Дисертації: "Réplication de l'ADN mitochondrial"

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Raffour-Millet, Armêl. "Identification du mécanisme impliqué dans la formation de délétions de l'ADN mitochondrial : cas de la "Common Deletion"." Thesis, Paris, Muséum national d'histoire naturelle, 2017. http://www.theses.fr/2017MNHN0017/document.

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Анотація:

La mitochondrie est une organelle essentielle possédant son propre ADN circulaire. Cet ADN peut présenter des mutations et/ou des délétions, consécutives à l’exposition à différents types de dommages ou en raison de protéines mutées. Ces mutations ou délétions sont impliquées dans de nombreuses pathologies, dont les cancers, et le vieillissement. Leur apparition peut survenir notamment lors de la réplication ou de la réparation. A ce jour, la réplication et la réparation mitochondriales ne sont pas encore bien élucidées. L’objectif de ce projet est donc de mieux en appréhender les mécanismes et de mieux comprendre l’émergence d’anomalies en nous intéressant plus particulièrement à une délétion appelée « Common Deletion ». Ce travail reposait sur l’hypothèse que cette délétion put résulter d’une mauvaise réparation de cassure(s) double-brin et/ou d’une erreur durant la réplication de l’ADN mitochondrial. L’analyse de ces résultats révèle que la formation de la « Common Deletion » ne nécessite qu’une seule cassure double-brin proche des séquences répétées entourant cette dernière et implique les protéines de la réplication de l’ADN mitochondrial. Ainsi, ce travail permet de mieux saisir les mécanismes de réplication et de réparation assurant la stabilité de l’ADN mitochondrial. Un second projet a été de proposer un modèle d’étude in vitro des topoisomérases en utilisant des minicercles d’ADN permettant la visualisation du complexe covalent, étape clef de la réaction de relaxation de ces enzymes
Mitochondria is an essential organelle with its own circular DNA. This DNA may exhibit mutations and/or deletions, as a result of exposure to different types of damage or due to mutated proteins. These mutations or deletions are involved in many pathologies, including cancers, and aging. They may occur during replication or repair. For now, mitochondrial replication and repair have not yet been fully elucidated. The objective of this project is therefore to better understand the mechanisms and the emergence of anomalies by focusing on a deletion called "Common Deletion". This work was based on the assumption that this deletion could result from poor repair of double-strand break(s) and/or error during mitochondrial DNA replication. Analysis of these results reveals that the formation of the "Common Deletion" requires only a single double-strand break close to the repeated sequences surrounding the latter and involves the proteins of mitochondrial DNA replication. Thus, this work makes it possible to better understand the mechanisms of replication and repair ensuring the stability of mitochondrial DNA. A second project was to propose an in vitro model for topoisomerases using DNA minicircles allowing visualization of the covalent complex, a key step in the relaxation reaction of these enzymes

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El, Achouri-Ait Lamine Ghizlane. "Rôle des isoformes de la dynamine mitochondriale OPA1 : identification d'une nouvelle fonction dans le maintien de l'intégrité du génome mitochondrial." Montpellier 1, 2009. http://www.theses.fr/2009MON1T031.

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La mitochondrie est un organite intracellulaire d'origine bactérienne possédant son propre génome, qui joue des rôles clés dans le métabolisme énergétique et dans l'apoptose. La dynamique mitochondriale résulte de la fusion et de la fission membranaire, conduisant à un changement de la morphologie du réseau mitochondrial. La dynamine mitochondriale OP Al joue un rôle clé dans la structuration de la membrane interne, requise pour la fusion du réseau mitochondrial, le métabolisme énergétique, et le contrôle de l'apoptose. OP Al est aussi responsable de l'Atrophie Optique Dominante, et elle existe sous forme de 8 isoformes générés par l'épissage alternatif de 3 exons : 4, 4b et Sb. L'objectif de ma thèse a consisté à étudier les fonctions associées aux différents isoformes d'OPA1. J'ai montré que les variants contenant l'exon 4 sont impliqués dans la fusion mitochondriale, tandis que les variants contenant l'exon Sb, sont impliqués dans l'apoptose, par la structuration des jonctions des crêtes mitochondriales responsable du piégeage du cytochrome c dans le volume intra-crête. De plus, j'ai mis en évidence pour la première fois chez les mammifères un lien entre OP A1-4b et le maintien du génome mitochondrial. En effet, je montre le peptide, résultant du clivage d'OP AI-4b, permet l'ancrage du nuc1éoide à la membrane interne, processus indispensable à l'initiation de la réplication et à la distribution des nucléoides. Ces observations corroborent les travaux obtenus chez les levures avec MGMl/Mspl, les orthologues d'OPA1, et permettent de définir un nouveau concept corrélant la dynamique de la membrane interne mitochondriale au maintien de l'intégrité du génome mitochondrial
Mitochondria is an intracellular organelle from bacterial origin with its own genome, which plays key roles in energy metabolism and apoptosis. The mitochondrial dynamics resu1ting from fusion and fission of the membranes, leading to a change in the morphology of mitochondrial network. The mitochondrial dynamin OP Al plays a key role in structuring the inner membrane required for fusion of the mitochondrial network, energy metabolism, and control of apoptosis. OP A1 is also responsible for the Dominant Optic Atrophy, and it exist's in the fonn of 8 isofonns generated by alternative splicing of 3 exons: 4, 4b and Sb. The objective of my thesis was to study the functions associated with different isofonns of OP A1. I have shown that variants containing exon 4 are involved in mitochondrial fusion, whereas variants containing exon Sb, are invojved in apoptosis, by structuring the cristae junctions responsible for mitochondnal cytochrome c trapping in the intra-cristae volume Furthemore, I demonstrated for the first tune m mammals a link between OPA1-4b and the maintenance of mitochondrial genome Indeed, I show that the peptide resulting from cleavage of OP AI-4b, allows anchoring the nucleoid to the inner membrane, a process essential for the initiation of replication and distribution of nucleoids. These observations corroborate the work produced in yeast with MGMI/Mspl, the orthologs of OPA1, and help define a new concept correlating the dynamics of inner mitochondrie membrane to maintain the integrity of the mitochondrial genome

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Velours, Christophe. "Réplication de l'ADN mitochondrial : identification d’une seconde activité ADN polymérase dans la mitochondrie de S.cerevisiae et Contribution à l’étude du réplisome mitochondrial." Thesis, Bordeaux 2, 2009. http://www.theses.fr/2009BOR21689/document.

