Добірка наукової літератури з теми "Système de Sécrétion de Type IV Cag"

Cette thèse est divisée en deux thématiques.La première porte sur le système de Sécrétion de TypeIV cag (cag-SST4) d’Helicobacter pylori. Il s’agit d’une machinerie de sécrétion complexe enchâssée dans l’enveloppe cellulaire de la bactérie, lui permettant d’injecter l’oncoprotéine CagA dans les cellules épithéliales gastriques humaines. Cette toxine est considérée comme un facteur de virulence majeur d’H. pylori. Elle interagit avec des protéines de l’hôte, perturbant la signalisation cellulaire et entraînant des modifications pouvant favoriser le développement de maladies gastrointestinales, y compris des ulcères et des cancers gastriques. Le cag-SST4 est subdivisé en trois parties : (i) un complexe de membrane interne, composé essentiellement d’ATPases fournissant l’énergie nécessaire à son assemblage et/ ou son fonctionnement ; (ii) un complexe de membrane externe, ou complexe core, formant un canal qui relie les membranes interne et externe et (iii) un pilus extracellulaire, dont l’existence est toujours controversée, et qui permettrait d’établir un contact entre la bactérie et sa cible, et éventuellement de transférer les substrats à travers la membrane de l’hôte.Un premier projet porte sur le pilus extracellulaire. L’objectif est d’obtenir des données concernant une interaction supposée entre les protéines CagI et CagL, essentielles à la sécrétion et pressenties pour entrer dans la composition du pilus. Nous avons surexprimé des versions recombinantes de ces protéines chez Escherichia coli et nous les avons co-purifiées par chromatographie d’affinité, démontrant ainsi une interaction directe entre elles. La capacité de DARPins et Nanobodies de lier ce complexe a été testée. L’analyse de ces complexes a également été entreprise par cryo-microscopie électronique (cryoME).Le second projet porte sur le complexe core avec pour objectif d’obtenir sa structure à haute résolution afin d’éclaircir les zones d’ombre qui persistent concernant cet imposant assemblage. Différentes techniques ont été mises en œuvre afin de pouvoir solubiliser ce complexe. Sa purification reste à optimiser afin de pouvoir envisager une analyse en cryoME. L’obtention de telles structures pourrait permettre de mieux comprendre le fonctionnement du cag-SST4 et d’envisager des stratégies permettant d’inhiber son assemblage et/ ou son fonctionnement, privant ainsi H. pylori d’un facteur de virulence majeur.La seconde thématique porte sur les spirosomes bactériens. L’enzyme AdhE est très conservée dans le règne bactérien et chez certains organismes eucaryotes. Il s’agit d’une enzyme bifonctionnelle alcool/ aldéhyde déshydrogénase, responsable de la conversion de l’acétyl-CoA en acétaldéhyde puis en éthanol au cours de la fermentation alcoolique en anaérobie. Cette enzyme est communément retrouvée sous sa forme oligomérique, appelée spirosome. En fonction des ligands présents dans le milieu, les spirosomes d’E. coli peuvent se présenter dans une conformation compacte ou étendue, cette dernière constituant la forme active de l’enzyme. Contrairement aux spirosomes d’E. coli, ceux de Streptococcus pneumoniae sont naturellement stabilisés dans leur conformation étendue.L’objectif de ce projet est de comprendre quels sont les mécanismes à l’origine de cette différence de conformation. La cryoME nous a permis d’obtenir une structure à haute résolution du spirosome de S. pneumoniae et ainsi de pouvoir la comparer à celle du spirosome étendu d’E. coli. Des expériences de mutagenèse fonctionnelle avec complémentation nous ont permis de déterminer quels sont les résidus impliqués dans l’extension de ces spirosomes. Etant impliqués dans la pathogénicité et révélés indispensables à la physiologie bactérienne en l’absence d’oxygène, l’étude approfondie de leur conformation pourrait donc mener à la découverte de molécules capables de réguler leur activité, ce qui pourrait présenter un intérêt majeur dans les domaines des biotechnologies et de la santé
