon systématique et comparative la tumeur et ses zones périphériques, incluant la zone tumorale centrale (Tc), zone tumorale périphérique (Tp), le tissu péritumoral sain au contact des cellules tumorales (TS-R1) et le tissu sain à distance (TS) dans une série rétrospective de 144 sarcomes des tissus mous.Le premier volet a caractérisé l’infiltrat immunitaire associé aux sarcomes en étudiant systématiquement la marge tissulaire avec un focus sur les structures lymphoïdes tertiaires (TLS), facteurs prédictifs de réponse à l’immunothérapie dans les sarcomes à l’aide d’une étude microscopique et immunohistochimique des prélèvements. La distribution des TLS prédomine dans la marge tumorale et semble être corrélée à un meilleur pronostic.Le second volet a étudié par deep learning (DL) les différentes zones tumorales à l’aide de lames scannées afin de mettre en évidence de nouveaux facteurs morphologiques prédictifs inconnus et une signature DL prédictive de rechute locale. Le score du DL dépasse les courbes de survie associées au grade FNCLCC, standard utilisée en clinique.Une 3e approche a comparé le transcriptome des différentes zones tumorales déterminé par whole RNA-sequencing afin d’identifier des biomarqueurs dérégulés de façon différentielles dans les différentes zones et de déterminer les signatures immunologiques entre les différents territoires. Des gènes d’intérêt ont été mis en évidence dans la zone marginale pouvant être associé au risque de rechute. Enfin une analyse spatiale transcriptomique par technique Visium a été réalisée sur quelques cas à titre exploratoire.Notre étude a ciblé des biomarqueurs corrélés au risque de rechute qui pourraient permettre à l’avenir d’identifier les patients à haut risque de rechute afin de personnaliser leur suivi et valider des modalités thérapeutiques complémentaires
Identification of morphological and molecular predictive factors of recurrence in soft tissue sarcomas of the limbs and trunk wallSarcomas are rare malignant mesenchymal tumors that represent 2/100,000 new cases per year. They represent a heterogeneous group of tumors, generally associated with a poor prognosis. Surgical resection remains the only curative treatment. These tumors can recur even after optimal surgery, classified R0, i.e. without microscopic residue (in about 10% of cases). Different pathological prognostic factors are known, including initial tumor size, FNCLCC histological grade scheme and deep tumor location. At present, there is no available marker to predict the risk of recurrence following curative surgical resection of a sarcoma, which complicates the clinical decision making.So far, studies have focused on the features of tumor cells but the features of tissue margins surrounding sarcoma cells are unknown. The margin constitutes the interface between the tumor tissue and the healthy tissue, it is a remodeled tissue located in direct contact with the tumor cells. The mode of tumor cell infiltration differs from one tumor to another and could modulate or reflect the risk of local relapse. Interestingly, a molecular signature predictive of local relapse has been identified in hepatocellular carcinoma by studying of the “healthy tissue”, but no data is available in sarcomas. This thesis project aims at identifying predictive factors of local tumor relapse by systematically and comparatively studying the tumor and its peripheral zones, including the central tumor zone (Tc), peripheral tumor zone (Tp), healthy peritumoral tissue in contact tumor cells (HT-R1) and remote healthy tissue (HT) in a retrospective series of 144 soft tissue sarcomas.In a first part, we have characterized the immune infiltrate associated with sarcomas by systematically studying the tissue margin with a focus on tertiary