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Au cours de la croissance des levures, la cellule doit dupliquer sont génome nucléaire et mitochondrial, le processus de réplication est bien moins étudié dans les mitochondries. Néanmoins, si de multiples ADN polymérases sont impliquées dans les processus de réplication et de réparation dans le noyau, il est considéré jusqu’à aujourd’hui qu’une seule ADN polymérase est impliquée dans ces processus dans la mitochondrie. Des résultats récents mettent en exergue le fait que la situation est bien plus compliquée qu’il n’y apparait au départ. Pour élucider le processus de réplication dans la mitochondrie de levure, j’ai focalisé mon intérêt à tenter de purifier et de caractériser le complexe de réplication. Ce travail était important à développer étant donné la découverte au laboratoire d’une seconde ADN polymérase supplémentaire à la polymérase gamma, dans les mitochondries de levure. Une première partie de ma thèse a été de m’investir afin d’obtenir suffisamment de protéines dans le but d’une identification par spectrométrie de masse, compte tenu de la faible proportion des ADN polymérases dans la cellule et en particulier dans la mitochondrie. Nous avons démontré que cette polymérase est codée par le gène unique POL1. Par des techniques d’ultracentrifugation et d’analyse biochimiques, j’ai réussi à isoler et caractériser un complexe de réplication mitochondrial. Des techniques d’exclusion chromatographiques ont permis d’attribuer une masse native à ce complexe. Sa composition a été étudiée grâce à des colonnes ioniques et hydrophobes, une autre méthode d’analyse repose sur l’utilisation de colonnes d’affinité afin de reconstituer in-vitro les interactions existant entre plusieurs protéines présumées impliquées. Ainsi, un réseau d’interactions impliquant les deux ADN polymérases mitochondriales avec cinq autres protéines a été reconstitué. La masse native de différentes formes stables de ce complexe se situent à 500 kDa ou au-delà de 1 MDa
During yeast growth, cells must duplicate their nuclear and mitochondrial DNA. The replication process involved is less studied in mitochondria. Nevertheless, if multiple DNA polymerases are implicated in the nuclear replication and repair mechanisms, until now it is believed that only one DNA polymerase is involved in these processes in mitochondria. Recent results pointed out that the situation is more complicated than preliminary believed. To elucidate the replication process in yeast mitochondria I focused my interest in attempts to purify and characterize the replication complexes. This work was important to develop in accord with the discovery in the laboratory of a second DNA polymerase in addition to the polymerase gamma in yeast mitochondria. One first part of my thesis was to hardly purify enough of this enzyme to be allowed to identify it by mass spectrometry as the DNA polymerase alpha, encoded by the unique POL1 gene. By ultracentrifugation and biochemical techniques, I succeeded to purify the complex. Exclusion chromatographies were managed to elucidate the native mass of this complex. In addition ionic and hydrophobic chromatographic columns were carried out to determine its composition. Another way to study the complex was the reconstitution in vitro of the interactions happening with some usual suspect proteins with the help of chromatographic affinity columns. I reconstituted partly an interactions model network, including the two mitochondrial DNA polymerases and 5 others proteins implicated in replication. I determined the mass of different stable forms of the isolated complexes, around 500 kDa and over 1 MDa

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Lin, Peipei. "Comprendre le rôle des relations entre les télomères et les mitochondries au cours du vieillissement." Electronic Thesis or Diss., Université Côte d'Azur, 2024. http://www.theses.fr/2024COAZ6020.

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Le processus de vieillissement correspond à un déclin fonctionnel des tissus en fonction du temps. On considère généralement que la sénescence cellulaire, l'attrition des télomères et le dysfonctionnement mitochondrial contribuent au processus de vieillissement. La sénescence cellulaire est un état permanent d'arrêt du cycle cellulaire, caractérisé par des changements dans la structure de la chromatine et l'activation d'un phénotype pro-inflammatoire. Les télomères sont les structures situées à l'extrémité des chromosomes et sont protégés par un complexe protéique composé de six protéines (TRF1, TRF2, RAP1, TPP1, TIN2 et POT1) appelé shelterin. Il existe de plus en plus de preuves de l'existence de liens multiples entre la fonction mitochondriale et les télomères. Le dysfonctionnement mitochondrial entraîne une augmentation des niveaux d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), qui provoquent un raccourcissement des télomères, et ce raccourcissement peut induire un dysfonctionnement mitochondrial par le biais de l'activation de p53. Des études récentes ont suggéré que la télomérase et certaines sous-unités de la shelterin régulent la fonction mitochondriale indépendamment de leur rôle télomérique, peut-être par le biais de leur localisation directe dans les mitochondries. Par exemple, la transcriptase inverse de la télomérase (TERT) se localise dans les mitochondries et protège l'ADN mitochondrial (ADNmt) dans les neurones en réduisant les niveaux de ROS. La protéine shelterin TIN2 se trouve dans les mitochondries où elle régule la phosphorylation oxydative. TRF2 régule l'expression de la sirtuine mitochondriale SIRT3 dans les cellules musculaires squelettiques. Dans l'ensemble, ces résultats suggèrent une boucle de rétroaction positive entre le dysfonctionnement des télomères et des mitochondries et soulèvent la question de savoir comment le lien entre les télomères et les mitochondries contribue à la sénescence.Pour répondre à cette question, nous avons étudié les fonctions de toutes les sous-unités de shelterin dans les mitochondries en utilisant des cellules de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF). Nous avons étudié leur rôle dans le métabolisme mitochondrial et leur implication dans la réplication de l'ADN mitochondrial (ADNmt) en utilisant une technique d'analyse in situ de la réplication de l'ADN mitochondrial (MIRA). Nous avons montré que TIN2, TPP1 et TRF2 affectent le métabolisme mitochondrial, mais que seule la déplétion de TRF2 a un effet néfaste sur la réplication de l'ADNmt. Fait important, nous avons constaté que TRF2 était localisé dans les mitochondries en utilisant diverses techniques, y compris la microscopie électronique. Nous avons approfondi la caractérisation des différents domaines de TRF2 et découvert que le domaine N-terminal de TRF2 (domaine B) était nécessaire et suffisant pour sa localisation mitochondriale et pour son rôle dans la réplication de l'ADNmt. Ce domaine a déjà été impliqué dans la reconnaissance des intermédiaires de réplication, où il les protège de la dégradation par les nucléases les intermédiaires réplicatifs de l'ADN. Nous avons également constaté que les niveaux de TRF2 diminuaient au fur et à mesure que les MEF entraient en sénescence et que l'expression ectopique de TRF2 était suffisante pour maintenir les niveaux de réplication de l'ADNmt au même niveau que ceux des jeunes MEF. Dans l'ensemble, nos résultats démontrent que la protéine shelterin TRF2 régule la réplication mitochondriale au cours de la sénescence
The aging process has been defined as a time-dependent functional decline in tissue functions. Cellular senescence, telomere attrition, and mitochondrial dysfunction are generally considered to contribute to the aging process. Cellular senescence is a permanent state of cell cycle arrest, and it is characterized by changes in chromatin structure and the activation of a pro-inflammatory phenotype. Telomeres are the structures located at the ends of chromosomes and are protected by a protein complex composed of six proteins (TRF1, TRF2, RAP1, TPP1, TIN2 and POT1) called shelterin. There is increasing evidence of multiple links between mitochondrial function and telomeres. Mitochondrial dysfunction leads to increased levels of reactive oxygen species (ROS), which cause telomere shortening, and this shortening can induce mitochondrial dysfunction through p53 activation. Recent studies have suggested that telomerase and some shelterin subunits regulate mitochondrial function independently of their telomeric role, perhaps through their direct localization to the mitochondria. For instance, telomerase reverse transcriptase (TERT) localizes to mitochondria and protects mitochondrial DNA (mtDNA) in neurons by reducing ROS levels. The shelterin protein TIN2 is found at mitochondria where it regulates oxidative phosphorylation. TRF2 regulates the expression of the mitochondrial sirtuin SIRT3 in skeletal muscle cells. Altogether, these findings suggest a positive feedback loop between telomere and mitochondrial dysfunction and raise the question of how the telomere-mitochondria connection contributes to senescence.To address this question, we investigated the functions of all shelterin subunits in mitochondria using mouse embryonic fibroblast cells (MEFs). We investigated their role in mitochondrial metabolism and their implication in mitochondrial DNA (mtDNA) replication by using the in-situ analysis of mitochondrial DNA replication (MIRA) assay. We showed that TIN2, TPP1 and TRF2 affect mitochondrial metabolism, but only TRF2 depletion has a detrimental effect on mtDNA replication. Importantly, we found that TRF2 was located at mitochondria by using a variety of techniques, including electron microscopy. We went deeper into the characterization of the different domains of TRF2 and found that the N-terminal domain of TRF2 (B domain) was required and sufficient for its mitochondrial location and for its role in mtDNA replication. This domain has previously been implicated in the recognition of replication intermediates, where it protects them from nuclease degradation in a sequence-independent manner. We also found that TRF2 levels decreased as the MEFs entered senescence and that ectopic expression of TRF2 was sufficient to maintain mtDNA replication levels as those of young MEFs. Collectively, our results demonstrate that the shelterin protein TRF2 regulates mitochondrial replication during senescence

