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Alors que, pour la plupart, les médicaments actuels sont de petites molécules inhibant l’action d’une protéine en bloquant un site d’interaction, la dégradation ciblée des protéines, découverte il y a une vingtaine d’années via les petites molécules PROTAC, connaît aujourd’hui un très grand développement, aussi bien au niveau universitaire qu’industriel. Cette dégradation ciblée permet de contrôler la concentration intracellulaire d’une protéine spécifique comme peuvent le faire les techniques basées sur les acides nucléiques (oligonucléotides antisens, ARNsi, CRISPR-Cas9). Les molécules PROTAC sont des chimères hétéro-bifonctionnelles capables de lier simultanément une protéine spécifique devant être dégradée et une E3 ubiquitine ligase. Les PROTAC sont donc capables de provoquer l’ubiquitinylation de la protéine ciblée et sa dégradation par le protéasome 26S. De nature peptidique, puis non peptidique, les PROTAC sont maintenant administrables par voie orale. Ce détournement du système ubiquitine protéasome permet aux molécules PROTAC d’élargir considérablement le champ des applications thérapeutiques puisque l’élimination de protéines dépourvues de poches ou de crevasses bien définies, dites difficiles à cibler, devient possible. Cette technologie versatile a conduit à la dégradation d’une grande variété de protéines comme des facteurs de transcription, des sérine/thréonine/tyrosine kinases, des protéines de structure, des protéines cytosoliques, des lecteurs épigénétiques. Certaines ligases telles que VHL, MDM2, cereblon et IAP sont couramment utilisées pour être recrutées par les PROTAC. Actuellement, le nombre de ligases pouvant être utilisées ainsi que la nature des protéines dégradées sont en constante augmentation. Deux PROTAC sont en étude clinique pour les cancers du sein (ARV471) et de la prostate (ARV110). La dégradation spécifique d’une protéine par le protéasome peut aussi être induite par d’autres types de molécules synthétiques : colles moléculaires, marqueurs hydrophobes, HaloPROTAC, homo-PROTAC. D’autres constituants cellulaires sont aussi éligibles à une dégradation induite : ARN-PROTAC pour les protéines se liant à l’ARN et RIBOTAC pour la dégradation de l’ARN lui-même comme celui du SARS-CoV-2. Des dégradations induites en dehors du protéasome sont aussi connues : LYTAC, pour des chimères détournant la dégradation de protéines extracellulaires vers les lysosomes, et MADTAC, pour des chimères détournant la dégradation par macroautophagie. Plusieurs techniques, en particulier des plates-formes de criblage, la modélisation mathématique et la conception computationnelle sont utilisées pour le développement de nouveaux PROTAC efficaces.

Depuis sa découverte, le Système Ubiquitine Protéasome (UPS) est reconnu pour son rôle majeur dans le contrôle de la plupart des voies métaboliques de la cellule. Outre son rôle primordial dans la dégradation des protéines, il intervient aussi dans l’adressage, la signalisation ou la réparation de l’ADN, ce qui en fait un acteur incontournable de l’homéostasie cellulaire. Bien que d’autres systèmes de contrôles existent dans la cellule, l’UPS est souvent considéré comme le chef d’orchestre. Au vu de son importance, toute dérégulation de l’UPS entraîne des désordres plus ou moins sévères pour la cellule et donc l’organisme. De fait, l’UPS est impliqué dans de nombreuses pathologies (cancer, maladie d’Alzheimer, de Huntington, etc.). L’UPS est composé de plus de 1000 protéines différentes dont les combinaisons permettent le ciblage fin de virtuellement toutes les protéines de l’organisme. L’UPS fait appel à une cascade enzymatique (E1, 2 isoformes ; E2 > 35 isoformes ; E3 > 800 isoformes) qui permet le transfert de l’ubiquitine, une petite protéine de 8,5 kDa, sur la protéine à cibler soit pour sa dégradation, soit pour modifier son activité. Ce signal d’ubiquitinylation est réversible et de nombreuses déubiquitinylases (DUB, ∼ 80 isoformes) jouent aussi un rôle important. Les enzymes E3 sont les plus nombreuses et leur fonction est de reconnaître la protéine cible, ce qui en fait des acteurs importants dans la spécificité d’action de l’UPS. La nature même des E3 et la complexité de leurs interactions avec différents partenaires offrent un champ d’investigation très large et donc des potentialités importantes pour le développement d’approches thérapeutiques. Sans être exhaustive, cette revue illustre les différentes stratégies ayant déjà été mises en œuvre pour lutter contre différentes pathologies (à l’exclusion des infections bactériennes ou virales).

