Дисертації з теми "Syndrome de détresse respiratoire aiguë de l'adulte – Thérapeutique"

Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) est caractérisé par des lésions alvéolaires diffuses menant à un œdème alvéolaire lésionnel et une insuffisance respiratoire aiguë hypoxémique. Malgré les progrès récents dans la prise en charge des patients de réanimation, le SDRA reste un syndrome fréquent et associé à une morbimortalité importante. Deux mécanismes principaux du SDRA semblent associés à une mortalité plus élevée et à des réponses thérapeutiques différentes : la déficience de la clairance liquidienne alvéolaire (AFC, pour alveolar fluid clearance), l’incapacité pour l’épithélium alvéolaire de résorber l’œdème alvéolaire, et la présence d’un phénotype « hyper-inflammatoire ». Les approches pharmacologiques du traitement du SDRA restent limitées et il est nécessaire de poursuivre l’étude des voies biologiques impliquées dans la pathogénie du SDRA et dans sa résolution afin de développer des approches innovantes des prises en charge diagnostique et thérapeutique du SDRA. RAGE, le récepteur des produits de glycation avancée, est un récepteur multi-ligands, exprimé abondamment par les cellules épithéliales alvéolaires du poumon (pneumocytes), qui module de nombreuses voies de signalisation intracellulaire. De nombreuses études récentes suggèrent que sRAGE, la forme soluble principale de RAGE, pourrait servir de marqueur lésionnel du pneumocyte de type I, et que RAGE pourrait jouer un rôle-pivot dans la pathophysiologie du SDRA, en initiant et en entretenant la réponse inflammatoire alvéolaire. Nos objectifs étaient de caractériser les rôles de RAGE au cours du SDRA, grâce à une approche translationnelle combinant études cliniques et précliniques. D’abord, des études cliniques observationnelles et interventionnelles ont été conduites afin de caractériser sRAGE comme un véritable biomarqueur dans le SDRA. Ensuite, des cultures in vitro de cellules épithéliales et de macrophages, ainsi qu’un modèle expérimental in vivo de SDRA murin par instillation trachéale d’acide chlorhydrique ont été utilisés pour décrire les effets de la voie RAGE sur les mécanismes d’AFC et l’inflammation macrophagique médiée par l’inflammasome « Nod-Like Receptor family, Pyrin domain containing 3 » (NLRP3). Enfin, l’effet d’une inhibition de RAGE, par sRAGE recombinant ou par anticorps monoclonal anti-RAGE, était testée en modèle murin. Nos résultats issus des études cliniques suggèrent que sRAGE présente toutes les caractéristiques d’un biomarqueur au cours du SDRA, avec un intérêt dans le diagnostic, le pronostic et la prédiction du risque de développer un SDRA dans une population à risque. Pris ensemble, notre travail suggère que la voie RAGE joue un rôle important dans la régulation de l’atteinte pulmonaire, de l’AFC et de l’activation macrophagique au cours du SDRA. Toutefois, les mécanismes précis de cette régulation restent incertains. La forme soluble de RAGE (sRAGE), lorsqu’elle est dosée dans le plasma, présente toutes les caractéristiques d’un biomarqueur pouvant être utile en pratique clinique, mais son intérêt dans la sélection de sous-groupes (ou « phénotypes ») de patients pouvant bénéficier de traitements ciblés reste à étudier. La voie RAGE pourrait enfin représenter une cible thérapeutique prometteuse. Bien que des études de validation restent nécessaires, ces résultats pourraient ouvrir de nouvelles perspectives dans la prise en charge des patients atteints de SDRA
The acute respiratory distress syndrome (ARDS) is associated with diffuse alveolarinjury leading to increased permeability pulmonary edema and hypoxemic respiratory failure. Despite recent improvements in intensive care, ARDS is still frequent and associated with high mortality and morbidity. Two major features of ARDS may contribute to mortality and response to treatment: impaired alveolar fluid clearance (AFC), i.e. altered capacity of the alveolar epithelium to remove edema fluid from distal lung airspaces, and phenotypes of severe inflammation. Pharmacological approaches of ARDS treatment are limited and further mechanistic explorations are needed to develop innovative diagnostic and therapeutic approaches. The receptor for advanced glycation endproducts (RAGE) is a multiligand pattern recognition receptor that is abundantly expressed by lung alveolar epithelial cells andmodulates several cellular signaling pathways. There is growing evidence supporting sRAGE (the main soluble isoform of RAGE) as a marker of epithelial cell injury, and RAGE may be pivotal in ARDS pathophysiology through the initiation and perpetuation of inflammatory responses. Our objectives were to characterize the roles of RAGE in ARDS through a translational approach combining preclinical and clinical studies. First, observational and interventional clinical studies were conducted to test sRAGE as a biomarker during ARDS.Then, cultures of epithelial cells, macrophages and a mouse model of acidinduced lung injury were used to describe the effects of RAGE pathway on AFC and inflammation, with special emphasis on a macrophage activation through NodLikeReceptor family, Pyrindomain containing 3 (NLRP3) inflammasome. Acidinjured mice were treated with an antiRAGE monoclonal antibody or recombinant sRAGE to test the impact of RAGE inhibition on criteria of experimental ARDS. Results from clinical studies support a role of sRAGE as a biomarker of ARDS, withdiagnostic, prognostic and predictive values. In addition, plasma sRAGE is correlated with a lung imaging phenotype of nonfocal ARDS and could inform on therapeutic response. Herein, we also describe in vivo and in vitro effects of RAGE activation on transepithelial fluid transport and expression levels of epithelial channels (aquaporin 5, αNa,KATPaseandαENaC) and on macrophage activation through NLRP3 inflammasome. Finally, RAGE inhibition improves AFC and decreases lung injury in vivo. Taken together, our findings support a role of RAGE pathway in the regulation of lung injury, AFC and macrophage activation during ARDS, albeit precise regulatory mechanisms remain uncertain. sRAGE has most features of a validated biomarker that could be used in clinical medicine, but whether it may help to identify subgroups (or phenotypes) of patients that would benefit from tailored therapy remains underinvestigated. Modulation ofRAGE pathway may be a promising therapeutic target, and though validation studies are warranted, such findings may ultimately open novel diagnostic and therapeutic perspectivesin patients with ARDS

Le syndrome de détresse respiratoire aiguë est une cause majeure d'insuffisance respiratoire avec un taux de mortalité élevé. Elle se caractérise par des lésions alvéolaires diffuses, un œdème alvéolaire et une défaillance respiratoire hypoxémique qui entraînent de lourds coûts de santé. Actuellement, les traitements disponibles pour le SDRA restent principalement de soutien, et aucune approche pharmacologique n'est traduite avec succès en application clinique. Il existe deux processus majeurs au cours du développement physiopathologique du SDRA qui conduisent à la formation d'un œdème pulmonaire :dysfonctionnement de la barrière alvéolaire et altération de la clairance du liquide alvéolaire suite à une lésion épithéliale alvéolaire et à une inflammation. Il a été indiqué que le récepteur des produits de glycation avancée (RAGE) était impliqué au cours de ces processus, avec le potentiel élevé de sa forme soluble en tant que biomarqueur pour le diagnostic et le pronostic du SDRA. Les agents halogénés volatils, tels que le sévoflurane ou l'isoflurane, sont de plus en plus utilisés dans les unités de soins intensifs comme agents sédatifs avec leurs caractéristiques intrinsèques idéales en tant que sédatifs. De plus, de nombreuses études précliniques et cliniques indiquent ses effets protecteurs pulmonaires chez les patients atteints de SDRA.Cependant, les mécanismes de ces effets bénéfiques restent à clarifier.Les principaux objectifs de ce travail de thèse sont multiples, à travers des approches expérimentales et modèles translationnels in vivo et in vitro du SDRA,1) Évaluer les effets protecteurs pulmonaires bénéfiques du sévoflurane dans le SDRA, y compris ses effets sur les caractéristiques physiologiques du SDRA, la clairance du liquide pulmonaire et la perméabilité alvéolaire.2) Étudier le mécanisme précis des effets observés du sévoflurane, y compris des études mécanistiques et la fonction et l'expression des protéines impliquées.3) Explorer le rôle de RAGE dans les lésions et la réparation de l'épithélium pulmonaire et son éventuel rôle de médiation des effets bénéfiques du sévoflurane.Au cours de ce travail de thèse, nous avons avancé sous plusieurs angles : Premièrement, nos travaux ont trouvé dans notre modèle de cicatrisation des cellules A549, le rôle important de RAGE dans la réparation des lésions pulmonaires processus, car son ligand, HMGB1, et les AGE ont favorisé la cicatrisation des plaies dépendante de RAGE des cellules épithéliales alvéolaires pulmonaires, ce qui est possiblement expliqué par une migration et une prolifération cellulaires améliorées. Deuxièmement, nos travaux sur des modèles murins de SDRA, trouve une diminution des indices de perméabilité et des structures épithéliales préservées dans les cellules et les souris, au moins en partie, augmentant l'expression de ZO-1 et l'inhibition de l'activité de RhoA et de pMLC ainsi que le réarrangement du cytosquelette d'actine suite à une lésion épithéliale pulmonaire . De plus, RAGE peut jouer un rôle médiateur dans les effets du sévoflurane sur les lésions pulmonaires aiguës. De plus, nos travaux sur des modèles de SDRA porcins in vivo ont confirmé les effets protecteurs pulmonaires du sévoflurane sur les caractéristiques du SDRA, avec une oxygénation améliorée, une perméabilité alvéolaire restaurée et une AFC améliorée. Notre étude suggère que l'effet protecteur du sévoflurane sur l'AFC peut s'expliquer par la restauration de l'expression pulmonaire altérée des canaux épithéliaux AQP-5, Na, K, ATPase et ENaC pendant le SDRA.Dans l'ensemble, ces travaux de thèse expliquent plus précisément les effets protecteurs des agents halogénés et la nouvelle révélation de son mécanisme potentiel, et conforte ainsi le grand intérêt pour l'utilisation de la sédation inhalée en soins intensifs pour les patients atteints de SDRA. Ce travail pourrait donner de nouvelles perspectives pour la recherche sur les effets du sévoflurane sur le SDRA et sa résolution
Acute respiratory distress syndrome (ARDS) is a major cause of respiratory failurewith a high mortality rate. It is characterized by diffuse alveolar damage, alveolar edema, and hypoxemic respiratory loss which cause heavy healthcare costs. Currently, available treatments for ARDS remain primarily supportive, and no pharmacological approach is successfully translated into clinical application. There are two major processes during the physiopathological development of ARDS that lead to the formation of lung edema:alveolar barrier dysfunction and the impairment of alveolar fluid clearance following alveolar epithelial injury and inflammation. The receptor for advanced glycation end products (RAGE) was indicated to be involved during those processes, with the high potential of its soluble form as a biomarker for ARDS diagnostic and prognostic. Volatile halogenated agents, such as sevoflurane or isoflurane, are increasingly used in intensive care units as sedative agents with their ideal intrinsic characteristics as a sedative. Furthermore, numerous pre-clinical and clinical studies indicate its lung protective effects for ARDS patients.However, its mechanisms of such beneficial effects remain to be clarified.The main objectives of this thesis work are multiple, through experimental andtranslational in vivo and in vitro models of ARDS, to1) Asses the beneficial lung protective effects of sevoflurane in ARDS, including its effects on ARDS physiological features, lung fluid clearance, and alveolar permeability.2) Investigate the precise mechanism of observed effects of sevoflurane, including mechanistic studies and involved proteins' function and expression.3) Explore the role of RAGE in lung epithelial injury and repair and its eventualmediation role of the beneficial effects of sevoflurane.During this thesis work, we advanced from many angles: First, our work found in ourA549 cells wound healing model, the important role of RAGE in the lung injury repairprocess, as its ligand, HMGB1, and AGEs promoted RAGE-dependent wound healing oflung alveolar epithelial cells, which is possible through enhanced cell migration and proliferation.Secondly, our work in murine in vitro and in vivo ARDS models, animprovement of experimental features, with decreased indices of permeability and preserved epithelial structures in cells and mice, by at least in a part, increasing expression of ZO-1 and the inhibition of RhoA activity and pMLC as well as actin cytoskeleton rearrangement following lung epithelial injury. Additionally, RAGE may play a mediating role in the effects of sevoflurane on acute lung injury. Furthermore, our work in porcine in vivo ARDS models confirmed the lung protective effects of sevoflurane on ARDS features, with improved oxygenation, restored alveolar permeability, and improved AFC. Our study suggests theprotective effect of sevoflurane on AFC may be explained by the restoration of impaired lung expression of epithelial channels AQP-5, Na, K, ATPase, and ENaC during ARDS.Taken together, this thesis work explained more precisely the protective effects ofhalogenated agents and the new revelation of its potential mechanism, and hence supports the high interest in the use of inhaled sedation in intensive care for ARDS patients. This work may give some new insights for research on the effects of sevoflurane on ARDS and its resolution.Keywords: Acute respiratory distress syndrome; Sevoflurane; Lung epithelial barrierfunction; Lung wound repair; Alveolar fluid clearance; Epithelial channels: Junction proteins;Intracellular pathways; Receptor for advanced glycation end-products

