Дисертації з теми "Sites de contacts membranaires"

Les cellules eucaryotes sont caractérisées par le cloisonnement des organelles par des membranes. La communication entre les différents compartiments cellulaires est assurée par deux voies de transport : le transport vésiculaire et transport non-vésiculaire. Le transport vésiculaire permet à la fois le trafic des protéines et des lipides d'un compartiment à un autre, alors que le transport non-vésiculaire permet uniquement le trafic des lipides. En effet, les lipides jouent un rôle essentiel dans l'organisation cellulaire. Au cours de ma thèse, je me suis intéressé au rôle des lipides dans le trafic intracellulaire, en utilisant la levure comme organisme modèle. Dans une première partie de ma thèse, j'ai étudié les hélices amphipathiques qui permettent le ciblage des protéines vers des compartiments cellulaires spécifiques. Dans une étude précédente, réalisé au laboratoire a montré que ces hélices amphipathiques interagissaient directement avec les lipides membranaires, ce qui permet un adressage spécifique des protéines en fonction des environnements lipidiques dans la cellule. Deux hélices amphipatiques ont fait l’objet de cette étude : le motif ALPS qui cible les vésicules de la voie sécrétoire précoce, et alpha-synucléine qui reconnaît et fixe les vésicules du compartiment trans-Golgi-membrane plasmique. Dans cette première partie de la thèse j’ai cherché à identifier des motifs similaires à celui d’alpha-synucléine dans les protéines de levure, et de déterminer leurs rôles dans la cellule. Dans une seconde partie de ma thèse, en collaboration avec le laboratoire du Dr Thierry Galli, j'ai étudié de nouveaux composants impliqués dans le métabolisme lipidique aux sites de contact entre le réticulum endoplasmique et la membrane plasmique. Les sites de contact membranaires sont des régions de proches appositions (de l'ordre de 10 à 30 nm) entre deux membranes, généralement entre la membrane du réticulum endoplasmique (RE) et une autre organelle. Ce sont principalement des sites de transfert des lipides et d'ions. Maja Petkovic dans le laboratoire de Thierry Galli a fait la découverte que la protéine SNARE du RE, Sec22, interagit avec une syntaxine (Stx1) de la membrane plasmique dans les neurones, ce qui permet un nouveau mécanisme de contact entre ces deux membranes. J’ai donc essayé de voir si ce mécanisme est conservé chez la levure. Les résultats que j'ai obtenus ont confirmé que la levure Sec22 est capable d'interagir avec une protéine SNARE SSO1 localisée à la membrane plasmatique et homologue de Stx1. J'ai trouvé par co-immunoprecipitation que Sec22 et SSO1 deux interagissent avec les protéines de transfert des lipides localisées aux sites de contact. L'utilisation d'une sonde spécifique au Phosphatidylinositol-4 phosphate (PI4P), nous a permis de montrer que Sec22 est impliquée dans la régulation du niveau de PI4P à la membrane plasmique. Pour disséquer les deux fonctions de Sec22, dans la voie sécrétoire et aux sites de contact, nous avons utilisé l'approche des suppresseurs multicopies dans la levure. Parmi les suppresseurs identifiés, nous avons trouvé le Sfh1, une protéine qui a un rôle potentiel dans le transfert des lipides. Ces résultats confirment bien ceux obtenus par l’équipe de Thierry Galli, montrant que Sec22 a un nouveau rôle aux sites de contact entre le RE et la membrane plasmique et suggèrent que ce complexe SNARE pourrait être impliqué dans transfert de lipides chez la levure
Eukaryotic cells are characterized by their internal membrane compartmentalization, with the various specialized organelles of the cell bounded by lipid membranes. Communication between different cellular compartments occurs via two transport pathways: vesicular transport and non-vesicular transport. Vesicular transport carries both proteins and lipids from one compartment to another in cells, whereas non-vesicular transport carries only lipids. An emerging idea is the important role that lipids play in cellular organization. Lipid binding amphipathic helices such as the ALPS (amphipathic lipid packing sensor) motif are targeted to membranes of a specific lipid composition, and hence act to transfer information encoded in membrane lipids to the vesicle trafficking machinery. The lipid composition of the membranes of different organelles is therefore of great importance. One mechanism that cells use to maintain the distinct lipid compositions of organelles is lipid transport, which occurs preferentially at membrane contact sites (MCS). MCS are regions of close appositions, on the order of 10 to 30 nm, between two membranes, generally between the membrane of the endoplasmic reticulum (ER) and another organelle. In my thesis, I addressed two aspects of how lipids and their transport function in intracellular trafficking, using yeast as a model system. First, I studied amphipathic motifs that mediate targeting of proteins to specific compartments in cells. Lipid binding amphipathic helices were shown in a previous study in the laboratory to mediate specific targeting to distinct lipid environments via direct protein-lipid interactions, both in vitro and in cells. One of these, the ALPS motif, targets vesicles of the early secretory pathway. The other, alpha-synuclein, targets vesicles travelling between the late Golgi, the plasma membrane and endosomes. I studied new potential alpha-synuclein-like motifs in yeast proteins, and their roles in cells. In a second project, in collaboration with the laboratory of Dr. Thierry Galli, I studied new compenents involved in lipid metabolism at contact sites between the endoplasmic reticulum and the plasma membrane. Maja Petkovic in the laboratory of Thierry Galli made the important discovery that the ER-localized SNARE protein Sec22 interacts with a plasma membrane syntaxin in neurons, thus providing a novel mechanism for mediating close contact between these two membranes. I addressed the question of whether this mechanism is conserved in yeast. The results I obtained confirmed that yeast Sec22 is able to interact with a SNARE protein localized to the plasma membrane, Sso1. I found by co-immunoprecitation that Sec22 and Sso1 both interact with lipid transfer proteins localized to ER-plasma membrane contact sites. Using a specific probe for phosphatidylinositol-4 phosphate (PI4P), we showed that Sec22 was involved in regulating the level of PI4P at the plasma membrane. These results extend to yeast those obtained by Maja Petkovic, Thierry Galli and colleauges showing that Sec22 has a novel role at ER-plasma membrane contact sites, and suggest that this SNARE complex might be implicated in lipid transfer at these sites in yeast