Cet article présente les principes retenus pour élaborer le module de prévision de la valeur d’un aliment à partir des résultats de son analyse. Le module PrévAlim, proposé avec la nouvelle version d’INRAtion, permet de calculer à la fois la valeur nutritive (UF, PDI) et pour les fourrages la valeur d’encombrement (UE) à partir de la nature de l’aliment et de la mesure de certaines de ces caractéristiques. Pour la valeur nutritive, une démarche séquentielle a été adoptée, centrée sur l’estimation de la dMO et de la dégradabilité de l’azote (DT) ; le calcul des valeurs UF et PDI utilise ensuite la séquence des équations des systèmes INRA 1988. L’estimation de la dMO se fait soit préférentiellement à partir de la méthode de digestibilité enzymatique pepsine-cellulase (dCs ou dCo), soit à partir de la composition chimique ou de l’âge de la plante. L’estimation de la DT et de la valeur PDI des concentrés est basée sur la méthode enzymatique avec une protéase (DE1). La valeur d’encombrement des fourrages est calculée à partir de l’ingestibilité estimée directement à partir de la composition chimique ou de la dMO ; les équations par grandes classes d’aliments ont été déterminées sur la base des Tables INRA 1988. Ce module rassemble, coordonne et met à jour des outils déjà disponibles (Tables de prévision de 1981 et équations publiées depuis) et des outils créés spécialement (estimation des UE). Les valeurs calculées (UF, PDI et UE) sont cohérentes entre elles ainsi qu’avec celles des Tables. L’approche hiérarchisée adoptée permet de calculer les valeurs même avec des informations manquantes et de retenir la méthode d’évaluation la plus pertinente en cas d’informations redondantes.

Les modifications post-traductionnelles constituent un niveau crucial de régulation de l'expression des gènes. Parmi elles, la conjugaison peptidique impliquant l'ubiquitine intervient entre autre dans la régulation de la stabilité protéique. Le travail présenté décrit le mode de régulation d'un facteur anti-apoptotique, Bag-1 (Bcl-2 AnthanoGene-1). Le contrôle de son niveau d'expression fait intervenir la voie ubiquitine-protéasome. L'enzyme de ligation de l'ubiquitine Siah2 (Seven In Absencia Homolog 2) a par ailleurs été identifiée comme étant potentiellement impliquée dans l'ubiquitination de Bag-1, stimulée par l'induction de l'apoptose. La caractérisation d'autres modulateurs de l'apoptose régulés par la voie ubiquitine-protéasome a été un objectif de notre travail. Un outil moléculaire nouveau a été mis au point et testés dans ce but. Il devrait permettre la purification des cibles d'ubiquitination et leur identification par les techniques de la protéomique.