Le syndrome de detresse respiratoire aigue (sdra) est un deme pulmonaire lesionnel du a une alteration diffuse de la barriere alveolo-capillaire (endothelium, membranes basales, epithelium), associee a un afflux alveolaire de polynucleaires neutrophiles. Le but general de ce travail est d'evaluer le role du polynucleaire neutrophile dans la physiopathologie du sdra et de ses surinfections respiratoires. Dans un premier travail, nous avons demontre qu'il existait une cooperation des proteases du neutrophile, elastase et gelatinase b, permettant sa migration au travers d'une membrane basale in vitro. Dans un deuxieme travail, nous avons montre la presence de gelatinase b, issue notamment des polynucleaires neutrophiles, en concentration elevee dans les fluides alveolaires de patients atteints de sdra. Nous avons constate que l'etat d'activation des neutrophiles alveolaires ne semblait pas dependre de l'existence d'une defaillance respiratoire. Notre troisieme travail a permis de confirmer cette derniere donnee par l'etude de deux modeles d'agression pulmonaire aigue du rat, i) le premier avec defaillance respiratoire, ii) le second sans defaillance respiratoire severe. Ainsi, un etat d'activation similaire du neutrophile alveolaire a ete trouve dans ces deux modeles. L'importance incidence de surinfections respiratoires observees au cours du sejour en reanimation des patients atteints de sdra serait due a un deficit des fonctions bactericides des polynucleaires alveolaires. Notre quatrieme travail a montre que l'instillation alveolaire d'endotoxine chez le rat induisait un important recrutement de polynucleaires neutrophiles aux fonctions preservees et conferait un effet protecteur vis a vis d'une surinfection bacterienne ulterieure, plaidant contre un deficit de fonctions bactericides du neutrophile alveolaire. En conclusion, nous montrons que le polynucleaire neutrophile migre grace a sa gelatinase b et que cette gelatinase est trouvee dans les espaces alveolaires au cours du sdra. Nous demontrons que l'exocytose de gelatinase par le neutrophile alveolaire ne depend pas du degre d'agression pulmonaire et que le neutrophile alveolaire a des fonctions bactericides conservees ex vivo et in vivo lui permettant de participer a la defense anti-bacterienne.

Le recrutement alvéolaire correspond à la ré-aération de territoires pulmonaires non-aérés. Objectifs : étudier l'influence des réglages du ventilateur sur le recrutement. Méthodes : Nous avons teste: la PEP, la réduction du volume courant (Vt), la pression de plateau (Pplat) et la fréquence respiratoire (FR). Résultats principaux: (1) La compliance de la courbe sans PEP traduisait le recrutement qui se poursuivait jusqu'à 30 cmH2O. (2) La pression de fermeture pulmonaire indiquant une " PEP maximale" théorique n'était pas retrouvée pour des PEP inférieures à 20 cmH2O. Le recrutement était positivement corrélé à la compliance de la courbe sans PEP. (3) La reduction du \/t et de la Pp!at induisait un dérecruternent. (4) L'augmentation de la FR induisait une PEP intrinsèque malgré la réduction du Vt. Conclusions : Le recrutement est un phénomène continu. La courbe PV sans PEP traduit la recrutabilité" pulmonaire. La Pplat et principalement la PEP influencent le recrutement
Aim: To assess influence of ventilatory pattern on alveolar recruitment measured by pressure volume curves (PV Curve) in acute respiratory distress syndrome (ARDS). Methods: We tested : PEEP, tidal volume (\/t), plateau pressure (Pplat) and respiratorv rate (RR). Results: (I) linear compliance on the zero end expiratory (ZEEP) PV curve reflected continuous alveolar recruitment. Recruitrnent induced by PEEP was associated with compliance reduction. (2) Pulmonary closing pressure that theoretically indicates a maximal PEEP was not tound for PEEP below 20 cmH2O. Potential for recruitment vas positively correlated with linear compliance measured on the ZEEP PV curve. (3) Vt reduction induced significant alveolar derecruitment. (4) Increasing RR resulted in gas trapping. Conclusions: Alveolar recruirnient is a continuous process. High compliance measured on the ZEEP PV curve, indicates that the lung is highly recruitable. Both, Pplat and PEEP may affect recruitment

Le dérecrutement alvéolaire qui correspond à l'association des processus d'atélectasies et d'œdème alvéolaire, est un des éléments clés du syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA). Dans ce travail, nous avons dans un 1er temps analysé les facteurs qui régissent le dérecrutement alvéolaire puis ceux qui permettent de s'y opposer et enfin optimiser le recrutement alvéolaire. Dans la 2ème partie, nous avons tenté de répondre à 3 questions : Comment peut-on quantifier le recrutement alvéolaire ; quelles sont les méthodes qui permettent de générer un recrutement alvéoaire et enfin quels sont les effets physiopathologiques des manœuvres de recrutement alvéolaire (MRA) ? Nous avons décrit la méthode de référence pour quantifier le recrutement alvéolaire au scanner et validé une méthode utilisable au lit du patient. Nous avons fait un état des lieux sur les MRA dans le SDRA et comparé 2 types de MRA : une CPAP et un soupir étendu. Nos résultats suggèrent que le recrutement est supérieur lorsque la MRA est adaptée à la mécanique ventilatoire de chaque patient par rapport à une CPAP de 40 cmH2O pendant 40s quelque soit le patient. Nous avons également montré que les MRA amélioraient la clairance de l'œdème alvéolaire. L'analyse morphométrique de l'effet des MRA est décrite. Différentes perspectives sont exposées
Acute respiratory distress syndrome (ARDS) is a very frequent cause of respiratory failure in intensive care units with a poor outcome. Alveolar derecruitment (i. E atelectasis and lung oedema) is a major concept in ARDS. In the first part of the manuscript, we describe the pathophysiological aspect of alveolar derecruitment, the ways to avoid it and how to increase alveolar recruitment. In the second part, we tried to propose answers to 3 questions : How could we assess alveolar recruitment with CT-Scan and at bedside ; how could we increase alveolar recruitment and what happened in the lung when we performed recruitment maneuvers (RM) ? We have described a new method of CT-scan assessment of alveolar recruitment, we have compared this method usable at bedside. We have compared 2 RM and our data suggested that an extended sigh, ventilatory mechanics-based pressure level is more efficient that one CPAP performed at the same pressure level for the same time in all patients with ARDS. We have shown that response to RM influences net alveolar fluid clearance. CT-scan analysis of RM-induced changes in lung has been described. The prospects were presented

Introduction. Le syndrome de détresse respiratoire aigue͏̈ est caractérisé par une instabilité alvéolaire et tendance au dérecrutement alvéolaire. Objectifs. Analyser les effets des réglages ventilatoires et des procédures diagnostiques et thérapeutiques sur le dérecrutement, et sa prévention. Interventions. Réduction 1) du volume courant (Vt) et 2) de la pression expiratoire positive (PEP) ; effets de 3) l'aspiration trachéale et 4) la fibroscopie bronchique. Résultats. 1) La réduction du Vt induit un dérecrutement prévenu par la PEP. 2) La fermeture alvéolaire débute à des pressions élevées. 3) L'aspiration trachéale induit un dérecrutement prévenu par des manoeuvres de recrutement. 4) La fibroscopie bronchique induit une hypoxémie prévenue par l'application d'une pression positive. Conclusions. Le dérecrutement est influencé par les réglages ventilatoires et les procédures diagnostiques et thérapeutiques. La PEP et les manoeuvres de recrutement peuvent prévenir ce dérecrutement
Introduction. The acute respiratory distress syndrome is characterized by alveolar instability and tendency for derecruitment. Aims. To study the influence of ventilatory settings and diagnostic and therapeutic procedures on derecruitment, and its prevention. Interventions. 1) Reduced tidal volume (Vt) ; 2) decreasing positive end-expiratory pressure (PEEP) ; 3 ) endotracheal suctioning ; 4) fiberoptic bronchoscopy. Results. 1)Vt reduction induces a derecruitment, prenvented by PEEP. 2) Alveolar closure is a continuous process, starting at high pressures. 3) Endotracheal suctioning induces a massive derecruitment, prevented by recruitment maneuvers during the procedure. 4) Fiberoptic bronchoscopy induces oxygenation disturbances, prevented by the application of continuous airway pressure during the procedure. Conclusions. Alveolar derecruitment is influenced by ventilatory settings and diagnostic and therapeutic procedures, and may be prevented by PEEP and recruitment maneuvers during such procedures

A ce jour, les trichomonadines (appelées communément trichomonas) n'ont qu'une place très limitée en pathologie humaine, à l'exception de Trichomonas vaginalis (T. Vaginalis) au niveau du tractus génito-urinaire. La présence de trichomonadines dans les voies respiratoires a parfois été signalée chez des patients présentant des pathologies broncho-pulmonaires chroniques. Ayant été confrontés à quelques cas privilégiés de la sphère ORL puis de la pathologie respiratoire, il nous est apparu que la situation était tout à fait différente. Tout d'abord, nous avons étudié la prévalence de l'infection à trichomonadines chez les patients atteints de pneumonie à Pneumocystis jirovecii. Les cytospins de lavages bronchoalvéolaires archivés sur une période de 10 ans ont été revues. De façon surprenante, il est apparu que l'association des deux agents pathogènes y est fréquente: 60% de l'ensemble des PcP sont co-infectées. L'association apparaît systématique dans le PcP riches en Pneumocystis (réf 2 et 7). La maladie pulmonaire "pneumonie à pneumocystis" (PcP) peut donc être considérée comme une co-infection à Pneumocystis et à trichomonadine. Le développement de la trichomonadine au sein de l'alvéole pulmonaire ne serait pas lié directement à l'immunodépression, mais plutôt à l'environnement local particulier induit par la croissance du champignon. Nous avons aussi recherché la prévalence de l'infection à trichomonadine chez les patients atteints d'affection respiratoire grave hospitalisés dans une unité de réanimation polyvalente. Nous avons retrouvé une prévalence de 30% au cours du syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA). Il est apparu que l'incidence augmente avec la durée d'évolution de l'oedème lésionnel, atteignant 65% au-delà du 5ème jour. Ainsi, cette surinfection se présente comme une évolution naturelle du SDRA (réf 6). La surinfection à trichomonadines apparaît bien dans un second temps, favorisée par les conditions locales à l'intérieur de la lumière alvéolaire (hypoventilation, débris organiques). Ces conditions locales sont aussi présentes au cours de la PcP et doivent être favorables au développement de ce parasite microaérophile. Cette surinfection lors des SDRA renforce l'idée que la trichomonadine manifeste un opportunisme de condition locale, et non de condition générale - telle que l'immunodépression - ainsi que le font la plupart des agents infectieux opportunistes (réf 4 et 5). Dans deux cas, la trichomonadine co-infectant une PcP a pu être identifiée par PCR suivie de séquençage de l' ARNr 16S ou de l'ARNr 5. 8S. Il s'agissait de T. Vaginalis dans le premier cas, et de Tritrichomonas foetus (T. Foetus) dans l'autre cas (réf 1 et 3). Concernant ce second cas, l'origine de cette trichomonadine, qui est connue chez les ruminants, est restée imprécise. Une espèce proche du T. Foetus bovin, mais adaptée à l'homme, n'est pas écartée. L'identification de ces deux espèces va à l'encontre de l'opinion que seul Trichomonas tenax, saprophyte de la cavité buccale, pourrait se développer dans le système respiratoire. T. Vaginalis et T. Foetus ont en commun d'être des pathogènes au niveau des voies génito-urinaires de l'humain et du bovin respectivement. La poursuite (en projet) de l'identification de la trichomonadine co-infectant la PcP ou surinfectant le SDRA pourrait confirmer l'impression que les trichomonadines en cause sont des espèces zoonotiques ou non décrites à ce jour. Le dernier volet a été la recherche d'un système de détection et de typage des trichomonadines dans les échantillons biologiques à l'aide de sondes oligonucléotidiques en hybridation in situ chromogénique (HISC). Différentes sondes, complémentaires de l'ARNr 16S et spécifiques de la classe Trichomonadida ou de ses genres et espèces, ont été testées et ont pu marquer les trichomonadines dans les échantillons cytologiques (réf 6). La transposition aux prélèvements solides, formolés et inclus en paraffine, n'est pas au point à ce jour. Par contre, avec des sondes complémentaires de séquences répétées présentes dans le génome de T. Vaginalis, des marquages ont été obtenus sur coupe en paraffine. Dans l'avenir, la réalisation de marquages en HISC devrait permettre de compléter la liste des conditions où les trichomonadines peuvent être impliquées. L'HISC sur coupe tissulaire devrait par ailleurs permettre de préciser visuellement les rapports entre le parasite et l'environnement, et donc de préjuger l'éventuelle action pathogène du parasite.

