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Abstract B cell receptor (BCR) signaling plays an important pathogenic role in chronic lymphocytic leukemia (CLL) enhancing homing and homeostasis of B-CLL cells and favoring the interaction with the pro-survival stromal lymph node microenvironment. Surface expression of CD69 is required to block the cells in lymphoid compartment while Sfingosine-1-phosphate receptor-1 (S1PR1) is necessary for egress of cells to blood. BCR signaling inhibitors such as Ibrutinib and Acalabrutinib, (anti-bruton tyrosine kinase) or Idelalisib (anti-Phosphatidylinositol 3-kinases ) represent a significant therapeutic advance in CLL. At least some of these drugs are distinctive to lead to an initial lymphocitosis due to rapid release of cells from lymphoid organs to blood, where they die. Changes in microRNAs expression characterize clinical progression of CLL with a strong decrease of miR-181b associated with the more aggressive phase of the disease. In this study we demonstrate that miR-181b is part of the BCR pathway in that it influences the anatomical redistribution of CLL cells from lymph nodes into the blood by balancing the expression of CD69 and S1PR1. We co-cultured MEC_01 and pure B-CLL cells in medium supplemented or not with IgM F(ab')2, specific antibodies for BCR. We observed a significant decrease of miR-181b after 24 hrs of BCR stimulation compared with the same cells cultured in medium without IgM F(ab')2. To establish that this effect was due to the stimulation of the BCR, studies were performed on MEC_01 and in pure B-CLL cells treated separately with 1μM Ibrutinib or 1 μM Idelalisib, which are a potent BCR signaling inhibitors. After 1 hours of treatment the relative expression of miR-181b was assessed noting an increase of the transcription of miR, suggesting that the activation of BCR down regulate the expression of miR-181b. To confirm what we observed in vitro, RNA was isolated from B cells of the CLL patients at different time-point before and after treatment with a BTK inhibitor, Acalabrutinib (ACP-196). We observed a marked increase of miR-181b in the patients in therapy with this drugs compared with respective baseline. Since BTK inhibitors lead to the immediate release of CLL cells from lymphoid tissues to circulation, we evaluated whether this miRNA could be involved in this process. To test this hypothesis MEC01 cells were infected with either LV-miR-181b_coGFP or the LV-CTRL_coGFP after which migration was assessed in transwell assays. The Cells (5 × 105 cells/well) were seeded on top of the transwells and allowed to migrate for 4 h. S1P (100 nM) was added to the lower chamber as a chemo attractant. Transwell assay was performed to determine the migratory capacity of MEC-01 GFP+ cells, mimicking spleen (S1P-) vs blood (S1P+) compartments. Our data indicate that enhanced expression of miR-181b accelerate the migration of B-CLL cells. On the same cells we also evaluated the expression of S1PR1 and CD69. We observed that the restoration of miR-181b down regulated CD69 expression and increased the S1PR1. We also demonstrated that both proteins are direct targets and that the regulation on SIPR1 by the miR-181b occurs through a not canonical way. In conclusion, our findings indicate miR-181b is down regulated by BCR stimulation in CLL cells and that its enhanced expression reduced CD69 while increased S1PR1 by direct targeting. This could facilitate the egress from lymphoid tissue to blood and in turn their death. Figure 1 Figure 1. Disclosures No relevant conflicts of interest to declare.