This thesis is divided into two themes.The first theme focuses on the cag Type IV secretion system (cag-T4SS) of the bacterium Helicobacter pylori. This is a complex secretion machinery embedded in the bacterium's cellular envelope, enabling it to inject the CagA oncoprotein into human gastric epithelial cells. This toxin is considered a major virulence factor of H. pylori. It interacts with host proteins, disrupting cell signaling and leading to changes that can promote the development of gastrointestinal diseases, including gastric ulcers and cancers. The cag-T4SS is subdivided into three parts: (i) an inner membrane complex, composed essentially of ATPases providing the energy required for its assembly and/or its function; (ii) an outer membrane complex, or core complex, forming a channel that connects the inner and outer membranes; and (iii) an extracellular pilus, the existence of which is still controversial, and which would establish contact between the bacterium and its target, and possibly transfer substrates across the host membrane.The first project focuses on the extracellular pilus. The aim is to obtain data concerning a putative interaction between the CagI and CagL proteins, which are essential for secretion and are thought to be involved in the composition of the cag-T4SS pilus. We overexpressed recombinant versions of these proteins in Escherichia coli and co-purified them by affinity chromatography, demonstrating a direct interaction between them. The ability of DARPins and Nanobodies to bind this complex was tested. Analysis of these complexes was also undertaken by cryo-electron microscopy (cryoEM).The second project focuses on the core complex, with the aim of obtaining its structure at high resolution in order to shed light on the remaining grey areas concerning this imposing assembly. Various techniques have been used to solubilize this complex. Its purification remains to be optimized before it can be analyzed by cryoEM. Obtaining such structures could lead to a better understanding of how cag-T4SS functions, and to consider strategies to inhibit its assembly and/or function, thus depriving H. pylori of a major virulence factor.The second theme concerns bacterial spirosomes. The AdhE enzyme is highly conserved in the bacterial kingdom and in certain eukaryotic organisms. It is a bifunctional alcohol/aldehyde dehydrogenase enzyme, responsible for the conversion of acetyl-CoA to acetaldehyde and then to ethanol during anaerobic alcoholic fermentation. This enzyme is commonly found in its oligomeric form, known as spirosome. Depending on the ligands present in the medium, E. coli spirosomes can have a compact or extended conformation, the latter constituting the active form of the enzyme. Unlike E. coli spirosomes, Streptococcus pneumoniae ones are naturally stabilized in their extended conformation.The aim of this project is to understand the mechanisms behind this conformational difference. CryoEM enabled us to obtain a high-resolution structure of the S. pneumoniae spirosome and thus comparing it with the extended E. coli spirosome. Functional mutagenesis experiments with complementation enabled us to determine which residues are involved in the extension of these spirosomes. As they are involved in pathogenicity and have been shown to be essential to bacterial physiology in the absence of oxygen, in-depth study of their conformation could lead to the discovery of molecules capable of regulating their activity, which could be of major interest in the fields of biotechnology and healthcare

Wolbachia est une bactérie Gram(-) intracellulaire modifiant la reproduction de nombreux arthropodes. Chez l'isopode Armadillidium vulgare, la souche wVulC entraîne la féminisation des mâles. Nous avons caractérisé deux opérons vir s'exprimant dans tous les tissus hôtes et codant un système de sécrétion de type IV (T4SS) pouvant permettre d'exporter des effecteurs bactériens vers le cytoplasme de l'hôte. La comparaison des séquences et de l'organisation des gènes de 37 souches de Wolbachia a révélé la forte conservation des deux opérons vir suggérant l'importance du T4SS dans la biologie de la bactérie. Nous avons également identifié, dans le génome en cours de séquençage de wVulC, 66 gènes codant des protéines à domaines ankyrines. Ces motifs forment des sites d'interactions protéine-protéine chez les eucaryotes et sont supposés être impliqués chez Wolbachia dans l'interaction avec des protéines de l'hôte. Nous avons montré qu'une des trois copies du gène pk2 de wVulC, n'est exprimée que chez des souches féminisantes mais chez aucune des 3 souches induisant l'incompatibilité cytoplasmique chez les isopodes terrestres. Ce produit du gène pk2 pourrait être impliqué dans la féminisation de l'hôte. Toutefois, nous avons réalisé des tests d'interaction par double-hybride en levures et par la méthode CRAfT (Cre-recombinase Reporter Assay for Translocation) entre les protéines du T4SS et cinq protéines à domaines ankyrines dont Pk2 afin de savoir si ces dernières étaient sécrétées par ce système. Les résultats montrent qu'aucun des cinq produits de gènes ank testés n'est sécrété par la bactérie mais se révèlent encourageants pour identifier les effecteurs de Wolbachia.