Les sites de contact membranaire (SCM) sont des régions subcellulaires où deux organites sont physiquement connectés. Ces micro-domaines, moléculairement définis par des interactions protéine-protéine et/ou protéine-membrane, sont impliqués dans la dynamique des organites et la communication inter-organites. Le champ disciplinaire des SCM s’enrichit constamment grâce à la découverte de nouveaux acteurs moléculaires impliqués dans l'attachement des organites entre eux. Dans ce contexte de recherche, nous avons identifié un nouvel acteur impliqué dans la formation de SCM, appelé MOSPD2 (motile sperm domain-containing protein 2). Cette protéine est ancrée dans la membrane du réticulum endoplasmique (RE) ; elle peut interagir grâce à son domaine MSP avec d’autres protéines (associées à d’autres organites cellulaires) dont la caractéristique commune est de posséder un court motif protéique nommé FFAT. Par ces interactions, MOSPD2 permet l’établissement de SCM entre le RE et les endosomes, les mitochondries et l’appareil de Golgi. Ces résultats montrent une nouvelle façon de piéger des organites dans le grand filet cytoplasmique qu’est le RE
Membrane contact sites (MCS) are specific subcellular regions where two organelles are physically connected. Such micro-domains - molecularly defined by protein-protein and/or protein membrane interactions - are involved in organelle dynamic and inter-organelle communication. The field of MCS is constantly expanding thanks to the discovery of new molecular actors involved in organelle tethering. In this context of research, we identified MOSPD2 (motile sperm domain-containing protein 2) as a new factor involved in the formation of MCS. The MOSPD2 protein is anchored to the membrane of the endoplasmic reticulum (ER); it is able to interact thanks to its MSP domain with other organelle-associated proteins which common feature is to have a short protein motif called FFAT. By binding with its protein partners, MOSPD2 establishes MCS between the ER and endosomes, mitochondria and the Golgi apparatus. These results show how a large net covering the entire cytoplasm made by the ER can trap a large variety of cellular organelles

La croissance des neurites au cours du développement neuronal nécessite une expansion de la membrane plasmique (MP) via l’insertion de nouveaux lipides et protéines. Cet événement se produit à la suite de la fusion des vésicules de sécrétion avec la MP. Cependant, plusieurs études ont montré que le transfert non-vésiculaire de lipides au niveau des sites de contact entre le réticulum endoplasmique (RE) et la MP joue aussi un rôle dans la croissance des cellules. Des membres de la famille de synaptotagmines étendues (E-Syts) ont été identifiés comme protéines de transfert des lipides dépendantes du Ca2+ au niveau des jonctions RE-MP.Nous avons découvert qu’un nouveau complexe SNARE aux sites de contact RE-MP, composé par Sec22b et Stx1, est impliqué dans la croissance des neurites bien qu’il soit incapable de favoriser la fusion membranaire. Cependant, la manière dont ce complexe participe à l’extension des neurites reste à élucider. Chez la levure, Sec22 interagit avec les protéines de transfert des lipides de la famille OSH, enrichis aux sites de contact RE-MP.Sur la base de ces observations, notre hypothèse est que le transfert non-vésiculaire de lipides induit par E-Syts au niveau des jonctions RE-MP contenant Sec22b pourrait contribuer à la croissance neuronale. L’objectif de ma thèse était d’explorer cette hypothèse. Nous montrons que Sec22b interagit avec E-Syt2 et Stx1 dans les cellules PC12 et avec E-Syt2, E-Syt3 et Stx3 dans les cellules HeLa. L’interaction Sec22b/E-Syt2 dépend du domaine Longin de Sec22b. La surexpression des E-Syts stabilise l’association Sec22b/Stx1, alors que l’inactivation des E-Syts provoque l’effet inverse. La surexpression de E-Syt2 de type sauvage, mais pas des mutants incapables de transférer les lipides ou non fixés au RE, augmentent la formation de filopodes axonaux et la ramification de neurites dans les neurones en développement. Cet effet est inhibé par une neurotoxine clostridiale clivant Stx1, par l’expression du domaine Sec22b Longin et par un mutant Sec22b ayant une extension entre les domaines SNARE et transmembranaire.En conclusion, mes résultats soutiennent l’idée que les sites de contact Sec22b/Stx1 contribuent à l’expansion de la MP via une interaction avec des protéines de transfert de phospholipides comme E-Syts
The growth of neurites during neuronal development requires a massive increase of surface area via the insertion of new proteins and lipids. This event occurs through the fusion of secretory vesicles with the plasma membrane (PM), the final step of the secretory pathway. Recently, non-vesicular transfer of lipids at contacts between endoplasmic reticulum (ER) and PM was shown to contribute to membrane expansion. Members of the ER-integral membrane protein Extended-Synaptotagmin (E-Syt) family have been identified as Ca2+-dependent lipid transfer proteins at ER-PM contact sites, and shown to transfer glycerophospholipids via their lipid binding domains. The laboratory previously found that a novel ER-PM SNARE complex, composed of the ER-resident Sec22b and the neuronal plasmalemmal Stx1, is involved in neurite growth despite being unable to mediate membrane fusion. However, how this complex participates to neurite extension remained to be elucidated. In yeast, Sec22 interacts with lipid transfer proteins of the OSH family, enriched at the ER- PM contacts, supporting a role for Sec22b-populated ER- PM junctions in non-vesicular lipid transport between these bilayers. Based on these observations, our starting hypothesis was that E-Syts-mediated non-vesicular lipid transfer at Sec22b-populated ER-PM contacts, might contribute to neurite growth. The goal of my PhD was to explore this hypothesis with two specific questions: 1-What are the partners of Sec22b complexes which might be involved in the unconventional mechanisms of membrane expansion? 2-What is the mechanism whereby the non-fusogenic SNARE Sec22b/Stx1 complex acts in neuronal development?Here we show that Sec22b interacts with E-Syt2 and Stx1 in PC12 cells and with E-Syt2, E-Syt3 and Stx3 in HeLa cells. Overexpression of E-Syt2 stabilized Sec22b-Stx3 association, whereas silencing of E-Syt2 had the opposite effect. Overexpression of E-Syt2 full length, but not the mutant forms which are unable to transfer lipids or attach to the ER, increased the formation of filopodia particularly in the growing axon. Finally, this effect was inhibited by a clostridial neurotoxin cleaving Stx1, by the expression of Sec22b Longin domain and a by a Sec22b mutant with extended linker between SNARE and transmembrane domains.In conclusion, these results support the hypothesis that Sec22b/Stx1 junctions may contribute to membrane expansion via an interaction with phospholipid transfer proteins like E-Syts