In questa tesi è stato studiato il ruolo della sfingosina 1-fosfato (S1P) nella risposta immunitaria durante l’infezione da M. tuberculosis. La S1P è un lipide bioattivo che regola diverse funzioni biologiche cellulari. In questo contesto, è stata analizzata l’attività anti-micobatterica in cellule della linea monocito/macrofagica, THP-1 ed in una linea tumorale di cellule dell’epitelio alveolare, A549 infettate con il ceppo patogeno di M. tuberculosis H37Rv e stimolate con S1P. La crescita di M. tuberculosis è stata valutata tramite il saggio delle unità formanti colonia ed i risultati di questa analisi mostrano che la stimolazione con S1P determina un incremento dell’attività micobattericida di queste cellule. La S1P potrebbe rappresentare un componente della mucosa polmonare importante nel mantenere la sterilità al livello degli alveoli e nel regolare la risposta infiammatoria locale. In questo ambito, il passo successivo è stato quello di quantificare la S1P al livello del lavaggio broncoalveolare tramite saggio di competizione con 3HS1P. Questa analisi ha evidenziato che il contenuto di S1P al livello della mucosa polmonare di pazienti con tubercolosi polmonare attiva è più basso di quello osservato nei soggetti sani; inoltre il trattamento con S1P di cellule di lavaggio broncoalveolare (BAL) provenienti da pazienti con tubercolosi polmonare attiva, ha messo in evidenza una riduzione della crescita intracellulare dei micobatteri endogeni. Questo risultato dimostra l’efficacia dell’azione svolta dalla S1P in un sistema cellulare che riflette quello presente nel polmone profondo in corso di malattia. Al fine di analizzare se la mucosa polmonare rappresentasse un sito di accumulo dei linfociti T CD4+CCR5+ e dei linfociti TCD4+CCR3+, entrambe queste sottopopolazioni cellulari sono state studiate nel BAL e nel sangue periferico di pazienti con tubercolosi, di soggetti con malattie polmonari non correlate alla tubercolosi e di soggetti sani. Questo studio ha messo in evidenza che i linfociti T CD4+ che esprimono il recettore CCR5 o CCR3 si raccolgono 4 maggiormente nel basso tratto respiratorio rispetto al sangue periferico e che, in accordo con l’osservazione che i linfociti T CD4 del polmone di pazienti con tubercolosi polmonare sono principalmente di tipo Th1, i linfociti T CD4+CCR5+ si accumulano in maggior misura nel polmone di pazienti con tubercolosi polmonare attiva. L’obiettivo successivo di questo lavoro è stato quello di determinare se una migliore uccisione intracellulare di M. tuberculosis, dopo la stimolazione con S1P, fosse associata ad una più efficiente risposta immunitaria, vista in termini di incremento della frequenza dei linfociti T CD4+CCR5+, specifici per M. tuberculosis. A questo scopo i PBMC provenienti da pazienti con tubercolosi polmonare attiva, da soggetti con tubercolosi latente (PPD+) e da donatori sani (PPD-), sono stati infettati con M. tuberculosis e trattati con S1P. La risposta immunitaria specifica verso M. tuberculosis è stata valutata determinando la frequenza dell’espressione del CD69 su linfociti T CD4+CCR5+ del sangue periferico, dopo infezione con M. tuberculosis. I risultati di questa tesi mostrano che dopo la stimolazione con S1P dei PBMC provenienti da pazienti con tubercolosi polmonare, si assiste ad un aumento della percentuale di linfociti T specifici per M. tuberculosis senza un concomitante aumento della produzione di IFN-γ da parte delle stesse cellule. Questo risultato potrebbe essere spiegato con il fatto che nei pazienti con tubercolosi polmonare, la presenza delle cellule T regolatorie inibirebbe l’attivazione dei linfociti T specifici per M. tuberculosis, indotti dalla stimolazione con S1P, e quindi anche la produzione di IFN-γ. La mancata attivazione dei linfociti T specifici per M. tuberculosis si riflette anche in una mancata capacità di controllo della crescita intracellulare di M. tuberculosis nei PBMC di pazienti con tubercolosi polmonare dopo stimolazione con S1P; al contrario, in tre soggetti con tubercolosi latente, la stimolazione dei PBMC con S1P determina una diminuzione della crescita intracellulare di M. tuberculosis.