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Berthon, Jonathan. "Etude de la réplication de l'ADN chez les Archaea." Phd thesis, Université Paris Sud - Paris XI, 2008. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00344124.

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Les organismes cellulaires appartiennent à l'un des trois domaines du vivant : Archaea, Bacteria, Eucarya. Les Archaea sont des organismes unicellulaires avec un phénotype bactérien mais qui possèdent de nombreux caractères moléculaires eucaryotes. En particulier, la machinerie de réplication archéenne est une version homologue et simplifiée de celle des eucaryotes. Au cours de cette thèse, j'ai étudié la réplication de l'ADN chez les Archaea en combinant des approches in vitro et in silico.
Premièrement, j'ai essayé de purifier la protéine initiatrice de la réplication Cdc6/Orc1, sous une forme native, dans l'espoir de mettre au point le premier système de réplication de l'ADN in vitro chez les Archaea. Malheureusement, cette approche a été infructueuse en raison de l'instabilité et des propriétés d'agrégation de la protéine.
Deuxièmement, j'ai réalisé une analyse comparative du contexte génomique des gènes de réplication dans les génomes d'Archaea. Cette analyse nous a permis d'identifier une association très conservée entre des gènes de la réplication et des gènes liés au ribosome. Cette organisation suggère l'existence d'un mécanisme de couplage entre la réplication de l'ADN et la traduction. De manière remarquable, des données expérimentales obtenues chez des modèles bactériens et eucaryotes appuient cette idée. J'ai ensuite mis au point des outils expérimentaux qui permettront d'éprouver la pertinence biologique de certaines des prédictions effectuées.
Finalement, j'ai examiné la distribution taxonomique des gènes de la réplication dans les génomes d'Archaea afin de prédire la composition probable de la machinerie de réplication de l'ADN chez le dernier ancêtre commun des Archaea. Dans leur ensemble, les profils phylétiques des gènes de la réplication suggèrent que la machinerie ancestrale était plus complexe que celle des organismes archéens contemporains.

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Bourdon, Alice. "Ribonucléotide réductase et synthèse de l'ADN mitochondrial." Paris 5, 2009. http://www.theses.fr/2009PA05T006.

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Les déplétions de l'ADN mitochondrial (ADNmt) sont caractérisées par une diminution de la quantité de molécules d'ADNmt et sont une cause importante des déficits de la chaîne respiratoire. Les travaux présentés dans cette thèse ont permis d'identifier un nouveau gène nucléaire de déplétion de l'ADNmt associée à une encéphalomyopathie sévère conduisant au décès dans les premiers mois de vie. Ce gène code pour une petite sous-unité de la ribonucléotide réductase p53R2 induite par le facteur suppresseur de tumeurs p53. La ribonucléotide réductase catalyse la réduction des nucléotides en leurs désoxynucléotides correspondants, ce qui constitue l'étape limitante dans la synthèse de l'ADN. La deuxième partie de ce travail a porté plus précisément sur le rôle de p53R2 dans la réplication de l'ADNmt en abordant les questions de sa localisation subcellulaire ainsi que de la régulation des sous-unités de la ribonucléotide réductase au cours du développement, chez la souris, dans différents tissus
Mitochondrial DNA (mtDNA) depletions are characterized by a decreased number of mtDNA molecules and constitute a major cause of respiratory chain deficiency. This work allowed us to identify a new nuclear gene of mtDNA depletion associated with a severe encephalomyopathy leading to death in the first months of age. This gene encodes a small ribonucleotide reductase (RNR) subunit p53R2 which is a target of the transcription factor p53. RNR catalyses the reduction of the nucleotides into their corresponding desoxyribonucleotides, which is the rate limiting step for DNA synthesis. The second part of this work focuses on the role of p53R2 in mtDNA replication studying its subcellular localization and the expression of the subunits of RNR in several mouse tissues during development

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Biju, Duval Christophe. "Diversité de l'ADN mitochondrial chez les lagomorphes." Paris 6, 1992. http://www.theses.fr/1992PA066046.

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Chez les léporidés, l'ADN mitochondrial manifeste une diversité importante, observée à deux niveaux: 1) des variations de longueur, dues principalement à des changements du nombre de deux motifs répétés en tandem dans la région non-codante de la molécule; 2) un polymorphisme des sites de restriction, dont l'analyse permet de retracer les lignées maternelles. L'étude d'un grand nombre d'individus appartenant à plusieurs espèces montre que les variations de longueur sont suffisamment fréquentés pour entretenir une hétéroplasmie généralisée, et variable d'un individu à l'autre, chez tous les léporidés. D'après les phylogènies mitochondriales, établies par comparaison des cartes de restriction, les trois genres lepus, oryctolagus et sylvilagus semblent s'être individualisés il y a près de 8 millions d'années. Chez les lapins de garenne (oryctolagus cuniculus), a été mise en évidence l'existence de deux lignées mitochondriales bien distinctes (vraisemblablement depuis 2,5 millions d'années), la première limitée au sud de la péninsule ibérique, la seconde occupant le reste de l'aire de répartition actuelle de l'espèce. Cette situation pose quelques questions concernant la biologie et l'histoire de l'espèce

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Toueille, Magali. "Etude du complexe de réplication de l'ADN nucléaire de blé." Bordeaux 2, 2001. http://www.theses.fr/2001BOR28888.