lymphoid structures (TLS), a predictive factor of response to immunotherapy in sarcomas using microscopy and immunohistochemistry. The distribution of TLS predominates in the tumor margin and seems to be correlated with a better prognosis.The second part studied by deep learning (DL) the different tumor areas using scanned slides to highlight new unknown predictive morphological factors correlated with relapse and to establish a predictive Deep learning (DL) signature of local relapse. The DL score exceeds the survival curves associated with the FNCLCC grade; the current gold standard used to assess patient risk in clinical practice.A third approach compared the transcriptome of the different tumor areas determined by whole RNA-sequencing to identify deregulated biomarkers in the different areas and to determine the immunological signatures in the different territories. Genes of interest have been highlighted in the marginal zone that may be associated with the risk of relapse. Finally, a spatial transcriptomic analysis by Visium technique was carried out on a few cases on an exploratory basis.Our study has evidenced biomarkers correlated with a higher risk of relapse that could allow in the future to identify high risk patients to personalize their follow-up and validate complementary therapeutic modalities

Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) sont des agrégats lymphoïdes organisés, sièges d’une réponse immunitaire cellulaire et humorale, se formant au sein de tissus non lymphoïdes en conditions inflammatoires. La valeur pronostique positive des TLS a été rapportée dans de nombreuses maladies telles que les infections virales ou bactériennes, et divers types de tumeurs solides. Notre équipe étudie la formation de ces structures au sein du parenchyme pulmonaire enflammé. L’axe majeur de mon travail a été l’élucidation du rôle des cellules ILC3 pulmonaires dans l’induction de la néogenèse des TLS. Dans ce cadre, j’ai participé à la mise au point d’un modèle murin d’inflammation pulmonaire induisant la formation de TLS, reposant sur des instillations intranasales de lipopolysaccharide (LPS) bactérien. J’ai d’abord établi une cinétique d’apparition et d’involution des TLS dans le tissu pulmonaire, structures que j’ai caractérisées et quantifiées. J’ai ensuite finement caractérisé l’évolution des ILC3 tout au long de l’inflammation pulmonaire ; j’ai étudié leur profil transcriptomique et évalué leur capacité d’induction de tissu lymphoïde in vitro et in vivo. Ces travaux ont montré que la proportion d’ILC3 augmente dans les poumons parallèlement à la néogenèse des TLS, et que ces cellules expriment de nombreux transcrits de gènes codant des molécules clé des premières étapes de l’organogenèse lymphoïde. Le transfert adoptif d’ILC3 pulmonaires induites par le LPS et exprimant l’eGFP a permis de montrer que ces cellules peuvent migrer vers les poumons des souris receveuses. Il s’est accompagné d’un accroissement de la densité de TLS formées suite au traitement par une faible dose de LPS (induisant une inflammation de faible intensité). Ces travaux m’ont donc permis d’identifier une cible cellulaire prometteuse pour stimuler la formation des TLS pulmonaires, les ILC3. Par ailleurs, le poumon étant un organe densément innervé, notre laboratoire avait commencé à étudier l’impact de la signalisation nerveuse sympathique sur la formation des TLS pulmonaires. Grâce à la déplétion sélective des fibres sympathiques par administration de la neurotoxine 6-OHDA, j’ai montré, dans le modèle d’induction des TLS par le LPS, qu’un nombre et une densité moindres de TLS sont induits en l’absence d’innervation sympathique. J’ai de plus mis en évidence suite au traitement par la 6-OHDA, une diminution significative de la proportion