La tubercolosi (TB) è la malattia infettiva, causata da un singolo agente infettivo, più diffusa a livello mondiale ed è responsabile di più di due milioni di decessi ogni anno. L’agente eziologico della tubercolosi è il Mycobacterium tuberculosis (MTB), un patogeno intracellulare aerobio obbligato che infetta l’uomo, preferibilmente per via aereosolica, riuscendo a sopravvivere a livello intracellulare. Un meccanismo d’evasione che MTB attua per sfuggire all’azione micobattericida del macrofago è rappresentato dalla maturazione del fagolisosoma e dall’inibizione dell’enzima fosfolipasi D (PLD), il cui prodotto metabolicamente attivo è l’acido fosfatidico (PA). In questa Tesi abbiamo studiato il ruolo di ligandi d’origine microbica, quali le sequenze CpG, e ligandi naturali, come Acido Lisofosfatidico (LPA) e Sfingosina 1-fosfato (S1P), nella risposta immunitaria innata antimicobatterica in cellule epiteliali alveolari e in cellule della linea monocito/macrofagica. In questo contesto, abbiamo dimostrato che, in entrambi i tipi cellulari, la stimolazione con CpG, LPA o S1P può i) inibire la crescita intracellulare di MTB attraverso l’azione della PLD, ii) indurre l’attivazione della PLD Ca++-dipendente, iii) promuovere la maturazione del fagolisosoma mediate il coinvolgimento della PLD in cellule infettate con MTB. Questi risultati indicano che le cellule epiteliali alveolari, oltre ai monociti-macrofagi, possono svolgere un ruolo attivo nell’ambito della risposta immunitaria innata antitubercolare e che l’attivazione della PLD con la conseguente produzione di PA, è cruciale per l’attivazione della risposta antimicrobica basata sulla maturazione fagolisosomale. Su queste basi, abbiamo ideato liposomi in grado di veicolare secondi messaggeri lipidici, come il PA la cui produzione è soppressa in corso di infezione con MTB, in grado di ristabilire o potenziare la risposta immunitaria innata micobattericida. Abbiamo, quindi, prodotto liposomi asimmetrici simili a corpi apoptotici caratterizzati dalla presenza di fosfatidilserina (PS) sul foglietto lipidico esterno e PA nel foglietto interno. I nostri risultati indicano che tali liposomi possono essere efficacemente internalizzati nei macrofagi senza indurre segnali proinfiammatori. Inoltre, la stimolazione di macrofagi umani con questi liposomi i) induce un incremento dei flussi di Ca++, ii) promuove la maturazione del fagolisosoma Ca++-dipendente e iii) riduce la crescita intracellulare micobatterica in maniera dipendente dalla maturazione fagolisosomale. In conclusione, questi risultati suggeriscono la possibilità di usare i liposomi come “cavalli di Troia” per veicolare secondi messaggeri lipidici e ripristinare quei segnali molecolari frequentemente inibiti dai patogeni intracellulari come strategia di sopravvivenza nella cellula ospite.
Tuberculosis (TB) is a worldwide infection disease, due to a single pathogen infection, which is estimated to kill over 2 million people annually. The causative agent of TB is Mycobacterium tuberculosis (MTB), an intracellular pathogen which infects human host and interferes with host antimicrobial pathways to allow intracellular survival, inhibiting Phospholipase D (PLD) dependent Phosphatidic Acid (PA) generation. The present study shows a novel role of synthetic oligodeoxynucleotides containing unmethylated CpG dinucleotides (CpG ODN), Lysophosphatidic Acid (LPA) and Sphingosine 1-phosphate (S1P) in the activation of antimicrobial immune response by innate immune cells, such as human monocytes/macrophages and type II human alveolar epithelial cells alveolar. In this context, we found that CpG, LPA and S1P stimulation i) induce Ca++-dependent PLD activation, ii) promote PLD-dependent phagolysosome maturation, and iii) enhance a PLD dependent intracellular mycobacterial killing. These results show that alveolar epithelial cells may represent efficient effecter cells of innate antimycobacterial immune response and that PLD activation i) is crucial for the activation of phagolysosome maturation-based antimicrobial response, ii) is conserved among cell types and iii) is at the intersection of different metabolic pathways, independent of the upstream stimulus received. In order to deliver these second lipid messengers able to recover or enhance host antimicrobial innate immune response to infected cells, a technological platform has been developed. In this context, apoptotic body-like liposomes characterized by the presence of phosphatidylserine (PS) in the outer lipid leaflet were engineered to contain PA in the inner lipid surface. We demonstrate that these liposomes can be internalized by macrophages and reduce production of proinfiammatory cytokines (IL-beta, TNF-alpha, IL-12, IL-23) by simultaneously inducing the production of IL-27. Moreover, the stimulation of human macrophages with apoptotic body like liposomes lead to Ca++ mobilization, Ca++-dependent phagolysosome maturation, and phagolysosome maturation dependent intracellular mycobacterial killing. Altogether, these results suggest the possibility to use apoptotic-like vesicles as Trojan particles to deliver second lipid messengers to restore those molecular pathways inhibited by intracellular pathogens as an intracellular survival strategy.