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La réplication de l' ADN est un phénomène complexe dans lequel de nombreux facteurs cellulaires sont impliqués. Elle est bien connue chez les procaryotes et les mammifères grâce à l' utilisation de modèles de réplication in vivo utilisant respectivement le bactériophage øx174 et le virus SV 40. En ce qui concerne la réplication de l' ADN chez les végétaux, seules des données fragmentaires, qui révèlent des différences entre les facteurs de réplication végétaux et mammifères, sont disponibles. L' objet de travail présenté dans ce mémoire est l' étude du complexe réplicatif et des facteurs le composant chez le blé, en vue de la reconstitution du complexe in vivo. Dans un premier temps, nous avons mis en place un essai de réplication utilisant comme matrice un plasmide simple brin (pWori) contenant les séquences essentielles du génome d' un virus infectant le blé, le géminivirus du nanisme du blé dont la réplication repose sur la machinerie réplicative de la cellule hôte. Nous avons purifié une fraction protéique à partir de cellules de blé en culture, capable d' assurer la réplication dans l' essai mis en place. Certains facteurs présents dans cette fraction ont été identifiés (protéines de liaison à l' ADN, topoisomérase) et purifiés (ADN polymérase A et B). La deuxième approche utilise la technique "double hybride" pour rechercher les facteurs interagissant au sein du complexe réplicatif avec une protéine centrale de celui-ci, la protéine RF-C. La troisième approche mise en oeuvre est basée sur le pontage chimique des éléments interagissant physiquement au sein du complexe réplicatif. Lors de cette étude nous avons détecté la présence de deux PCNA de taille diférente. L' analyse de séquences nucléotidiques partielles codant les PCNA a permis de mettre en évidence deux types d' ARN messagers, dont la détermination des séquences complètes est en cours
DNA replication requires a large set of proteins. The role played by the various factors of the prokaryotic and eukaryotic DNA replication machinery has been well established using a cell-free system with bacteriophage øx174 for prokaryotes and virus SV40 for eukaryotes. Plant DNA replication studies are scarce and their partial data reveal somme differences between mammalian and plant factors associated to DNA replication. This thesis concerns the analysis of the factors involved in the wheat "replicative complex" for a complete reconstitution in vitro. First, we isolated a wheat protein fraction acting as a DNA replication complex using a template as primed single-stranded phagemid (pWori) containing the geminivirus WDV (wheat dwarf virus) replication origins and the coding sequence of the geminiviral initiation protein (Rep). From the functionnal replicative complex, some factors were identified (DNA binding proteins, topoisomerase) and purified (DNA polymerases A and B and PCNA). Then by a "two hybrid" technique in yeast, we tried to determine the partners interacting with a key DNA replication factor : the RF-C. The last strategy concerns the reversible chemical bindings of physically interacting proteins present in the replicative complex. We detected two PCNA : a short and a long one. The analysis of their partial nucleotidic sequences showed the presence of two different RNA messengers. Their full length sequences are in progress

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DEGOUL, FRANCOISE. "Mutations de l'adn mitochondrial dans differentes myopathies humaines." Clermont-Ferrand 2, 1991. http://www.theses.fr/1991CLF21276.

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L'adn mitochondrial (adn mt) code pour des proteines de la chaine respiratoire et de l'atp synthetase. Nous avons retrouve des deletions heteroplasmiques de l'adn mt dans les tissus de patients atteints de myopathies oculaires et des mutations ponctuelles de l'adn mt dans les tissus de patients atteints de syndrome de merrf et de melas. Les deletions sont differentes d'un individu a l'autre (3 a 8,5 kb) et sont identiques dans les tissus d'un meme individu mais la quantite de molecules anormales est variable d'un tissu a l'autre. Elles amputent plusieurs genes codant pour les sous-unites des complexes i, iii, iv, et v et plusieurs genes d'arnt. Plus la quantite de genome mute est importante plus le deficit biochimique est detectable. Le mecanisme implique dans la formation des deletions demeure inconnu pourtant la presence de sequences repetees dans les 3/4 des cas suggere des mecanismes de recombinaison apres appariements de sequences homologues. Les mutations ponctuelles a la position 8344 et 3243 sont specifiques respectivement du syndrome de merrf et du syndrome de melas. Elles se situent dans les genes d'arn de transfert de la lysine au niveau de la boucle t pseudouridine c (8344) et de la leucine au niveau de la boucle dihydouracile (3243). Elles sont heteroplasmiques et se retrouvent a des taux variables suivants les tissus. Les mutations ponctuelles sont transmises selon les lois de l'heredite maternelle. Pour les deletions ce schema n'est pas retrouve: certains cas sont sporadiques, d'autres sont familiaux montrant une heredite autosomale dominante ce qui suggere l'intervention d'une proteine nucleaire dans le processus de formation des deletions

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Norais, Cédric. "Etude de la réplication de l'ADN chez l'archaea halophile Haloferax volcanii." Paris 11, 2007. http://www.theses.fr/2007PA112104.

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J'ai étudié, durant mon travail de thèse, la réplication de l'ADN chez l'archaea halophile Haloferax volcanii. Le premier objectif de ma thèse était de mettre en place l'utilisation des outils génétiques disponibles chez H. Volcanii, dont la méthode de délétion de gène par intégration/excision de plasmide (pop-in/pop-out), pour un usage routinier au laboratoire. L'annotation partielle des gènes impliqués dans les mécanismes de réplication et réparation de l'ADN a permis d'identifier 16 protéines Initiator Cdc6/Orc1 putatives. L'utilisation des outils génétiques, combinée à une analyse des biais de représentation des nucléotides, nous ont permis d'identifier cinq origines de réplication. Le chromosome majeur possède au moins deux origines de réplication tandis qu'une autre est retrouvée sur les deux épisomes pHV1 et pHV4. L'activité in vivo de ces origines a pu être confirmée par cartographie des sites d'initiation de la réplication (RIP mapping) et par gel bidimensionnels d'ADN. L'étude des peptides interagissant avec PCNA nous a permis d'identifier que RnaseH interagit avec PCNA pour former un complexe inactif. Nos analyses génétiques chez H. Volcanii ont permis d'illustrer l'implication dans les processus de réparation de l'ADN des protéines Fen1 et de manière surprenante de RNAseH I et RnaseHII. Ces analyses ont montré que Fen1 intervient aussi dans la réplication de l'ADN. J'ai pu confirmer que les fragments d'Okazaki font moins de 200 bases et portent une amorce ARN synthétisée par la primase de type eucaryote PriS/L qui est essentielle chez H. Volcanii. En revanche, la primase de type bactérienne putative DnaG peut être inactivée, mais son rôle reste à caractériser. Mes travaux ont démontré qu'avec ses multiples réplicons et des outils génétiques efficaces permettant la caractérisation des gènes, H. Volcanii est un modèle novateur et pertinent pour l'étude de la réplication de l'ADN chez les archaea
During my doctoral work, I have studied DNA replication in the halophilic archaeon Haloferax volcanii. The first aim of this study was to establish the use of available genetic tools for H. Volcanii, including the pop-in/pop-out gene deletion system, for routine work at the laboratory. A partial annotation of the genes implicated in DNA replication and repair allowed the identification of 16 putative Initiator Cdc6/Orc1. The use of genetics combined with nucleotide skews analyses allowed the identification of five replication origins. The main chromosome carries at least two replication origins whereas another origin is used to replicate both pHV1 and pHV4. The in vivo activity of these origins could be confirmed by replication initiation point mapping and DNA two-dimensional gels. The study of PCNA interacting peptides revealed that archaeal RNAseH interacts with PCNA to form an inactive complex. Genetic analyses with H. Volcanii revealed the implication in DNA repair of Fen1 and surprisingly RnaseHI and RnaseHII. These studies also showed that Fen1 is required for DNA replication. I confirmed that H. Volcanii Okazaki fragments are less than 200 bases long and carry an RNA primer synthesized by the essential PriS/L eukaryotic-like primase. On the other hand, the putative bacterial-like primase DnaG can be deleted and its role remains to be characterized. My studies have demonstrated that with its multi-replicon structure and efficient genetic tools for gene characterization, H. Volcanii is a novel and pertinent model for the study of archaeal DNA replication

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Gonzalez, Laure. "Implication de Ruvbl2/Reptin dans l'initiation de la réplication de l'ADN." Montpellier 1, 2008. http://www.theses.fr/2008MON1T028.