Au cours des états de choc les réponses immunitaires sont différentes dans les tissus et dans le compartiment circulant. Dans certains organes, comme le poumon une réponse pro-inflammatoire est observée alors que dans le sang circulant prédomine une réponse anti-inflammatoire et immunosuppressive. Dans un modèle de choc hémorragique murin,nous avons démontré une augmentation des cytokines pro-inflammatoires intrapulmonaires induite par les formes actives de l'oxygène et la stimulation alpha-adrénergique via l'activation du facteur transcriptionnel Nuclear Factor-kappa B. Au cours du choc septique humain nous avons mis en évidence dans le sang circulant une apoptose lymphocytaire et une perte d'expression de la molécule HLA-DR et du récepteur du GM-CSF par les monocytes. Ces modifications sont associées à la gravité, à la survenue d'infections secondaires et à une surmortalité. Les conséquences physiologiques et thérapeutiques de ces réponses en apparence opposées sont discutées

L’objectif de cette thèse est de mettre en évidence le rôle des canaux ioniques de l’épithélium alvéolaire dans la pathogenèse du syndrome de détresse respiratoire aiguë. Des études cliniques ont montré que l’absorption anormale de l’œdème pulmonaire par l’épithélium alvéolaire secondaire à la libération de médiateurs inflammatoires est une manifestation caractéristique du syndrome de détresse respiratoire aiguë. Dans une première étude, nous avons démontré que l’activité élevée du transforming growth factor -b1 (TGF-b1) présent dans les alvéoles lors de détresse respiratoire aiguë provoque un œdème pulmonaire en réduisant le transport vectoriel de sodium et de fluides à travers l’épithélium alvéolaire. Puis, nous avons montré que l’interleukine -1b (IL-1b) permet l’activation de TGF-b1 via un mécanisme cellulaire dépendant de l’intégrine avb6. Finalement, dans une dernière étude, nous avons montré que IL-1b affecte directement et indirectement le transport vectoriel de sodium et d’eau à travers l’épithélium alvéolaire. Cette réduction de transport de fluides s’est révélée être due en majeure partie à une diminution de la présence du canal sodium épithélial (ENaC) à la membrane apicale des cellules épithéliales alvéolaires, causée par l'inhibition de l’activité du promoteur d’ENaC par un mécanisme dépendant des MAP kinases. L’ensemble de ces études démontre que TGF-b1 et IL-1b affectent la biosynthèse d’ENaC, et suggère un rôle clé pour ces médiateurs dans la persistance de l'œdème pulmonaire chez les patients atteints de détresse respiratoire aiguë
The objective of this thesis is to investigate the role of abnormalities in alveolar epithelial ion channel function in the pathogenesis of acute lung injury. Clinical studies have demonstrated that impaired alveolar fluid clearance associated with the release of inflammatory mediators within the distal airspace of the lung is a characteristic feature of acute lung injury. Therefore, we examined the potential effect of these mediators on ion transport across the alveolar epithelium. In the first study, we demonstrated that increased transforming growth factor -b1 (TGF-b1) activity in distal airspaces during acute lung injury promoted pulmonary edema by reducing alveolar epithelial sodium and fluid transport. In the second study we showed that in alveolar epithelial cells, interleukin -1b (IL-1b) activated TGF-b1 via an integrin avb6-dependent mechanism. Finally in the last study, we demonstrated that IL-1b could also directly and independently reduce the alveolar epithelial sodium and fluid transport. The reduction in fluid transport was shown to be attributable in large part to a decrease in apical membrane expression of the epithelial sodium channel (ENaC) in lung epithelial cells. The decreased cell surface expression of ENaC was mediated through a MAP kinase-dependent inhibition of ENaC promoter activity. In summary, the studies presented here demonstrate that IL-1b and TGF-b1 down-regulate ENaC biosynthesis and indicate a critical role for these mediators in the impaired fluid clearance of patients with acute lung injury

Nous avons mis au point une méthode de lavage broncho-alvéolaire permettant d'effectuer in vivo des mesures répétées (toutes les 15 min. Pendant 3h30. ) de la perméabilité capillaro-alvéolaire à une macromolécule (FlTC-dextran). Sur un modèle pré-clinique de lésion à l'acide oléique (AO) on observe, en 30 minutes un pic de perméabilité au FlTC-dextran. La perméabilité décroît ensuite lentement jusqu'à la fin de l'expérience. Nous avons testé les effets de la terbutaline, un β2-agoniste réputé réduire in vitro l'augmentation de perméabilité dans les lésions pulmonaires inflammatoires. Une perfusion de terbutaline débutée 10 min. Après la lésion à l'AO ne modifie pas l'évolution de la perméabilité. Une perfusion tardive de terbutaline (90 min. Aprés la lésion) aggrave la perméabilité. Comme l'index cardiaque et la pression capillaire augmentent au cours de la perfusion de terbutaline, nous supposons que la terbutaline recrute des capillaires lésés et aggrave la perméabilité à la phase tardive de la lésion à l'AO
We developed a new modality of broncho-alveolar lavage technique to measure repeatedly in vivo (every 15 min. During 3. 5 h), the capillary-alveolar permeability to a macromolecule (FlTC-dextran). Following a pre-clinical model of oleic acid lung injury, capillary-alveolar permeability to FlTC-dextran reaches a peak within 30 minutes. Thereafter the permeability decreases slowly until the end of the experiment. We assessed the effects of terbutaline, a β2-agonist assumed to reduce in vitro the microvascular permeability in acute lung injury. Terbutaline infusion started 10 min. After oleic acid injury did not change the time course of permeability. Terbutaline infusion started 90 min. After injury interrupted the recovery with an aggravation in permeability. As cardia index and pulmonary capillary pressure increased with terbutaline infusion, we speculate that terbutaline recruits leaky capillaries and increases FlTC-dextran permeability during late recovery from oleic acid injury

La transfusion sanguine permet de sauver des vies et réduit la morbidité pour un grand nombre de maladies et d'affections cliniques, mais elle n'est pas exempte de complications. Un incident néfaste lié à une transfusion, également appelé Effet Indésirable Receveur (EIR), est un incident défavorable survenant chez un patient pendant ou après une transfusion sanguine. Parmi eux, le TRALI est considéré comme l’une des réactions inflammatoires les plus critiques. Cette pathologie se développe généralement dans les 6 heures après transfusion. On en reconnaît deux types, les TRALI immunologiques et les TRALI non-immunologiques. En France, les premiers sont presque entièrement prévenus par une politique de sécurité des produits sanguins, tandis que la fréquence des seconds augmente. La physiopathologie du TRALI reste mal connue. Tandis que certains y accordent une place importante aux plaquettes sanguines du patient transfusé, d’autres les considèrent comme pas réellement impliquées. Le but de ce travail de thèse a été, dans un premier temps, d’investiguer le potentiel inflammatoire des plaquettes sanguines conservées dans les concentrés plaquettaires et l’influence de cette inflammation sur l’endothélium vasculaire général. Ensuite, sera évalué le rôle des plaquettes sanguines de l’organisme, notamment par l’intermédiaire de leurs produits de sécrétion, dans la pathogénie de cette complication transfusionnelle. Pour cela, un ALI (mimant un TRALI) a été déclenché, dans un modèle in vivo, par une injection d’anticorps anti-CMH I chez des souris préalablement stimulées avec du LPS. L’ensemble de nos résultats confirme le potentiel inflammatoire des plaquettes sanguines, au sein des concentrés plaquettaires, pouvant probablement assumer l’entière responsabilité du déclenchement d’un TRALI non-immunologique, ainsi qu’un rôle secondaire des plaquettes sanguines de l’organisme, participant activement à l’amplification de la sévérité de la pathologie. Cette thèse s’inscrit dans la continuité logique des études menées, au sein du laboratoire GIMAP-EA3064, investiguant la place des plaquettes sanguines au sein de l’inflammation, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives dans la sécurité transfusionnelle
Blood transfusion saves lives and reduces morbidity for many diseases and clinical conditions, but it is not without complications. A transfusion-related adverse event, also known as the Adverse Reaction (AR), is an incident occurring in a patient during or after a blood transfusion. Among them, TRALI is considered as one of the most critical inflammatory reactions. This pathology usually occurs within 6 hours after transfusion. Two types are recognized: immune TRALI and non-immune TRALI. In France, the first is almost completely prevented by a blood product safety policy, while the frequency of the second increases. The pathophysiology of TRALI remains poorly understood. While some scientists give an important function of patient blood platelets, others consider them dispensable. The aim of this thesis was, first, to investigate the inflammatory potential of blood platelets stored in platelet concentrates and its impact on the general vascular endothelium. Next, the role of patient blood platelets, including their secretory products, in the pathogenesis of this transfusion complication will be evaluated. For it, an ALI (mimicking a TRALI) was triggered, in an in vivo model, by an injection of anti-MHC I antibody in mice previously stimulated with LPS. Our results confirm the inflammatory potential of blood platelets in platelet concentrates, which can probably assume the entire responsibility for triggering a non-immune TRALI, and a secondary role for patient blood platelets in the amplification of the severity of this pathology. This thesis is the continuity of studies conducted in the laboratory GIMAP-EA3064, investigating the function of blood platelets in inflammation, thus opening up new perspectives in transfusion safety

Les maladies infectieuses, causées par divers microorganismes, sont la première cause de mort à travers le monde. Les lymphocytes T sont une population variée de cellules qui participent aux immunités innée et adaptative. Nous cherchons à caractériser les réponses lymphocytaires T lors des infections bactériennes et virales chez l’homme. Notre recherche, menée à partir de prélèvement humains, s’est portée sur l’infection osseuse (IO) bactérienne chronique, sur le Syndrome de Détresse Respiratoire Aiguë de l’adulte (SDRA), et sur l’infection par le Virus de l’Immunodéficience Humaine (VIH). Les IO sont caractérisées par une augmentation de l’activation et une diminution de la prolifération lymphocytaire T, associées à une diminution de CD28 et une augmentation de la molécule de costimulation CTLA4 au sein de la population CD4. La sous-population T CD4+CD28- a des capacités cytolitiques accrues comparativement aux lymphocytes T CD28+, avec une augmentation de la sécrétion de perforine. Au cours du SDRA, l’activation et la prolifération des lymphocytes T alvéolaires sont associées à une augmentation de l’expression de CLTA4, en lien avec la présence de clones TH-17. L’IL17 participerait à une attraction de l’expression de CTLA4, en lien avec la présence de clones TH-17. L’IL17 participerait à l’attraction des polynucléaires neutrophiles pouvant initier la fibrose observée lors d’un SDRA. Au cours du VIH, l’introduction d’un anti-intégrase en complément d’une trithérapie usuelle efficace diminue l’ADN viral intracellulaire dans les T CD4, et est associé à une augmentation de CD28 et une diminution de CTLA4 sur ces mêmes cellules, et à une inhibition relative du taux d’apoptose. En conclusion, les modifications de molécules de costimulation lymphocytaires T sont dépendantes du site d’infection et/ou du stade aigu ou chronique de l’infection, et non de l’agent pathogène en cause. Les traitements anti-infectieux peuvent modifier l’expression de ces molécules de costimulation, les thérapies ciblant ces molécules devant donc intégrer ces critères cinétiques
Infectious diseases, caused by various microorganisms are the major cause of death worldwide. T-lymphocytes are a diverse population of cells that participate in both innate and adaptive immunity. We are defining human T lymphocyte responses to viral and bacterial infection and their role on protective immunity and disease pathogenesis. Our research focuses on chronic and acute bacterial and viral infection in Osteomyelities, Acute respiratory distress syndrome (ARDS) and human Immunodeficiency virus (HIV). Our research is largely clinically based because these diseases do not have good experimental animal models. We report increased T-cell activation and decreased proliferation along with the alteration of its costimulatory pathways as hallmarks of bacterial bone infections in humans. A remarkable decrease in the CD28 expression on CD4 T cells was observed in infected bone tissues along with increased CTLA4 expression. On further analysis of CD28 negative CD4 T cell population, it seemed that it has enhanced cytotoxic capabilities in comparison to their CD28 positive counterparts, being obvious by increased perforine secretion. In ARDS we observed increased activated and proliferating T cell phenotype with increased CTLA4 expression, suggesting that increased CTLA4 seems to play a suppressive role in order to achieve normal T cell homeostasis after going through the active phase of activation. Also we observed IL-17 secretion in ARDS, which may suggest the role of IL-17 as a chemoattractant for neutrophils at the site of infection. In AIDS, the included patients had a stable HAART treatment with undetectable viral load for at least six months. In our study we did not observed major alteration in T cell phenotype and its costimulatory molecules after Raltegravir introduction, but we observed a decrease in viral load in CD4 T cells. In conclusion, alteration of the costimulatory molecules appeared to be disease-related but not pathogen specific

Le Syndrome de Détresse Respiratoire Aiguë (SDRA) est une maladie inflammatoire courante en service de réanimation qui touche environ 10% des patients. Une augmentation pathologique de la rigidité et/ou de l'adhésion des leucocytes des patients atteints du SDRA semble être un des facteurs déclenchants majeurs de la maladie. Nous avons utilisé la microfluidique pour mimer le passage des cellules dans les capillaires pulmonaires. L'observation du passage de cellules modèles (lignée monocytaire humaine THP-1) dans des constrictions microfluidiques (H=12µm et W=6µm) a permis de mesurer leur temps d'entrée. Ensuite nous avons incubé des cellules dans des sérums issus de malades et étudié leurs caractéristiques de passage dans des constrictions microfluidiques en fonction du temps d'incubation et de la concentration en sérum. Ces résultats sont ensuite comparés à la composition des sérums en cytokines (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, TNF-α, TGF-β et INF-γ). Des corrélations entre l'IL-8, IL-1β, le TNF-α et le temps d'entrée ont été trouvés. Ces deux cytokines peuvent jouer un rôle dans la rigidité cellulaire lors de cette maladie. En incubant ainsi nos cellules avec les recombinants humains (IL-8, IL-1β et Tnf-α), nous avons constaté une augmentation de la rigidité des cellules. D'un point de vue médical nous avons montré que l'utilisation d'anticorps bloquants anti IL-8, anti IL-1β et anti TNF-α permet de protéger les cellules
The project consists in using microfluidic devices to test human leukocyte behavior in microcirculation. Adult Respiratory Distress Syndrome (ARDS) is a disease that affects numerous patients in intense care services with a rate of death 50%. It is triggered to the sequestration of neutrophils within the lung microvasculature. There is neither diagnostic nor efficient treatment now. We study the properties of the passage of THP-1, and real neutrophils in micro-channels of width 6µm. In order to improve the understanding of SDRA, we also incubate models cells in patient's serums who are suffering from ARDS and diagnostic tools are being developed in collaboration with the hospitals of Marseille