Wolbachia est une bactérie Gram(-) intracellulaire modifiant la reproduction de nombreux arthropodes. Chez l'isopode Armadillidium vulgare, la souche wVulC entraîne la féminisation des mâles. Nous avons caractérisé deux opérons vir s’exprimant dans tous les tissus hôtes et codant un système de sécrétion de type IV (T4SS) pouvant permettre d'exporter des effecteurs bactériens vers le cytoplasme de l'hôte. La comparaison des séquences et de l'organisation des gènes de 37 souches de Wolbachia a révélé la forte conservation des deux opérons vir suggérant l'importance du T4SS dans la biologie de la bactérie. Nous avons également identifié, dans le génome en cours de séquençage de wVulC, 66 gènes codant des protéines à domaines ankyrines. Ces motifs forment des sites d'interactions protéine-protéine chez les eucaryotes et sont supposés être impliqués chez Wolbachia dans l'interaction avec des protéines de l’hôte. Nous avons montré qu'une des trois copies du gène pk2 de wVulC, n'est exprimée que chez des souches féminisantes mais chez aucune des 3 souches induisant l’incompatibilité cytoplasmique chez les isopodes terrestres. Ce produit du gène pk2 pourrait être impliqué dans la féminisation de l’hôte. Toutefois, nous avons réalisé des tests d'interaction par double-hybride en levures et par la méthode CRAfT (Crerecombinase Reporter Assay for Translocation) entre les protéines du T4SS et cinq protéines à domaines ankyrines dont Pk2 afin de savoir si ces dernières étaient sécrétées par ce système. Les résultats montrent qu'aucun des cinq produits de gènes ank testés n'est sécrété par la bactérie mais se révèlent encourageants pour identifier les effecteurs de Wolbachia
Wolbachia are intracellular Gram(-) bacteria that are reproductive manipulators of many arthropods. In the isopod Armadillidium vulgare, the Wolbachia wVulC strain induces male feminization. Here, we characterized two vir operons which are expressed in all host tissues and which encode a type IV secretion system (T4SS) used to translocate bacterial effectors into host cytoplasm. Gene organization and sequence comparison in 37 Wolbachia strains highlighted the high conservation of both vir operons and their importance for the biology of the bacteria. We also identified in the on-going assembly of the wVulC genome, 66 ankyrin domain-encoding genes. Ankyrin motifs are known to mediate protein-protein interactions in eukaryotic organisms and thus are suggested to mediate in Wolbachia the interaction with host molecules. We showed that one of the three copies of the wVulC pk2 gene is only expressed in feminizing strains but not in the three strains inducing cytoplasmic incompatibility in terrestrial isopods. The associated Pk2 protein could be involved in male feminization. We thus tested the interaction between three T4SS proteins and five ankyrins (including Pk2) via the yeast twohybrid and CRAfT (Cre-recombinase Reporter Assay for Translocation) methods. None of the five ankyrin proteins were revealed to be secreted by the wVulC strain. Nevertheless, this promising approach may enable us to identify Wolbachia effectors

Les bactéries du genre Brucella sont des pathogènes intracellulaires facultatifs qui ont développé la capacité de survivre et de se répliquer dans des phagocytes professionnels et non professionnels. Le système de sécrétion de type IV (T4SS), VirB, est un facteur de virulence déterminant utilisé par Brucella. Il est probable qu’il délivre des protéines effectrices directement dans la cellule eucaryote, où ces molécules perturbent la biologie de la cellule. Les mutants VirB ont perdu la capacité de perturber le trafic des vésicules, essentielle à l’établissement de la niche de réplication intracellulaire de la bactérie. Les modèles structuraux suggèrent que la machinerie du T4SS est composée d’ATPases associées à la membrane interne, d’un pore transmembranaire putatif et d’un pilus exposé à la surface de la bactérie. Les mécanismes de l’interaction entre le T4SS et la cellule hôte ne sont pas