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Afin d'identifier de nouveaux facteurs potentiels de la réplication de l'ADN, une approche protéomique a été mise au point au laboratoire. Elle consiste en un crible différentiel de protéines qui se lient à la chromatine interphasique durant la mise en place des complexes de pré-réplication. Par spectrométrie de masse, des facteurs connus de la réplication ont été identifiés validant ainsi cette approche et aussi d'autres facteurs avec des rôles potentiels dans la réplication. Je me suis particulièrement intéressée à l'un d'entre eux : Ruvbl2/Reptin. Ruvbl2 et son partenaire Ruvbl1 sont très conservés chez les eucaryotes et sont essentiels à la viabilité de nombreux organismes. Ce sont des ATPases AAA+ et font partie de plusieurs complexes multiprotéiques impliqués dans diverses fonctions. Elles sont également associées à deux voies oncogéniques : β-caténine et c-myc. Leurs propriétés biochimiques ainsi que leur implication dans la prolifération cellulaire et le développement précoce ont suggéré un rôle potentiel pour les deux protéines dans la réplication. Dans le système des extraits d'oeufs de xénope, j'ai observé que Ruvbl2 s'associe à Ruvbl1 et que sa déplétion conduit à celle de Ruvbl1. Ruvbl2 se lie rapidement à la chromatine au temps de la formation des complexes de pré-réplication et reste associé à la chromatine au cours de la phase S. De plus, son recrutement sur la chromatine est dépendant de celui d'Orc2. Elle est requise pour la réplication de l'ADN chromosomique mais pas pour la synthèse d'un brin d'ADN complémentaire à partir d'une matrice M13 simple brin. Elle est aussi nécessaire au recrutement de CDC6 et du complexe MCM2-7 (probablement l'hélicase réplicative). En résumé, ces données suggèrent que Ruvbl2 est impliquée précocement dans le processus réplicatif dans un contexte non-transcriptionnel.

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Lafont, Laurent. "Rôle de la sumoylation de la cycline E lors de la réplication de l'ADN." Montpellier 2, 2009. http://www.theses.fr/2009MON20079.

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La cycline E, qui contrôle l'entrée en phase S, est cruciale pour l'assemblage du complexe de pré-initiation de réplication lorsque la cellule réentre dans le cycle après une phase de quiescence. Elle est éliminée au cours de la phase S du cycle cellulaire, mais rien n'est connu sur ce qui déclenche sa dégradation à cette étape. Son élimination est certainement primordiale, si l'on se réfère à la très forte instabilité chromosomique provoquée par sa surexpression dans les cellules primaires et son accumulation anormale dans la plupart des cancers humains. Notre équipe a découvert que la cycline E est modifiée sur la chromatine au moment de l'initiation de la réplication par de multiples modifications post-traductionnelles (phosphorylation, ubiquitination) dont la sumoylation. La sumoylation, processus de modification post-traductionnelle consiste en la conjugaison d'une isoforme de SUMO (Small Ubiquitin like Modifier) sur une protéine d'intérêt. L'objectif de cette thèse était donc d'établir le rôle de la sumoylation dans la régulation de la cycline E parallèlement au rôle joué par cette modification dans la régulation de la réplication
The cyclin E, which controls the entry to phase S, is crucial for the assembly of the pre-initiation complex of replication when the cell re-enter in the cycle after a phase of quiescence. This cyclin is eliminated during the phase S during the cellular cycle, but nothing is known on what activates its degradation in this stage. Its elimination is certainly essential, if we refer to the very strong chromosome instability provoked by its overexpression in the primary cells and its abnormal accumulation in most of the human cancers. Our team discovered that the cyclin E is modified on the chromatin at the time of the initiation of the replication by multiple post-translation modifications (phosphorylation, ubiquitination) of which sumoylation. The sumoylation, process of post-translation modification, consists of the conjugation of an isoforme of SUMO (Small Ubiquitin like Modifier) on a protein of interest. The objective of this thesis was to establish the role of the sumoylation in the regulation of the cyclin E at the same time as the role played by this modification in the regulation of the replication

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Rocher, Christophe. "Anomalies de l'ADN mitochondrial et métabolisme mitochondrial : Mécanismes des déplétions et des délétions." Bordeaux 2, 2001. http://www.theses.fr/2001BOR28910.

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Un des problèmes fondamentaux qui se pose lors de l'étude de l'intégration du métabolisme mitochondrial dans le métabolisme cellulaire est de comprendre comment est contrôlé le métabolisme mitochondrial. Le sujet de cette thèse s'inscrit dans cette problèmatique en essayant de répondre aux deux questions suivanres : 1- Quelles sont les répercussions au niveau du métabolisme énergétique d'une variation de la quantité d'ADN mitochondrial dans la cellule ? Pour cela, j'ai utilisé deux modèles d'étude (i) une lignée lymphoblastoide (DES) provenant d'un patient pour lequel une cytopathie d'origine mitochondriale a été diagnostiquée et dont une diminution de la quantité d'ADNmt dans le muscle (déplétion) de 99 % a été mise en évidence, mais également (ii) des lignées cellulaires stables déplétées en ADN mitochondrial par traitement avec des analogues de nucléotides (AZT et ddC) d'une lignée contrôle. Les résultats obtenus nous indiquent clairement que la quantité d'ADNmt dans la cellule semble être un des paramètres importants dans la régulation des oxydations phosphorylantes. En effet, malgrè le nombre élevé de copies d'ADNmt dans les cellules, une faible diminution entraîne de sévères répercussions sur le métabolisme énergétique mitochondrial. Par conséquent, la quantité d'ADNmt présente dans la cellule semble être un nouveau paramètre à prendre en compte dans l'étude des pathologies mitochondriales au même titre que la nature ou le taux de mutation de cet ADN. 2- Quels sont les mécanismes moléculaires impliqués dans les remaniements de l'ADN mitochondrial et plus particulièrement dans le cas des délétions de l'ADNmt ? En effet, un certain nombre de pathologies ont été décrites mettant en cause des réarrangements de l'ADNmt humain. De nombreux modèles ont été proposés pour expliquer ces remaniements de l'ADNmt. Le modèle le plus probable est le mécanisme de "slipped mispairing". Cependant, si ce modèle est maintenant bien admis, aucune base moléculaire n'a encore été décrite. Les résultats que nous avons obtenus montrent que la formation d'une triple hélice peut être impliquée dans les mécanismes de formation des remaniements de l'ADNmt. Nous pensons aussi qu'un mécanisme comparable serait à l'origine des duplications-triplications partielles
One of the fundamental problems of the study of mitochondrial metabolism integration in cellular metabolism is to understand how mitochondrial metabolism is controlled (regulated) ? The subject of this thesis concerns this topic and tries to answer the two following questions : 1- What are the repercussions of a mitochondrial DNA (mtDNA) amount variation at the level of the energy metabolism ? We used two models which are : (i) a lymphoblastoid cell line coming from a patient for whom a 99 % decrease of the muscle mtDNA amount was observed (depletion), but also (ii) a series of stable mtDNA depleted cell lines obtained by treatment of a control one with nucleotides analogues (AZT and ddC). The results clearly indicate that cellular mtDNA amount is one important parameter in the regulation of oxidative phosphorylations. Indeed, despite the high copy number of mtDNA, a small decrease in its content has severe implications on mitochondrial bioenergetics. Consequently, the quantity of mtDNA in the cell is a parameter to take into account for the study of mitochondrial pathologies as well as the nature or the heteroplasmlic level of a mtDNA mutation. 2- What are the molecular mechanisms involved in the generation of human mitochondrial DNA rearrangements, such as large-scale deletions ? Some mitochondrial pathologies areare due to such reorganizations of mtDNA and different mechanisms have been proposed to explain these rearrangements. The mechanism of slipped mispairing has been proposed but no molecular bases are described. The results we obtained show that the formation of a triple helix could be involved in the generation of mtDNA deletions as well as partial duplications or triplications