Les patients en état critique nécessitant une ventilation artificielle sont particulièrement exposés au risque d'une agression rénale ischémique. L'apparition d'une insuffisance rénale aiguë (IRA) dans ce contexte est responsable d'une surmortalité. L'objectif de ce travail était l'optimisation de la prévention de l'IRA incluant deux axes de recherche. D'une part l'évaluation de mesures de protection rénale visant au maintien de la délivrance rénale en oxygène et d'autre part l'étude de la performance des outils d'évaluation de la fonction rénale pour la détection et la caractérisation d'une agression.La principale mesure de prévention de l'IRA proposée en pratique clinique pour la restauration et le maintien d'une perfusion rénale est l'expansion volémique mais avec un risque d'altération de la fonction pulmonaire. Nos travaux ont permis de montrer que le pronostic rénal au cours de la réanimation liquidienne dépend du type de soluté administré. L'incidence de l'IRA est plus élevée lorsque des colloïdes à base d'hydroxyéthylamidons et/ou ayant un pouvoir oncotique élevé sont utilisés. Contrairement au rein, l'évolution de la fonction respiratoire ne dépend pas de l'effet oncotique du soluté utilisé mais des volumes administrés. La degradation de la fonction respiratoire semble survenir pour un volume moindre de colloïdes que de cristalloïdes, sans doute du fait d'une efficacité plus importante sur l'augmentation du volume intravasculaire.Associé à la restauration de la perfusion rénale, le maintien de l'oxygénation artérielle est un autre déterminant potentiel de l'oxygénation rénale. Nous avons évalué la réponse rénale à une hypoxémie modérée, habituelle au cours du syndrome de détresse respiratoire aiguë. Une baisse de la FiO2 est en effet recommandée pour la prévention des lésions pulmonaires induites par l'oxygène. Une ventilation de 2 heures à un niveau de SaO2 entre 88 et 92% engendre une réponse diurétique et une augmentation des résistances artérielles rénales mesurées par la méthode Doppler. Cette réponse rénale est indépendante des modifications ventilatoires et hémodynamiques, elle est rapidement réversible avec la réoxygénation. En plus de sa capacité à détecter une modification de la vascularisation rénale, nous avons retrouvé que la mesure de l'index de résistance prédisait de façon satisfaisante la persistance d'une IRA, performance meilleure que celle de certains indices biochimiques urinaires habituellement recommandés.Ces différents travaux ont permis de mieux appréhender les interactions physiopathologiques entre la prévention des dysfonctions rénale et pulmonaire et soulignent les antagonismes qui peuvent exister entre ces deux organes. La réanimation liquidienne peut être optimisée par le choix d'un soluté hypo-oncotique pour réduire le risque d'IRA sans altérer la fonction respiratoire. La réponse rénale à une hypoxémie modérée suggère que la préservation de l'oxygénation artérielle puisse avoir un rôle dans la préservation de la fonction rénale. Enfin, le Doppler rénal est un outil prometteur pour la sélection, l'évaluation et l'optimisation des mesures de protection rénales
Critically ill patients needing mechanical ventilation are particularly exposed to ischemic renal injury leading for acute kidney injury (AKI) occurrence is associated and poor outcome. The aim of this work was to optimize AKI prevention. We evaluated protective measures for renal oxygen delivery on one hand and the performance of usual tools for the detection and characterization of renal injury on the other hand.The main measure in preventing AKI is the correction and the preservation of blood volume; fluid resuscitation is, however, associated with an increased risk of pulmonary oedema. Our results show that renal outcome depends on the type of fluid used with an increased risk of AKI using hydroxyethylstarches and/or hyper-oncotic colloids while pulmonary function is not influenced by the type of fluids used but depends on the volume infused. Pulmonary worsening seems to occure for a lower volume of colloids than crystalloids, probably because of a higher efficiency to increase intravascular volume.In addition to the restoration of renal perfusion, arterial oxygenation is a potential determinant of renal oxygenation. Because the use of a low FiO2 level is recommended to avoid oxygen related pulmonary lesions, we assessed the renal response to a moderate hypoxemia, usually applied in patient with acute respiratory distress syndrome. Two hours of mechanical ventilation with a SaO2 between 88% and 92% induces renal diuretic and vascular response identified by Doppler. This response is independent from ventilator and hemodynamic changes. Renal response is rapidly reversible with the correction of hypoxemia. In addition to the ability in detecting changes of intra-renal vascular resistances, we found that Doppler resistive index is helpful in predicting the persistence of AKI, better than most of the usual urinary indices.Our works allow a better approach of the intricate mechanisms in preventing renal and pulmonary functions. Fluid resuscitation can be optimized preferring hypo-oncotic fluids for reducing AKI incidence without apparent negative impact on pulmonary function. Renal response to a moderate hypoxemia suggests that arterial oxygen preservation might be essential for renal function preservation. Renal Doppler is a promising tool for the selection and the evaluation of AKI preventive measures

Les deux formes d'inflammation pulmonaire en réanimation sont la pneumonie et le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA). Nous avons conçu un test diagnostique rapide basé sur l'autofluorescence des neutrophiles alvéolaires. S'appuyant sur une étude expérimentale, puis sur une étude clinique randomisée, nous avons montré que les sondes d'intubation avec ballonnets coniques diminuaient les micro-inhalations sans prévenir l'incidence des pneumonies post-opératoire. Une grande variabilité des pressions des ballonnets coniques pose la question de leur effet délétère. La thérapie cellulaire basée sur les cellules souches mésenchymateuses (CSM) est prometteuse. L'étude des effets thérapeutiques des vésicules extracellulaires issues de CSM (VE-CSM) constitue un nouvel axe de recherche. Dans 2 modèles murins de SDRA, puis dans un modèle de poumons humains ex vivo, nous avons démontré des effets thérapeutiques des VE-CSM. Nous avons ensuite étudié les lymphocytes T régulateurs (Treg) pulmonaires et systémiques dans le SDRA. Cette étude a montré un déficit quantitatif plutôt que fonctionnel de la population Treg pulmonaire dans le SDRA, avec une cinétique évoquant un recrutement des Treg circulants vers le compartiment pulmonaire au cours de la maladie. En conclusion, nos travaux ont développé de nouvelles stratégies diagnostiques et préventives des pneumonies de réanimation, afin de réduire leur impact en termes de morbi-mortalité. Les bénéfices thérapeutiques des CSM et des VE-CSM dans le SDRA expérimental, ainsi que l'altération du phénotype Treg observé chez nos patients, ouvrent de nouveaux champs de recherche vers le développement d'immunothérapies innovantes
Pneumonia and acute respiratory distress syndrome (ARDS) are two facets of severe acute lunginflammation, often met in intensive care unit (ICU). Rapid diagnosis of pneumonia remains essential inorder to optimize their management. We worked on setting up a quick test diagnosis based on theintensity of alveolar neutrophils autofluorescence. The validation of this test in a multicenter cohort isunderway. Preventing microaspiration across the cuff remains a priority to prevent pneumonia inmechanically ventilated patients. Based on the results of an ex vivo study followed by a clinicalrandomized trial, we showed that tapered-cuff endotracheal tube prevented microaspiration in the exvivo model, without lowering intraoperative microaspirations and postoperative pneumonia rate aftermajor vascular surgery. Both studies yielded similar results concerning the higher variation of cuffpressureover time, which leads to the question of their safety of use in terms of potential resultingtracheal wall ischemia.Pneumonia represents 80% of the cause of ARDS, which can be viewed as lung uncontrolledinflammatory response. Cell-based therapy using mesenchymal stem cells (MSC) is a growing field ofresearch in ARDS therapy. Despite numerous beneficial effects in ARDS, their capacity of self-renewalpoints them out as a potential cancer inducer in the mid-long term. In this context, evaluating thetherapeutic effects of extracellular vesicles-released from MSC (EV-MSC) represents a novel approach.We showed therapeutic effects of EC-CSM in two murine model of ARDS induced by endotoxin or liveEscherichia coli bacteria, and in another ex vivo human lung preparation.We then focused our research on temporal and compartmental dynamics of regulatory T cells(Treg) phenotypes in ARDS patients. This prospective observational clinical study showed that Early ARDSwas characterized with an alveolar compartment fully polarized towards pro-inflammatory state andneutrophils chemotaxis. In lung compartment, and compared to control patients, ARDS patients showeda quantitative Tregs deficiency, which partially recovered over time, while activation markers wereoverexpressed in both Tregs and effectors T cells (Teff). Conversely, patients with ARDS had a higherproportion of systemic Tregs compared to controls. Significant increased proportion in circulating Th1,Th22, and ILC1 subsets, and decreased proportion in ILC3 subsets were also found in ARDS patientscompared to controls.In conclusion, we developed novel strategies to diagnose and prevent pneumonia in ICU, whichremains essential to improve patients’ outcomes. Therapeutic effects of MSC and EV-MSC, as well asTreg phenotype alterations pave the way for development of novel immunoregulatory therapies

La clairance des cellules apoptotiques appelée efferocytose est un mécanisme complexe participant à l’homéostasie des êtres pluricellulaires. Son dysfonctionnement est associé à des maladies inflammatoires aiguës et chroniques ainsi qu’autoimmunes. La reconnaissance de la phosphatidylsérine (PS) à la surface des cellules apoptotiques par les phagocytes prévient la libération de leur contenu cytotoxique. Au cours de pathologies comme le syndrome de détresse respiratoire aigu (SDRA) on observe une accumulation de cellules apoptotiques dans le tissu pulmonaire. High mobility group box 1 (HMGB1) est une molécule aux propriétés pro-inflammatoires et chémo-attractantes, libérée dans le milieu extracellulaire après modification post-transcriptionnelle comme une acétylation ou une phosphorylation. Sa concentration plasmatique est élevée dans de nombreuses pathologies comme le sepsis et le SDRA. Son administration dans des modèles animaux induit des lésions pulmonaires similaires à celles du SDRA alors que l’utilisation d’anticorps anti-HMGB1 les prévient. But : ces expériences ont été réalisées afin d’explorer le rôle d’HMGB1 au cours de l’efferocytose. Résultats : HMGB1 en se liant à l’intégrine αVβ3 à la surface des macrophages inhibe l’efferocytose. La délétion de l’extrémité C-terminale d’HMGB1 n’altère pas sa capacité à se lier à αVβ3 mais lui fait perdre une partie de ses propriétés inhibitrices en la rendant incapable de se fixer au récepteur aux Advanced Glycation Endoproducts (RAGE) qui participe à l’efferocytose en se liant à PS. La stimulation par le LPS, un ligand de TLR4, induit la libération dépendante de la Poly (ADP) Ribose Polymerase 1 (PARP1) d’HMGB1 ribosylé. Cette ribosylation augmente la capacité d’HMGB1 à se lier à RAGE et à PS et ainsi d’inhiber l’efferocytose. Conclusion : HMGB1 a un effet pro-inflammatoire en inhibant l’efferocytose. HMGB1 se lie sur la surface des phagocytes à l’intégrine αVβ3 et à RAGE qui est un récepteur à PS nouvellement décrit. La ribosylation d’HMGB1 intensifie la propriété inhibitrice d’HMGB1 sur l’efferocytose.