Ce travail décrit un criblage systématique du système ubiquitine-protéasome (UPS) basé sur une organisation en cascade. Nous avons évalué l’effet de l’inhibition par ARN interférent de composants individuels d’UPS sur la viabilité de cellules cancéreuses de la prostate, avec un accent particulier sur les cellules TMPRSS:ERG-positive (VCaP), comme un modèle de phénotype prévalent du cancer. Sept gènes ont été identifiés comme étant particulièrement importants pour le fonctionnement des cellules cancéreuses de la prostate. Parmi eux, le gène-candidat le plus prometteur était UBE2U. Cette thèse met en évidence l’implication d’UBE2U dans la carcinogénèse de la prostate et décrit les premières caractérisations d’UBE2U comme une cible thérapeutique potentielle.La prévalence des composants de la voie CRL/NEDD8 parmi les hits (4 sur 7) suggère que la neddylation est importante dans la biologie des cellules cancéreuses de la prostate. Deux de ces gènes, CUL2 et RBX1, n’ont des effets spécifiques que dans des cellules TMPRSS2:ERG-positives, et, donc, sont potentiellement ERG-dépendantes. Nous avons également révélé un rôle crucial du facteur d’échange de CRL (CAND1), en particulier lorsque la neddylation est compromise. L’inhibition de CAND1 induit l’apoptose dans des cellules VCaP, qui est renforcé par l’inhibiteur spécifique de la neddylation MLN4924. CAND1 est donc une nouvelle cible thérapeutique potentielle. Par ailleurs, nous avons démontré que l’inhibition de la voie CRL/NEDD8 dans les cellules cancéreuses de prostate a des conséquences qui dépendent fortement du contexte cellulaire. L’inhibiteur MLN4924 induit l’apoptose dans toutes les lignées cellulaires testées, bien que les cellules TMPRSS2:ERG-positives se soient révélées significativement plus résistantes. Nous avons démontré que la résistance accrue des cellules VCaP reflète la plasticité des cellules cancéreuses régulée par un réseau d’interactions ERG:NF-kB:c-Myc:Wnt/β-cat:AR. L’inhibition partielle de la neddylation enclenche une reprogrammation transcriptionnelle de cellules VCaP, amenant à la quiescence des cellules et à l’inhibition de l’apoptose dépendant de la prolifération. Cet effet est le résultat de la réactivation du programme AR. Nous avons conclus que la voie CRL/NEDD8 régule le réseau transcriptionnel qui contrôle la plasticité des cellules cancéreuses. Ces résultats peuvent aider à trouver des traitements plus efficaces de cancers TMPRSS2:ERG-positifs.Finalement, nous avons observé que l’inhibition de la neddylation modifie les propriétés de la membrane et la morphologie des cellules VCaP. Cet effet est accompagné par des changements du taux et de la localisation de plusieurs protéines associées à la membrane, y compris l’occludine, la N-cadherine, la paxilline and FAK. Nous en avons conclus que la voie CRL/NEDD8 pourrait être impliquée dans le tri/trafic des protéines membranaires. Cette partie du projet nécessite de plus amples études, étant donné que la compréhension des mécanismes sous-jacents est importante et peut mettre à jour un nouveau rôle de la voie CRL/NEDD8 dans la régulation des fonctions cellulaires.Conclusion générales :1. Nous avons caractérisé l’implication de tous les composants E1-E2 d’UPS dans la régulation de la viabilité des cellules cancéreuses de prostate (avec cinq différentes lignées cellulaires).2. Nos travaux ont mise en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement du cancer, telles qu’UBE2U et CAND1.3. Nous avons démontré le rôle de la voie CRL/NEDD8 dans la régulation de la plasticité et de la morphologie des cellules cancéreuses
In this work we describe a systematic approach for screening of ubiquitin-proteasome system (UPS) based on cascade organization. We have evaluated the effect of RNAi knockdown of individual UPS components on viability of PCa cells with major focus on TMPRSS:ERG-positive cell line, VCaP, as a model of prevalent phenotype of prostate cancer. Seven genes have been identified to be particularly important for the functioning of PCa cells. Among them, UBE2U was the strongest hit. This thesis provides the first evidence for UBE2U involvement in prostate carcinogenesis and describes initial characterization of UBE2U as a potential drug-target.The prevalence of the components of CRL/NEDD8 pathway in the hits (four out of seven) suggested the importance of neddylation for PCa biology. Two of these hits, CUL2 and RBX1, being specific to TMPRSS2:ERG-positive cells, are potentially ERG-dependent. We have also revealed the crucial role of CRL-exchange factor CAND1, in particular, when the neddylation is compromised. Knockdown of CAND1 induces apoptosis in VCaP cells that is further potentiated by neddylation-specific inhibitor MLN4924. CAND1 is, therefore, a novel potential drug target. Furthermore, we have demonstrated that the inhibition of CRL/NEDD8 pathway in prostate cancer cells has a complex outcome that strongly depends on cellular context. MLN4924 inhibitor induced apoptosis in all tested cell lines, though TMPRSS2:ERG positive cells were significantly more resistant. We have demonstrated that the increased resistance of VCaP cells reflects the plasticity of cancer cells ensured by sophisticated interaction network ERG:NF-kB:c-Myc:Wnt/β-cat:AR. We found that partial inhibition of neddylation triggered transcriptional reprogramming of VCaP cells leading to cell quiescence and inhibition of proliferation-dependent apoptosis. This was a result of re-activation of AR program and induction of differentiation-like state. We conclude that CRL/NEDD8 pathway regulates cancer transcriptional network that underlies cancer cells plasticity. This knowledge would help to find better treatments for TMPRSS2:ERG-positive cancers.Finally, we observed that neddylation inhibition changed membrane properties and morphology of VCaP cells. This was accompanied by dose-dependent changes in the level and the localization of several membrane-associated proteins, including occludin, N-cadherin, paxillin and FAK. We thus conclude that CRL/NEDD8 pathway might be involved in sorting/trafficking of membrane proteins. This part of the work requires further investigation, as understanding of the underlying mechanisms is of general importance and may uncover a new role of CRL/NEDD8 pathway in regulation of cellular functions.General conclusions:1. We have obtained a comprehensive dataset on the involvement of all human E1-E2 UPS components in the regulation of viability of PCa cells, represented by five different cell lines.2. Our work has revealed new potential drug targets for PCa treatment: UBE2U and CAND1.3. We have demonstrated the role of CRL/NEDD8 pathway in the regulation of cancer cell plasticity and morphology