La multicellularité chez les plantes repose sur une communication intercellulaire qui permette le transfert d'informations à travers l'entièreté de l'organisme. Chez les plantes terrestres, la route principale de ces “conversations cellulaires” est assurée par les plasmodesmes (PD), des canaux nanoscopiques qui traversent la paroi pecto-cellulosique. En effet, ces pores sont impliqués dans la circulation d'une très grande variété de molécules, comme des facteurs de transcription, de l'ARN, des hormones et des métabolites et ceci à tous les stades de la vie végétale, permettant réponses et adaptations à l'environnement. Les PD sont particuliers dans le sens où ils forment une continuité du réticulum endoplasmic (RE), de la membrane plasmique (MP) et du cytoplasme entre les cellules adjacentes. Leur architecture est singulière et consiste en un filament de RE, appelé desmotubule, entouré d'un tube de MP qui, lui, longe la paroi. Les PD sont actuellement décrits comme des sites de contact membranaire, du fait du fort accolement des membranes du RE et de la MP (2 à 10 nm) et de la présence de protéines de jonction qui connectent les deux organelles. Dans la présente étude, nous décrivons au niveau structural et fonctionnel plusieurs membres de la famille des MCTPs (protéine avec de multiples domaines C2 et une région transmembranaire) comme protéines assurant la jonction du RE et de la MP dans les PD. Nous démontrons que ces protéines possèdent les caractéristiques moléculaires nécessaires à l'interaction transitoire avec les lipides anioniques de la MP, via leurs domaines C2, ainsi qu'à l'induction de courbure membranaire au RE, via la région transmembranaire qui agit comme un domaine homologue aux protéines réticulons. Ces données nous ont permis de corréler la fonction des MCTPs à l'architecture et la biogenèse des PD et de réfléchir au rôle du RE à l'intérieur des PD. En conclusion, ce travail a fourni des résultats originaux qui placent les MCTPs comme des protéines centrales dans l'établissement de la structure fine des PD et des fonctions qui y sont associées
Plant multicellularity relies on intercellular communication in order to transmit information from cell to cell and throughout the entire plant body. In land plants, the major line for such cellular conversations is through plasmodesmata (PD) pores, which are nanoscopic membranous tunnels spanning the pecto-cellulosic cell wall. These pores are indeed involved in the transfer of a wide variety of molecules such as transcription factors, RNAs, hormones and metabolites during all stages of plant life, adaptation and responses to their environment. PD are singular amongst other types of intercellular junctions as they provide a direct continuity of the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane (PM) and the cytosol between neighboring cells. Their architectural organization can be summarized as followed: a thin strand of constricted ER, called desmotubule, is encased in a tube of PM lining the cell wall. PD are seen as a specialized ER-PM membrane contact sites from the very close apposition (2 to 10 nm) of the ER and PM membranes and the presence of tethering elements bridging the two organelles. In this study, we describe the structural organization and function of several members of the MCTP (Multiple C2 domains and Transmembrane region Protein) family which act as ER-PM tethering elements at PD. We show that these proteins possess molecular features capable of transient interaction with anionic lipids of the PM, through their C2 domains, as well as ER membrane shaping, through their transmembrane region which presents homology to a reticulon domain. We further correlate MCTP function with PD architecture and biogenesis, and investigate on the role of the ER inside PD. Altogether, this work provides original data placing MCTPs as core PD proteins that appear to be crucial in the establishment of PD ultrastructure and associated functions