Le SDRA est défini comme une inflammation pulmonaire aiguë généralisée associée à une perméabilité vasculaire accrue et entraînant une insuffisance respiratoire menaçant le pronostic vital. Le SDRA reste une affection grave et fréquente chez les patients admis en réanimation, résultant de lésions épithéliales pulmonaires (telles qu'observées dans la pneumonie) et d'états inflammatoires systémiques aigus tels que le choc septique, dans lesquels les lésions endothéliales et le recrutement cellulaire excessif jouent un rôle majeur. Cette affection est caractérisée par une augmentation du recrutement leucocytaire et en particulier neutrophilique du compartiment sanguin vers les poumons. Après une étape d'adhérence ferme résultant de l'interaction entre l'intégrine LFA-1 et son ligand endothélial ICAM-1, la migration transendothéliale repose sur des mécanismes moléculaires complexes impliquant d'une part des molécules d'adhésion endothéliale (E-sélectine, ICAM) et leurs ligands leucocytaires (PSGL-1, LFA-1, Mac-1) et, d'autre part, des activateurs chimiotactiques de la diapédèse des leucocytes (CXCL-12, CCL-2, IL-8) ou des inhibiteurs tels que l'endocan.Endocan est un protéoglycane circulant principalement synthétisé et sécrété par l'endothélium pulmonaire. Cette molécule a été décrite comme un inhibiteur fonctionnel de l'interaction LFA-1 / ICAM-1, ce qui explique sa capacité à inhiber le recrutement des leucocytes. De manière concordante, de faibles niveaux d'endocan ont été rapportés comme étant associés à un risque accru de défaillance respiratoire chez les patients admis en réanimation en état de sepsis sévère. Cette association pourrait résulter d'un manque de sécrétion d'endocan entraînant un déficit de protection contre une inflammation pulmonaire excessive chez ces patients. Une autre explication pourrait être avancée, basée sur les résultats de De Freitas Caires et al., qui ont montré l'existence d'un catabolite majeur de l'endocan produit sous l'effet protéolytique de la cathepsine G des neutrophiles. Ce fragment d'endocan, dénommé p14, dépourvu de la chaîne glycanique requise pour l'activité anti-inflammatoire d'endocan, pourrait être impliqué dans la restauration de niveaux élevés d'inflammation pulmonaire. En effet, il pourrait antagoniser la capacité d’endocan à interagir avec le LFA-1, avec pour conséquence de réverser son effet anti-migratoire. Ainsi, endocan et p14 pourraient constituer une voie innovante, dont l'exploration associée à celles d'autres paramètres pourrait finalement améliorer la prise en charge du SDRA.Au cours de ma thèse, nous avons d'abord étudié les effets de l'endocan humain sur la migration transendothéliale, puis exploré l'implication potentielle de l'interaction LFA-1 / ICAM-1 dans ces effets et évalué l'effet anti-inflammatoire hypothétique de l'endocan dans un modèle murin d'inflammation aiguë pulmonaire. Nous avons également exploré les effets de p14 sur l'interaction endocan / LFA-1 / ICAM-1 et ses conséquences sur le recrutement des leucocytes humains. Par la suite, nous avons décrit les conditions de fiabilité de la mesure de l'endocan chez les patients afin de déterminer si les résultats concernant les effets de l'endocan et de p14 dans le domaine de la science fondamentale pouvaient être extrapolés pour les investigations cliniques. Enfin, nous avons cherché à conforter la valeur pronostique de l'endocan sanguin mesurée à l'admission en réanimation en tant que prédicteur du SDRA, confortant ainsi l'hypothèse émise par Palud et al., dans une cohorte indépendante et plus large de patients
ARDS is defined as an acute diffuse, inflammatory lung injury associated with increased vascular permeability and leading to life-threatening respiratory failure. ARDS is still a severe and common condition in ICU patients, resulting from lung epithelial injuries (as observed in pneumonia) as well as systemic acute inflammatory states, such as septic shock, in which endothelial injury and excessive cellular recruitment play a major role. This condition is characterized by an increase in the migration of leukocytes and especially neutrophils from blood compartment into the lung. Following a firm adherence step depending on the interaction between the integrin LFA-1 and its endothelial ligand ICAM-1, transendothelial migration is based on complex molecular mechanisms involving on one hand endothelial adhesion molecules (E-selectine, ICAMs), and their leukocyte ligands (PSGL-1, LFA-1, Mac-1) and on the other hand chemotactic activators of leukocyte diapedesis (CXCL-12, CCL-2, IL-8) or inhibitors such as endocan.Endocan is a circulating proteoglycan mainly synthesized and secreted by lung endothelium. This molecule has been reported as a functional inhibitor of the LFA-1 / ICAM-1 interaction, explaining its ability to inhibit leukocyte recruitment. Consistently, low levels of endocan have been reported to be associated with high occurrence of respiratory failure in patients admitted in ICU with severe sepsis. This association could result from a lack of secretion of endocan leading to an insufficient protection against excessive lung inflammation in these patients. Another explanation could be advanced, based on the results from De Freitas Caires et al, who have reported the existence of a major catabolite of endocan produced under the proteolytic effect of neutrophil cathepsin G. This endocan fragment, named p14, devoid of the glycanic chain required for the anti-inflammatory activity of endocan, could be involved in the restoration of high levels of lung inflammation. Indeed, it could compete with endocan’s ability to interact with LFA-1, and then could reverse its biological anti-migratory effect. Thus, endocan and p14 could constitute an interesting innovative pathway integrating in much larger models that could finally improve the management of ARDS.During my PhD, we first investigated the effects of human endocan on transendothelial migration, then assessed the potential involvement of the LFA-1 / ICAM-1 interaction in those effects and finally evaluated the hypothetical anti-inflammatory effect of human endocan in a mouse LPS-induced ALI model. We also explored the effects of p14 on the endocan / LFA-1 / ICAM-1 interaction and its consequence on the recruitment of human leukocytes. Then, to assess whether those results concerning the effects of endocan and p14 in the field of basic science could be extrapolated for clinical investigations, we described the conditions of reliability of measurement of blood endocan in ICU patients. Finally, we aimed to comfort the prognostic value of blood endocan measured at ICU admission as a predictor of ARDS, thus supporting the hypothesis emitted by Palud et al, in an independent and larger cohort of patients

Étude de déterminants de la dysfonction vasculaire pulmonaire au cours du syndrome de détresse respiratoire aigue. La physiopathologie du syndrome de détresse respiratoire aigue (Acute Respiratory Distress Syndrome, ARDS) inclut une dysfonction vasculaire pulmonaire, résultant de phénomènes de thrombose, hyperperméabilité endothéliale, dysrégulation de la vasomotricité et remodelage. La ventilation en pression positive est un facteur aggravant. Il en résulte une augmentation des résistances vasculaires pulmonaires, à l'origine d'une hypertension pulmonaire et à risque de cœur pulmonaire aigu, associés à un pronostic péjoratif au cours de l'ARDS. Mais les déterminants de cette dysfonction vasculaire pulmonaire demeurent largement méconnus. Un modèle murin d'agression pulmonaire aigue two hit a été développé, associant une instillation orotrachéale de lipopolysaccharide bactérien à une ventilation mécanique protectrice, avec explorations physiologiques respiratoires et hémodynamiques invasives. Trois déterminants potentiels de la dysfonction vasculaire pulmonaire ont été étudiés. Dans le premier travail, nous avons établi que l'utilisation de manœuvres de recrutement alvéolaire, consistant en l'application transitoire et répétée de hauts niveaux de pression positive, limitait la dégradation de la mécanique ventilatoire mais induisait une hypertension pulmonaire. Une analyse transcriptomique pulmonaire a montré une dysrégulation d'un grand nombre de gènes impliqués dans les principales fonctions endothéliales. Dans le deuxième travail, une déficience en interleukine-6 a été montrée associée à une inflammation et un œdème pulmonaires majorés. Une élévation des résistances pulmonaires totales était aussi observée, prévenue par l'injection d'interleukine-6 recombinante et au moins partiellement attribuable à une dysrégulation de la vasomotricité pulmonaire impliquant la voie des nitric oxide synthases. Dans le troisième travail, nous avons comparé des souris adultes jeunes et d'âge mature et illustré une gravité âge-dépendante, caractérisée par une inflammation systémique et pulmonaire et une fuite alvéolocapillaire accrues, ainsi qu'un dosage bronchoalvéolaire d'angiopoiétine 2 élevé, suggérant une atteinte endothéliale sévère. Nos résultats pourraient contribuer à l'identification de nouvelles voies thérapeutiques ciblant la microvascularisation pulmonaire au cours de l'ARDS. Mots clés: syndrome de détresse respiratoire aigue, ventilation mécanique, hypertension pulmonaire, dysfonction vasculaire pulmonaire, vieillissement, interleukine-6, manœuvre de recrutement
Study of factors determining the pulmonary vascular dysfunction during acute respiratory distress syndrome.The pathophysiology of the acute respiratory distress syndrome (ARDS) includes a pulmonary vascular dysfunction, which is attributable to thrombosis, endothelial hyperpermeability, dysregulation of the pulmonary vasomotor tone and remodeling. Positive pressure ventilation is an exacerbating factor. The result is an increase in the pulmonary vascular resistances, which lead to an acute pulmonary hypertension and may cause acute cor pulmonale, both associated with an altered prognosis during ARDS. But the factors determining the pulmonary vascular dysfunction are poorly known. A murine model of two hit acute lung injury, combining an orotracheal aspiration of bacterial lipopolysaccharide to a protective mechanical ventilation, with physiological respiratory and invasive hemodynamic monitoring. Three factors which might determine pulmonary vascular dysfunction were studied. In the first work, we established that the use of alveolar recruitment maneuvers, consisting in a transient and repetitive application of high positive pressure level, minimized the alteration of lung mechanics but induced a pulmonary hypertension. A transcriptomic lung analysis showed a dysregulation of many genes involved in main endothelial functions. In the second work, a interleukin-6 deficiency was shown to be associated with higher pulmonary inflammation and edema. An increase in total pulmonary resistances was also observed, but prevented with a human recombinant interleukin-6 treatment and at least partially attributed to a nitric oxide synthase-dependent dysregulation of the pulmonary vasoreactivity. In the third work, we compared young adult and mature adult mice and we observed an age-dependent severity, including a higher systemic and pulmonary inflammation, a higher alveolocapillary leak and a higher bronchoalveolar angiopoietin 2, suggestive for a severe endothelial injury. Our results might contribute to identify new therapeutic pathways targeting pulmonary microvessels during ARDS.Key words: acute respiratory distress syndrome, mechanical ventilation, pulmonary hypertension, pulmonary vascular dysfunction, aging, interleukin-6, recruitment maneuvers

Les maladies infectieuses sont responsables de 14 millions de décès chaque année dans le monde. La reconnaissance des motifs structuraux des pathogènes se fait par l’intermédiaire de récepteurs dont les "Toll-like" ou TLRs. Les TLRs et leurs molécules adaptatrices sont des composants fondamentaux de l'immunité innée. Cette étude vise à comprendre le rôle des TLRs, de leurs voies de signalisation et de certaines cytokines induites dans les réponses immunitaires mises en œuvre dans les modèles de maladies infectieuses comme la malaria cérébrale, la tuberculose, l’asthme allergique et non allergique. L’analyse est réalisée chez les souris génétiquement déficientes pour différents TLRs, les molécules adaptatrices MyD88, TIRAP, et TRIF ainsi que les molécules de la famille du TNF. Cette étude a permis de montrer que la voie de signalisation impliquant TLR4, MyD88 et TIRAP est essentielle, alors que les voies impliquant TRIF ou IL-1R1 et IL-18R ne sont pas indispensables à l’inflammation des voies respiratoires induite par le LPS. Dans le modèle d’infection par Plasmodium berghei Anka, ni les TLRs, MyD88, TIRAP, ou TRIF ne sont impliqués dans la pathogenèse de la malaria cérébrale. Nous avons également mis en évidence le rôle majeur joué par LTa, LTb et les voies de signalisation impliquant TNFR2 et LTbR dans la malaria cérébrale. Finalement, dans le modèle d’infection à Mycobactérium tuberculosis, au-delà des voies TLRs, la voie IL-1R1 dépendante de MyD88 est essentielle pour le contrôle de l’infection aigue.

