Добірка наукової літератури з теми "Spectro-Microscopie"

Des aciers renforcés par dispersion de nano-particules d'oxide de titane et d'yttrium (Y-Ti-O ODS), irradiés et non irradiés, ont été éxaminés par microscopie électronique en transmission à balayage couplée à la spectroscopie de perte d'énergie des électrons (STEM-EELS) pour étudier leurs structures chimiques et les effets des radiations. Des méthodes analytiques telles que l'analyse statistique multivariée (MVA) et l'ajustement de courbes sur les spectres EELS sont utilisées afin de réaliser une quantification élémentaire ou d'étudier les structures fines des seuils (ELNES). Les traitements MVA permettent d'extraire les réponses spectrales indépendantes des spectre-images (SI) pour mieux comprendre la distribution spatiale des états de valence des différentes expèces. L'observation de poudres d'ODS après le broyage (MA) montre que les nano-particules (NPs) précipitent durant le traitement thermique qui suit, (consolidation). Pour les échantillons consolidés et non irradiés, les particules de taille moyenne (> 3-4 nm) adoptent une structure pyrochlore imparfaite (Y2Ti2O7-d) avec une structure coeur-coquille (Y-Ti-O)-Cr complétée par une couche de Ti réduit également dépourvue en Y. Une ségrégation de Cr est également observée aux joints de grains. Le ratio O/Ti de 3.2 et la non homogénéité de la distance entre plans (222) est due à des défauts dans la structure de la particule, confirmant ainsi qu'elles présentent de nombreux défauts et sont non stoechiométriques. L'ICA nous permet de générer des cartes d'état de valence mais aussi d'extraire une réponse interfaciale Ti-Cr; à l'interface, les atomes Ti et Cr diffusent sur une distance de quelques Å. Pour les plus petites particules, nos résultats montrent qu'elles peuvent consister soit en une structure pyrochlore hautement déficiente en oxygène (Y2Ti2O6+d) soit en une structure chimique inconnue YaTibOc. Le ratio O/Ti diminue de 3-3.5 vers des valeurs inférieures à 1 pour des tailles allant de 4 à 1.8 nm. Les plus grandes particules (de quelques dizaines à quelques centaines de nm), des oxides et/ou nitrures Ti-O, N-Ti, Y-Ti-O ne représentent qu'une faible proportion du nombre total des NPs (< 1%). Pour étudier les effects des irradiations aux neutrons, un certain nombre d'échantillons ODS furent implantés avec des ions He+ et irradiés avec des ions Fe+. Après l'irradiation et l'implantation, une distribution homogène de bulles d'He à haute pression est observée ainsi que des déplétions, ségrégations et précipitations de Cr induites par irradiation (RID, RIS et RIP). Les bulles sont fréquemment observées piégées à l'interface NP-matrice, cependant elles sont aussi observées piégées par des dislocations, libres dans la matrice et aux joints de grains. Le seuil He-K (21.218 eV pour les atomes libres) se déplace vers des énergies plus hautes (ΔE = 0.5 à 4 eV); nous montrons que ce déplacement est corrélé avec la densité d'He. La quantification de l'He est réalisée à l'aide de trois méthodes différentes: différence spatiale, ajustement de courbes, MVA. Les valeurs de la densité et de la pression atteignent 100 nm-3 et 8 GPa respectivement. Cependant, avec des barres d'erreur pouvant atteindre 30%, les mesures de la pression sont plutôt semi-quantitatives. La méthode d'ajustement de courbes permet une cartographie de la position et de l'intensité du pic He-K et donc une cartographie de la densité pour des bulles individuelles. Les réponses spectrales de bulles individuelles peuvent être extraites d'un SI contenant plusieurs bulles à différentes densités en utilisant l'ICA ou l'analyse de la composante vertex (VCA). Nos mesures montrent que les bulles plus grandes que 4 nm sont sous préssurisées ou à l'équilibre avec la matrice Fe-Cr. En dessous de 3.5 nm, la pression de l'He augmente rapidement, correspondant à un état surpressurisé