de lymphocytes B pulmonaires naïfs observés après traitement par le LPS, ainsi qu’une diminution de la réponse primaire systémique lors d’une immunisation par l’ovalbumine. Ces données m’ont conduite à émettre l’hypothèse selon laquelle l’innervation sympathique participe à la formation in situ des TLS dans le tissu pulmonaire enflammé, en modulant le compartiment lymphocytaire B. En conclusion, mes travaux de thèse ont visé une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à la formation des TLS pulmonaires, et ont identifié une cible cellulaire, les ILC3, dont la manipulation pourrait permettre d’induire la formation des TLS, améliorant ainsi le pronostic de patients présentant divers types d’infections ou des cancers
Tertiary lymphoid structures (TLS) are organized lymphoid aggregates forming in non-lymphoid tissues under inflammatory conditions, and a priming site for cellular and humoral immune responses. The positive prognostic value of TLS has been reported in a variety of diseases such as viral or bacterial infections, and solid tumors. Our team deciphers the formation of such structures within the inflamed lung parenchyma. The main axis of my work was dedicated to elucidating the role of pulmonary ILC3 in the induction of TLS neogenesis. To this extent, I have contributed to the development of a murine model of pulmonary inflammation triggering TLS formation, relying on repeated intranasal instillations of bacterial lipopolysaccharide (LPS). First, I established the kinetics of TLS appearance and involution within lung tissue, followed by the characterization and quantification of these structures. I have then thoroughly characterized the evolution of ILC3 throughout pulmonary inflammation. I have studied their transcriptomic profile and assessed their lymphoid tissue inducing capacities, both in vitro and in vivo. Our data showed that ILC3 proportions are increased in mouse lungs in parallel to TLS neogenesis, and these cells expressed numerous transcripts of genes encoding major molecules involved in the very first steps of lymphoid organogenesis. Adoptive transfer of isolated LPS-induced eGFP+ ILC3 showed that these cells can migrate to the lungs of recipient mice and boost pulmonary TLS formation following low dose LPS treatment. Thus, this work unravelled a promising cellular target to be explored for pulmonary TLS induction. Moreover, considering the lungs’ dense innervation, our laboratory had started investigating how sympathetic nerve signalling impacts pulmonary TLS formation. Using selective 6-OHDA-mediated sympathetic nerve fibers depletion, I showed that decreased numbers and density of TLS are formed in the absence of sympathetic innervation in the LPS model. Moreover, following 6-OHDA treatment, I reported a significant decrease in pulmonary naive B cells proportion after LPS treatment, as well as in the primary antibody response to ovalbumin immunization. These data prompted me to hypothesize that sympathetic innervation participates in TLS formation within inflamed pulmonary tissue, through the modulation of the B cell compartment. Overall, my thesis work has aimed at a better understanding of the mechanisms underlying pulmonary TLS formation, and identified ILC3 as a cellular target that could be manipulated to enhance TLS formation, thus improving the prognosis of patients with infections or cancers