L’atrofia muscolare scheletrica insorge come conseguenza fisiologica dell’ invecchiamento (sarcopenia) o di uno stile di vita sedentario ma può anche essere conseguenza di patologie come l'insufficienza cardiaca cronica (Bacurau et al., 2016), la malattia polmonare cronica ostruttiva (Passey et al.,2016), l'HIV (Pinto et al.,2016), la sepsi (Cohen et al.,2015) ed di alcuni disordini neuromuscolari, quali la distrofia muscolare di Duchenne e la sclerosi laterale amiotrofica (Thomas et al.,2007) o a seguito di tumore (cachessia). Prescindendo dall’evento scatenante, che implica sempre una mutifattorialità, l’atrofia muscolare è caratterizzata dalla diminuzione della massa e della funzione muscolare (Cruz-Jentoft et al.,2010) e, dal punto di vista bio-molecolare, dalla drastica riduzione del contenuto proteico per diminuzione della velocità di sintesi e aumento della degradazione proteica, in particolare delle proteine miofibrillari (Dedkov et al.,2003; Rudrappa et al.,2016). I principali meccanismi di proteolisi coinvolti nell’atrofia muscolare prevedono l’attivazione del sistema ubiquitina-proteasoma ed del sistema autofagico-lisosomiale (Milan et al.,2015). Sono due le ubiquitina ligasi, espresse specificatamente nel muscolo scheletrico: Muscle Atrophy F-box (MAFbx), definita anche Atrogin-1/MAFbx, e Muscle Ring Finger 1 (MuRF1) (Bilodeau et al., 2016; Bodine et al., 2014;. Cao et al., 2004). Questi enzimi promuovono l'ubiquitinazione di proteine bersaglio e la loro conseguente degradazione via proteasoma. Gli sfingolipidi (SLs), rappresentano una classe di molecole bioattive capaci di modulare il destino di molti tipi cellulari, tra cui le cellule del muscolo scheletrico (mioblasti). Infatti negli ultimi anni molti sono gli studi che sottolineano il ruolo fondamentale degli SLs nel mantenere la funzionalità e la vitalità delle fibre muscolari, quali la regolazione delle proprietà contrattili, la risposta a ormoni come l’insulina (Straczkowski M. et al., 2007), il controllo della fatica (Cowart L.A., 2010), ect. In particolare, S1P è implicata nell’attivazione delle cellule satelliti, cellule staminali residenti nel muscolo, favorendone l’attivazione, la proliferazione (Sassoli et al., 2014) ed il differenziamento, finalizzato alla rigenerazione del tessuto in seguito a danno (Danieli-Betto et al.,2009; Fortier et al., 2013; Germinario et al.,2012; Nagata et al.,2006). Poco è noto circa un possibile coinvolgimento di S1P nell’atrofia muscolare (De Larichaudy et al.,2012); vi sono invece alcune evidenze sperimentali riguardanti un’azione di protezione, come nel caso dell’azione protettiva in una fibra muscolare isolata soggetta ad esempio a denervazione (Ieronimakis et al., 2013; Zanin M. et al., 2008) o a contrazione eccentrica (Sassoli et al., 2011). Al momento non sono disponibili in letteratura dati riguardo il ruolo funzionale nella biologia delle cellule muscolari dell’altro sfingolipide bioattivo fosforilato, ceramide 1-fosfato (C1P). Per questo motivo, in questa tesi sperimentale è stato valutato il potenziale ruolo degli sfingolipidi bioattivi S1P e C1P e degli enzimi coinvolti nella loro sintesi, (sfingosina chinasi, SphK e ceramide chinasi, CerK rispettivamente), nella regolazione dei processi biologici deputati al mantenimento della massa muscolare. Lo studio è stato condotto inizialmente su un modello animale in vivo rappresentato da topi BalbC a cui è stata indotta cachessia mediante inoculazione sottocutanea di un frammento del tumore solido carcinoma C26 (Gorselink et al., 2006). Successivamente, al fine di caratterizzare il ruolo di S1P e C1P e le vie di segnalazione da essi promosse, le condizioni di atrofia sono state riprodotte in un modello cellulare in vitro rappresentato da cellule muscolari scheletriche differenziate della linea murina C2C12 in coltura, sottoposte al trattamento con desametasone (Dexa), un glucocorticoide in grado di indurne il passaggio ad un fenotipo atrofico, accelerando la degradazione proteica (Nakashima et al.,2016). In una prima fase, sono stati correlati i livelli d’espressione di Atrogin-1/MAFbx e MuRF1 ed l’espressione di SphK1 e CerK in biopsie di muscolo EDL (Extensor Digitorum Longus) di topi cachettici portatori di C26 e successivamente confermati in un modello cellulare di atrofia cioè in miotubi C2C12 trattati con Dexa. In entrambi i sistemi è stata dimostrata una correlazione tra l’asse SphK1/S1P e la comparsa di modificazioni morfologiche tipiche del fenotipo atrofico. Questi dati sono stati recentemente presentati al XIV congresso FISV 2016 presso