Irradiated and non-irradiated (Y-Ti-O) oxide-dispersion-strengthened (ODS) steels are investigated by scanning transmission electron microscopy coupled with electron energy-loss spectroscopy (STEM-EELS) to study their chemical structure and the effects of radiation. Analytical methods such as multivariate statistical analysis (MVA) and EELS curve-fitting are carried out to achieve elemental quantification or study the edge fine structures (ELNES). Using MVA, the spectrum-images (SI) can be separated into independent spectral responses to gain insights into the valence state of various elements such as Ti or Cr. Investigations on post-mechanical-alloyed (MA) powders show that the nanoparticle (NP) precipitation occurs only after a further high-temperature treatment (consolidation). In non-irradiated consolidated samples, medium-sized NPs (> 3-4 nm) are found to adopt a Y2Ti2O7-d defective pyrochlore structure with a (Y-Ti-O)-Cr core-shell structure with a reduced-Ti layer also depleted in Y. Cr is also shown to segregate to the grain boundaries in non-irradiated samples. The measured O/Ti ratio of 3.2 found for medium-sized NPs and the observed non-homogeneity of the inter-reticular distance d222 through the particle is interpreted as being due to defects in the particles’ structure; it is indeed confirmed that Y2Ti2O7 medium-sized NPs in ODS steels present numerous defects and are non-stoichiometric. The Ti oxidation state is shown to vary from the centre of the NPs to their periphery from Ti4+ in distorted Oh symmetry to a valency often lower than 3+. Independent component analysis (ICA) allows us to generate bonding maps and extract a Ti-Cr interfacial response. An inter-diffusion of Ti and Cr atoms is observed at this interface. The smallest NPs present a different and ill-defined structure and interface with the Fe-Cr matrix. They either consist of a highly oxygen-deficient pyrochlore structure (Y2Ti2O6+d) or an unknown YaTibOc chemical structure. The O/Ti ratio decreases from 3-3.5 to below 1 for an NP size going from 4 to 1.8 nm. A few large particles (sized from tens to hundreds of nm) present a N-Ti-O or Ti-O chemistry but represent only a small percentage of all the NPs (< 1%). To study the neutron irradiation-induced changes, a number of ODS samples were implanted with He+ ions and irradiated with Fe+ ions. After irradiation, they display a homogeneous distribution of high-pressure He bubbles and radiation-induced Cr depletion, segregation and precipitation (RID, RIS and RIP). The He bubbles are frequently trapped at the NP-matrix interface, although bubbles can exist freely in the matrix, trapped by dislocations and at grain boundaries. The He-K line (21.218 eV for free atoms) shifts to higher energy in the bubbles (ΔE = 0.5 to 4 eV); this is shown to be correlated with the He density. He quantification is carried out with three different methods: spatial difference, curve-fitting and MVA. The density and pressure values are found to reach 100 nm-3 and 8 GPa respectively, although the pressure measurement is only semi-quantitative given that the error bars can reach 30%. The curve-fitting method allows us to map the He-K energy position and intensity, yielding the density, in individual bubbles. The spectral response of individual bubbles can be separated in an SI containing many bubbles at different densities using ICA or vertex component analysis (VCA). Bubbles larger than 4 nm are shown to be under-pressurized or at equilibrium with the Fe-Cr matrix. Below 3.5 nm, the He pressure is shown to increase markedly, passing into the over-pressurised regime

La NADPH oxydase des phagocytes (NOX2) est responsable de la production d’anions superoxydes qui sont les précurseurs des autres formes réactives de l’oxygène. NOX2 est une enzyme majeure de la réponse immunitaire. Les dysfonctionnements de NOX2 sont associés à de nombreuses pathologies et donc il convient d’en comprendre les détails de la régulation. Cette oxydase est composée de cinq sous-unités : deux protéines membranaires, gp91phox et p22phox et 3 protéines cytosoliques p47phox, p67phox et p40phox. D’après les études in vitro avec des protéines purifiées, les protéines cytosoliques sont supposées former un complexe ternaire qui se déplace à la membrane avec une petite protéine G, Rac, au moment l’activation.L’objectif de ce projet est de caractériser les interactions spécifiques entre les sous-unités cytosoliques de NOX2 en cellules vivantes en utilisant le phénomène de transfert résonant d’énergie de type Förster (FRET) entre deux fluorophores, un donneur et un accepteur. Ici les fluorophores seront des protéines fluorescentes de la famille de la GFP. Elles sont fusionnées à deux sous-unités. L’efficacité du FRET dépend de la distance entre les fluorophores et permet ainsi de caractériser les interactions entre les protéines d’intérêt. Une méthode rapide d’identification des situations où le FRET est