Le cancer de la vessie est de mauvais pronostic au stade infiltrant le muscle (TVIM). Les TVIM de sous-type basal/squameux (Ba/Sq) peuvent évoluer vers le variant sarcomatoïde et sont de très mauvais pronostic.Les mécanismes de progression des tumeurs non invasives vers une TVIM basale sont difficiles à étudier chez l’homme du fait de son caractère agressif. Dans une première partie, nous avons donc utilisé un modèle murin carcinogène-induit de TVIM Ba/Sq pour étudier l’évolution de l’expression génique depuis les stades pré-invasifs menant au TVIM Ba/Sq et au variant sarcomatoïde. Nous avons déterminé que les tumeurs précoces présentent d’emblée des caractères du phénotype Ba/Sq et qu’il existe des groupes de gènes d’évolution coordonnée au cours de la progression, avec une pertinence en pathologie humaine. L’étude des cas sarcomatoïdes a révélé une ressemblance au variant sarcomatoïde humain et l’existence d’une bascule de signalisation de l’EGFR vers une activation de la voie de FGFR1 lors de la dé-différenciation sarcomatoïde, corrélée à la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM). Ce résultat indique un potentiel bénéfice des inhibiteurs des FGFRs pour les tumeurs sarcomatoïdes, avec TEM et/ou exprimant fortement FGFR1.De plus, les régulateurs transcriptionnels clés du phénotype Ba/Sq sont méconnus. Une méthode pour identifier de tels régulateurs consiste en l’identification d’un circuit de facteurs de transcriptions (FT) auto-régulés et contrôlés par des super-enhancers (SE), larges régions génomiques régulatrices jouant un rôle dans l‘identité cellulaire. Dans une deuxième partie, nous avons identifié les régions SE dans des tumeurs primaires et des lignées de cancer de vessie, y compris du sous-type Ba/Sq, par la réalisation d’une ChIP-seq H3K27ac, modification d’histone caractéristique des régions SE. Nous avons démontré que le profil chromatinien H3K27ac est associé aux sous-types moléculaires et avons identifié les SE spécifiques du sous-type Ba/Sq. En utilisant l’algorithme CRCmapper, nous avons identifié des FT candidats pouvant réguler le phénotype basal, tels que RUNX2 ou KLF7. Une validation de ces candidats dans des lignées cellulaires de cancer de vessie sera nécessaire.Ce travail permet de mieux caractériser le sous-type Ba/Sq des cancers de vessie et ouvre la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques
Bladder cancer is frequent, with poor prognosis at the muscle-invasive stage (MIBC). The basal/squamous (Ba/Sq) subtype of MIBC can progress to the sarcomatoid variant and has very poor outcome.Owing to their aggressive phenotype, Ba/Sq tumors are often diagnosed at advanced stages, hampering the study of disease progression in humans. In a first part, we thus utilized a carcinogen-induced mouse model of Ba/Sq MIBC to explore the molecular changes occurring from pre-invasive stages, to Ba/Sq MIBC, to the sarcomatoid variant. We determined that pre-invasive stages already harbor Ba/Sq features and identified clusters of genes with co-expression changes during progression, with relevance to human disease. A focus on sarcomatoid cases revealed their close resemblance to the human sarcomatoid counterpart. We identified an EGFR/FGFR1 switch during sarcomatoid dedifferentiation, correlated with epithelial-mesenchymal transition (EMT). This finding indicates that patients with sarcomatoid, EMT- or FGFR1-high tumors may benefit from FGFR inhibitors.Additionally, the master transcription factors (TFs) controlling the Ba/Sq phenotype are poorly understood. One approach to identify such TFs is to pinpoint to those forming a core regulatory circuitry (CRC) driven by super-enhancers (SE), i.e., large genomic regulatory domains with a major role in cell identity. In a second part, we identified such SEs by performing ChIP-seq for H3K27ac, a typical histone modification found in SE regions, in bladder cancer primary tumors and cells lines, including of Ba/Sq subtype. We determined that distinct H3K27ac profiles are associated with molecular subtypes and identified subtype-specific SEs. CRC analysis using the CRCmapper algorithm nominated potential master TFs driving the Ba/Sq phenotype, including RUNX2 and KLF7. Further functional validation of these candidates in bladder cancer cell lines is necessary.Overall, this work furthers our understanding of Ba/Sq MIBC and provides potential new therapeutic strategies