La communication intercellulaire est essentielle pour le développement et la survie d'organismes multicellulaires. Dans le règne végétale, une des voies privilégiée pour la communication intercellulaire est la voie symplastique qui implique des canaux aux dimensions nanométriques connectant les cellules entre elles, leur permettant d'échanger directement photo-assimilats, miARN, protéines, oligoéléments etc. Observés pour la première fois en 1880 par le botaniste autrichien Eduard Tangl (Tangl 1880; Kohler & Carr 2006), ils ont longtemps été considérés comme de simples trous perméables permettant la diffusion de matériel cellulaire (Lee & Lu 2011; Oparka & Roberts 2001). Etant donné leurs taille nanoscopique, ce n'est que dans les années 1960, avec la démocratisation de la Microscopie Électronique en Transmission (MET) qui permet d'atteindre , que les premiers modèles ultrastructuraux sont établis (Lopez-Saez 1965; Robards 1970). Ils font état d'un canal d'environ 30 à 40 nm de diamètre avec un élément central cylindrique traversant le pore, appelé le desmotubule, connecté au Réticulum Endoplasmique des deux cellules (Figure 1 of our review Tilsner et al. 2016). Dans les années 1980 notre compréhension des plasmodesmes a quelque peu évolué et nous savons maintenant que ces structures ne sont pas de simples trous mais des structures membranaires très spécialisées et régulées (Lucas & Lee 2004; Faulkner & Maule 2011; Furuta et al. 2012). Le modèle ultrastructural actuel découle de la congrégation d'études ultrastructurale, physiologiques et pharmacologiques plus ou moins anciennes dépeignant une structure morphologiquement très souple et changeant de conformation au cours du développement. Les plasmodesmes peuvent réguler leur ouverture/fermeture par la constriction de leurs extrémités grâce à l'accumulation entre la membrane plasmique et la paroi végétale d'un polymère de sucre, la callose qui va pousser la membrane plasmique contre le desmotubule et en obstruer les entrées. Cette modulation permettrait majoritairement de réguler les flux intercellulaires qui impliquent les plasmodesmes. Cependant nos connaissances sur les remaniements membranaires prenant place durant le développement des plasmodesmes et sur la régulation de leur perméabilité sont encore imparfaites.La microscopie électronique en transmission, malgré l'ancienneté de la technique, est l'une des plus résolutive, largement utilisée en biologie. Avec l'amélioration des techniques de préservation d'échantillons, notamment les cryo- méthodes, elle permet d'atteindre à l'heure actuelle des résolutions inférieures à 5 nm en condition contrastée et inclus en résine et peut descendre en dessous du nanomètre pour la cryo-microscopie. Ce potentiel permet aisément l'étude des sous-compartiments cellulaires de l'ordre du µm tel que mitochondries, chloroplastes, noyaux etc. (Frey et al. 2002) mais permet également l'étude ultrastructurale précise de structures de l'ordre de la dizaine de nm (Beck et al. 2007; Al-Amoudi et al. 2007).En revanche, dans son utilisation classique, la microscopie électronique ne permet pas d'accéder à la troisième dimension de l'espace, rendant difficile l'interprétation de structure à l'architecture quelque peu compliquée. En effet, les images produites ne sont que des projections en deux dimensions d'objets en trois dimensions. Cela a mené au développement de la tomographie électronique en transmission (Crowther et al. 1970), méthode basée sur un concept mathématiques formulé par Johann Radon au XIXe siècle. Ce n'est que dans les années 2000 que la tomographie électronique a pris un essor significatif grâce au couplage avec des méthodes d'automatisation informatiques
Plasmodesmata were first observed by Austrian botanist Eduard Tangl in 1880. He devoted himself to studying the anatomy and cytology of plants and his greatest discovery, of course, was the observation and first characterization of plasmodesmata (Tangl 1880, 1884 and 1885). Despite not having access to their ultrastructure, he observed thin striations (see front page engraving) between cotyledon cells of Strychnos nuxvomica and in the endosperm of seeds and described them as being conductive ducts. Already at the time, he was evoking the idea that these strands "unite them [the cells] to an entity of higher order", in other words formulating the first definition of a symplastic domain. lt is only in 1901 that Strasburger finally names these canals "plasmodesmata". His discovery led to a radical change in our conception of the plant entity and brought in new concepts such as the symplasm (Munch 1930) and transmembrane fluxes between cells, which are now being tackled with great interest by numerous research teams around the globe.Because of their size, plasmodesmata ultrastructure was not accessible until the advent of electron microscopy and they were long thought to be simple holes connecting plant cells one-another with no specific regulation. lt is only with the advent of electron microscopy and chemical fixation that botanists started to gain interest in this structure again. And even with these methods allowing the observation of structures down to several nanometers in size, there are still debates on the nature of the canal, its constituents and physiology (Lopez-Saez J. 1965, Robards A. 1970, Ding et al. 1992, Tilney et al. 1991, Overall and Gunning 1982, Schulz et al. 1995).Nowadays, with the advent of modern cryopreservation and three-dimensional electron tomography methods, great improvements are to be done in the understanding of the ultrastructure and physiology of these mysterious canals. More particularly by understanding the link between the membranous rearrangements taking place in these pores and the molecular transit regulation.My work has led us to view plasmodesmata as specialised Membrane Contact Sites (MCS). Hence, by analogy with MCS found in mammals, yeast and plants, this work embraces an original angle on the speculation of the composition and role of the desmotubule-plasma-membrane tethering complex. The work produced during my thesis allowed me to contribute to the publication of one review and two articles, which will constitute the introduction and two main sub-sections of the results chapter, respectively. The introductory review has been published in 2016 in Annual Review of Plant Biology. The first one is still under reviewing at Nature Plant and the other has been published in The Plant Cell journal in April 2015