positif a été mise au point par cytométrie en flux. Des études détaillées et quantitatives ont ensuite été réalisées en utilisant l’imagerie de durée de fluorescence (FLIM) du donneur. Le FLIM, combiné à l’utilisation de donneurs présentant une durée de vie mono-exponentielle, permet de déterminer directement des efficacités de FRET apparentes et moléculaires, qui contiennent, toutes les deux, des informations qualitatives et quantitatives sur l’interaction et la structure des protéines impliquées. De ces données, il est possible d’extraire la fraction des donneurs interagissant avec un accepteur. Les informations obtenues à partir des données de FRET-FLIM permettent une meilleure compréhension de l’organisation et de la régulation de NOX2 tout en permettant une estimation des constantes de dissociation (Kd). Afin de confirmer ces résultats, des expériences de spectroscopie de corrélation de fluorescence à deux couleurs (FCCS) ont été réalisées. Cette méthode complétement indépendante n’est pas basée sur la distance entre fluorophores comme le FRET mais sur leur co-diffusion à travers un petit volume d’observation dans le cytoplasme cellulaire.L’approche FRET-FLIM nous a tout d’abord permis d’observer les interactions entre hétéro-dimères formés de deux sous-unites différentes en cellules vivantes et d’exclure la formation d’homo-dimères entre deux sous-unités identiques. Etant donné la bonne précision des mesures de FLIM, nous avons pu comparer les informations structurales obtenues en cellules avec les données structurales issues d’études sur les protéines purifiées in vitro et nous avons constaté qu’elles sont en bon accord. Nous avons ensuite aligné les structures disponibles pour proposer un premier modèle 3D du complexe cytosolique de la NADPH oxydase au repos dans le cytosol cellulaire.Les fractions de protéines en interaction sont pour tous les hétéro-dimères autour de 20% ce qui n’est pas en accord avec l’hypothèse courante qui propose que toutes les sous-unités cytosoliques soient sous forme de complexe. Toutefois nos premiers résultats de FCCS confirment ce résultat extrait des données de FRET-FLIM. Nous proposons donc que la complexation des sous-unités cytosolique pourrait être impliquée dans la régulation de la NADPH oxydase. Des études complémentaires seront nécessaires pour valider cette nouvelle hypothèse. Les constantes de dissociation Kd estimées à partir de nos résultats sont micromolaires et donc un ordre de grandeur plus élevé que les valeurs nanomolaires déterminées in vitro. Des mesures plus détaillées de FCCS pourront compléter et valider ces résultats
The phagocyte NADPH oxidase (NOX2) is a key enzyme of the immune system generating superoxide anions, which are precursors for other reactive oxygen species. Any dysfunctions of NOX2 are associated with a plethora of diseases and thus detailed knowledge about its regulation is needed. This oxidase is composed of five subunits, the membrane-bound gp91phox and p22phox and the cytosolic p47phox, p67phox, and p40phox. The latter are assumed to be in a ternary complex that translocates together with the small GTPase Rac to the membranous subunits during activation.Our aim was to discover and to characterize specific interactions of the cytosolic subunits of NOX2 in live cells using a Förster Resonance Energy Transfer (FRET) based approach: Since FRET depends on the distance between two fluorophores, it can be used to reveal protein-protein interactions non-invasively by studying fluorescent protein tagged subunits. To have a rapid method on hand to reveal specific interactions, a flow cytometer based FRET approach was developed. For more detailed studies, FRET was measured by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), because it allows a direct determination of the apparent and molecular FRET efficiency, which contains both qualitative and quantitative information about the interaction and the structure of the interacting proteins. Furthermore, the FRET-FLIM approach enables an estimation of the fraction of bound donor. This information itself is important for a better understanding of the organisation and regulation of the NOX2, but it is also necessary for the calculation of the dissociation constant Kd from the FRET-FLIM data. To confirm the findings obtained by FRET-FLIM fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS) experiments were performed. This completely