l’Università di Roma, “La Sapienza” e sono parte di un manoscritto in preparazione. La S1P agisce come mediatore intracellulare ma negli ultimi venti anni è stata ampiamente caratterizzata la sua azione come molecola in grado di legare specifici recettori accoppiati a proteine eterotrimeriche leganti il GTP, denominati S1P1-5. Di questi sottotipi recettoriali solo tre sono espressi sul sarcolemma delle fibre muscolari: S1P1, S1P2, S1P3 (Ebenezer et al.,2016; Meacci et al., 2003; Pulkoski-Gross et al.,2015; Rosen et al., 2009). E’ stata riscontrata un’alterazione significativa dei livelli di espressione dei tre sottotipi recettoriali nei topi cachettici C26 e nei miotubi indotti ad atrofia da Dexa e delle loro vie di segnalazione a valle. In particolare, le vie di segnalazione a valle di S1P1 ed S1P2 possa contribuire all’induzione del fenotipo atrofico, mentre quelle a valle di S1P3 sembrano non rivestire un ruolo determinante. L’importanza di queste vie di segnalazione è stata confermata con agonisti ed antagonisti specifici dei vari sottotipi recettoriali ed i risultati ottenuti sono parte di un manoscritto in preparazione. La seconda parte di questa tesi sperimentale si è focalizzata su potenziali strategie per contrastare l’instaurarsi di un fenotipo atrofico e favorire la rigenerazione tissutale. A questo proposito, sono stati condotti esperimenti su cellule mesenchimali stromali derivate da midollo osseo (BM-MSCs). E’ stato infatti ampiamente dimostrato che il trapianto di cellule staminali mesenchimali nei tessuti muscolari murini danneggiati ha un grande potenziale terapeutico (Costamagna et al.,2015; Natsu et al.,2004; de la Garza-Rodea et al.,2011; von Roth et al.,2012) e che l’efficacia terapeutica sia principalmente attribuita alla loro abilità a secernere fattori in grado di promuovere meccanismi endogeni di riparazione tissutale in seguito a danno (Rose et al., 2008 ;Salem et al., 2010; Sassoli et al., 2012; Uccelli et al.,2008). In maniera interessante è stato dimostrato che le BM-MSCs sono in grado di rilasciare S1P nel mezzo di coltura e che la sintesi e il rilascio dello sfingolipide bioattivo possano giocare un ruolo importante sulla stimolazione della proliferazione dei mioblasti e di una coltura primaria di cellule satelliti (isolate da fibre muscolari murine EDL). Questi dati sono stati recentemente pubblicati sulla rivista internazionale PLOS ONE (Sassoli et al. 2014). Inoltre esperimenti preliminari hanno dimostrato una riduzione significativa dei livelli di espressione del fenotipo atrofico quando i miotubi sono stati incubati per 48 h con il mezzo condizionato delle BM-MSCs. Questi risultati sono stati presentati al 40° congresso FEBS 2015 in Berlino e alla conferenza internazionale "Molecular Medicine of Sphingolipids" 2016 in USA. Lo studio del ruolo del metabolismo degli sfingolipidi nel rimodellamento della matrice e nel differenziamento cellulare è stato esteso anche ai cardiomioblasti trattati con l’ormone peptidico relassina. Questo studio è stato recentemente pubblicato su Molecular Endocrinology (Frati et al., 2015) Infine, in vista dell'importanza di molti fattori antiossidanti contenuti naturalmente negli alimenti, si è iniziato ad estendere lo studio sulle proprietà nutraceutiche di un prodotto tipico della tradizione della Regione Toscana, Castanea sativa, ed in particolare ad uno dei suoi prodotti derivati. Estratti totali contenenti polifenoli e tocoferoli ottenuti dalla farina dolce di Castanea sativa, sono stati testati per la loro capacità di contrastare la comparsa in cellule muscolari differenziate del fenotipo atrofico. I risultati positivi sono stati recentemente pubblicati sulla rivista internazionale Food and Function (Frati et al.,2014). I dati presentati in questa tesi di dottorato, oggetto di due future pubblicazioni (Pierucci et al., 2017a, 2017b), mettono in evidenza il ruolo degli assi SphK1/S1P/S1PR e CerK/C1P come circuiti molecolari di regolazione della cellula muscolare scheletrica sia per quanto concerne le vie che portano alla degenerazione cellulare sia per quelle coinvolte nella regolazione del microambiente cellulare con un particolare sguardo all’ interazione funzionale tra cellule muscolari scheletriche, cellule mesenchimali stromali e cellule staminali coinvolte nella rigenerazione tissutale. Questi dati nel loro insieme contribuiscono a migliorare la comprensione della biologia delle cellule muscolari e mesenchimali importante per le potenzialità di una terapia cellulare orientata verso le alterazioni fisio-patologiche del muscolo scheletrico.

Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradci Králové Department of anorganic and organic chemistry Candidate: Tomáš Drozen Supervisor: Doc. PharmDr. Kateřina Vávrová, Ph.D. Title of Diploma thesis: Synthesis of ceramide analogues based on 5C sphingosine Ceramides are lipids, in particular sphingolipids. They have many important roles in the organism. Ceramides form the main part of lipid matrix in the stratum corneum, the uppermost skin layer, and take an important part in maintaining skin barrier properties. Membranes of eukaryotic cells also contain ceramides, and both ceramides and their derivatives formed in organism are important signalling molecules. They act as both primary and secondary messengers, participating in regulation of cell growth, apoptosis and inflammatory responses. Although ceramides have been investigated for a long time, there are still many unanswered questions. Fo rthe understanding of the ceramide functions, it is necessary to investigate their movement in the organism and study the effects of their analogs with changed structure. Olefin metathesis is often used for synthesis of analogs with varying chain length or different florescent labels. This thesis describes attempts to synthesise ceramide analogs with very short sphingosine chain, which can be used...

Charles University, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmaceutical Technology Author: Denisa Kubátová Supervisor: PharmDr. Andrej Kováčik, Ph.D. Consultant: PharmDr. Lukáš Opálka, Ph.D. Title of diploma thesis: Study of sphingosine, dihydrosphingosine and phytosphingosine in skin barrier models The stratum corneum (SC), the uppermost layer of the skin, localized in the uppermost part of the epidermis, represents the skin barrier of the organism. SC is composed of corneocytes and an intercellular lipid matrix, which is formed by ceramides (Cer), free fatty acids (FFA), and cholesterol (Chol) in an equimolar ratio. Substances from the group of sphingolipids - Cer, are sphingoid bases (for example, sphingosine (S), dihydrosphingosine (dS), phytosphingosine (P)) acylated with a fatty acid (for example, lignoceric acid (LIG)). In the lipid matrix, the metabolic products of Cer (free sphingoid bases) are also present, but their role in SC barrier functions is not clear. Some studies show that Cer with different sphingoid bases, and increased presence of free sphingoid bases, can lead to a change in the permeability of the skin barrier. This work aimed to study the effect of permeability of sphingoid bases on the model membrane permeability. Nine types of membranes were prepared; they...

Ceramides are a complex group of lipids, naturally occurring in the uppermost layer of the epidermis, in the stratum corneum (SC). They constitute a major component of extracellular matrix and they are responsible for the skin barrier properties. Diseases such as atopic dermatitis or psoriasis are associated with the decline in content and changes in the composition of ceramides, which lead to the reduction in the protective functions of the skin. Although the importance of ceramides is known, the relationship between their structure and effect on the barrier function is not yet fully elucidated. Earlier studies indicate that the length of ceramide acyl chain affects the skin permeability. It appears that ceramides with short acyl lose the protective properties. First, I have prepared a series of analogues of ceramides with fifteen carbon atoms chain in the sphingosine part and the acyl part of a length of 2, 4 and 6 carbons. Starting substance of the synthesis was N-protected L-serine methyl ester, which was further protected by the formation of a cyclic acetal and subjected to the reduction of the ester to aldehyde. The resulting aldehyde reacted with 1-alcynide in the presence of HMPA. The triple bond was subsequently reduced to a trans-double bond by lithium in ethylamine. After deprotection of...