connus, mais les composants du pilus sont les premiers candidats de cette interaction. Récemment, des protéines de plantes qui interagissent avec le pilus VirB d’Agrobacterium tumefaciens ont été identifiées. Nous avons utilisé les protéines VirB2 et VirB5 de B. Suis comme appâts pour cribler une banque d’ADNc de cellules HeLa pour identifier les « host interacting proteins » (HIPs). Trois HIPs interagissant avec VirB2 et une interagissant avec VirB5 ont été identifiées. Les trois Hips de VirB2 sont des protéines membranaires : CD98hc est une protéine de surface cellulaire qui agit comme récepteur de certains virus et module l’activité des intégrines, LZIP est un activateur transcriptionnel impliqué dans la réponse aux infections virales et MCL-1 est un facteur anti-apoptotique. La protéine Galectine-1 qui interagit avec VirB5 est une « lectin like ». Par microscopie confocale nous avons trouvé que la protéine CD98 est recrutée dès le début de l’infection autour des vacuoles qui contiennent la souche sauvage de B. Suis, mais non autour de celles qui renferment un mutant virB. De plus, nous avons montré en utilisant des cellules cd98hc-/- que CD98hc est impliqué dans l’internalisation de Brucella (indépendamment de VirB2) et de Listeria monocytogenes mais CD98hc n’a aucun effet sur l’entrée de Salmonella enteritica serovar Typhimurium
Bacteria of the genus Brucella are facultative intracellular pathogens which have developed the ability to survive and replicate in professional and non-professsional phagocytes. The VirB type IV secretion system (T4SS) is a key virulence determinant used by Brucella, thought to deliver effector proteins directly into eukaryotic host cells, where these molecules subvert host cell biology. VirB mutants have lost the ability to perturb vesicular trafficking essential for the establishment of the bacterium's intracellular replication niche. Structural models suggest that the T4SS machinery is composed of inner membrane associated ATPases, a putative pore structure spanning the envelope, and a pilus like appendage exposed on the bacterial surface. It is not known how the T4SS interacts with the host cell, however the components of the pilus are prime candidates. Recently, plant proteins that interact with the Agrobacterium VirB pilus have been identified. We used the B. Suis VirB2 and VirB5 proteins as baits to screen a Hela cell cDNA library to identify « host interacting proteins » (HIPs). Three HIPs interacting with VirB2 and one interacting with VirB5 were identified. The three VirB2 HIPs are membrane proteins; CD98hc is a cell surface protein that acts as a receptor for certain viruses and modulates integrins functions, LZIP is a transcriptional activator involved in the response to viral infections and MCL-1 is an anti-apoptotic factor. The protein Galectin-1 that interacts with VirB5 is a lectin like. With confocal microscopy, we find that CD98 is recruited to wild type, but not virB- Brucella containing phagosomes from the early stages of infection. Furthermore, we showed using cd98hc-/- cells that CD98hc is involved in Brucella (in a VirB2 independent manner) and Listeria monocytogenes internalization into the host cells but, it has no effect on Salmonella enteritica serovar Typhimurium entry

Wolbachia est une bactérie intra-cellulaire stricte qui infecte certains nématodes filaires et un grand nombre d'arthropodes. Chez la plupart des insectes, Wolbachia est considérée comme parasite de la reproduction. Néanmoins, chez l'hyménoptère Asobara tabida, la bactérie est devenue obligatoire à l'accomplissement de l'ovogenèse. Malgré l'intétêt scientifique porté à Wolbachia, les mécanismes moléculaires impliqués dans les interactions avec ses hôtes peu connus. Le séquençage des génomes de souches Wolbachia a mis en évidence la présence des gènes codant le système de sécrétion de type IV ( SST4) souvent engagé dans le dialogue bactéries-hôtes. Dans ce contexte, le travail de cette thèse consistait à développer des outils permettant la manipulation de la bactérie puis à étudier la fonctionnalité du SST4 chez Wolbachia. Un anticorps ciblant la protéine VirB6 du SST4 a été produit et a permis de confirmer la fontionnalité du translocon in cellulo et in insecta