independent method is not based on distances like FRET but on the observation of the co diffusion of the fluorescently labelled samples when they move across a small observation volume inside the cells.The FRET-FLIM approach allowed us in a first step to discover heterodimeric interactions between all cytosolic subunits in live cells. Due to the good precision of the results, we were able to extract structural information about the interactions and to compare them with available structural data obtained from in vitro studies. The information from FRET-FLIM was coherent with in vitro data. We then aligned the available structures leading to the first 3D model of the cytosolic complex of the NADPH oxidase in the resting state in live cells.Additionally, the bound fraction for all heterodimeric interactions derived by FRET-FLIM is around 20 %, which is in contrast to the general belief that all cytosolic subunits are bound in complex. The first FCCS results support our findings. Therefore, we believe that the complexation of the cytosolic subunits could be involved in the regulation of the NADPH oxidase and should be investigated further. The estimated Kd derived from the FRET-FLIM approach is in the low micomolar range, which is an order of a magnitude higher than the nanomolar range of in vitro studies.In conclusion, we showed that our quantitative FRET-FLIM approach is not only able to distinguish between specific and unspecific protein-protein interactions, but gives also information about the structural organisation of the interacting proteins. The high precision of the FRET-FLIM data allow the determination of the bound fraction and an estimation of the Kd in live cells. FCCS is a complementary method, which can verify these quantitative findings. However, it cannot replace FRET-FLIM completely as it does not give any structural information.With respect to the biological outcome of this project, we can propose for the first time a 3D-model of the cytosolic complex of the NADPH oxidase covering the in vitro as well as the live cell situation. Additionally, the small bound fraction found here may raise new ideas on the regulation of this vital enzyme

Les éléments traces, malgré leur rareté (moins de 100 parties par million) sur Terre, remplissent diverses fonctions : certains agissent comme des micronutriments, tandis que d'autres, appelés métaux critiques, possèdent des applications industrielles et médicales uniques. Dans les systèmes aquatiques naturels dépourvus d'oxygène, les transferts d'électrons impliquent des réactions biogéochimiques catalysées par le fer, le soufre et les éléments traces. Comprendre leur réactivité dans ces environnements reste un défi. Ma recherche de doctorat se concentre sur combler cette lacune de connaissance concernant trois éléments spécifiques (rhénium (Re), sélénium (Se) et gadolinium (Gd)). Ils existent sous diverses formes chimiques aqueuses dans l'eau : anion monovalent (perrhénate, ReO4—), anion divalent (sélénate, SeO42— et sélénite, SeO32—) ou cation (gadolinium, Gd3+). Le rhénium est un métal critique, tandis que le sélénium est un élément bioessentiel à faibles niveaux et devient toxique à des concentrations plus élevées. Le gadolinium est un élément des terres rares et un métal critique également, en raison de son utilisation étendue comme agent de contraste dans l'imagerie par résonance magnétique (IRM).Ces éléments sont les plus concentrés dans les sédiments marins formés dans des environnements dépourvus d'oxygène. Les phases minérales courantes comprennent la pyrite (FeS2) et la magnétite (Fe3O4), selon la teneur en sulfure dans ces environnements et l'origine (autogène vs détritique, par exemple, à partir de roches volcaniques) des particules. Ma recherche, présentée sur quatre chapitres, étudie les processus de réduction de surface (Re(VII), Se(VI) et Se(IV)) et la sorption (Gd(III)) sur/dans les particules de magnétite et de pyrite. En utilisant diverses méthodes analytiques telles que la spectroscopie XAFS, la spectroscopie STEM-EELS et le MC-ICP-MS, notre étude révèle des voies réactives distinctes. Re(VII) réagit avec l'eau sulfurée pour former des nanoparticules de Re(III, IV, V)2S7, tandis qu'à des concentrations plus faibles, le Re est réduit et incorporé dans les particules, selon des voies caractérisées par une fraction isotopique moindre avec la pyrite qu'avec la magnétite. Nous montrons