Le système Ubiquitine-Protéasome (UbPr) est au cœur de la plupart des processus biologiques, du fait de son rôle central dans la protéolyse régulée. La dégradation d'une protéine via le système UbPr implique généralement deux grandes étapes successives: l'ubiquitylation de la protéine et sa dégradation par le protéasome 26S. Cependant, il reste de nombreuses questions quant au fonctionnement du système UbPr. Durant ma thèse, j'ai suivi deux axes de recherches visant à étudier l'étape mal caractérisée qu'est l'interface ubiquitylation/dégradation. Le premier était l'étude du rôle de la protéine Rad23/hHR23, décrite comme un adaptateur impliqué dans l'adressage des substrats ubiquitylés au protéasome, sur la régulation de l'ubiquitylation de la protéine p53 par Hdm2. J'ai montré que l'effet de Rad23 est double: en plus d'inhiber la multi-mono- et la poly-ubiquitylation de p53 par Hdm2, Rad23 favorise l'auto-ubiquitylation de Hdm2. Par ailleurs, j'ai confirmé que le domaine de Rad23 responsable de ces effets est le domaine UBA2, et j'ai montré que la dimérisation de Rad23 semble impliquée dans ces processus. Le deuxième axe était d'identifier de nouveaux facteurs cellulaires impliqués dans l'adressage des substrats ubiquitylés au protéasome ou qui assistent ce dernier dans la protéolyse. Mon but était de purifier par fractionnement cellulaire des cofacteurs du protéasome qui ont un effet activateur sur la dégradation de la protéine p53 ubiquitylée. J'ai obtenu, dans un premier temps, des résultats très intéressants indiquant que le complexe PA28 αβ pourrait jouer un rôle dans l'activation du protéasome 26S. Cependant, ces résultats n'ont pas pu être compris faute de temps et en raison de problèmes expérimentaux. Dans un second temps, j'ai purifié à partir des extraits cellulaires une autre activité qui était capable de s'associer et d'activer le protéasome 26S. J'ai ainsi identifié deux activateurs potentiels: la protéine Ecm29 et le complexe de traduction eIF3
The ubiquitin-proteasome system (UPS) plays a key role in most biological pathways, due to its central function in regulated proteolysis. Protein degradation through the UPS usually occurs in two main steps: ubiquitylation of proteins and subsequent degradation by the 26S proteasome. However, many open questions remain concerning UPS functioning. During my thesis, I followed two main research axes aimed at investigating the ill-understood ubiquitylation/degradation interface. One axis was to further study the role(s) in Hdm2-mediated p53 ubiquitylation of the Rad23/hHR23 protein, known to be an adaptator involved in addressing ubiquitylated substrates to the proteasome. I showed that Rad23 effect is twofold: in addition to inhibit both multi-mono- and poly-ubiquitylation of p53 by Hdm2, Rad23 somehow favors Hdm2 auto-ubiquitylation. Moreover, I confirmed that the domain responsible for the effects of Rad23 is its UBA2 domain, and showed that Rad23 dimerization might be involved in these processes. The second axis was aimed at identifying new cellular factors involved in targeting ubiquitylated substrates to the proteasome, or in assisting 26S proteasome during protein degradation. My goal was to purify and characterize proteins, through cell extract fractionation, having a positive effect on degradation of ubiquitylated p53 by purified 26S proteasome. Rapidly, my work was focused on the PA28 αβ complex, that was found in active fractions, and I obtained striking results indicating that it could play a role in 26S activation. However, due to time constraints and technical difficulties, this part of my work could not be brought to a conclusive end yet. In a second part of this project, I purified from cell extracts another activity that is able to both bind to and activate the 26S proteasome. Two potential candidates were identified in the active fractions: the Ecm29 protein and the translational complex eIF3

L'addiction est définie comme l'usage compulsif d'une substance en dépit de ses conséquences néfastes. Les propriétés renforçantes des drogues d'abus conduisent à une usurpation pathologique des circuits neuronaux servant aux apprentissages appétitifs. Ces neuro-adaptations, telles que la plasticité synaptique et les changements morphologiques des neurones, partagent de nombreuses similarités avec les mécanismes mis en jeu lors de la formation d'une mémoire à long terme. Dans l'hippocampe de rongeurs, la dégradation protéique par le système ubiquitine protéasome (SUP) joue un rôle primordial dans la plasticité synaptique et la formation de la mémoire. Cependant l'activité du SUP n'est pas restreinte à la plasticité hippocampique et à la mémoire mais est aussi impliquée dans les adaptations cellulaires induites par un traitement morphinique à long terme sur des cultures de neuroblastomes. Au vu de ces similarités, le point majeur restant à élucider est donc quelle est l'implication du SUP dans l'établissement des propriétés renforçantes des drogues d'abus in vivo. Le noyau accumbens (NAcc), un important point de convergence du circuit de la récompense, joue un rôle majeur dans ces propriétés renforçantes et participe à la transition entre un usage contrôlé et un usage compulsif des drogues. Le but de ce travail était donc d'évaluer la nécessité du SUP dans le NAcc de rongeurs lors du développement de comportements induits par les opioïdes. Nous avons dans un premier temps vérifié qu'une injection de morphine in vivo induisait bien une dégradation protéique dans le NAcc. Nous avons ensuite déterminé quelles étaient les conséquences de l'inhibition de la dégradation protéique, grâce à des injections locales de lactacystine, un inhibiteur du SUP, dans le NAcc, pendant l'établissement d'un grand nombre de paradigmes expérimentaux couramment utilisés pour tester les propriétés renforçantes des drogues. Ce travail nous a donc permis de définir clairement un rôle primordial de la dégradation protéique dans le NAcc lors de l'acquisition de comportements dirigés par les des effets renforçants opioïdes menant à l'addiction
Addiction is defined as a compulsive use of a substance despite negative consequences. High reinforcing properties of drugs of abuse lead to pathological usurpation of neural processes that normally serve reward-related learning. In recent years, it was shown that the transition to addiction depends on plastic changes in the reward system. These neuro-adaptations, such as synaptic plasticity and changes in neuronal morphology, share many similarities with mechanisms involved in long-term memory (LTM). In the hippocampus of rodents, protein degradation by the ubiquitin proteasome system (UPS) plays a crucial role in synaptic plasticity and memory. Nevertheless UPS activity is not restricted to hippocampal plasticity and long-term memory storage but is also involved in cellular adaptations induced by long-term morphine treatments in neuroblastoma cultures. An important question is, therefore, whether the UPS is necessary for the in vivo reinforcing properties of drugs of abuse. The nucleus accumbens (NAcc), an important point of convergence in the reward circuitry, plays a major role in the reinforcing properties of drugs of abuse and participate in the transition from recreational to compulsive drug use. The purpose of the present work was therefore to evaluate the necessity of UPS in the NAcc for the development of opiate-induced behaviors in rodents. First, we investigated whether injection of morphine in vivo could induce protein degradation in the NAcc. Then, our strategy was to determine the effects of protein degradation blockade by locally injecting lactacystin, a proteasome inhibitor, in the NAcc during the establishment of a wide range of standard behavioral paradigms commonly used to test morphine reinforcement. This strategy allowed us to provide compelling evidence for a role of protein degradation in the NAcc in the establishment of goal-directed behaviors induced by opiate reinforcing effects that lead to addiction