Le Syndrome de Détresse Respiratoire Aiguë (SDRA) est la forme la plus sévère d’agression alvéolaire aiguë. Il estcaractérisé par un dommage alvéolaire diffus, suivi d’une phase de réparation nécessaire à la guérison. Bien queles monocytes/macrophages soient des acteurs incontournables de la pathogénie et de la résolution du SDRA, leurpolarisation et leur rôle dans la réparation alvéolaire restent mal connus chez l’Homme. L’hypothèse défendue parcette thèse est que l’environnement alvéolaire module la différenciation et la polarisation desmonocytes/macrophages au cours du SDRA, et que les macrophages alvéolaires ainsi polarisés participentactivement à la réparation et à sa régulation. Les principaux résultats de nos travaux ont permis d’établir que : 1)l’environnement alvéolaire de SDRA inhibe la différenciation des monocytes en fibrocytes (précurseursmésenchymateux associés à la fibroprolifération et à pronostic péjoratif). L’inhibition est majoritairement due à laSerum Amyloid protein P (SAP), provenant en partie du relargage de ses stocks matriciels pulmonaires à la faveurde la lésion alvéolaire ; 2) l’environnement alvéolaire de SDRA induit une polarisation anti-inflammatoire desmacrophages se rapprochant de la polarisation induite in vitro par l’IL-10 ; 3) les macrophages anti-inflammatoirespolarisés par le lavage broncho-alvéolaire (LBA) de patients SDRA favorisent la réparation alvéolaire épithéliale viala production polarisation-dépendante d’Hepatocyte Growth Factor (HGF). Cette production macrophagique d’HGFest amplifiée via une boucle autocrine PTGS2/PGE2 chez l’Homme ; 4) ces résultats semblent étayés par lesdonnées obtenues sur une cohorte clinique qui montrent que les concentrations de sCD163 (marqueur depolarisation anti-inflammatoire) et d’HGF rapportées au nombre de macrophages alvéolaires sont plus élevéeschez les patients survivants que chez les patients décédés de SDRA. L’ensemble de nos travaux démontrent pour lapremière fois chez l’Homme le rôle bénéfique de l’environnement alvéolaire sur les monocytes/macrophages,d’une part en inhibant leur différenciation en fibrocytes contribuant ainsi à limiter la fibroprolifération pulmonaire,et d’autre part en induisant un phénotype macrophagique anti-inflammatoire, contribuant à limiter l’inflammationengendrée par la lésion alvéolaire initiale et favorisant la réparation épithéliale via la production d’HGF. Lesdonnées physiopathologiques obtenues pourraient permettre d’envisager la reprogrammation anti-inflammatoiredes macrophages comme une cible thérapeutique du SDRA en cas d’excès d’inflammation ou de fibro-proliférationavec réparation aberrante
Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS) is the most severe form of acute lung injury. ARDS is characterized bydiffuse alveolar damage followed by a phase of alveolar repair necessary to recovery. Althoughmonocytes/macrophages are key actors of pathogenicity and resolution of ARDS, little is known about theirpolarization and role on alveolar repair during human ARDS. The hypothesis of our studies was that ARDS alveolarenvironment modulates differentiation and polarization of monocytes and macrophages, and that polarizedmacrophages are involved in alveolar repair and its regulation. The main results of our work have shown that: 1)ARDS alveolar environment inhibited monocytes differentiation into fibrocytes (mesenchymal progenitorsassociated with fibroprolifération and a poor prognosis), mainly through its Serum Amyloid P (SAP) content,originating, at least in part, from the release of SAP associated with lung connective tissue during ARDS; 2) ARDSalveolar environment drove an anti-inflammatory macrophage polarization, close to that induced by IL-10 in vitro;3) anti-inflammatory macrophages polarized by broncho-alveolar lavage (BAL) from ARDS patients favored alveolarepithelial repair through a polarization-dependent production of Hepatocyte Growth Factor (HGF). This HGFproduction is amplified by an autocrine PTGS2/PGE2 dependent loop in human macrophages; 4) these results mayhave clinical relevance, since sCD163 (a marker of anti-inflammatory polarization) and HGF concentrations,expressed relatively to BAL macrophage count, were higher in ARDS survivors than non-survivors. Taken together,our works demonstrate for the first time the beneficial role of the ARDS alveolar environment onmonocytes/macrophages, inhibiting their differentiation into fibrocytes, thus limiting excessive lungfibroproliferation, and inducing an anti-inflammatory macrophage polarization, thus limiting the inflammationgenerated by the initial alveolar damage and favoring epithelial repair through HGF production. The datapresented in this thesis may allow considering anti-inflammatory macrophage repolarization as a potential newtherapeutic target of ARDS with excessive inflammation or fibro-proliferation with aberrant repair

Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) présente un taux de mortalité élevé, près de 40%, dans des unités de soins intensifs. Il est défini comme un ensemble de manifestations cliniques, radiologiques et physiologiques qui traduisent une intense inflammation pulmonaire et une hyperperméabilité pulmonaire, correspondant aux différentes agressions aiguës du poumon. Le prise en charge des patients atteints du SDRA nécessite une ventilation assistée qui, en cas de mauvaise adaptation des paramètres de ventilation, notamment, pression et volume, peut aggraver l'état du patient. Le réglage de ces paramètres est basé sur l'analyse de l'aération pulmonaire en réponse à la ventilation assistée. Cette analyse peut être faite sur des images tomodensitométriques (CT en anglais) après y avoir segmenté le parenchyme pulmonaire. Néanmoins, cette segmentation est entravée par l'augmentation de la densité du parenchyme, qui réduit le contraste entre le poumon et les structures voisines. Cette thèse cherche à fournir des outils de traitement d'images qui permettent aux experts l'analyse de l'aération pulmonaire dans des images CT acquises dans le cadre d'un projet sur le SDRA utilisant un modèle animal
Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS) is a life threatening disease presenting a high mortality of about 40% in intensive care units. It is the consequence of different pulmonary aggressions generating hypoxemia and pulmonary edema, which are radiologically expressed as infiltrations observable as opaque regions in the lung. The treatment of ARDS requires mechanical ventilation, which may deteriorate the state of the patient if the ventilation parameters, namely volume and pressure, are not correctly adjusted. To adjust the parameter settings to each individual case, lung aeration - in response to ventilation - needs to be assessed. This assessment can be done using computed tomography (CT) images. However, it requires the segmentation of the lung-parenchymal tissue, which is a challenging task in ARDS images due the opacities that hinder the image contrast. In this thesis we aim to provide the required tools for the experts to analyze the aeration in the images acquired within an ARDS project using an animal model

La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) et le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) de l’adulte constituent des affections sévères et létales du poumon profond associées à une hypoxie alvéolaire, pour lesquelles les ressources thérapeutiques sont limitées. La thérapie cellulaire utilisant des cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh) est actuellement envisagée dans ces pathologies, mais les mécanismes d’action des CSMh restent à élucider. Nous avons testé in vitro l’hypothèse selon laquelle les CSMh pourraient exercer un effet cytoprotecteur paracrine sur les cellules épithéliales alvéolaires (CEA) soumises à l’hypoxie.Dans une première étude, nous avons montré que l’exposition aiguë de CSMh dérivées de moelle osseuse à un environnement inflammatoire (traitement par cytomix constitué de TNFα, d’Interféron Ƴ et d’Interleukine 1β) et hypoxique (3% O₂) mimant le microenvironnement alvéolaire du SDRA ne modifiait pas le phénotype ou la viabilité des cellules mais induisait des modifications de leur secretome, notamment de facteurs connus pour réguler le transport trans-épithélial alvéolaire de sodium (Na) et la réabsorption de l’oedème alvéolaire : IL1-ra, PGE2 et KGF. Le milieu de culture des CSMh (MC-CSMh), qu’il soit obtenu en normoxie ou en hypoxie-cytomix, prévenait l’augmentation de la perméabilité épithéliale des CEA primaires de rat cultivées sur support semi-perméable et exposées à l’hypoxie et au cytomix. Le MC-CSMh provenant de CSMh cultivées en normoxie prévenait l’inhibition du transport transépithélial alvéolaire de Na en restaurant l’expression à la surface de la sous-unité α du canal sodique épithélial ENaC, tandis que le MC-CSMh obtenu sous hypoxie-cytomix n’avait pas d’effet protecteur. La sécrétion de Keratinocyte Growth Factor (KGF) par les CSMh était indispensable à leur effet protecteur.Dans une seconde étude, nous avons montré qu’une exposition prolongée à l’hypoxie telle que rencontrée au cours de la FPI induisait des modifications phénotypiques des CEA de rat évocatrices de transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) avec perte progressive d’expression des marqueurs épithéliaux (TTF1, AQP5, ZO-1 et E-Cadhérine) couplée à l’apparition tardive de marqueurs mésenchymateux (α -SMA et Vimentine). Ces modifications phénotypiques s’accompagnaient de l’expression à la phase initiale de l’hypoxie de facteurs de transcription impliqués dans la TEM (SNAI1, TWIST1 et ZEB1) ou induits par l’hypoxie (HIF-1α et HIF-2α et de protéines induisant la TEM (TGFβ1 et CTGF). La co-culture des CEA avec des CSMh en fond de puits prévenait les modifications phénotypiques induites par l’hypoxie ainsi que l’expression des facteurs pro-TEM TWIST1, ZEB1, TGFβ1 et CTGF. Là encore, le KGF était au moins en partie responsable des effets protecteurs des CSMh.Ces deux études indiquent que les CSMh sont susceptibles d’exercer des effets cytoprotecteurs paracrines vis-à-vis des CEA soumises à l’hypoxie aiguë ou prolongée, en limitant d’une part les effets de délétères de l’hypoxie sur les propriétés de transport vectoriel de Na et en prévenant d’autre part les modifications phénotypiques évocatrices de TEM. La sécrétion par les CSMh de KGF, facteur de croissance épithélial bien connu pour ses effets bénéfiques sur les CEA, explique en partie les effets protecteurs paracrines des CSMh. Nos résultats suggèrent que les effets cytoprotecteurs des CSMh vis-à-vis des CEA pourraient contribuer aux effets bénéfiques des CSMh observés in vivo dans différents modèles animaux d’agressions alvéolaires aiguës ou à tendance fibrosante
Non communiqué

La ventilation mécanique(VM) est le premier traitement en réanimation du syndrome de détresse respiratoire aigüe permettant de maintenir une oxygénation tissulaire suffisante. Mais elle induit une atteinte de la fonction contractile des muscles respiratoires, principalement le diaphragme, augmentant ainsi la dépendance du patient vis à vis de son ventilateur. Cette pathologie musculaire acquise est appelée Dysfonction Diaphragmatique induite par la ventilation (VIDD). L’objectif de cette thèse est proposer, à partir d’un modèle murin de ventilation mécanique, les mécanismes physiopathologiques précoces impliqués dans cette dysfonction, afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans la prévention de cette pathologie musculaire.Nous avons montré en effet la présence, après 6 heures de ventilation mécanique chez la souris, d’un stress oxydant d’origine mitochondrial à la base d’une oxydation du récepteur à la ryanodine (RyR1), principal canal calcique impliqué dans le CEC. Nous avons également montré la présence au bout d’un temps de ventilation mécanique équivalent, d’une phosphorylation de ce même canal, du faite d’une activation de la voie des protéines kinase, secondaire à un stress adrénergique. Nous également avons démontré que ces deux modifications post traductionnelles du RyR1 devaient être nécessairement associées pour induire une atteinte fonctionnelle du canal avec fuite calcique dans le cytosol, du faite de la perte de liaison avec sa protéine stabilisatrice FKBP12. Dans ses travaux de thèse, nous montrons également, que ces anomalies de troubles de l’homéostasie calcique observée après 6 heures de ventilation mécanique, induisaient au bout de 12 heures de ventilation une activation secondaire de la protéolyse dépendante du calcium, associée à une atrophie. Ainsi ces résultats montrent l’intérêt de toutes thérapeutiques permettant de stabiliser la liaison entre le canal RyR1 et sa protéine FKBP12 dans la prévention de la VIDD. En effet, avons observé chez la souris, qu’un traitement anti oxydant spécifique de la mitochondrie (SS-31) ou qu’un traitement bétabloquant spécifique de la voie béta2 adrénergique (ICI-118551) ou qu’un traitement qui stabilise directement la liaison RyR1-FKBP12 (S107) permettaient de prévenir les troubles précoces de l’homéostasie calcique et l’apparition secondaire d’une protéolyse et d’une atrophie induite par la ventilation mécanique. Enfin, dans le dernier travail de ma thèse, je propose que la production de ROS mitochondriale, puisse être associée à un remodelage du réseau mitochondrial avec prépondérance d’un phénomène de fission des mitochondries. Ce remodelage, qui pourrait être considéré comme une adaptation de la mitochondrie du faite d’une rupture brutale de l’équilibre entre production et consommation d’énergie par la fibre musculaire. En effet, nous montrons qu’un inhibiteur de la fission mitochondriale (P110), qui bloque la liaison entre la protéine Drp1 et son récepteur, dans notre modèle animal de ventilation mécanique, pouvait prévenir l’apparition d’une VIDD. Ainsi dans la continuité de ses derniers travaux, afin de faire le lien entre fission mitochondriale et stress oxydant à la base des troubles de l’homéostasie calcique, j’espère montrer que ce traitement, au cours de la ventilation mécanique, limite la production de ROS mitochondriale, l’oxydation du canal RyR1, ainsi que la fuite calcique à travers le RyR1. Ces derniers travaux, mettraient en avant toute thérapeutique permettant de limiter les phénomènes de fission mitochondriale et ses conséquences dans la prévention de la VIDD.Mots clés : RyR, mitochondrie, dysfonction contractile, VIDD, stress oxydant
Mechanical ventilation (MV) is the first treatment in intensive care for acute respiratory distress syndrome to maintain adequate tissue oxygenation. However, it induces an impairment of the contractile function of the respiratory muscles, particularly the diaphragm, thereby increasing the patient's dependence on his ventilator. This acquired muscle disease have been termed ventilator induced diaphragmatic dysfunction (VIDD). The aim of this thesis is to propose, from a mouse model of mechanical ventilation, early pathophysiologic mechanisms involved in this dysfunction, to identify new therapeutic targets in preventing VIDD.We observed after 6 hours of mechanical ventilation, a mitochondrial oxidative stress which induces ryanodine receptor (RyR1) oxidation, the main calcium channel involved in the ECC. We also showed the presence after an equivalent time of mechanical ventilation, phosphorylation of RyR1, due to protein kinase activation, secondary to an adrenergic stress. Then, we have demonstrated that these post-translational modifications of RyR1 should be necessarily associated to trigger a functional impairment of RyR1 with calcium leakage from the sarcoplasmic reticulum to the cytosol, due to the loss of connection between RyR1 and the stabilizing protein KBP12. In his thesis, we also showed that these calcium homeostasis disorders, induced by 12 hours of ventilation, secondary activates the dependent proteolysis calcium and atrophy.Thus, these results show the benefit of all therapy stabilizing the connection between the RyR1 channel and the FKBP12 protein to prevent VIDD. Indeed, were observed in mice, that a specific mitochondrial anti-oxidant treatment (SS-31), or a specific beta-blocker treatment of beta2 adrenergic pathway (ICI-118551 ) or a treatment that stabilizes directly FKBP12- binding RyR1 (S107 ) prevent early disorders of calcium homeostasis and secondary appearance of proteolysis and atrophy induced by mechanical ventilation.Finally, in the last part of my work thesis, I suggest that mitochondrial ROS production may be associated with remodeling of the mitochondrial network with a preponderance of mitochondrial fission phenomenon. This remodeling could be seen as an adaptation of the mitochondria due to a sudden mismatch between energy production and consumption. Indeed, we showed that an inhibitor of the mitochondrial fission (P110), which blocks the connection between the DRP1 protein and its receptor in our animal model of mechanical ventilation, could prevent the appearance of VIDD. Thus the continuity of this last work of my thesis is to make the link between mitochondrial fission and oxidative stress underlying the disorders of calcium homeostasis. Indeed, I hope to show that this treatment during mechanical ventilation, may decrease mitochondrial ROS production, oxidation of RyR1 channel and calcium leak through the RyR1. This last work will emphasis any therapeutic which limit mitochondrial fission and its consequences, to prevent VIDD.Keywords: RyR1, mitochondria, contractile dysfunction, VIDD, oxidative stress