également que les nanoparticules de pyrite réduisent le Se(VI) et le Se(IV), jusqu'à obtenir du Se(0) en surface ou du Se(-I) en structure, selon que l'adsorption ou la co-précipitation se produit. Enfin, le Gd se substitue au Fe(III) dans les nanoparticules de magnétite jusqu'à une substitution de 5% de Fe par Gd. Nous tentons d'unifier le comportement d'affinité de ces éléments traces et d'autres avec les sédiments riches en Fe anoxiques à la lumière du principe des acides et des bases durs et mous.L'étude apporte de nouvelles perspectives sur les mécanismes qui régissent la séquestration des métaux et métalloïdes dans les environnements sédimentaires. La signification de cette recherche réside dans sa pertinence pour les entreprises scientifiques et technologiques contemporaines, en particulier pour comprendre comment les processus dans les systèmes riches en Fe et en sulfures fonctionnent, tels que les éléments traces, la mobilité du Fe et du S, l'équilibre des masses dans les cycles sédimentaires mondiaux, jusqu'à l'exploration, l'exploitation minière et le recyclage des gisements potentiels de métaux. De plus, elle améliore notre compréhension actuelle de l'utilisation des proxies paléoenvironnementaux pour reconstruire la formation de la Terre. Enfin, cette étude a également des implications pour le traitement des déchets nucléaires et de la pollution, en particulier dans la gestion de la contamination par le sélénium (Se) et le gadolinium (Gd)
Trace elements, despite their scarcity (less than 100 parts per million) on Earth, serve diverse purposes: some act as micronutrients, while others, known as critical metals, possess unique industrial and medical applications. In oxygen-deprived natural aquatic systems electron transfers involve biogeochemical reactions catalyzed by iron, sulfur and trace elements. Understanding their reactivity in these environments remains a challenge. My Ph.D. research focus on filling this knowledge gap concerning three specific elements (rhenium (Re), selenium (Se), and gadolinium (Gd)). They exist in various chemical aqueous species in water: monovalent anion (perrhenate, ReO4—), divalent anion (selenate, SeO42—and selenite, SeO32—) or cation (Gadolinium, Gd3+). Rhenium is a critical metal, while selenium is a bioessential element at low levels, and becomes toxic in higher concentrations. Gadolinium is a rare earth element and a critical metal as well, due to its wide use as a contrast agent in magnetic resonance imaging (MRI).These elements are most concentrated in marine sediments formed in oxygen-deprived environments. Common mineral phases include pyrite (FeS2) and magnetite (Fe3O4) depending on sulfide content in those environments, and origin (autogenic vs. detritic, e.g., from volcanic rocks) of the particles. My research, presented across four chapters, investigates surface reduction (Re(VII), Se(VI) and Se(IV)) and the sorption (Gd(III)) processes on/into magnetite and pyrite particles. Employing various analytical methods such as XAFS spectroscopy, STEM-EELS spectro microscopie and MC-ICP-MS, our study reveals distinct reactive pathways. Re(VII) reacts with sulfidic water to form Re(III, IV, V)2S7 nanoparticles, while at lower concentrations Re is reduced and incorporated into particles, in different pathways characterized by less isotopic fractionation with pyrite than with magnetite. We also show that pyrite nanoparticles reduce Se(VI) and Se(IV), down to surface Se(0) or structure Se(-I) depending on whether adsorption or co-precipitation occurs. Lastly, Gd substitutes for Fe(III) in magnetite nanoparticles up to 5% Fe substitution by Gd. We attempt to unify the affinity behaviour of these and other trace elements with anoxic Fe-bearing sediments in the light of the hard and soft acids and bases principle.The study provides new insights into the mechanisms that govern the sequestration of metals and metalloids in sedimentary settings. The significance of this research lies in its relevance to contemporary scientific and technological endeavours, particularly in understanding how processes in Fe and sulfidic systems work like trace elements, Fe and S mobility, mass balance in the global sedimentary cycles to the exploration, mining and recycling of potential repositories of metals. Furthermore, it enhances our current understanding of the use of palaeoenvironmental proxies to reconstruct the Earth's formation. Finally, this study also has implications for the treatment of nuclear waste and pollution, particularly in the management of selenium (Se) and gadolinium (Gd) contamination