La protéine OSBP est un transporteur de lipides qui régule la distribution cellulaire du cholestérol. OSBP comprend un domaine PH, deux séquences « coiled coil », un motif FFAT (deux phénylalanines dans un environement acide), et un domaine de liaison de lipides (ORD) à son extrémité C-terminale. Le domaine PH interagit avec le PI(4)P et la petite protéine G Arf1-GTP au niveau du Golgi, alors que le motif FFAT interagit avec la protéine VAP-A, résidente du réticulum endoplasmique (RE). En liant simultanément tous ces déterminants, OSBP stabilise des sites de contact membranaire entre RE et Golgi, permettant ainsi un contre-échange cholestérol / PI(4)P par l'ORD. OSBP contient également une longue séquence N-terminale d’environ 80 aa, intrinsèquement désordonnée, composée principalement de glycine, proline et d'alanine. Nous démontrons que la présence de ce N-terminus désordonné augmente le rayon de Stoke de OSBP tronquée du domaine ORD, et limite sa densité d’association sur la membrane portant le PI(4)P. La protéine dépourvue du N terminus favorise l'agrégation symétrique des liposomes PI(4)P (mimant la membrane du Golgi) par les deux domaines PH du dimère OSBP, alors que la présence de la séquence désordonnée empêche cette association symétrique. De même, nous observons que la distribution d’OSBP sur la membrane de vésicules unilamellaires géantes (GUV) varie selon la présence ou l'absence du N-terminus. En présence de la séquence désordonnée, la protéine est répartie de manière homogène sur toute la surface du GUV, alors que la protéine sans N-terminal a tendance à s'accumuler à l'interface entre deux GUV de type Golgi. Cette accumulation locale ralentit fortement la mobilité de la protéine à l’interface. Un effet similaire du N-terminal sur la dynamique des protéines est observé lorsque l’association de membranes de type ER et Golgi est assuré par des protéines monomériques (dépourvue du coiled coil) en présence de Vap-A. Les résultats de nos expériences in vitro ont été confirmés en cellules vivantes, où la séquence intrinsèquement désordonnée contrôle le recrutement d’OSBP sur les membranes Golgiennes, sa mobilité et sa dynamique d’activité au cours des cycles de transfert de lipides. La plupart des protéines de la famille d’OSBP contiennent des séquences N-terminales de faible complexité, suggérant un mécanisme général de régulation
Oxysterol binding protein (OSBP) is a lipid transfer protein that regulates cholesterol distribution in cell membranes. OSBP consists of a pleckstrin homology (PH) domain, two coiled-coils, a “two phenylalanines in acidic tract” (FFAT) motif and a C-terminal lipid binding OSBP-Related Domain (ORD). The PH domain recognizes PI(4)P and small G protein Arf1-GTP at the Golgi, whereas the FFAT motif interacts with the ER-resident protein VAP-A. By binding all these determinants simultaneously, OSBP creates membrane contact sites between ER and Golgi, allowing the counter-transport of cholesterol and PI(4)P by the ORD. OSBP also contains an intrinsically disordered ~80 aa long N-terminal sequence, composed mostly of glycine, proline and alanine. We demonstrate that the presence of disordered N-terminus increases the Stoke’s radius of OSBP truncated proteins and limits their density and saturation level on PI(4)P-containing membrane. The N-terminus also prevents the two PH domains of OSBP dimer to symmetrically tether two PI(4)P-containing (Golgi-like) liposomes, whereas protein lacking the disordered sequence promotes symmetrical liposome aggregation. Similarly, we observe a difference in OSBP membrane distribution on tethered giant unilamellar vesicles (GUVs), based on the presence/absence of N-terminus. Protein with disordered sequence is homogeneously distributed all over the GUV surface, whereas protein without N-terminus tends to accumulate at the interface between two PI(4)P-containing GUVs. This protein accumulation leads to local overcrowding, which is reflected by slow in-plane diffusion. The effect of N-terminus is also manifested in monomeric OSBPderived proteins that tether ER-like and Golgi-like membranes in the presence of VAP-A. Findings from our in vitro experiments are confirmed in living cells, where N-terminus controls the recruitment of OSBP on Golgi membranes, its motility and the on-and-off dynamics during lipid transfer cycles. Most OSBP-related proteins contain low complexity N-terminal sequences, suggesting a general effect

STARD3 est une protéine endosomale de la famille START (Steroidogenic Acute Regulatory (StAR) Related lipid Transfer), qui lie le cholestérol. STARD3 module l’organisation de la cellule en formant des sites de contact membranaire entre les endosomes et le réticulum endoplasmique (RE). Le lien entre les sites de contact membranaire et le transport du cholestérol n’était pas compris. Dans ce travail, nous montrons que STARD3 en interagissant avec les protéines VAPs (VAMP–Associated Proteins) bâtit une machine moléculaire autonome qui transporte le cholestérol au niveau des contacts RE–endosomes. Ce transport permet la formation de membranes internes dans les endosomes et est potentiellement impliqué dans le fonctionnement de ces organites. De plus, nous avons étudié la fonction de STARD3 dans la maladie Niemann Pick type C, qui est caractérisée par une anomalie du transport de cholestérol dans les endosomes
STARD3 is an endosomal sterol-binding protein which belongs to the START protein family. Remarkably, STARD3 modulates the cellular organization by creating membrane contact sites between the endoplasmic reticulum (ER) and endosomes. The link between ER-endosome contact sites and cholesterol transport was not understood. In this work, we showed that STARD3 and its ER–resident partner, VAMP–associated protein (VAP), assemble into a machine that allows a highly efficient transport of cholesterol within ER–endosome contacts. This cholesterol transport provides building blocks for endosome inner membranes formation, and is probably involved in endosome dynamics. Furthermore, we studied STARD3 function in Niemann Pick type C disease, a condition characterized by an impairment of endosomal cholesterol export

Les lipoproteines de haute densite (hdl) jouent un role protecteur contre l'atherosclerose, en partie en captant le cholesterol des tissus peripheriques, est ensuite catabolise dans le foie ou dans les tissus steroidrogenes. L'existence de sites membranaire de liaison specifique des hdl, distincts des recepteurs apob/e et apoe, pourraient etre impliques dans les echanges de cholesterol entre hdl et les tissus hepatiques et peripheriques. Ces sites ne sont pas regules, et leur intervention au niveau des tissus peripheriques dans l'efflux du cholesterol cellulaire en presence de hdl n'est pas limitante

Lors de la migration cellulaire nécessite, les contacts focaux, points d'ancrage des cellules à la matrice extracellulaire, constituent des sites particulièrement remaniés. La paxilline en est un des composants protéiques essentiels. Ce travail de thèse a porté sur l’étude de la dégradation de la paxilline pendant la migration cellulaire et de la régulation de ce phénomène par phosphorylation. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés aux sérines 188/190, les deux résidus principalement phosphorylés en réponse à l’adhésion cellulaire mais dont la fonction restait à découvrir. Nous avons pu montrer que la paxilline est dégradée par la voie protéasomale et que, lorsque les cellules migrent, la dégradation de la paxilline est retardée. De plus, ce retard de dégradation requiert la phosphorylation des sérines 188/190. Nous avons également pu montrer que la phosphorylation des sérines 188/190 régule l’étalement, la migration cellulaire, et la dynamique des protrusions membranaires.