Das kolorektale Karzinom (KRK) zählt zu den immunogenen Tumoren und zeichnet sich durch eine ausgeprägte Infiltration von verschiedenen Immunzell-Populationen aus. Dabei scheinen insbesondere CD8+ T-Lymphozyten und CD4+ T-Helfer-Zellen Typ 1 das Tumorwachstum zu beeinflussen und spielen somit eine zunehmende Rolle als prognostische Marker. Dementsprechend ergaben sich mehrere Hinweise, dass eine hohe Frequenz dieser beiden T-Zell-Populationen in KRK-Geweben mit einer erhöhten Überlebensrate assoziiert ist. Diese neuen Erkenntnisse könnten zukünftig in die Klassifikation des KRKs einfließen und therapeutische Entscheidungen beeinflussen. Im Gegensatz zu Tumor-infiltrierenden T-Zellen ist jedoch über die Frequenz und die Eigenschaften von nativen humanen dendritischen Zellen (DCs) in Kolonkarzinom-Geweben und deren mögliche Rolle in der immunologischen Abwehr von Tumoren nur sehr wenig bekannt. Als professionelle antigenpräsentierende Zellen spielen DCs eine Schlüsselrolle bei der Induktion und Aufrechterhaltung einer Tumor-gerichteten Immunantwort und können dadurch die Tumorentwicklung wesentlich beeinflussen. Daher wurden im Rahmen dieser Dissertation erstmalig Frequenz, Verteilung, Reifestatus und Zytokinexpression von 6-sulfo LacNAc+ (slan) DCs in Kolonkarzinom-Geweben sowie in korrespondierenden tumorfreien Kolon-Geweben untersucht. SlanDCs stellen eine große Subpopulation von humanen Blut-DCs dar, die nach Aktivierung hohe Konzentrationen von verschiedenen proinflammatorischen Zytokinen sezernieren. Darüber hinaus sind sie effizient in der Lage, die antitumoralen Eigenschaften von CD8+ T-Lymphozyten und CD4+ T-Helfer-Zellen sowie von Natürlichen Killer-Zellen zu fördern. Ausgehend von diesen Eigenschaften könnten slanDCs einen Beitrag zur Immunabwehr des Kolonkarzinoms leisten und somit das Tumorwachstum beeinflussen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst mit Hilfe immunhistochemischer Färbungen der Nachweis von slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben erbracht. In diesem Zusammenhang konnte eine höhere Frequenz von slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben (Mittelwert: 16,69 slanDCs/mm2, n=38) im Vergleich zu den korrespondierenden tumorfreien Geweben (Mittelwert: 9,25 slanDCs/mm2, n=38) detektiert werden. Des Weiteren wurde eine höhere Dichte von infiltrierenden slanDCs in Kolonkarzinom-Gewebeproben (Mittelwert: 18,85 slanDCs/mm2, n=20) im Vergleich zu plasmazytoiden DCs (Mittelwert: 4,86 pDCs/mm2, n=20), welche eine andere Subpopulation von humanen DCs im Blut repräsentieren, nachgewiesen. Ausgehend von diesen Erkenntnissen erfolgten verschiedene Immunfluoreszenzfärbungen zur Untersuchung des Reifestatus und der Zytokinexpression der Kolonkarzinom-infiltrierenden slanDCs. Dabei konnten in allen zehn untersuchten Tumorgeweben CD83-exprimierende slanDCs detektiert werden (Mittelwert: 46,7 % CD83+ slanDCs), was auf einen reifen Phänotyp dieser DCs hinweist. Zudem erfolgte der Nachweis einer Interleukin (IL)-23-Expression in variabler Ausprägung durch infiltrierende slanDCs in zehn von elf analysierten Kolonkarzinom-Geweben (Mittelwert: 33,8 % IL-23+ slanDCs). Dabei stellte sich heraus, dass slanDCs einen wesentlichen Anteil der IL-23-exprimierenden Zellen in einigen untersuchten Gewebeproben darstellen. Eine Expression von Tumornekrosefaktor durch Kolonkarzinom-infiltrierende slanDCs wurde hingegen nur in einer geringen Frequenz detektiert. Weitere Untersuchungen identifizierten slanDCs als neue zelluläre Komponente der T-Zell-Zone von