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Moindrot, Benoît. "Organisation de la chromatine et son lien avec la réplication de l'ADN." Phd thesis, Ecole normale supérieure de lyon - ENS LYON, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00733254.

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L'organisation de la chromatine a une importance fonctionnelle pour contrôler le programme d'expression des gènes. Par contre, les liens qui l'unissent au déroulement de la réplication de l'ADN sont beaucoup moins connus. Grâce à des approches basées sur la capture d'interactions chromosomiques et sur l'imagerie cellulaire, nous avons étudié les liens entre le repliement à grande échelle de la chromatine et le timing de réplication. Cette analyse, effectuée dans des cellules humaines lymphoblastoïdes, des cellules mononucléées du sang (PBMC) et des cellules issues d'une leucémie myéloïde à caractère érythrocytaire, a permis l'identification de domaines structuraux du noyau. Ces domaines sont relativement isolés les uns des autres et leurs frontières coïncident avec les zones d'initiation précoce. De plus, notre étude montre que ces zones d'initiation précoce interagissent préférentiellement, aussi bien entre voisins immédiats (séparation génomique de l'ordre de la mégabase) que le long du chromosome entier. Les loci répliqués tardivement interagissent eux-aussi avec leurs homologues, conduisant, dans l'espace nucléaire, à une ségrégation des loci en fonction de leur timing de réplication. Ces résultats sont soutenus par des mesures de distances sur des hybridations in-situ qui montrent que les loci répliqués en début de phase S sont plus proches qu'attendus. Nos travaux révèlent enfin que l'organisation de la chromatine est similaire dans des cellules en phase G0 (PBMC dormantes), démontrant qu'elle n'est pas spécifique des cellules en phase S. Pris ensemble, ces résultats apportent des preuves directes d'une organisation robuste de la chromatine, partagée par les cellules en cycle et dormantes, et corrélée au timing de réplication à différentes échelles.

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Legros, Frédéric. "Étude de la dynamique du compartiment mitochondrial et des mutations hétéroplasmiques de l'ADN mitochondrial." Paris 7, 2002. http://www.theses.fr/2002PA077109.

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Garnery, Lionel. "Variabilité de l'ADN mitochondrial de l'abeille domestique : Implications phylogénétiques." Paris 6, 1992. http://www.theses.fr/1992PA066487.

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La variabilité de l'ADN mitochondrial de l'abeille domestique, apis mellifera, a été étudiée par analyses de restrictions sur 87 colonies appartenant à 13 races différentes. Les 23 types mitochondriaux détectés correspondent à trois groupes de populations possédant une aire de répartition distincte. Ces résultats confirment partiellement les hypothèses antérieures fondées sur les études de morphométrie et des systèmes allozymes. La différence majeure concerne les populations nord africaines et siciliennes, qui appartiennent à la branche A plutôt qu'a la branche M. Les deux variations de longueur de fragment détectées sont en accord avec les phylogénies obtenues et la répartition géographique des colonies. Une de ces variations située dans la région codant pour les gènes coi et coii est liée à une duplication ancestrale du gène codant pour l'ARNT leucine et l'évolution de cette région le long de la lignée apis a été imaginée sous forme de scenarios. La distribution spatiale des échantillons suggère le proche orient comme centre de dispersion le plus probable de l'espèce en accord avec la distribution géographique et la plus grande variabilité des autres espèces du genre. La séparation des trois branches a été estimée a un million d'années, en fonction de la valeur conservée (diptère:vertébrés) de 2%/ma

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Sarzi, Emmanuelle. "Caractérisation génétique et phénotypique des déplétions de l'ADN mitochondrial." Paris 5, 2008. http://www.theses.fr/2008PA05T048.

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Les maladies mitochondriales forment le groupe le plus courant d'anomalies congénitales du métabolisme. Ces maladies représentent actuellement plus de 17% des consultations régulières de notre service de génétique médicale. Les déficits multiples de la chaîne respiratoire mitochondriale sont à l'origine d'un grand nombre de maladies mitochondriales. Ils se caractérisent par des atteintes multi-viscérales responsables la plupart du temps d'un décès précoce dans les premières années de vie des patients atteints par ce type de pathologie. Depuis une quinzaine d'années, notre laboratoire a recruté un très grand nombre de patients présentant un déficit multiple de la chaîne respiratoire (CR). En 2001, il a été mis en évidence qu'un tout nouveau type d'anomalie touchant l'ADN mitochondrial (ADNmt) pouvait être à l'origine de ces déficits multiples. Ces anomalies sont des modifications quantitatives de l'ADNmt connues sous le nom de déplétions de l'ADNmt. Le recrutement important de cas de déficits multiples et le faible rendement de diagnostic moléculaire établi nous a incité à considérer les déplétions de l'ADNmt comme origine potentielle de déficits multiples de la chaîne respiratoire. Le travail de recherche présenté dans ce manuscrit a eu pour objectif tout d'abord d'estimer l'incidence des déplétions de l'ADNmt dans notre cohorte de patients atteints de déficit multiple de la CR. Nous nous sommes ensuite attachés à définir les atteintes cliniques associées à ces déplétions de l'ADNmt. Enfin, l'étude des gènes connus de déplétion de l'ADNmt DGUOK, POLG1 et TK2 nous a permis de mieux caractériser ces patients. Par la suite, l'étude par cartographie génétique de nos familles consanguines avec déplétions de l'ADNmt et de mutation actuellement inconnue, nous a conduit à la première identification de mutations récessives dans le gène PEO1 responsables d'un syndrome hépatocérébral de déplétion de l'ADNmt. La dernière partie de ce manuscrit rapporte l'étude en cours de cartographie génétique et de séquençage de gènes candidats pour une famille consanguine présentant un autre type de syndrome hépatocérébral associé à un déficit multiple de la chaîne respiratoire. L'ensemble de ce travail a permis à notre laboratoire d'acquérir de meilleures connaissances de l'origine génétique des déficits multiples de la chaîne respiratoire associés à une déplétion de l'ADNmt et d'améliorer ainsi le conseil génétique d'une partie des maladies mitochondriales
Mitochondrial diseases are a common group of metabolism pathologies. Nowadays, they represent more than 17% of our clinical consultations. Multiple respiratory chain deficiency account for an important number of mitochondrial disease and are characterised by a multi-systemic organ involvement leading to early death. Since these last 15 years, we have recruited a large number of patients with multiple respiratory chain deficiency. In 2001, it has been shown that a mtDNA quantitative anomaly was at the origin of this defect also named mtDNA depletions. The large number of patients with multiple respiratory chain deficiency and the weak yield of molecular diagnosis prompt us to consider mtDNA depletion as a cause of multiple respiratory chain deficiency. The aim of this work was firstly to estimate the incidence of mtDNA depletion in our series of multiple respiratory chain cases. Then, we characterised the genetic and phenotypic features of mtDNA depletions. Finaly, the study of one family among our consanguineous and/or multiplex patients allowed us to identify a new gene responsible for mtDNA depletions associated with a hepatocerebral failure. This gene also named PEO1 encodes for the mitochondrial Twinkle helicase which has been ever known to cause adult onset PEO in a dominant transmission. Finally, we have studied another consanguineous family with multiple respiratory chain deficiency and hepatic failure. This work allowed us to improve the genetic counselling in our laboratory especially for all patients with multiple respiratory chain deficiency associated with a mtDNA depletion