Le bon fonctionnement de notre organisme repose sur de nombreux réseaux de communication intercellulaires (neurotransmetteurs, hormones, facteurs de croissance, lymphokines, molécules d'adhésion, etc.) prolongés par les voies de signalisation intracellulaires. Les signaux moléculaires sont des ligands reconnus par des récepteurs exprimés à la surface des cellules cibles. La fixation du ligand à son récepteur déclenche des voies de signalisation intracellulaires qui commandent la réponse fonctionnelle. Mes travaux scientifiques m'ont conduit à étudier diverses voies de signalisation intracellulaires qui seront évoquées dans cette HDR avec une emphase particulière sur les études les plus récentes.
Les cellules de la réponse immune cellulaire, les lymphocytes T, reconnaissent leur antigène spécifique à l'aide d'un récepteur multi-protéique, le complexe TCR/CD3. Le contrôle de son expression de surface est essentiel car le nombre de récepteurs stimulés par l'antigène et la durée de cette interaction déterminent la réponse fonctionnelle. Au cours de ma thèse au Centre d'Immunologie de Marseille-Luminy, j'ai participé à l'étude des mécanismes qui contrôlent l'expression de surface du récepteur et son internalisation suite à l'interaction avec l'antigène. Ces travaux ont permis 1) de corroborer que l'expression de surface du complexe TCR/CD3 est dépendante de l'assemblage complet de toutes les sous-unités qui le composent, 2) et surtout d'aborder le lien entre voies de signalisation associées au complexe TCR/CD3 et son internalisation stimulées par la liaison d'un ligand spécifique.
Le récepteur aux poly-immunoglobulines (pIgR) exprimé à la surface des cellules épithéliales qui tapissent la cavité interne de nos organes transcytose les anticorps sécrétés dans le milieu basal vers le lumen. Ainsi, ce récepteur approvisionne-t-il continuellement les sécrétions mucosales en anticorps (pIgA et pIgM). La forte augmentation de la quantité d'anticorps produits en réponse à une infection nécessite un transport accru de ces anticorps vers les surfaces mucosales à protéger. Pendant mon stage post-doctoral à UCSF (University of California, San Francisco) j'ai contribué 1) à montrer que la liaison des pIgA au pIgR stimulait une voie de signalisation, 2) à décrire au niveau moléculaire le fonctionnement de cette voie de signalisation, 3) à montrer in vivo que cette voie de signalisation stimule fortement la transcytose des pIgAs.
Les épithéliums représentent une barrière à la pénétration d'agents pathogènes mais également une surface d'échange avec le milieu extérieur. Pour accomplir leurs fonctions les cellules épithéliales maintiennent un phénotype polarisé avec un coté orienté vers les tissus sous-jacents (pôle basal) et un autre tourné vers le milieu extérieur (pôle apical). Ces cellules doivent établir entre elles des contacts physiques pour maintenir la cohésion de l'ensemble du tissu qu'elles constituent. Les contacts cellulaires sont assurés par des molécules d'adhésion (E-cadhérine) qui se comportent comme des récepteurs couplés à des voies de signalisation transduisant notamment des signaux qui participent au maintien de la polarité épithéliale. Depuis mon arrivée à l'IPMC (Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire), j'ai mis au jour une nouvelle voie de signalisation associée aux molécules de E-cadhérine qui comprend un facteur d'échange (EFA6) et son substrat la petite protéine G Arf6. Cette voie de régulation contrôle notamment la mise en place de la structure moléculaire, appelée jonction étroite, qui régule les échanges paracellulaires de l'épithélium et contribue à la polarité épithéliale. EFA6, connecté à deux voies de signalisation qui agissent de façon coordonnée, participe à l'organisation du cytosquelette d'actine qui soutient la jonction étroite. Par ailleurs, nous avons trouvé que le niveau d'expression d'EFA6 est étroitement régulé pendant le développement de la polarité. Cette régulation post-traductionnelle est assurée par la machinerie de dégradation cytosolique appelée système ubiquitine-protéasome. Nous avons identifié certains acteurs de cette voie de régulation et commencé de montrer son importance pour le développement et le maintien de la polarité épithéliale. Les résultats les plus récents pointent vers un rôle de ces protéines dans les cancers épithéliaux qui se caractérisent toujours par une perte de la polarité cellulaire.