tertiären lymphoiden Strukturen (TLS) der Tumorumgebung des Kolonkarzinoms. Darüber hinaus wies ein deutlicher Anteil der dort lokalisierten slanDCs einen reifen Phänotyp oder eine Expression von IL-23 auf. Ausgehend von diesen neuen Ergebnissen könnten die infiltrierenden slanDCs an der Modulation einer adaptiven Immunantwort in der T-Zell-Zone Kolonkarzinom-assoziierter TLS beteiligt sein und einen Einfluss auf das Tumorwachstum ausüben. Weiterhin könnte die Expression des proinflammatorischen Zytokins IL-23 durch slanDCs im Tumor-umgebenden Stroma und in den TLS eine Induktion IL-17-produzierender Zellen fördern und damit auf eine Beteiligung der slanDCs an einem entzündungsbedingten Fortschreiten der Tumorerkrankung über die IL-23/IL-17-Achse hindeuten. Insgesamt leisten die gewonnenen Erkenntnisse einen Beitrag zum Verständnis der Rolle von humanen nativen DCs im Kolonkarzinom und könnten die Entwicklung neuer immuntherapeutischer Strategien in der Behandlung dieser Tumorerkrankung fördern.:Abbildungsverzeichnis IV Tabellenverzeichnis VI Abkürzungsverzeichnis VII 1 Einleitung 1 1.1 Das humane Immunsystem 1 1.2 Dendritische Zellen 2 1.2.1 Phänotyp und Funktion dendritischer Zellen 3 1.2.2 Aktivierung von T-Lymphozyten durch dendritische Zellen 4 1.2.3 Subpopulationen humaner dendritischer Zellen 6 1.3 Interaktion von Immunsystem und Tumor 8 1.4 Infiltration von Tumoren durch Immunzellen 10 1.5 Kolonkarzinome 11 1.5.1 Entwicklung, Charakteristika und Klassifikation kolorektaler Karzinome 12 1.5.2 Therapieansätze des Kolonkarzinoms 14 1.6 Zielstellung 17 2 Material und Methoden 19 2.1 Material 19 2.1.1 Chemikalien und Reagenzien 19 2.1.2 Lösungen und Puffer 19 2.1.3 Testkitsysteme 19 2.1.4 Antikörper zur Detektion von Oberflächenmolekülen 20 2.1.5 Seren 20 2.1.6 Geräte 21 2.1.7 Sonstige Materialien 21 2.1.8 Gewebeproben 21 2.2 Methoden 23 2.2.1 Vorbereitung der Gewebeproben zur Immunmarkierung 23 2.2.2 Immunhistochemischer Nachweis von slanDCs und pDCs in Kolonkarzinom-Geweben und tumorfreien Kolon-Geweben 24 2.2.3 Untersuchung der Zytokinexpression von slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben und tumorfreien Kolon-Geweben mit Fluoreszenzfärbungen 25 2.2.4 Nachweis der Expression von CD83 durch slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben mit einer Fluoreszenzfärbung 26 2.2.5 Analyse einer Kolokalisation von slanDCs und CD3+ T-Lymphozyten in Kolonkarzinom-Geweben 26 2.2.6 Detektion von slanDCs in tertiären lymphoiden Strukturen von Kolonkarzinom-Geweben 26 2.2.7 Nachweis der Expression von CD83 und Interleukin-23 durch slanDCs in TLS von Kolonkarzinom-Geweben 28 2.2.8 Auswertung der immunhistochemischen Färbungen von slanDCs und pDCs in Kolonkarzinom-Geweben und in tumorfreien Kolon-Geweben 29 2.2.9 Statistik 30 3 Ergebnisse 31 3.1 Nachweis von slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben 31 3.2 Assoziation der ermittelten Frequenz infiltrierender slanDCs mit der TNM-Klassifikation des Kolonkarzinoms 37 3.3 Nachweis von pDCs in Kolonkarzinom-Geweben 39 3.4 Expression von CD83 durch slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben 42 3.5 Expression von Interleukin-23 durch slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben 44 3.6 Expression von Tumornekrosefaktor durch slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben 47 3.7 Kolokalisation von slanDCs und CD3+ T-Lymphozyten in Kolonkarzinom-Geweben 50 3.8 Detektion von slanDCs in tertiären lymphoiden Strukturen von Kolonkarzinom-Geweben 51 3.9 Expression von CD83 durch slanDCs in TLS von Kolonkarzinom-Geweben 54 3.10 Expression von IL-23 durch slanDCs in TLS von Kolonkarzinom-Geweben 56 4 Diskussion 57 4.1 DCs als zentrale Mediatoren einer Tumor-gerichteten Immunantwort 57 4.2 DCs als Komponente des