Lorsqu'un neurone est excite, certaines de ses proprietes physiques sont transitoirement modifiees. La plus evidente de ces modifications est la variation du potentiel transmembranaire. Cette variation est enregistree par des methodes optiques, nouvelles et prometteuses pour l'analyse des mecanismes membranaires responsables de l'excitation des neurones. L'approche realisee consiste a etudier l'activite electrique membranaire de neurones en enregistrant les signaux optiques produits par une sonde moleculaire extrinseque incorporee a la membrane du neurone. Cette sonde emet une lumiere fluorescente dont la longueur d'onde varie en fonction du champ electrique local. Le but de cette these est de detecter et d'identifier l'origine biologique des variations de la longueur d'onde d'emission du marqueur. Les variations de longueur d'onde sont traduites en variations d'intensite grace a un filtre optique. Ces variations d'intensite ont une extension spatiale et une intensite lumineuse faibles. Les images obtenues a partir du systeme utilise sont affectees de nombreux bruits instrumentaux et experimentaux qui empechent la detection immediate des variations d'intensite dues aux variations locales du champ electrique. Il apparait notamment que la variance d'un pixel de ces images depend fortement de l'intensite de ce pixel. Nous avons developpe deux algorithmes pour detecter les variations d'intensite. Le premier est base sur une segmentation de l'image et le deuxieme est base sur l'analyse d'image par transformation en ondelettes. Les resultats montrent que l'on detecte des groupements significatifs de pixels repartis de facon heterogene sur la membrane et que ces groupements sont lies a l'activite electrique des neurones. Ainsi, la repartition spatiale des sites depolarises detectes serait directement liee a la repartition spatiale des canaux ioniques potentiel-dependants.

L’élément constitutif des synapses centrales est le site synaptique individuel, comprenant une zone active du côté présynaptique et une densité postsynaptique associée. Du fait de limitations techniques nos connaissances sur le mode de fonctionnement d’un site synaptique restent insuffisantes. Pour faire progresser cette question nous projetons d’effectuer des enregistrements en paires entre interneurones de la couche moléculaire du cervelet. Ces neurones forment des synapses qui ont des signaux élémentaires quantiques de grande taille, et les synapses comprennent parfois un seul site synaptique, ce qui fait qu’ils offrent des avantages décisifs pour ce projet. Les réponses postsynaptiques à des trains de potentiels d’action seront étudiées dans différentes conditions expérimentales. Les résultats seront interprétés par un modèle supposant que les vésicules synaptiques doivent se lier à un petit groupe de sites d’arrimage avant l’exocytose
The unitary element of central synaptic transmission is a single synaptic site, with one active zone as presynaptic component and the postsynaptic density as postsynaptic partner. Due to technical limitations there is much uncertainty on the mode of functioning of a single synaptic site. To address this issue it is planned to perform paired recordings between interneurons of the molecular layers of the cerebellum. These neurons form synapses with a large quantal size, and occasionally displaying a single release site, and are thus favorable for this study. Postsynaptic responses will be studied in response to trains of presynaptic action potentials under various conditions. The results will be compared to a model supposing the obligatory binding of vesicles to a small complement of docking sites prior to exocytosis

La cyclophiline b (cypb) est une immunophiline qui possede une activite peptidyl-prolyl cis/trans isomerase et qui fixe la cyclosporine (csa), un puissant immunosuppresseur utilise dans la prevention des rejets de greffe. Decrite comme une proteine residente du reticulum endoplasmique, elle a egalement ete caracterisee dans le lait et le plasma humain. Afin de comprendre les roles de la cypb extracellulaire, nous avons etudie ses proprietes de fixation a la surface des cellules t et son role potentiel dans l'activite immunosuppressive de la csa. Ainsi, nous avons mis en evidence sur les lymphocytes t une fixation specifique et reversible, avec un kd de l'ordre de 12 nm. Les sites de fixation se distribuent entre les differentes sous-populations lymphocytaires t, avec une preference pour les cellules cd4#+. Ces sites de fixation seraient constitues d'une part de glycosaminoglycannes de type heparine reconnaissant l'extremite n-terminale basique de la cypb et d'autre part, de recepteurs proteiques interagissant avec une region de la cypb impliquee dans la fixation de la csa et dans son activite enzymatique. La fixation de la cypb a la surface des lymphocytes qui induit un flux calcique membranaire, est suivie d'une endocytose et d'une degradation intracellulaire de la cypb. L'inhibition du flux calcique en presence de csa, suggere que l'induction de ce flux depend de l'interaction de la cypb avec les recepteurs de nature proteique, interaction qui est inhibee en presence de csa. Par contre, les sites de fixation de type heparine ne sont pas inhibes en presence de csa et sont capables de fixer le complexe cypb/csa
Ces interactions favorisent ainsi le ciblage de la csa vers les cellules lymphocytaires qui expriment ces sites de fixation. Le complexe cypb/csa augmente l'activite immunosuppressive de la csa et reduit considerablement in vitro les variations inter-individuelles de sensibilite au medicament. La mesure du taux plasmatique de la cypb chez des sujets sains et des patients traites a la csa a revele une augmentation significative de la concentration de la cypb chez ces derniers. Le fait que cette augmentation favorise la formation du complexe cypb/csa ainsi que l'activite immunosuppressive de la csa, laisse entrevoir une application clinique de la cypb, en particulier chez les patients resistants a la csa

Les arcs électriques à faible courant sont l'objet d'instabilités. Parmi ces instabilités, l'extinction de l’arc occupe une place importante tant du point de vue expérimental que théorique. L'extinction d'arc joue un rôle considérable dans l'industrie. En même temps, son étude est liée au problème de l'émission électronique de la cathode, au comportement de l'ensemble des sites émissifs et aux caractéristiques individuelles des sites. Dans le présent travail,un modèle statistique (modèle "multisite") de fonctionnement et des extinctions spontanées des arcs est proposé. Ce modèle recoupe les données expérimentales sur la durée des arcs à faible courant entre des électrodes en métal non réfractaire. Grâce à ce modèle, l'arrachement de courant trouve une explication. Ce modèle permet également une approche théorique du problème de l'érosion des électrodes. Une simulation numérique des extinctions des arcs basée sur la méthode de MONTE-CARLO permet de mieux comprendre les lois de probabilité qui régissent le comportement des sites émissifs sur la surface cathodique. L'étude spectroscopique de la lumière de l'arc a permis d'établir une classification des raies et des bandes moléculaires émises. La présence de cyanogène CN est détectée dans ce type d'arc brûlant dans l'air. Une estimation de la température, du degré d'ionisation et da la densité électronique dans les régions cathodique et anodique et dans la colonne est donnée. Un dispositif de spectroscopie résolue dans le temps a été réalisé. Ce dispositif permet d'établir l'évolution de la lumière avant et après l'extinction pour différentes longueurs d'onde. Une présentation de spectres-rapport est proposée. Grâce à cette méthode, l'émission d'ions d'azote et d'oxygène avant l’extinction est montrée. Le modèle "unisite" basé sur l'analyse des spectres-rapport des différentes. Espèces émettrices est ensuite utilisé pour expliquer l'extinction de l'arc.