Au cours du développement des vertébrés, l'activité morphogénétique de la protéine Sonic hedgehog (Shh) passe par les facteurs de transcription Gli. Lors de mon travail de thèse, je me suis intéressé à la régulation des protéines Gli3 et Gli1 par le système Ubiquitine-Protéasome. En absence de signal Shh et suite à sa phosphorylation par la PKA, Gli3 est délété de son domaine de transactivation pour former un répresseur transcriptionnel. L'Ubiquitine-ligase SCFßTrCP se lie à Gli3, favorise son ubiquitination et est nécéssaire à sa dégradation partielle dépendante du Protéasome 26S. Gli1 interagit avec ßTrCP et peut être ubiquitiné sans de maturation protéolytique. En revanche, la transactivation induite par Shh et Gli1 est inhibée par un inhibiteur du Protéasome, et requiert la présence de ßTrCP. Une étude plus approfondie de la régulation des protéines Gli par le SCFßTrCP et la PKA permettrait de mieux comprendre ce rôle double et antagoniste de ßTrCP dans la signalisation Shh
In vertebrates, Sonic hedgehog (Shh) morphogenetic activities are mediated by Gli transcription factors. My PhD work has focused on Gli3 and Gli1 regulation by the Ubiquitin-Proteasome pathway. Upon PKA phosphorylation, the deletion of Gli3 carboxyterminal transactivation domain generates transcriptional repressor. The SCF-type E3 Ubiquitin-ligase component ßTrCP is required for Gli3 proteolytic processing, binds to Gli3 and promotes its poly-ubiquitination. Gli1 binds ßTrCP and can be ubiquitinated, without any proteolytic processing. Shh and Gli1-dependant transactivation can be blocked by a Proteasome inhibitor as well as by downregulating ßTrCP expression by RNA interference. This work could establish that the SCFßTrCP complex participates in Shh signaling both in a negative and a positive manner. Further studies should unravel the unusual mechanisms likely involved in controlling Gli proteins by SCFßTrCP and PKA/GSK3ß activities

Les papillomavirus humains (HPV) constituent l’archétype des virus à ADN oncogènes. Les HPV muqueux à haut risque (principalement HPV16) sont les principaux agents étiologiques du cancer du col utérin. Les protéines virales E6 et E7 sont des acteurs cruciaux de la cancérogenèse induite par HPV. Nous avons construit une ressource composée de 600 ADNc codant les effecteurs humains du système ubiquitine-protéasome (UPS) et identifié de nouvelles cibles potentielles des protéines E6 et E7 en utilisant une méthode basée sur la complémentation protéique de la Gaussia princeps luciférase (GPCA). HPV16 E6 lie les motifs LxxLL présents dans E6AP et IRF3. Nous avons résolu la structure cristallographique des complexes E6/LxxLL de E6AP/p53 et E6/LxxLL de IRF3. Par ailleurs, nous avons montré que les HPV ciblent une nouvelle voie suppresseur de tumeurs, la voie Hippo, avec ses deux médiateurs clef YAP et TAZ. Nous avons généré une banque d’ADNc codant 265 domaines PDZ humains et identifié de nouveaux partenaires potentiels des protéines YAP/TAZ en utilisant la méthode GPCA. Les résultats obtenus permettent de mieux comprendre la biologie des HPV et leur pouvoir oncogène
The human papillomavirus (HPVs) are the archetype of DNA oncogenic viruses. High-risk mucosal HPVs (mainly HPV16) are the main causative agents of cervical cancer and are also involved in other cancers. HPV oncogenic properties are mainly due to the expression of E6 and E7 proteins. We built a resource composed of 600 cDNA encoding the human ubiquitin-proteasome system (UPS) effectors and identified novel E6 and E7 potential targets by using a method based on the complementation of the Gaussia princeps luciferase (GPCA). HPV16 E6 binds to specific LxxLL motifs present in E6AP and IRF3. We have solved the crystallographic structure of the E6/E6AP LxxLL/p53 and E6/IRF3 LxxLL complexes. Furthermore, HPV may target a novel tumour suppressor pathway, the Hippo signalling pathway with its two main mediators YAP and TAZ. We have built a cDNA library dedicated to the 265 human PDZ domains and identified news potential partners of YAP and TAZ proteins by using the GPCA. The results provide novel insights on HPV biology and their oncogenic property

Les activités de recherche présentées dans ce document s'articulent en deux parties distinctes. La première partie concerne des travaux réalisés au sein de l'équipe du Pr Guy Serre, à la faculté de Médecine Purpan et portant sur la caractérisation des antigènes cibles d'auto-anticorps associés à une maladie auto-immune, la polyarthrite rhumatoïde. La seconde partie, réalisée au sein de l'Unité Mixte CNRS-Pierre Fabre dirigée par le Pr Jean-Edouard Gairin, est centrée sur l'étude d'un système biologique impliqué dans la dégradation des protéines intracellulaires, le système ubiquitine-protéasome et pouvant générer des cibles d'intérêt thérapeutique dans le domaine du cancer.