Hfq est une protéine bactérienne qui a un rôle pleiotropique. La principale fonction de la protéine Hfq bactérienne consiste à répondre aux stress que peut rencontrer la bactérie lors d’un changement environnemental, en utilisant essentiellement un contrôle post-transcriptionnel. La protéine, par sa capacité à interagir avec les ARN et notamment les petits ARN non codant, permet ainsi une régulation rapide de l’expression génétique. En outre la protéine interagit aussi avec l’ADN qu’elle aide à se structurer. Les mutations dans le gène qui code pour Hfq ont des effets pleïotropes (déterminant plusieurs caractères phénotypiques).D’un point de vue structural, la protéine adopte un repliement de type Sm, caractérisé par un oligomère toroïdal reposant sur la formation d’un feuillet β continu à 30 brins. Cependant, outre cette région Sm N-terminale, Hfq possède également une région C-terminale (CTR) de taille et de séquence variables selon les bactéries. Mon travail de thèse a porté sur l’analyse de cette région CTR chez la bactérie Escherichia coli. Cette région a en effet la capacité de former une structure de type amyloïde : structures auto-assemblées in vivo, à proximité de la membrane interne et dans le nucléoïde.Par l’utilisation de diverses techniques physico-chimiques (microscopie moléculaire, spectroscopie et microscopie infrarouge, dichroïsme circulaire et diffusion aux petits angles), mon travail a consisté à caractériser l’assemblage de cette région de Hfq ainsi que les facteurs l’influençant en particulier la présence d’acide nucléique. Une partie de mon travail de thèse a aussi consisté à mettre en place une méthode d’imagerie corrélative innovante permettant d’analyser la signature chimique et morphologique d’une fibre amyloïde unique. Mon travail a enfin porté sur l’analyse de l’effet de composés inhibant l’agrégation de la structure amyloïde, ce qui pourrait constituer une piste pour développer une nouvelle classe d’antibiotiques
Hfq is a pleiotropic bacterial protein that determines several phenotypic characteristics. Its main function is to facilitate responses to stresses that bacteria may encounter during environmental changes, mainly by using post-transcriptional genetic control. The protein, by its capacity to interact with RNA, in particular small non-coding RNA, enables a rapid regulation of gene expression. In addition, the protein also interacts with DNA and compacts it. From a structural point of view, the protein adopts an Sm-like fold, characterized by a toroidal oligomer formed by a continuous 30-stranded β-sheet. Besides its conserved N-terminal Sm domain, Hfq also possesses a C-terminal region (CTR) that can vary in size and sequence between bacteria. My PhD work focused on the analysis of this CTR region in Escherichia coli bacteria. Indeed, this region has the capacity to form an amyloid structure. This structural dynamic is related to the formation of self-assembled structures in vivo, in the proximity of the inner membrane and in the nucleoid.Using various physicochemical techniques (molecular microscopy, spectroscopy and infrared microscopy, circular dichroism and small angle X-ray scattering), my work consisted in characterizing the assembly of this region of Hfq, as well as the factors influencing its assembly (in particular, the presence of nucleic acids). A part of my work consisted in setting up an innovative correlative–imaging method to analyze the chemical and morphological signature of a single amyloid fibre. Finally, my work focused on the analysis of the effect of compounds that inhibit the aggregation of the amyloid structure, which could constitute a new way to develop a novel class of antibiotics