Immunzellinfiltrats im Kolonkarzinom 58 4.2.1 Immunhistochemischer Nachweis von DCs in Kolonkarzinom-Geweben 58 4.2.2 Zielstrukturen eingesetzter Antikörper in immunhistochemischen Färbungen von DCs 60 4.2.3 SlanDCs als DC-Subpopulation in Kolonkarzinom-Geweben 61 4.3 Phänotyp infiltrierender slanDCs im Kolonkarzinom 64 4.3.1 Expression von CD83 durch slanDCs 64 4.3.2 Expression von Interleukin-23 durch slanDCs 67 4.3.3 Expression von Tumornekrosefaktor durch slanDCs 69 4.4 SlanDCs als Komponente von tertiären lymphoiden Strukturen im Kolonkarzinom 71 5 Zusammenfassung 75 6 Summary 77 7 Literaturverzeichnis 79 Anlage 1 91 Anlage 2 92 Danksagung 93
Colorectal cancer as an immunogenic tumor is characterized by a marked infiltration of different immune cell populations. Especially CD8+ T-lymphocytes and CD4+ T helper cells type 1 seem to influence tumor growth and therefore play an increasing role as prognostic markers. Thus, it has been shown that high densities of these T cell subsets are associated with improved survival of colorectal cancer patients. These new insights could become part of the classification of colorectal cancer and influence therapeutic decisions. Despite these studies, little is known about the frequency and properties of native human dendritic cells (DCs) in colon cancer tissues and their potential role in antitumor immunity. DCs as professional antigen-presenting cells are critical for the induction and maintenance of antitumor immunity and can essentially influence tumor progression. Thus, the frequency, distribution, maturation, and cytokine expression of 6-sulfo LacNAc+ (slan) DCs in colon cancer tissues as well as in corresponding tumor-free colon specimens were investigated. SlanDCs represent a subset of human blood DCs that secrete large amounts of proinflammatory cytokines upon activation. Furthermore slanDCs are able to efficiently activate CD4+ T cells, tumor-reactive CD8 + T cells, and natural killer cells. Due to these functional properties, slanDCs may contribute to antitumor immunity and may influence tumor growth. Within this doctoral thesis the presence of slanDCs in primary colon cancer samples was immunohistochemically verified. In this context, a higher frequency of slanDCs in colon cancer tissues (mean: 16,69 slanDCs/mm2, n=38) in comparison to the corresponding tumor-free specimens (mean: 9,25 slanDCs/mm2, n=38) could be detected. Moreover, higher frequencies of infiltrating slanDCs in colon cancer tissues (mean: 18,85 slanDCs/mm2, n=20) were detectable compared to plasmacytoid DCs (mean: 4,86 pDCs/mm2, n=20), representing another human blood DC-subset. Based on these results, various immunofluorescence stainings were performed to investigate maturation and cytokine expression of the infiltrating slanDCs. SlanDCs expressing the maturation marker CD83 were detected in all 10 analyzed colon cancer tissues (mean: 46,7% CD83+ slanDCs). In addition, IL-23-expressing slanDCs were present at varying percentages in 10 of 11 evaluated colon cancer samples (mean: 33,8% IL-23+ slanDCs). Interestingly, in several tissues slanDCs represented a marked proportion of all IL-23-expressing cells. However, slanDCs expressing tumor necrosis factor could only be detected in low frequencies in the analyzed colon cancer specimens. Further studies revealed that slanDCs are a novel component of the T-cell zone of colon cancer-associated tertiary lymphoid structures (TLS). A proportion of these TLS-associated slanDCs displays a mature phenotype or express IL-23. These novel findings indicate that slanDCs may modulate adaptive immune responses in the T-cell zone of colon cancer-associated TLS and may contribute to the regulation of tumor progression. Furthermore the IL-23-expressing slanDCs in the tumor-surrounding