1. La polyarthrite rhumatoïde et les auto-anticorps anti-protéines citrullinées :

La polyarthrite rhumatoïde est une maladie auto-immune d'étiologie inconnue, caractérisée par une inflammation chronique et destructive des articulations synoviales. Le processus auto-immun rhumatoïde fait l'objet d'intenses recherches et bien que des progrès importants aient été réalisés dans la compréhension de certains mécanismes immuno-pathologiques mis en jeu, il n'a pas été possible d'identifier un élément unique comme responsable du processus inflammatoire auto-immun. Il est donc communément admis aujourd'hui que c'est la combinaison de divers facteurs qui détermine l'apparition et l'entretien de la maladie.
La présence dans le sérum des patients, d'anticorps décrits pour leur marquage du Stratum Corneum (ou couche cornée) de l'épithélium d'œsophage de rat et de l'épiderme humain, s'est avérée comme une caractéristique suffisamment fréquente et spécifique de la maladie rhumatoïde pour qu'on puisse les suspecter de jouer un rôle significatif dans les processus responsables de l'inflammation articulaire chronique. Afin de mieux comprendre le rôle joué par ces auto-anticorps qualifiés alors d'anticorps « anti-kératines » dans la pathogénie rhumatoïde, il était essentiel d'identifier leur cible antigénique. L'analyse par immunotransfert, à l'aide de sérums rhumatoïdes, d'extraits d'épithélium d'œsophage de rat a permis de détecter, comme cibles murines des auto-anticorps, trois antigènes solubles dans des tampons de faible force ionique. Ces trois protéines ne correspondent pas à des cytokératines mais à de nouvelles protéines spécifiques des étapes tardives du programme de différenciation de l'épithélium d'œsophage de rat. D'autre part, l'antigène ciblé dans l'épiderme humain a été identifié à un variant acide de la filaggrine, protéine jouant un rôle physiologique dans l'agrégation des filaments de kératines de l'épiderme. Ces formes acides sont générées in situ par modification post-traductionnelle des résidus arginine basiques en résidus citrulline par une enzyme, la peptidyl arginine déiminase, exprimée dans l'épiderme. Cette modification a pu être reproduite in vitro après action de la peptidyl-arginine déiminase (PAD) sur divers polypeptides dérivés de la séquence de la filaggrine et il a été ainsi montré que les épitopes reconnus par les auto-anticorps pouvaient être générés par la déimination post-traductionnelle des filaggrines.
Toutefois, la filaggrine n'étant pas exprimée dans les tissus osseux et synoviaux, nous avons recherché une cible articulaire de ces anticorps portant des épitopes déiminés et immunologiquement apparentée à la filaggrine. Ayant à disposition des tissus synoviaux provenant d'une série de patients, deux protéines, p55-61 et p64-78, portant toutes deux des résidus citrullines ont été extraites des membranes synoviales et reconnues spécifiquement par les sérums rhumatoïdes; ces protéines ont été identifiées aux chaînes a et b de la fibrine. Le fait que ces deux protéines ne soient ciblées par les sérums rhumatoïdes qu'après déimination par une PAD, soulignait soulignait le rôle émergent d'une « immunité anti-citrulline » reconnue aujourd'hui comme pouvant être à la base de certains dérèglements impliqués dans diverses maladies auto-immunes.

2- Le système ubiquitine-protéasome et ses implications dans le cancer :

Le protéasome est un complexe multicatalytique présent dans le cytoplasme et le noyau de toutes les cellules eucaryotes. Il constitue la machinerie protéolytique de la voie ubiquitine-protéasome, voie majeure responsable de la dégradation des protéines intracellulaires. Cette voie détermine la durée de vie et la concentration de nombreuses enzymes et protéines régulatrices dont beaucoup jouent un rôle dans les processus de cancérisation.
Afin de mieux connaître le fonctionnement de cette machinerie protéolytique, nous avons étudié les mécanismes moléculaires intervenant dans la régulation du protéasome 20S qui constitue le cœur catalytique du système. L'analyse protéomique du protéasome 20S préparé à partir de cellules humaines non pathologiques a permis l'identification de l'ensemble des sous-unités constitutives du protéasome 20S et a révélé l'existence de modifications post-traductionnelles de type phosphorylation. Deux nouvelles sous-unités phosphorylées , les sous-unités b2 et b7, ont pu être identifiées posant ainsi la question du rôle joué par ces phosphorylations dans la régulation fonctionnelle du protéasome 20S.
L'analyse similaire des protéasomes exprimés dans diverses lignées tumorales a révélé une complexité structurale importante avec en particulier la co-expression de deux formes de protéasomes : le protéasome dit standard et l'immunoprotéasome. L'étude fonctionnelle de ces protéasomes a montré une sensibilité différente de ces deux formes à certaines molécules de la chimiothèque de substances naturelles purifiées dans l'UMS de Chimie CNRS-Pierre Fabre. En accord avec ceci, l'analyse comparative des protéasomes présents dans les cellules normales comparées à ceux présents dans les cellules tumorales d'un même patient a confirmé la surexpression de l'immunoprotéasome dans les cellules cancéreuses. Le système ubiquitine-protéasome est un système cellulaire particulièrement sensible aux facteurs micro-environnementaux et l'induction de l'immunoprotéasome témoigne de ce processus. Dans ce contexte, nos résultats font émerger la question de l'impact de l'immunoprotéasome sur la dérégulation du système ubiquitine-protéasome dans la cellule tumorale. Afin de répondre à cette question, des lignées de lymphomes surexprimant l'immunoprotéasome ont été développées ainsi que des substrats peptidiques fluorescents spécifiques de l'immunoprotéasome ou du protéasome.
Outre une meilleure connaissance de cette machinerie protéolytique, la continuité de ce travail devrait aboutir à l'identification de nouveaux agents pharmacologiques anti-tumoraux. Enfin, il s'intègre pleinement dans la logique de l'UMR 2587 CNRS-Pierre Fabre en témoignant d'un effort de recherche focalisé sur des systèmes biologiques pouvant générer des cibles d'intérêt thérapeutique dans le domaine du cancer.