Les neutrophiles représentent une population de cellules immunes effectrices-clés dans la lutte anti-infectieuse. Longtemps considérées comme des cellules ultraspécialisées dans l’élimination des microbes, de plus en plus de recherches tendent pourtant à repositionner le neutrophile comme un acteur de la régulation des réponses immunitaires dans de nombreux contextes (cancer, auto-immunité, infection). De plus, il semble aujourd’hui clair qu’il n’existe pas un type de neutrophile mais que celui-ci est doué de fonctions multiples (parfois antagonistes) en lien avec l’environnement ou potentiellement à des sous-populations fonctionnelles préexistantes. De ce fait, le(s) neutrophile(s) pourraient jouer un rôle bénéfique ou délétère en fonction de la pathologie ou de la phase inflammatoire de la pathologie. A titre d’exemple, le neutrophile semble pouvoir présenter un profil pro- et/ou anti-inflammatoire au cours de l’infection grippale. De façon générale, le neutrophile semble jouer un rôle-clé dans l’immunopathologie grippale et ses complications comme le syndrome de détresse respiratoire aiguë. En effet, sa présence dans les voies aériennes est corrélée à la sévérité de la pathologie dans les modèles expérimentaux et chez les patients. Toutefois, d’autres études semblent indiquer un rôle protecteur du neutrophile au cours de l’infection grippale. Bien que la différence de modèles utilisés puisse expliquer en partie ces résultats discordants, nous émettons l’hypothèse qu’un tel phénotype pourrait être également dû à l’existence de différentes sous-populations fonctionnelles jouant des rôles opposés au cours de la grippe. Au cours de l’infection par le virus Influenza (IAV), nous avons observé l’émergence d’une population de neutrophiles matures exprimant le marqueur de cellules souches hématopoïétiques Sca-1 (Ly6A). Cette population existe à l’homéostasie et présente un tropisme particulier pour les tissus non lymphoïdes. Au cours de l’infection IAV, les neutrophiles Sca-1+ présentent un profil phénotypique et fonctionnel immunorégulateur se caractérisant par l’expression de protéines membranaires régulatrices comme PD-L1 ou MHC-II et la sécrétion de médiateurs anti-inflammatoires comme l’IL-10 et l’arginase-1. L’acquisition de ces fonctions semble avoir lieu dans la moelle osseuse via un mécanisme dépendant de l’IFN-γ. La déplétion de ces neutrophiles Sca-1+ aboutit à une susceptibilité accrue des animaux à l’infection IAV et à une exacerbation des phénomènes inflammatoires associés à l’infection. En conclusion, nos travaux suggèrent un nouveau concept où une infection virale localisée peut modifier à distance le développement médullaire fonctionnel des neutrophiles
Neutrophils are key innate effector cells during infections, mostly described as single footsoldiers of innate immunity that eliminate pathogens through multiple mechanisms. However, emerging evidences tend to reposition neutrophils as cells endowed with relevant immunomodulatory functions in various immune responses including auto-immunity, cancer and viral infections. Thus, it is now admitted that neutrophils can play multiple (sometimes opposite) functions in relation to the environment or the existence of preset functional subsets. In this context, neutrophil(s) can play either protective or deleterious role according to the disease and the inflammatory stage of the disease. This paradigm can be further exemplified during experimental Influenza A virus (IAV) infection, a model of lung immunopathology, in which neutrophils have been shown to play either pro- or anti-inflammatory functions. It is usually conceded that neutrophils play a critical role in IAV-dependent immunopathology and its complications such as acute respiratory distress syndrome. Thus, its presence in airways is correlated to disease severity in experimental model and clinical studies. However, some studies indicate a protective role for neutrophils during IAV infection. While the differences in the model used may somehow explain these contradictory results, we hypothesized that this discrepancy may arise from the existence of functional subsets that play opposite roles during IAV infection.During IAV infection, we observed the emergence of a subset of mature neutrophils expressing the hematopoietic stem cell marker Sca-1 (Ly6A). This subset could be observed under steady-state and preferentially populated non lymphoid tissues. During flu infection, Sca-1+ neutrophils displayed a phenotypic and functional profile of cells endowed with immunoregulatory functions. Specifically, they expressed the regulatory surface makers PD-L1 and MHC-II and secreted anti-inflammatory molecules such as IL-10 and arginase-1. These functions appeared to be acquired in the bone marrow during neutrophil development in an IFN-γ-dependent manner. Interestingly, depletion of Sca-1+ neutrophils culminated in increased susceptibility to IAV infection and IAV-dependent inflammation. In sum, our work suggest a new immunological concept in which a distant viral infection can remote the functional development of neutrophils in the bone marrow

Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) est caractérisé par des lésions alvéolairesdiffuses qui résultent d’une lésion de la membrane alvéolo-capillaire entrainant entre autresune réaction inflammatoire intense et une perte massive et hétérogène du volume pulmonaireaéré. La tomographie par émission de positons (TEP) et la tomographie par impédanceélectrique (TIE) sont deux techniques d’imagerie fonctionnelle permettant l’étude noninvasive, quantitative et régionale du poumon.Ce travail présente le résultat d’études expérimentales conduites dans le SDRA. Tout d’abord,nous avons comparé positivement la TIE à la TEP pour la mesure de la ventilation pulmonaireet du volume aéré. Nous avons ensuite décrit et validé une technique robuste d’obtention duvolume aéré et de la ventilation spécifique en TEP sans prélèvement invasif. Enfin, nousavons étudié en TEP l’influence de la pression expiratoire positive (PEP) et du décubitusventral (DV) sur la répartition de la ventilation, de la perfusion et de l’inflammationpulmonaires. Les poumons agressés par l’acide chlorhydrique inhalé ont une inflammationsignificativement plus élevée que le groupe contrôle. Aucune différence significatived’inflammation n’a été trouvée entre les groupes expérimentaux malgré des modificationsimportantes de la répartition de la ventilation et de la perfusion régionales lors de la mise enDV. Ces études donc ont permis le développement d’un modèle porcin stable d’agressionpulmonaire aiguë et la validation de techniques d’imagerie permettant l’étude non invasive deparamètres physiologiques importants pouvant aider au réglage de la ventilation mécanique aucours du SDRA
Acute respiratory distress syndrome (ARDS) is characterized by diffuse alveolar damage andresulting from an increased permeability of the alveolar-capillary membrane. Of notice, thereis an intense lung inflammation. Positron emission tomography (PET) and electricalimpedance tomography (EIT) allow noninvasive assessment of pulmonary ventilation,perfusion and inflammation. We use these techniques to decipher the impairments ofventilation and inflammation throughout the lungs in an experimental model of acute lunginjury by hydrochloric acid inhalation in pigs.In a first study, we compared EIT to PET in quantifying pulmonary aerated volume andventilation, using PET as a gold standard. We found that lung ventilation and volume wereaccurately measured with EIT over a wide range of lung volume and minute ventilation. Wehave then described and validated a new model to obtain lung aerated volume and ventilationwith PET, without the requirement of gas sampling in the respiratory circuit. Finally, weconducted a controlled study with PET to evaluate the effects of positive end-expiratorypressure and body position on regional lung inflammation, ventilation and perfusion.Inflammation was significantly higher in injured groups than in control. However, there wasno significant change in inflammation across ALI groups despite significant differencebetween ventilation and perfusion repartition.We have developed in this work a stable experimental model of acute lung injury andvalidated noninvasive imaging tools allowing studying of important physiologic parametersthat could help setting up mechanical ventilation

Introduction : La réanimation est une discipline médicale récente ayant pour spécificité une surveillance rapprochée et tracée des patients et de leurs traitements. Une grande quantité de données concernant les caractéristiques des patients, leur prise en charge et leur évolution sont ainsi générées et collectées quotidiennement. La médecine basée sur les preuves oppose classiquement les études observationnelles et interventionnelles et confère à ces dernières, notamment aux études randomisées et contrôlées, un niveau de preuve scientifique supérieur.Objectifs : Décrire l’apport de l’utilisation des données observationnelles en réanimation au travers de travaux récents recourant à différentes méthodologies d’analyse. Discuter les contributions respectives qu’ont les études observationnelles et interventionnelles dans l’acquisition des connaissances scientifiques en réanimation.Méthode : Quatre études observationnelles prospectives multicentriques conduites en réanimation et publiées dans des revues à comité de relecture. Détail de la variété des outils disponibles dans la conception d’études observationnelles à travers différentes méthodes telles que l’utilisation de données en temps réel, la description de cohortes, et l’appariement sur un score de propension afin d’estimer l’effet d’un traitement. Résultats : Les différents travaux détaillés dans cette thèse décrivent la variété des apports des données observationnelles en réanimation. Ces données peuvent constituer un outil de surveillance des épidémies en temps réel comme nous l’avons montré au cours de la pandémie de grippe A H1N1 en France. Elles sont aussi indispensables à la réalisation d’études épidémiologiques telle celle que nous présentons concernant le syndrome de détresse respiratoire aigu. Nous montrons aussi comment ce type de données a remis en question la définition des groupes de sevrage de la ventilation mécanique initialement proposée par une conférence de consensus. Enfin, l’utilisation de techniques statistiques innovantes telles celles basées sur un score de propension a permis l’évaluation du bénéfice de l’utilisation de la circulation extra-corporelle à visée d’oxygénation dans les cas les plus sévères de détresse respiratoire secondaire à la grippe A H1N1.Conclusion : Les études observationnelles ne sont pas à opposer aux études interventionnelles mais apportent des résultats complémentaires et offrent des solutions alternatives lorsqu’une intervention ne peut pas être testée. Connaitre les avantages et limites de chacune des méthodes permet d’optimiser la conception des études l’interprétation des résultats. L’utilisation des données observationnelles en réanimation participe pleinement au progrès des connaissances de cette spécialité
Introduction: Intensive care is a recent medical specialty which has the particularity to provide a close monitoring and traceability of patients and their treatments. Thus, a huge amount of data is daily collected on characteristics, management and evolution of patients. Evidence based medicine usually confronts observational and interventional studies confers to the latters, particularly randomized controlled trials, a higher scientific quality.Objective: To describe the benefit of observational data for intensive care through recent works using different analysis methods. To discuss respective benefits of observational and interventional studies for scientific knowledge in intensive care.Methods: Four prospective observational multicenter studies conducted in intensive care units and published in peer reviewed journals. Detail of the spectrum of available tools to design observational studies presenting different methods such as real time data use, cohort description and propensity matched analysis to estimate a treatment effect. Results: The studies presented in this thesis describe the different contributions of observational data for intensive care. As we demonstrated during the Influenza A H1N1 pandemics, observational data can be used for a real-time monitoring of epidemics. They are necessary to conduct epidemiological studies such as the acute respiratory distress syndrome study presented. We also show how observational data lead to question the definition of weaning from mechanical ventilation groups initially proposed by a consensus conference. Finally, innovative statistics techniques as propensity score allowed the evaluation of extracorporeal membrane oxygenation for the most severe cases of respiratory failure due the Influenza A H1N1. Conclusion: Observational studies should not be opposed to interventional studies as they provide additional results and give alternative options when an interventional cannot be tested. One must know the benefits and limits of each methods in order to optimize studies design and results interpretation. Observational data are fully part of the knowledge progress of intensive care specialty