Wolbachia is a strict intracellular bacterium which infects certain filarial nematodes and a great number of arthropods. For the marjority of insects, Wolbachia is considered a reproductive parasite. Nevertheless, in hymenoptera Asobara tabida, the bacterium became obligatory for insect oogenesis. Despite the scientific interest carried with Wolbachia, the molecular mechanisms implied in the interactions with its hosts are poorly knwn. The sequencing Wolbachia genomes highlighted the presence of genes encoding the type IV secretion system ( T4SS) often involved in the dialogue between bacteria and hosts. In the context, this study consisted in developing tools to handle the bacterium, then to decipher the functionality of the T4SS in Wolbachia. Polyclonal antibodies raised against the VirB6 protein was produced and confirmed the functionality of the T4SS translocon in cellulo and in insecta

Helicobacter pylori est une bactérie qui colonise les cellules épithéliales gastriques humaines. Une des conséquences de cette infection est l'induction de cancers de l'estomac dans 1 à 3 % des cas, via l'injection d'une cytotoxine appelée CagA qui dérégule les voies de signalisation des cellules cibles. Cette injection, dont le mécanisme est encore inconnu, se fait grâce à un système de sécrétion de type IV (T4SS). Le pilus du cagT4SS est encore mal caractérisé. Les protéines CagI, CagL et CagH sont essentielles à la fonctionnalité du cagT4SS et à la biogenèse du pilus. De plus les trois protéines forment un sous-complexe dont les détails moléculaires n'ont pas encore été élucidés. Par conséquent mes études se sont focalisées sur ces trois protéines, leurs interactions et leur relation structure/fonction. J'ai mis en évidence que CagL interagissait directement avec CagI et CagH avec une affinité de l'ordre du micromolaire et que CagI et CagH n'interagissaient pas entre elles. La caractérisation de ces interactions a permis notamment d'identifier un complexe CagL-CagI. Afin de comprendre les détails structuraux de ce complexe, j'ai entrepris deux études structurales. La première consiste à déterminer les résidus de CagL impliqués dans l'interface d'interaction avec CagI par RMN. La seconde étude se focalise sur la détermination de la structure 3D du complexe CagI-CagL par microscopie électronique. Pour cela j'ai purifié le complexe CagI-CagL, monodisperse et stable en solution. Nous avons collecté des images du complexe par cryoEM et généré des classes 2D. Cette étude a permis pour la première fois de caractériser les interactions entre CagL-CagI-CagH et d'obtenir des informations structurales du complexe CagI-CagL
Helicobacter pylori is a bacterium that colonizes the human stomach in half of the world population. It is estimated that 20% and 3% of patients develop peptic ulcer and gastric cancer, respectively. For these reasons, H. pylori was identified as a group 1 carcinogen by the World Health Organization (WHO) in 1994. The most virulent strains of H. pylori carry a type IV secretion system (Cag-T4SS) responsible for the injection of the oncoprotein CagA into gastric epithelial cells. One remarkable feature of the cagT4SS is its external pilus which composition is not clear. CagL, CagH and CagI proteins are critical components of the Cag-T4SS because these proteins are necessary for CagA translocation and are involved in pilus formation. Moreover CagL forms a sub-assembly with CagI and CagH but the molecular details of the complex are still to be discovered. Our objective is to better understand the molecular basis of CagLIH complex by interaction and structural study. CagL interacts with CagI and CagH with a with Kds of 5 µM. CagI does not interact with CagH. The structural study of CagL/CagI complex has been investigated by a two-pronged approach. First I have purified the CagL/CagI complex and collected cyo-EM micrographs. In parallel I have collected NMR spectra of CagL in the presence of CagI and identify the changes in the spectra to determine the residues involved in the interaction. In this study we have, for the first time, characterize the CagL-CagI-CagH interactions and obtained structural informations of the CagI-CagL complex