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Al, Amir Dache Zahra. "Étude de la structure de l'ADN circulant d'origine mitochondriale." Thesis, Montpellier, 2019. http://www.theses.fr/2019MONTT059.

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Le plasma transporte des cellules sanguines avec un mélange de composés, y compris les nutriments, déchets, anticorps, et messagers chimiques... dans tout l'organisme. Des facteurs non solubles tels que l’ADN circulant et les vésicules extracellulaires ont récemment été ajoutés à la liste de ces composants et ont fait l'objet d'études approfondies en raison de leur rôle dans la communication intercellulaire. Or, l’ADN circulant (ADNcir) est composé de fragments d’ADN libres ou associés à d’autres particules, libérés par tous les types cellulaires. Cet ADN est non seulement de l'ADN génomique mais aussi de l'ADN mitochondrial extra-chromosomique. De nombreux travaux réalisés au cours des dernières années indiquent que l’analyse quantitative et qualitative de l’ADNcir représente une avancée dans les applications cliniques en tant que biomarqueur non invasif de diagnostic, de pronostic et de suivi thérapeutique. Cependant, malgré l'avenir prometteur de cet ADNcir dans les applications cliniques, notamment en oncologie, les connaissances sur ses origines, sa composition et ses fonctions qui pourraient pourtant permettre d’optimiser considérablement sa valeur diagnostique, font encore défaut. Le principal objectif de ma thèse a été d’identifier et de caractériser les propriétés structurales de l’ADN extracellulaire d’origine mitochondrial. En examinant l'intégrité de cet ADN, ainsi que la taille et la densité des structures associées, ce travail a révélé la présence de particules denses d’une taille supérieure à 0,2 µm contenant des génomes mitochondriaux complets et non fragmentés. Nous avons caractérisé ces structures notamment par microscopie électronique et cytométrie en flux et nous avons identifié des mitochondries intactes dans le milieu extracellulaire in vitro et ex-vivo (dans des échantillons de plasma d’individus sains). Une consommation d'oxygène par ces mitochondries a été détectée par la technique du Seahorse, suggérant qu'au moins une partie de ces mitochondries extracellulaires intactes pourraient être fonctionnelles. Par ailleurs, j’ai participé à d’autres travaux réalisées dans l’équipe, dont (1) une étude visant à évaluer l’influence des paramètres pré-analytiques et démographiques sur la quantification d’ADNcir d’origine nucléaire et mitochondrial sur une cohorte composée de 104 individus sains et 118 patients atteints de cancer colorectal métastatique, (2) une étude dont l’objectif était d’évaluer l’influence de l’hypoxie sur le relargage de l’ADN circulant in vitro et in vivo, et (3) une étude visant à évaluer le potentiel de l’analyse de l’ADN circulant dans le dépistage et la détection précoce du cancer. Ce manuscrit présente une synthèse récente de la littérature sur l’ADNcir, ses différents mécanismes de relargage, qui vont de pair avec la caractérisation structurelle de cet ADN, ses aspects fonctionnels et ses différentes applications en cliniques. De plus, cette thèse apporte des connaissances nouvelles sur la structure de l’ADN mitochondrial extracellulaire tout en ouvrant de nouvelles pistes de réflexion notamment sur l’impact que pourrait avoir la présence de ces structures circulantes sur la communication cellulaire, l’inflammation et des applications en clinique
Plasma transports blood cells with a mixture of compounds, including nutrients, waste, antibodies, and chemical messengers...throughout the body. Non-soluble factors such as circulating DNA and extracellular vesicles have recently been added to the list of these components and have been the subject of extensive research due to their role in intercellular communication. Circulating DNA (cirDNA) is composed of cell-free and particle-associated DNA fragments, which can be released by all cell types. cirDNA is derived not only from genomic DNA but also from extrachromosomal mitochondrial DNA. Numerous studies carried out lately indicate that the quantitative and qualitative analysis of cirDNA represents a breakthrough in clinical applications as a non-invasive biomarker for diagnosis, prognosis and therapeutic follow-up. However, despite the promising future of cirDNA in clinical applications, particularly in oncology, knowledge regarding its origins, composition and functions, that could considerably optimize its diagnostic value, is still lacking.The main goal of my thesis was to identify and characterize the structural properties of extracellular DNA of mitochondrial origin. By examining the integrity of this DNA, as well as the size and density of associated structures, this work revealed the presence of dense particles larger than 0.2 µm containing whole mitochondrial genomes. We characterized these structures by electron microscopy and flow cytometry and identified intact mitochondria in the extracellular medium in vitro and ex vivo (in plasma samples from healthy individuals). Oxygen consumption by these mitochondria was detected by the Seahorse technology, suggesting that at least some of these intact extracellular mitochondria may be functional.In addition, I contributed to other studies carried out in the team, such as studies aiming at evaluating (1) the influence of pre-analytical and demographic parameters on the quantification of nuclear and mitochondrial cirDNA on a cohort of 104 healthy individuals and 118 patients with metastatic colorectal cancer, (2) the influence of hypoxia on the release of cirDNA in vitro and in vivo, and (3) the potential of cirDNA analysis in the early detection and screening of cancer.This manuscript present a recent review on cirDNA and its different mechanisms of release, which go hand in hand with the structural characterization of this DNA, its functional aspects and its clinical applications. In addition, this thesis provides new knowledge on the structure of extracellular mitochondrial DNA and opens up new avenues for reflection, particularly on the potential impact that could have those circulating mitochondria on cell-cell communication, inflammation and clinical applications

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Guilbaud, Guillaume. "Etude du programme de réplication du génome humain par peignage moléculaire de l'ADN et séquençage massif." Paris 7, 2010. http://www.theses.fr/2010PA077104.