Le pronostic à court terme des patients d'oncohématologie admis en réanimation s'est notablement amélioré au cours des deux dernières décennies. Ces progrès sont le fait d'une diversification importante de l'arsenal thérapeutique relatif à l'oncologie et l'hématologie mais aussi d'une meilleure prise en charge de ces patients au sein des réanimations. Notre travail de recherche s'est centré sur la devenir de ces malades et les facteurs associés à celui-ci.Dans ce cadre, nous avons conduit plusieurs études observationnelles pronostiques portant sur des patients neutropéniques admis en réanimation. Nous avons montré que les facteurs indépendamment associés à la mortalité hospitalière étaient une allogreffe de moelle, le recours à la ventilation mécanique invasive, le recours à l'épuration extra-rénale ainsi qu'une documentation microbiologique positive. De plus, chez les patients neutropéniques admis en réanimation pour sepsis sévère/choc septique, les facteurs indépendamment associés à la mortalité en réanimation étaient une antibiothérapie initiale inappropriée, un délai d'initiation de l'antibiothérapie en réanimation > 1h, une documentation microbiologique positive à bacille gram négatif non fermentant et à un score SOFA élevé dès l'admission en réanimation. La désescalade du traitement antibiotique initial, réalisable dans 44% des cas,était sans répercussion significative sur le pronostic à court et long-terme. Enfin, chez les patients neutropéniques admis en réanimation pour détresse respiratoire aiguë, le seul facteur indépendant associé à la mortalité hospitalière était le recours à la ventilation mécanique alors que l'utilisation de corticostéroïdes les jours précédant l'admission en réanimation et l'une admission dans un contexte de sortie d'aplasie étaient protecteurs.Finalement, nous avons montré dans une récente revue de la littérature que le pronostic du patient d'oncohématologie admis en réanimation s'était amélioré au cours du temps et que la neutropénie ne semblait pas être un facteur pronostique dans ce contexte.En conclusion, nous avons montré que le patient neutropénique est à haut risque de complications sévères infectieuses, respiratoires et immunologiques. Ces complications impactent le pronostic des patients de manière significative. Nos résultats vont donner lieu à plusieurs essais randomisés chez le patient neutropénique admis en réanimation notamment autour de la désescalade antibiotique au cours du sepsis et des stratégies d'oxygénothérapie en cas de détresse respiratoire
The short-term prognosis of patients with onco-hematological diseases and neutropenia admitted to intensive care has significantly improved over the last two decades. This progress is the fact of a significant diversification of the armamentarium on oncology and hematology but also a better management of these patients in the ICUs. Our research has focused on the outcome of these patients and its prognostic factors. In this context, we have conducted several prognostic observational studies of neutropenic patients admitted to intensive care units. We showed that factors independently associated with hospital mortality were the bone marrow transplantation, the use of invasive mechanical ventilation, the use of renal replacement therapy and a positive microbiological documentation. Moreover, in neutropenic patients admitted to intensive care for severe sepsis / septic shock, factors independently associated with ICU mortality were inappropriate initial antibiotic therapy, a delay of antibiotic treatment > 1h, a positive microbiological documentation with non-fermenting gram negative bacilli, a high SOFA score on admission in ICU. The de-escalation of initial antibiotic treatment feasible in 44% of cases had no significant impact on the short and long-term outcomes. Otherwise, in neutropenic patients admitted to intensive care for acute respiratory failure, the only independent factor associated with hospital mortality was the need for mechanical ventilation, while the use of corticosteroids in the days before ICU admission and a admission during neutropenia recovery period were protective. Finally, we have shown in a recent review of the literature that the outcome of hematology-oncology patient admitted to intensive care had improved over time and that neutropenia did not seem to be a prognostic factor in this context. In conclusion, we have shown that the neutropenic patient is at high risk of severe infectious,respiratory and immunological complications. These complications significantly impact the outcome of these patients. Our results could lead to the planning of several randomized trials in neutropenic patients admitted to intensive care in particular about the escalation antibiotic in sepsis and oxygentherapy strategies for respiratory distress

Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (ARDS) est la forme la plus sévère d'agression alvéolaire aiguë (ALI) Il est caractérisé par un dommage alvéolaire diffus suivi d'une phase de réparation nécessaire à la guérison. Bien que les fibroblastes pulmonaires soient des acteurs essentiels de cette réparation, leurs caractéristiques et leurs fonctions restent mal connues chez l'homme au cours des ALI/ARDS. L’hypothèse défendue par cette thèse est qu’une réparation alvéolaire harmonieuse nécessite un recrutement adapté des fibroblastes et de leur précurseur, les fibrocytes, vers le poumon, ainsi qu' une fine régulation de leurs fonctions par l'environnement inflammatoire de l'alvéole. Les principaux résultats de nos travaux ont permis : 1) d’établir que le liquide de lavage alvéolaire (LBA) recueilli lors des ALI/ARDS stimule la production de facteurs de réparation épithéliaux comme l'Hepatocyte Growth Factor (HGF) et le Keratinocyte Growth Factor (KGF) par les fibroblastes. Cette production est principalement induite par l'IL-1ß via une boucle autocrine COX2/PGE2. 2) de montrer que les fibroblastes alvéolaires cultivés à partir des LBA d'ALI/ARDS présentent un phénotype activé, caractérisé par une production augmentée de collagène 1 et une capacité de migration majorée. La détection de fibroblastes dans les cultures de cellules du LBA est associée à une diminution des marqueurs de l'inflammation et à une réduction de la durée de ventilation des patients concernés. 3) D’analyser l’effet des LBA d'ALI/ARDS sur la migration des fibroblastes et de monter l’existence d’un équilibre entre activation et inhibition de la migration via une modulation de le voie du PDGF. La forme soluble du récepteur a au PDGF (PDGF-sRa) est un des inhibiteurs présent dans le LBA. Une augmentation de la capacité chimiotactique des LBA de patients en ALI/ARDS est associée à une augmentation de la mortalité.4) De démontrer la présence de fibrocytes, précurseurs mésenchymateux circulants d'origine hématopoïétique, dans les LBA de patients en ALI/ARDS et de mettre en évidence que leur recrutement excessif, est associé à un mauvais pronostic. Ainsi, après ajustement sur les covariables cliniques et biologiques (modèle de COX), un pourcentage de fibrocyte supérieur à 6% de la population cellulaire totale du LBA est associé à une durée de ventilation prolongée et à une mortalité augmentée. L’ensemble de ces travaux démontrent pour la première fois que les fibroblastes et les fibrocytes sont directement associés au pronostic lors des ALI/ARDS, que leur rôle est indispensable à la guérison mais que leur recrutement excessif pourrait impacter défavorablement le pronostic des patients. Les données physiopathologiques obtenues pourraient contribuer à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et à proposer de nouveaux marqueurs biologiques dans la prise en charge des ALI/ARDS
Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS) is the most severe form of Acute Lung Injury (ALI) and is characterized by diffuse alveolar damage followed by a phase of alveolar repair necessary to recovery. Although lung fibroblasts are key players in this repair process, their characteristics and functions remain poorly understood in humans during ALI/ARDS. The hypothesis of our studies was that effective alveolar repair requires a regulated recruitment of fibroblasts and fibrocytes (circulating mesenchymal precursors of hematopoietic origin) to the lung, as well as a tight regulation of their functions by the alveolar inflammatory environment. The main results of our works have shown that: 1) The alveolar lavage fluid (BAL) from ALI/ARDS patients stimulated the production of Hepatocyte Growth Factor (HGF) and Keratinocyte Growth Factor (KGF) by fibroblasts, both of which were involved in epithelial repair. This production was mainly induced by IL-1ß via an autocrine COX2/PGE2 dependant loop. 2) The alveolar fibroblasts cultured from BAL fluids of ALI/ARDS patients demonstrated an activated phenotype, characterized by an increase of both collagen 1 production and ability to migrate. A positive BAL fibroblast cell culture was associated with reduced markers of inflammation and reduced ventilation duration of ALI/ARDS patients. 3) BAL fluids from ALI/ARDS patients modulated fibroblast migration. This effect was related to a balance between activation and inhibition of migration involving the PDGF signaling pathway. The soluble form of the PDGF a receptor (PDGF-sRa) participated in the BAL inhibitory chemotactic activity. An increased chemotactic ability of BAL from ALI/ARDS patients was associated with higher mortality. 4) Excessive recruitment of fibrocytes is associated with poor prognosis. After adjustment of clinical and biological covariates (Cox model), a percentage of fibrocytes higher than 6% of total BAL cells is associated with a prolonged ventilation duration and an increased mortality. Taken together, our works demonstrate for the first time that fibroblasts and fibrocytes are directly associated with prognosis in ALI/ARDS. Fibroblasts are essential to lung healing, but their excessive recruitment may have a negative impact on prognosis. The data presented in this thesis may help identify new therapeutic targets and suggest new biomarkers to consider in the management of ALI/ARDS

La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) et le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) de l’adulte constituent des affections sévères du poumon distal, avec un pronostic sombre pour les patients. A ce jour, aucun traitement n’est réellement efficace. De manière intéressante, une hypoxie alvéolaire est retrouvée dans ces pathologies.La thérapie cellulaire utilisant des cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh) pourrait représenter un intérêt thérapeutique chez l’Homme. Cependant, leurs mécanismes d’action sont multiples et encore mal définis. Aussi, nous avons testé in vitro l’hypothèse selon laquelle les CSMh pourraient exercer un effet cytoprotecteur paracrine sur les cellules épithéliales alvéolaires (CEA) soumises à l’hypoxie.Dans une première étude, nous avons montré qu’une exposition prolongée à l’hypoxie telle que celle rencontrée au cours de la FPI induisait des modifications phénotypiques des CEA primaires de rat, évocatrices d’une transition épithélio-mésenchymateuse (TEM). On observe une perte progressive d’expression des marqueurs épithéliaux (TTF1, AQP5, ZO-1 et E-Cadhérine), couplée à l’apparition tardive de marqueurs mésenchymateux (α-SMA et Vimentine). Ces modifications phénotypiques s’accompagnent de l’expression dès les premières heures d’hypoxie de facteurs de transcription impliqués dans la TEM (SNAI1, TWIST1 et ZEB1) ou induits par l’hypoxie (HIF-1α et HIF-2α), et de protéines induisant la TEM (TGF-β1 et CTGF). La co-culture des CEA avec des CSMh en fond de puits prévient les modifications phénotypiques induites par l’hypoxie ainsi que l’expression des facteurs pro-TEM TWIST1, ZEB1, TGF-β1 et CTGF. Cet effet bénéfique des CSM est en partie expliqué par la sécrétion d’un facteur de croissance épithélial, le KGF.Dans une deuxième étude, nous avons confirmé que les CEA entraient en apoptose en condition hypoxique, via l’induction de deux voies de signalisations hypoxiques pro-apoptotiques. D’une part, les facteurs de transcription induits par l’hypoxie HIF sont stabilisés, et une cible pro-apoptotique, Bnip3, est induite. D’autre part, l’hypoxie induit une accumulation d’espèces réactives à l’oxygène délétère pour la cellule, perturbant l’équilibre redox de la cellule, endommageant l’ADN, et conduisant à l’apoptose. Cette accumulation pourrait résulter notamment d’une diminution de l’activité des enzymes anti-oxydantes SOD, en hypoxie. Le manque d’oxygène entraine également l’expression de CHOP, facteur de transcription pro-apoptotique impliqué dans le stress du réticulum endoplasmique, qui va13inhiber l’expression de la protéine anti-apoptotique Bcl-2. Nous avons montré que la culture des CEA en présence de milieu conditionné de CSMh (mc-CSMh) permet de prévenir partiellement l’apoptose des CEA en hypoxie, en modulant la voie de signalisation HIF, et en prévenant l’accumulation et les effets délétères des ROS. L’effet protecteur des CSM impliquerait le KGF comme observé lors de la première étude, mais également le HGF.Ces deux études indiquent que les CSMh sont susceptibles d’exercer des effets cytoprotecteurs paracrines vis-à-vis des CEA soumises à l’hypoxie aiguë ou prolongée, en limitant d’une part les modifications phénotypiques évocatrices de TEM, et d’autre part l’apoptose des CEA via la modulation des voies de signalisations hypoxiques. La sécrétion par les CSMh de KGF et de HGF, facteurs de croissance épithéliaux connus pour leurs effets bénéfiques sur les CEA, explique en partie les effets protecteurs paracrines des CSMh. Nos résultats suggèrent que les effets cytoprotecteurs des CSMh vis-à-vis des CEA pourraient contribuer aux effets bénéfiques des CSMh observés in vivo dans différents modèles animaux de fibrose induite, ou lors d’agressions alvéolaires aiguës
Acute or chronic alveolar injuries provoke massive apoptosis of alveolar epithelial cells (AEC) that compromises an efficient repair of the alveolar epithelium and leads to lung diseases such as ARDS or IPF. These disorders are commonly associated with local alveolar hypoxia aggravating their progression through the stimulation of AEC apoptosis. Administration of allogenic mesenchymal stem cells (MSCs) has been shown to limit lung inflammation and fibrosis in murine models of alveolar injury, through a still poorly understood paracrine mechanism. In a first study, we showed that long term exposure of AEC in hypoxia leads to phenotypic alterations which looks like epithelio-mesenchymal transition (EMT). Co-culture with MSCs prevent hypoxia-induced EMT.In a second work, we studied whether MSC could protect AEC from hypoxia-induced apoptosis and the mechanisms involved. hMSC-conditioned media (hMSC-CM) significantly reduced hypoxia-induced apoptosis of AEC. Such a anti-apoptotic effect was also obtained with ROS scavenger N-acetylcystein or HIF1a inhibitor YC-1. hMSC-CM decreased the protein expression of HIF1α and HIF2α and of their pro-apoptotic target Bnip3 in hypoxic AEC. hMSC-CM also reduced ROS accumulation in hypoxic AEC by enhancing the activity of anti-oxidant enzymes and prevented the induction of CHOP, a pro-apoptotic factor induced by ROS signaling. The paracrine effect of hMSC was partly dependent on KGF and HGF secretion. hMSC prevent via a paracrine effect hypoxia-induced apoptosis of AEC by modulating hypoxic and ROS signaling.These two studies show that MSCs exert cytoprotective effects in vitro against hypoxia-induced apoptosis and EMT in AEC