Grâce au partenariat Tradition and Transition among Labrador Inuit unissant le Gouvernement Nunatsiavut et l'Université Mémorial de Terre-Neuve, la fouille exhaustive du site Double Mer Point (GbBo-02) a pu être effectuée. Elle nous a permis d'étudier l'impact des interactions culturelles au Labrador sur la vie quotidienne des occupants de l'Habitation 1 durant la période de contact, soit entre XVIIe et le XIXe siècle; un sujet d'étude encore sous-exploité par l'archéologie. Des idées théoriques tirées des Cultural Contact Studies et de l'archéologie postcoloniale ont ainsi pu être appliquées au cadre contextuel du Labrador par la réalisation de ce mémoire. Notre réflexion théorique portant sur l'étude des assemblages de la période de contact nous a mené à développer une méthodologie de recherche combinant l'aspect culturel d'un objet et son mode de fabrication. L'Habitation 1, une maison semi-souterraine en tourbe datée entre la fin du XVIIIe siècle et le début du XIXe siècle, a pu être interprétée à partir des données (matérielles, zooarchéologiques, architecturales et environnementales) collectées lors des fouilles en 2015. La datation du site, les phases d'occupation et les aires d'activités ont été déterminées grâce à diverses analyses. L'Habitation 1 a dévoilé une occupation plus complexe que la plupart des maisons semi-souterraines de cette période. Elle a témoigné de plusieurs phases d'occupation dont la première serait dorsétienne, tandis que la dernière démontre l'intégration d'un Européen à une communauté inuite. L'application de la méthodologie développée a quant à elle permis d'identifier des transferts culturels directs, d'observer l'intensification de traits culturels intrinsèques, d'étudier l'influence d'une nouvelle matière sur le quotidien d'une communauté et d'évaluer l'impact de ces changements à long terme. Ce mémoire participe à la reconstitution de l'histoire culturelle du Labrador et espère encourager la réalisation de recherches portant sur les interactions culturelles et l'étude de la culture matérielle de la période de contact.
Through the Tradition and Transition among Labrador Inuit partnership between the Nunatsiavut Government and the Memorial University of Newfoundland, the extensive archaeological excavation undertaken at Double Mer Point (GbBo-02) allowed us to study the impact of cultural interactions in Labrador on the daily life of the inhabitants of House 1 during the contact period, between the 17th and 19th centuries, a subject still under-exploited by archeology. Theoretical ideas from cultural contact studies and postcolonial archeology have thus been applied to Labrador through this research. Our theoretical reflection about the study of material culture from the contact period led to the development of a methodology combining the cultural aspects of objects and their manufacture. House 1, a semi-subterranean sod house dated from the late 18th and early 19th century, was interpreted using data (material, zooarchaeological, architectural and environmental) collected directly in the field. The dating of the site, the occupation phases and activities areas were determined via various analyzes. House 1 revealed a more complex occupation than most of the semi-subterranean houses of this period. It suggests of several phases of occupation of which the first would be a prehistoric Dorset occupation while the last one demonstrates the integration of a European in an Inuit community. The application of our methodology allows us to identify direct cultural transfers, to observe the intensification of intrinsic cultural traits, to study the influence of new material in the daily life of a community and to assess the impact of these changes in Labrador. This thesis contributes to the reconstruction of the cultural history of Labrador and hopes to encourage research about cultural interactions and material culture of the contact period.

L'objectif de ces travaux vise à évaluer les performances d'un contacteur membranaire à fibres creuses utilisé pour réaliser l'absorption chimique du CO2 dans une solution ammoniacale ainsi que la régénération de cette dernière. Les membranes utilisées sont composites, c'est-à-dire composées d'une fine couche dense recouverte sur un support microporeux, la couche dense permettant d'éviter le mouillage par pénétration de liquide dans la membrane. Pour réaliser ces études, une approche combinant expérimentation et modélisation a été adoptée. Lors de la réalisation de l'absorption chimique avec un contacteur membranaire, des chutes importantes d’efficacité de captage du CO2 au cours du temps ont été observées et confirment les résultats obtenus lors de travaux ultérieurs. Cette baisse des performances est attribuée à la précipitation de sels d’ammonium en phase gaz. Lors de l'utilisation d’un gaz saturé en vapeur d'eau, comme le seraient les fumées industrielles, les performances du procédé se sont révélées stables. Un modèle 1D multi-composant adiabatique du contacteur a été développé sur Aspen Custom Modeler® et validé à partir des résultats expérimentaux. Les simulations réalisées avec ce modèle ont confirmé le potentiel d'intensification volumique de la technologie, toutefois, la réduction des pertes de NH3, grâce à l'utilisation d’une couche dense sélective moins perméable à NH3 qu’au CO2, n’a pas été satisfaisante. Les phénomènes de condensation dans les contacteurs membranaires ont été étudiés par expérimentation et modélisation. Il a ainsi été montré que le mouillage par condensation de la membrane ne devrait pas survenir, par contre, la condensation dans le lumen des fibres creuses entraîne une augmentation importante de la perte de charge pouvant conduire à des coûts de compression des gaz à traiter plus élevés. Des expériences et des simulations sur la régénération de solutions ammoniacales chargées avec des contacteurs membranaires ont été effectuées et des disparités importantes ont été trouvées entre les flux de CO2 mesurés et simulés. Une réduction volumique de trois par rapport à la colonne à garnissage a pu être calculée laissant entrevoir un potentiel intéressant de la technologie pour l’étape de régénération. En collaboration avec les partenaires du projet C2B, dans lequel s’intègre cette thèse, des essais d’absorption de CO2 ont été réalisés sur site avec un contacteur de taille industrielle. Les résultats de ce pilote sont conformes aux résultats obtenus au laboratoire et encourageants quant au transfert de la technologie vers l’échelle industrielle
This work aims to evaluate the performances of hollow fiber membrane contactors used for the CO2 absorption in aqueous ammonia and the regeneration of the latter within the frame of post-combustion CO2 capture. Fibers are made of a thin dense layer coated on a microporous support, the dense layer prevent membrane wetting by liquid penetration. Both experiment and modelling were done. During absorption experiments, important decrease of the CO2 capture efficiency was observed due to ammonium salts precipitation in the gas-side corroborating results from previous works. Experiments with CO2/N2 mixture saturated with water vapor, as would be the case for flue gas, interestingly, showed stable performances of the process. A one-dimensional multi-component adiabatic transfer model for CO2 absorption in NH3 has been implemented in Aspen Custom Modeler® and validated with experimental results. The simulations performed with the model confirmed the volumetric intensification potential of the technology, however, the NH3 slip reduction expected, because of the use of a dense layer more permeable to CO2 than NH3, wasn’t satisfying. Water condensation phenomenon in membrane contactors were studied with both experiments and simulations. It was thus showed that membrane pore wetting by condensation should not happened but gas-side condensation led to an important increase of the pressure drop with the potential of increasing compression costs. Experiments and simulations of the desorption of CO2 from a loaded aqueous ammonia solution with a membrane contactor were performed and important disparities were found between CO2 flux measured and simulated. A volumetric reduction of the membrane contactor when compared to the packed column was calculated highlighting the potential of the technology for the stripping step. In collaboration with the partners of the C2B project, in which this thesis is integrated, CO2 absorption essays were carried out on site with an industrial scale membrane contactor. The results of this pilot are consistent with laboratory results and encourages the transfer of the technology to the industrial scale