Le syndrome de l’intestin irritable (SII) est un trouble fonctionnel d’origine multifactorielle, impliquant des facteurs environnementaux tels que le stress, l’alimentation et met en jeu un dysfonctionnement de l’axe intestin-cerveau, une micro-inflammation, une dysbiose et une hyperperméabilité intestinale. Le rôle du protéasome dans la régulation de la barrière intestinale au cours du SII a été étudié. De plus, ces troubles fonctionnels intestinaux (TFI) ont également été décrits comme exacerbés chez des patients souffrant d’obésité, dont la physiopathologie est complexe. Néanmoins, les mécanismes impliqués dans cette association restent mal compris et ont donc été recherchés. Dans ce travail, des modèles murins « SII-like » comme le modèle de stress « water avoidance stress » ou WAS et le modèle post-inflammatoire « post-TNBS » ont été utilisés afin d’étudier l’impact d’une inhibition du protéasome sur la régulation de la perméabilité intestinale. L’inhibition pharmacologique du protéasome par le PR-957 ou l’utilisation de souris invalidées pour une sous unité β2i du protéasome limite l’hyperperméabilité intestinale. Une supplémentation orale en glutamine permet également de diminuer la perméabilité intestinale. Une étude protéomique au niveau colique des souris WAS et une étude de l’ubiquitome colique de patients souffrant de SII à profil diarrhéique confirment l’implication du protéasome dans la physiopathologie du SII. Nous avons ensuite cherché à comprendre le lien entre l’obésité et le SII en combinant des modèles d’obésité (génétique et induite par une alimentation riche en graisses ou HFD) et le modèle WAS. Seules les souris HFD présentent une exacerbation de l’hyperperméabilité intestinale et une corticostéronémie plasmatique élevée en réponse au modèle WAS. Des études complémentaires suggèrent que ces résultats sont indépendants de la leptine, de la glycémie et du microbiote intestinal. Nos travaux proposent donc de nouvelles pistes de prise en charge des patients souffrant de SII, par intervention nutritionnelle via la glutamine ou en utilisant le protéasome comme cible thérapeutique. Nous suggérons également un rôle de l’alimentation (riche en graisse) dans le développement des TFI au cours de l’obésité
Irritable bowel syndrome (IBS) is a multifactorial functional disorder, involving environmental factors (stress and diet for instance), gut-brain-axis dysfunction, micro-inflammation, dysbiosis and an alteration of intestinal permeability. The role of the proteasome in the regulation of the intestinal barrier during IBS has been studied. In addition, these intestinal functional disorders have also been described in patients with obesity. Nevertheless, the mechanisms underlying an association of intestinal functional disorders in the obesity context, remain poorly understood and have therefore been investigated in this thesis. In this study, "IBS-like" mouse models such as water avoidance stress (WAS) and the post-inflammatory (post-TNBS) models, were used to study the impact of proteasome inhibition on the regulation of intestinal permeability. We found that the pharmacological inhibition of the proteasome (with PR-957) or the use of knock-out mice for a subunit of the proteasome (β2i -/-) limit intestinal hyperpermeability occured in IBS-Like models. Moreover, we found that oral supplementation with glutamine also reduces intestinal hyperpermeability, wich, thus, can be considered as a putative nutritional treatment for IBS. A colonic proteomic study of WAS mice and a study of colonic ubiquitoma in IBS patients with diarrheal profiles confirmed the involvement of proteasome in the pathophysiology of IBS. Therefore, the link between obesity and IBS was examined by combining models of obesity (ob/ob genetic and high-fat diet [HFD] models) with WAS model. Only HFD mice displayed enhanced intestinal hyperpermeability and higher plasma corticosterone levels in response to WAS. Further studies suggest that these results, themselve, are independent of leptin, glycaemia and gut microbiota. This study paves new ways of treating patients suffering from IBS, by nutritional intervention via glutamine or by using the proteasome as a therapeutic target. We also suggest a role of diet (high fat) in the development of intestinal functional disorders during obesity