Identifier les déterminants moléculaires des bactéries pathogènes et comprendre comment ils sont régulés pour permettre l’adaptation à l’environnement et à l’hôte est crucial pour imaginer des méthodes de contrôle innovantes et proposer des alternatives thérapeutiques. Ehrlichia ruminantium est une bactérie intracellulaire obligatoire de la famille des Anaplasmataceae, vectorisée par les tiques du genre Amblyomma et causant la cowdriose, une maladie fatale des ruminants. Dans le cadre de cette thèse, nous avons caractérisé certains déterminants du pouvoir pathogène d’E. Ruminantium selon trois niveaux de résolution différents. Une approche globale sans a priori, nous a tout d’abord permis de déterminer le protéome de la membrane externe de la forme infectieuse d’E. Ruminantium. Cette étude nous a permis d’avoir une meilleure vision de l’architecture de la membrane externe qui constitue la première interface d’échanges entre la bactérie et sa cellule hôte. Ensuite, nous avons montré la fonction d’ErxR comme régulateur central du système de sécrétion de type IV (SST4) et de la famille multigénique map1 en permettant d’intégrer les signaux environnementaux que sont la carence en fer et l’acidité du milieu. En outre, ce travail a permis d’établir pour la première fois le lien entre les protéines Map1 de la membrane externe et le SST4 et suggère donc qu’elles puissent avoir un rôle direct dans la virulence. Enfin, une analyse in silico utilisant le logiciel S4TE a conduit à la caractérisation d’Erip1, le premier effecteur du SST4 d’E. Ruminantium. Cet effecteur, phosphorylé sur les tyrosines et injecté dans le noyau de la cellule hôte, ne présente aucune homologie dans les bases de données et pourrait donc représenter une nouvelle famille de nucléomodulines. La recherche d’éventuels partenaires protéiques et l’identification des cibles intracellulaires de cet effecteur permettront de mieux comprendre comment E. Ruminantium manipule la cellule hôte à son profit. Enfin, la caractérisation des voies de signalisation ciblées par Erip1 sera riche d’enseignements sur la réponse cellulaire à l’infection par E. Ruminantium
Identify the molecular determinants of pathogenic bacteria and understand how they are controlled to allow adaptation to the environment and the host is crucial to develop innovative control methods and provide therapeutic alternatives. Ehrlichia ruminantium is an obligate intracellular bacterium of the family Anaplasmataceae, vectored by ticks of the genus Amblyomma and causing heartwater, a fatal disease of ruminants. As part of this thesis, we characterized some determinants of pathogenicity E. Ruminantium three levels of resolution different. A comprehensive approach without preconceptions, first of all we determined the proteome of the outer membrane of the infectious form of E. Ruminantium. This study will allowed to have a better vision of the architecture of the outer membrane, which is the first interface exchanges between the bacterium and its host cell. Then we showed the function of ErxR as a central regulator of the type IV secretion system (SST4) and map1 multigene family for integrating environmental signals that are iron deficiency and acidity of the medium. In addition, this work has established for the first link between Map1 proteins of the outer membrane and the SST4 and suggests that may have a direct role in virulence. Finally, an in silico analysis using the software S4TE led to the characterization of Erip1, the first effector SST4 E. Ruminantium. This effector phosphorylated tyrosines and injected into the nucleus of the host cell, removed no homology in the databases and may therefore represent a new family of nucleomodulines. Protein partners and identification of intracellular targets of the effector will better understand how E. Ruminantium manipulates the host cell to its advantage. Finally, channels of the characterization of signaling targeted Erip1 be instructive on the cellular response to infection E. Ruminantium