Le cancer est une pathologie que l’on se doit de détecter le plus tôt possible si l’on veut accroître les chances de guérison. Ces travaux étudient l’apport de la signature polarimétrique à la caractérisation et l’identification des tissus cancéreux. Il s’agit d’extraire des images multidimensionnelles de polarisation des informations physiques qui caractérisent les constituants de l’objet bien au-delà de l’information visuelle des images d’intensité. Durant cette thèse, un imageur de Mueller, POLARIS, a pu être mis en place ainsi que les outils de traitement et de calibration adaptés. Une méthode de segmentation d’images de Mueller en condition d’éclairement non homogène a été proposée. Une première base d’images multi-spectrales polarimétriques de tissus sains et pathogènes chez la souris a été constituée. Une approche originale a enfin été proposée en se basant sur les forêts aléatoires pour extraire parmi un ensemble de paramètres physiques un jeu de paramètres permettant de différencier les zones saines des zones pathogènes aux différentes longueurs d’ondes de travail. Une comparaison est proposée avec la littérature et permet de valider l’approche
Cancer is a pathology that must be detected as soon as possible in order to increase the chances of recovery. These studies investigate the contribution of polarimetric signature to the characterization and identification of cancerous tissues. It is a matter of extracting multidimensional polarization images of the physical information which characterize the constituents of the object well beyond the visual information of the intensity images. During this thesis, a Mueller imager, POLARIS, was set up, as well as the appropriate processing and calibration tools. A method of Mueller images segmentation in non-homogeneous illumination has been proposed. A first database of polarimetric multi-spectral images of healthy and pathogenic tissues in mice was constructed. An original approach was finally proposed based on random forests to extract from a set of physical parameters a set of parameters allowing to differentiate the healthy zones from the pathogenic zones at different working wavelengths. A comparison is proposed with the literature and validates the approach

En cellules vivantes, les interactions dynamiques entre les protéines jouent un rôle clé dans la régulation de nombreuses voies de signalisation et événements biochimiques. C’est également le cas de la NADPH oxydase (NOX) des phagocytes, qui est une enzyme majeure du système immunitaire inné. Elle génère des anions superoxyde (O₂•⁻), précurseurs d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), qui sont essentielles dans la lutte contre les infections microbiennes. La NADPH oxydase est un complexe protéique composé de six sous-unités ; deux protéines membranaires (NOX2 et p22phox) formant le centre catalytique, trois protéines cytosoliques (p67phox, p47phox et p40phox) et une petite GTPase Rac. Le mécanisme d’activation de la NADPH oxydase est basé sur l’assemblage de toutes les sous-unités cytosoliques avec les sousunités membranaire, où les interactions protéineprotéine jouent un rôle important. Un défaut d’activité de la NADPH oxydase cause une maladie granulomateuse septique chronique (CGD) caractérisée par des infections sévères et récurrentes. En revanche, des niveaux élevés de ROS contribuent aux maladies cardiovasculaires et neurodégénératives. Ainsi, l’activité de la NADPH oxydase doit être strictement régulée. Une meilleure compréhension de la machinerie de la NADPH oxydase au niveau moléculaire aidera à identifier les aspects clés de l’activité enzymatique et donc les potentielles cibles thérapeutiques. Le but de ma thèse était d’étudier l’état actif de la NADPH oxydase en utilisant des stratégies de microscopie à fluorescence en cellules vivantes. Pour détecter les interactions protéine-protéine, nous avons exploité le phénomène de transfert résonant d’énergie de type Förster (FRET) mesuré par imagerie de durée de fluorescence (FLIM). Étant donné que le phénomène de FRET a lieu uniquement entre des fluorophores proches spatialement (< 10 nm), il est approprié pour révéler les interactions à l’échelle nanométrique entre les sous-unités de la NOX étiquetées par des protéines fluorescentes (PFs) et il fournit également des informations sur la topologie du complexe enzymatique. Les approches de FRET-FLIM ont été réalisées soit avec des sous-unités séparées, soit avec une protéine de fusion chimérique appelée "Trimère". Le Trimère est composé des domaines essentiels des protéines cytosoliques p47phox, p67phox et Rac1, permettant une activité constitutive de la NADPH oxydase dans les cellules, sans avoir besoin d’un stimulant. Dans une première étape, nous avons travaillé avec les sous-unités individuelles étiquetés par les PFs dans les cellules de type fibroblastes ou dans des modèles de phagocytes. Nous avons comparé le PMA et l’acide arachidonique en tant qu’activateurs