L’exocytose est un mécanisme biologique fondamental qui permet la libération du contenu des granules de sécrétion dans le milieu extracellulaire. C’est un processus finement régulé par le calcium qui nécessite entre autre, la réorganisation de la membrane plasmique et la formation de domaines lipidiques. Dans les cellules chromaffines, l’annexine A2, protéine capable de lier les phospholipides et l’actine de manière calcium-dépendante, est responsable de la formation et de la stabilisation de ces plateformes lipidiques. Le résultat majeur de ma thèse concerne l’organisation tridimensionnelle et le rôle de l’actine au niveau des sites d’exocytose. Sachant que la phosphorylation de la tyrosine 23 de l’annexine A2 affecte sa liaison à l’actine et aux membranes, deux acteurs majeurs de l’exocytose, j’ai mis en évidence l’importance fonctionnelle de cette phosphorylation. Une autre conséquence de cette phosphorylation est le passage de l’annexine A2 de la face interne à la face externe de la membrane plasmique. Le mécanisme de sortie et le rôle de l’annexine A2 extracellulaire dans les cellules chromaffines ont également été étudiés
Exocytosis is a fundamental biological mechanism which allows liberation of the contents of secretory granules into the extracellular medium. This calcium-regulated process requires the formation of lipid domains for the structural and spatial organisation of exocytotic sites. In the chromaffin cell, annexine A2, a calcium-, actin- and lipid-binding protein participates in the formation and stabilization of lipid microdomains. The major advance resulting from my thesis is the elucidation of the three-dimensional organization and the role of actin at the exocytotic site. Phosphorylation of the tyrosine 23 is known to affect the binding of annexin A2 to actin filaments and plasma membrane, two major actors of the exocytotic process and my results highlight the functional importance of this phosphorylation on exocytosis. Furthermore, tyrosine 23 phosphorylation also triggers a translocation of annexin A2 to the external face of the plasma membrane. The role and functional signification of this externalization was also examined

Dans plusieurs neurones du SNC l'activité somato-dendritique infraliminaire peut se propager passivement dans l'axone et augmenter transitoirement la transmission synaptique spontanée et évoquée par le potentiel d'action de manière dépendante du Ca2+. Les mécanismes sousjacents à ce type de plasticité synaptique, appelée facilitation "analogique" ou "analogo-digitale", restent largement inconnus pour la plupart des synapses centrales, principalement en raison de la difficulté à réaliser des enregistrements directs des petits boutons présynaptiques. Ici, nous utilisons de la photolyse de Ca2+ et de l'imagerie aux niveau des terminaisons présynaptiques individuelles des interneurones de la couche moléculaire du cervelet (ICM), combinées à des enregistrements électrophysiologiques avec la technique du patch. Nous décrivons un nouveau mécanisme de facilitation analogo-digitale qui est dépendant du Ca2+ infraliminaire et dans lequel la fraction et la cinétique du pool de vésicules dites “prêtes à être libérées” (readily releasable pool ou RRP en anglais), est modulée par des modifications de la probabilité d'occupation des sites d'ancrage dans des contacts synaptiques individuels. Nos résultats ajoutent une nouvelle dimension à la compréhension de la manière dont l'activité infraliminaire module le flux d'information dans les circuits neuronaux
In several neurons of the CNS, subthreshold somatodendritic activity can spread passively into the axon and transiently enhance spontaneous and spike-evoked synaptic transmission in a Ca2+-dependent and graded manner. Available evidence about the underlying mechanism of this type of synaptic plasticity, called “analog” or “analog to digital” facilitation (ADF), remains largely incomplete for the majority of central synapses, mainly due to the experimental inaccessibility to the small presynaptic boutons. Here we use both Ca2+ photolysis and imaging at individual presynaptic terminals of the rat cerebellar molecular layer interneurons (MLIs), combined with whole-cell paired recordings from synaptically connected MLIs, to report a novel subthreshold Ca2+-dependent mechanism for ADF whereby the fraction and the kinetics of the pool of vesicles available for immediate release, the readily releasable pool (RRP), are modulated by changing the docking site occupancy probability in single synaptic contacts. Our results add a new dimension in the understanding of how subthreshold activity modulates information flow in neuronal circuits