stroma and the TLS may promote the generation of IL-17-producing cells and may participate in inflammation-related cancer progression mediated by the IL-23/IL-17 axis. These novel observations can help to decipher the role of human native DCs in colon cancer and may have implications for the design of therapeutic strategies against this tumor entity.:Abbildungsverzeichnis IV Tabellenverzeichnis VI Abkürzungsverzeichnis VII 1 Einleitung 1 1.1 Das humane Immunsystem 1 1.2 Dendritische Zellen 2 1.2.1 Phänotyp und Funktion dendritischer Zellen 3 1.2.2 Aktivierung von T-Lymphozyten durch dendritische Zellen 4 1.2.3 Subpopulationen humaner dendritischer Zellen 6 1.3 Interaktion von Immunsystem und Tumor 8 1.4 Infiltration von Tumoren durch Immunzellen 10 1.5 Kolonkarzinome 11 1.5.1 Entwicklung, Charakteristika und Klassifikation kolorektaler Karzinome 12 1.5.2 Therapieansätze des Kolonkarzinoms 14 1.6 Zielstellung 17 2 Material und Methoden 19 2.1 Material 19 2.1.1 Chemikalien und Reagenzien 19 2.1.2 Lösungen und Puffer 19 2.1.3 Testkitsysteme 19 2.1.4 Antikörper zur Detektion von Oberflächenmolekülen 20 2.1.5 Seren 20 2.1.6 Geräte 21 2.1.7 Sonstige Materialien 21 2.1.8 Gewebeproben 21 2.2 Methoden 23 2.2.1 Vorbereitung der Gewebeproben zur Immunmarkierung 23 2.2.2 Immunhistochemischer Nachweis von slanDCs und pDCs in Kolonkarzinom-Geweben und tumorfreien Kolon-Geweben 24 2.2.3 Untersuchung der Zytokinexpression von slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben und tumorfreien Kolon-Geweben mit Fluoreszenzfärbungen 25 2.2.4 Nachweis der Expression von CD83 durch slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben mit einer Fluoreszenzfärbung 26 2.2.5 Analyse einer Kolokalisation von slanDCs und CD3+ T-Lymphozyten in Kolonkarzinom-Geweben 26 2.2.6 Detektion von slanDCs in tertiären lymphoiden Strukturen von Kolonkarzinom-Geweben 26 2.2.7 Nachweis der Expression von CD83 und Interleukin-23 durch slanDCs in TLS von Kolonkarzinom-Geweben 28 2.2.8 Auswertung der immunhistochemischen Färbungen von slanDCs und pDCs in Kolonkarzinom-Geweben und in tumorfreien Kolon-Geweben 29 2.2.9 Statistik 30 3 Ergebnisse 31 3.1 Nachweis von slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben 31 3.2 Assoziation der ermittelten Frequenz infiltrierender slanDCs mit der TNM-Klassifikation des Kolonkarzinoms 37 3.3 Nachweis von pDCs in Kolonkarzinom-Geweben 39 3.4 Expression von CD83 durch slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben 42 3.5 Expression von Interleukin-23 durch slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben 44 3.6 Expression von Tumornekrosefaktor durch slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben 47 3.7 Kolokalisation von slanDCs und CD3+ T-Lymphozyten in Kolonkarzinom-Geweben 50 3.8 Detektion von slanDCs in tertiären lymphoiden Strukturen von Kolonkarzinom-Geweben 51 3.9 Expression von CD83 durch slanDCs in TLS von Kolonkarzinom-Geweben 54 3.10 Expression von IL-23 durch slanDCs in TLS von Kolonkarzinom-Geweben 56 4 Diskussion 57 4.1 DCs als zentrale Mediatoren einer Tumor-gerichteten Immunantwort 57 4.2 DCs als Komponente des Immunzellinfiltrats im Kolonkarzinom 58 4.2.1 Immunhistochemischer Nachweis von DCs in Kolonkarzinom-Geweben 58 4.2.2 Zielstrukturen eingesetzter Antikörper in immunhistochemischen Färbungen von DCs 60 4.2.3 SlanDCs als DC-Subpopulation in Kolonkarzinom-Geweben 61 4.3 Phänotyp infiltrierender slanDCs im Kolonkarzinom 64 4.3.1 Expression von CD83 durch slanDCs 64 4.3.2 Expression von Interleukin-23 durch slanDCs 67 4.3.3 Expression von Tumornekrosefaktor durch slanDCs 69 4.4 SlanDCs als Komponente von tertiären lymphoiden Strukturen im Kolonkarzinom 71 5 Zusammenfassung 75 6 Summary 77 7 Literaturverzeichnis 79 Anlage 1 91 Anlage 2 92 Danksagung 93