de la NADPH oxydase en termes de cinétique d’activation et de production de ROS. Les conditions expérimentales les plus convenables ont été explorées par la microscopie TIRF, qui permet d’exciter sélectivement des fluorophores situés près de la membrane plasmique et ainsi rend possible de suivre la formation du complexe actif de la NADPH oxydase en temps réel. Dans la deuxième partie de ma thèse, nous avons utilisé majoritairement le Trimère. Les expériences FRET-FLIM ont révélé que le Trimère forme des clusters dans la membrane plasmique. L’activité continue de la NADPH oxydase incité par le Trimère a été également examinée en termes de conséquences sur la physiologie des cellules vivantes. Nous avons montré que la production continue de ROS à long terme conduit à l’acidification du pH intracellulaire et déclenche l’apoptose
In living cells, dynamic interactions between proteins play a key role in regulating many signaling pathways and biochemical events. It is also the case of the phagocyte NADPH oxidase (NOX), a key enzyme of the innate immune system. It generates superoxide anions (O₂•⁻), precursors of reactive oxygen species (ROS), such as hydrogen peroxide or hydroxyl radical that are critical for host responses to microbial infections. The NADPH oxidase is a protein complex composed of six subunits; two membrane proteins (NOX2 and p22phox) forming the catalytic core, three cytosolic proteins (p67phox, p47phox and p40phox) and a small GTPase Rac. The sophisticated activation mechanism of the NADPH oxidase relies on the assembly of all cytosolic subunits with the membrane-bound components, whereby proteinprotein interactions play an important role. Lack of the NADPH oxidase activity leads to chronic granulomatous disease (CGD) characterized by severe and recurrent infections. On the other hand, enhanced levels of ROS contribute to cardiovascular and neurodegenerative diseases. Thus, the NADPH oxidase activity needs to be tightly regulated in order to maintain physiological levels of ROS. Understanding the NADPH oxidase machinery at the molecular level will help to identify the key aspects of its enzyme activity and thereby potential therapeutic targets. The aim of my PhD project was to investigate the active state of the NADPH oxidase in living cells using state of the art fluorescence microscopy strategies. To detect the protein-protein interactions Förster Resonance Energy Transfer (FRET) measured by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) was a method of choice. As the FRET phenomenon occurs only between fluorophores in close proximity (< 10 nm), it is well-suited to reveal interactions of the NADPH oxidase subunits labeled by fluorescent proteins at nanoscale level, but also it provides information about the topology of the enzyme complex. FRET-FLIM was performed either with separated NOX subunits or with a chimeric fusion protein called “Trimera”. The Trimera is composed of the essential domains of the cytosolic proteins p47phox, p67phox and Rac1, enabling constitutive, robust NADPH oxidase activity in cells without the need of a stimulant. First, we worked with the individual FP-labeled cytosolic subunits in COSNOX cells (stably expressing NOX2/p22phox subunits) or macrophages and compared PMA and arachidonic acid as activators of the NADPH oxidase in terms of the activation kinetics and the total ROS production. By introducing mutations into the p47phox and p67phox subunits we were able to modulate the oxidase activity. The final validated working conditions were explored by TIRF microscopy, an imaging method allowing selective excitation of the fluorophores situated in the vicinity of the plasma membrane, and thus enabling to monitor the realtime formation of the active NADPH oxidase complex. We also focused on NOX2, the catalytic center of the NADPH oxidase that we labeled by FPs and prepared for further FRET-FLIM experiments aiming the investigation of NOX2/cytosolic subunits interactions. Second, we employed the Trimera that acts as a single activating protein of the NADPH oxidase. FRET-FLIM experiments revealed that theFP-Trimera forms clusters in the plasma membrane. The continuous long-term NOX activity elicited by the Trimera was also examined in terms of consequences on the physiology of living cells. We showed that the sustained ROS production leads to acidification of the intracellular pH and triggers apoptosis