La superfamille des filaments de type IV (TFF) est un groupe de machines moléculaires localisées dans la membrane des bactéries et des archées. Ces machines associent des polymères protéiques de manière non-covalente appelés des pili, qui s’étendent depuis la cellule pour réaliser plusieurs fonctions qui ont évolué spécifiquement pour s’adapter à des organismes hôtes différents. La superfamille TFF comprend le système de sécrétion de type II (T2SS) et les pili de type IVa (T4aP). Le T2SS induit la sécrétion de substrats chez les bactéries Gram-négatives. Ces substrats sont en général des enzymes qui dégradent les complexes carbohydrates, le peptidoglycane, les lipides, ce qui à terme entraîne la libération de nutriments. Les T4aP sont de longues fibres flexibles qui sont ancrées dans la membrane et permettent de nombreuses fonctions. Le mécanisme par lequel le T2SS et les T4aP remplissent ces différentes fonctions n’est toujours pas entièrement compris. Pour comprendre le mécanisme de sécrétion du T2SS, nous avons étudié par RMN la structure de la pseudopiline OutG, le composant majeur du pseudopilus chez Dickeya dadantii. Dans une seconde partie, nous avions pour objectif d’aborder la structure et l’assemblage des pilines mineures, des protéines qui composent le T4P d’Escherichia coli entérohémorragique. Nous avons optimisé la surexpression, la purification et le marquage de les pilines mineures pour leur étude par RMN. De plus, la modélisation des pilines et le cross-linking ont été réalisés sur les échantillons de pseudopili T4P et T2SS purifiés en tant que méthodologie pour déterminer la structure et les interactions des pilines et pseudopilines au sein du pilus natif
The type IV filament (TFF) superfamily is a group of molecular machineries located in the membrane of bacteria and archaea. These machineries assemble non-covalent protein polymers called pili extending away from the cell to perform multiple functions which have evolved specifically to adapt to different host organisms. The TFF superfamily includes the type II secretion system (T2SS) and the type IVa pili (T4aP). The T2SS promotes the secretion of substrates in Gram-negative bacteria. These substrates are in general enzymes degrading complex carbohydrates, peptidoglycan, and lipids, resulting in the release of nutrients. The T4aP are long flexible fibres anchored in the membrane and enable various functions such as twitching motility, DNA uptake and biofilm formation. The mechanism by which the T2SS and T4aP pilus fulfil their different functions is still not completely understood. To understand the mechanism of secretion by T2SS, we studied the structure of the pseudopilin OutG, the major component of the pseudopilus in Dickeya dadantii by Nuclear Magnetic Resonance (NMR). In a second part, we aimed to address the structure and the assembly of minor pilins, protein components of Enterohemorrhagic Escherichia coli T4aP. We optimised the overexpression, purification and labelling of the minor pilins for their structural study by NMR. Furthermore, molecular modelling of the minor pilins and crosslinking mass spectrometry were performed on whole T4aP and T2SS pseudopili purified samples as a methodology to determine the structure and the interactions of pilins and pseudopilins within the native pilus

Legionella pneumophila est une bactérie aquatique qui prolifère en se répliquant à l’intérieur de cellules amibiennes. Elle peut persister dans ces environnements en vivant en communauté sous forme de biofilms. L’inhalation par l’Homme d’eau contaminée, vaporisée par les réseaux d’eau chaude ou les tours aéro‐réfrigérantes, peut mener à l’infection des macrophages pulmonaires qui se traduit par une grave pneumonie appelée légionellose. Le di‐GMP cyclique (diGMPc) est impliqué, chez diverses espèces bactériennes, dans la transition entre les modes de vie mobiles et sessiles, et chez certains pathogènes, dans la régulation de la virulence. Mon travail de thèse vise à démontrer l’implication des voies de signalisation à diGMPc dans le contrôle de la virulence et de la formation de biofilms par L. pneumophila. Cette implication a été étudiée grâce à l’inactivation systématique de chacun des gènes codant les protéines du métabolisme du diGMPc chez la souche L. pneumophila Lens. Notre étude a révélé que trois de ces protéines, Lpl0780, Lpl0922 et Lpl1118, sont spécifiquement requises pour le contrôle de la virulence et, plus particulièrement, pour la survie précoce lors de l’infection de cellules‐hôtes via l’orchestration de la sécrétion de facteurs de virulence dans la cellule‐hôte. Lpl1118 participerait également à la biogénèse de la vacuole de réplication. Cinq autres de ces protéines sont impliquées dans la régulation de la formation et de l’architecture des biofilms. L’une d’elles est, plus particulièrement, requise pour la formation de biofilms en présence d’oxyde nitrique. Ces résultats contribuent à une meilleure compréhension de l’organisation complexe et spécifique des voies de signalisation à diGMPc chez L. pneumophila et pourraient permettre d’envisager une lutte plus efficace contre ce pathogène
Legionella pneumophila is a bacterium that proliferates in fresh water environments through the replication within amoebas. These bacteria can persist in these environments through biofilm formation. The inhalation of aerosolized contaminated water through hot water systems or cooling towers can induce the infection of human lungs, leading to a severe pneumonia called legionellosis. Cyclic di‐GMP (c‐di‐GMP) in involved, in various bacterial species, in the motility‐to‐sessility transition, and in some pathogens, in virulence control. My work aims to demonstrate the involvement of signaling pathways that use c‐di‐GMP in virulence control and biofilm formation of L. pneumophila. This involvement was investigated by systematically inactivating each gene encoding a c‐di‐GMP‐metabolizing enzyme in L. pneumophila Lens strain. Our work revealed that 3 of these proteins, Lpl0780, Lpl0922 and Lpl1118 are specifically involved in virulence control and, particularly, in the early survival during host cell infection through the orchestration of virulence factors secretion within host cell. Lpl1118 is particularly required for replicative vacuole biogenesis. Five other proteins, participate in the formation and architecture of biofilms. One of them is more specifically involved in biofilm formation in the presence of nitric oxide. These results help to better understand the complexity and the specificity of c‐di‐GMP signaling pathways in L. pneumophila and should allow the exploration of more effective ways to fight this pathogen

Wolbachia est une bactérie Gram(-) intracellulaire symbiote de nombreux arthropodes. Chez A. vulgare, elle entraîne la féminisation des mâles (souche wVul). Nous avons caractérisé le chromosome de wVul (ADN circulaire de 1.75 Mb) qui semble comporter de façon atypique plusieurs opéron rrn et dont les profils de restriction sont différents de ceux des autres souches de Wolbachia. La purification de l'ADN bactérien a permis d'amorcer le séquençage de ce génome. Un système de sécrétion de type IV caractérisé par deux opérons vir a été mis en évidence. L'expression de ces gènes dans les ovocytes et l'étude des protéines impliquées révèlent que ce système pourrait être fonctionnel. Des cartographies bidimensionnelles de profils protéiques de tissus d'individus infectés ou non indiquent des différences d'expression correspondant à des protéines du métabolisme et du cytosquelette de l'hôte surexprimées, et à une RNA hélicase qui pourrait interagir avec le déterminisme du sexe de l'hôte.