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La réplication du génome humain démarre à partir d'environ 30 000 origines dont la position et le moment de déclenchement sont peu connus. Des analyses bioinformatiques ont mis en évidence l'existence d'une asymétrie de la composition nucléotidique entre les brins répliqués de manière continue et discontinue. L'analyse du profil de ce biais se caractérise par une forme en N (N-domaines). Il a été proposé que les bords des N-domaines correspondent à des origines de réplication efficaces. L'inversion progressive du biais d'un bord à l'autre traduirait un changement progressif de l'orientation moyenne des fourches de réplication. Nous avons caractérisé la chronologie de la réplication par séquençage massif et avons interprété le profil obtenu à partir d'observations par peignage moléculaire de l'ADN. Nous avons établi que le génome se réplique à partir de zones d'initiation contenant des origines efficaces, déclenchées en début de phase S, et que cette réplication se propage par activation progressive d'origines adjacentes de plus en plus tardives, avec un taux d'activation qui augmente au cours de la phase S. Le profil temporel des N-domaines montre une forme en U, ce qui indique que leurs bords constituent des zones d'initiation précoces à partir desquelles la réplication se propage vers leur centre par activation consécutive d'origines plus internes. Le peignage moléculaire montre que les fourches se dirigeant vers le centre ou vers les bords des N-domaines parcourent des distances inégales, en raison de cette activation consécutive. Ce processus explique quantitativement le profil temporel et le profil de polarité des fourches de réplication au sein des N-domaines
Replication of the human genome starts at some 30. 000 origins whose position and timing of replication are not well known. Bioinformatic analyses have shown a nucleotide compositional asymmetry between the lagging and the leading replicating strands. The profile of this skew revealed that an important fraction of the genome is organized in 1Mb domains that show an N-shape (called N-domains). The skew profile of N-domain borders showed a sharp upward jump that was interpreted as the signature of highly efficient replication origins. The progressive inversion of the skew between two upward jumps suggested a progressive inversion of the average replication fork orientation. We determined the timing of replication for the whole human genome and then focused on N-domains. The timing profile was obtained by massive sequencing and interpreted using single DNA molecule replication patterns obtained by molecular combing of DNA. We show that replication begins at early replicating initiation zones containing efficient origins. Replication then propagates by progressive activation of neighbouring origins with an initiation rate that increases during S phase. The average N-domain timing profile shows a U shape, which indicates that their borders constitute early and efficient initiation zones from which replication progresses towards their centre by progressive activation of inner origins. Molecular DNA combing shows that replication forks moving toward the centre or the borders do not travel the same distance, due to this sequential activation. This process quantitatively explains the timing profile and the fork polarity profile within N-domains

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Andraos, Nathalie. "Etudes Structurales et Biochimiques de l'ADN Polymérase du Bactériophage T5." Paris 6, 2004. http://www.theses.fr/2004PA066352.

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Raynaud, Cécile. "Relations entre cycle cellulaire et division des plastes : caractérisation des gènes AtSulA, AtCDT1a/b et ATXR5/6." Paris 11, 2005. http://www.theses.fr/2005PA112087.

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Les plastes sont des organites indispensables à la survie des cellules végétales. Ils dérivent d'un évènement d'endosymbiose entre une cellule hôte et une bactérie, sans doute proche des cyanobactéries actuelles. De ce fait, les cellules ne les synthétisent pas de novo : ils se multiplient par fission binaire, grâce à un échaffaudage protéique complexe appelé anneau de division des plastes. A chaque mitose, le nombre de plastes est divisé par deux. De plus, il existe dans les cellules de parenchyme, une corrélation nette entre la taille et la ploidie de la cellule, et le nombre de plastes qu'elle contient. Il paraît donc vraisemblable qu'il existe un couplage entre la division des plastes et prolifération cellulaire d'une part, et division des plastes et endoréplication d'autre part. Au cours de ma thèse, j'ai cherché à vérifier cette hypothèse par une approche gène candidat chez Arabidopsis. Nous avons combiné deux approches : la recherche d'homologues de régulateurs de la division bactérienne dans le génome d'Arabidopsis, et l'étude de gènes déjà connus pour réguler le cycle cellulaire et présentant des signaux d'adressage aux plastes. La première approche nous a permis d'identifier une nouvelle protéine participant à la division des plastes. La seconde nous a permis d'aboutir à la conclusion qu'il existe bien un couplage entre division des plastes et cycle cellulaire, et qu'il se situe au moment de l'initiation de la réplication de l'ADN nucléaire, ce qui permet d'expliquer à la fois le maintien du nombre de plastes dans des cellules en prolifération, et l'augmentation du nombre de plastes au cours de l'endoréplication
Plastids are indispensable to plant cell survival because a large number of metabolic pathways take place in them. These organelles originated from an endosymbiosis between a host cell and a cyanobacteria. Therefore, plants do not synthetise plastids de novo : they proliferate by binary fission. The mechanism of plastid division is closely related to that of bacterial cell division but its regulation is poorly understood. Mitosis results in a two-fold decrease in plastid number. Moreover, plastid number in mesophyll cells correlates with cell size and cell ploidy. Plastid division and cell cycle are thus likely to be coordinated. To investigate this, and to analyse the underlying molecular mechanism, we caracterised the function of three Arabidopsis genes. The first was chosen on the basis of its sequence similarity with a bacterial cell division inhibitor. The others were analysed because they are known to play a role in cell cycle regulation, and harbour plastid targeting sequences. The first approach allowed us to identify a new plastid division protein. The second led us to the conclusion that cell cycle and plastid division are indeed coordinated, and that the link between the two processes could occur at the G1/S transition. This hypothesis accounts both for the maintain of plastid number in proliferating cells, and for the increase in plastid number in endoreduplicating cells

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Lengronne, Armelle. "Dynamique de la réplication et instabilité du génome chez la levure S. Cerevisiae en l'abscence de l'inhibiteur de CDKs, Sic1p." Paris 11, 2002. http://www.theses.fr/2002PA112087.

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La protéine Sic1p appartient à la famille des CKI (Cyclin-Dependent-Kinase Inhibitor), de même que p21/Cip1 ou p27/Kip1 chez les cellules de mammifères, et est exprimé de la fin de la mitose à la fin de la phase G1 du cycle cellulaire chez la levure S. Cerevisiae. Le but majeur de ma thèse était de comprendre l'origine de l'instabilité génétique observée dans les cellules dépourvues de Sic1p. Ces cellules présentent une chute de la viabilité, une augmentation de la perte de chromosomes et sont retardées dans le cycle au cours de la mitose. Des travaux réalisés au laboratoire suggéraient que les mutants sic1d préparaient à chaque cycle un nombre insuffisant d'origines de réplication compétentes pour la phase S. Dans la première partie de ma thèse, afin d'étudier d'éventuels défauts de réplication chez les mutants sic1d, j'ai développé un ensemble de techniques moléculaires, électrophorétiques et microscopiques, fondées sur l'incorporation de BrdU et permettant de mesurer précisément la progression de la phase chez la levure. Dans la seconde partie de ma thèse, en utilisant ces techniques, j'ai montré que les cellules sic1d (1) initient la réplication à partir d'un nombre restreint d'origines, (2) ont une phase S allongée et (3) séparent inefficacement leurs chromatides soeurs pendant l'anaphase. De façon surprenante, les cellules sic1d ne sont pas arrêtées en métaphase comme attendu si le checkpoint S/M avait été activé pour permettre la duplication complète des chromosomes. Enfin, j'ai montré que les mutants sic1d ont une fréquence de réarrangements chromosomiques 600 fois supérieure à celle de cellules sauvages, résultant probablement de l'entrée inappropriée en anaphase. Nous proposons que l'activation précoce des CDKs entraîne une instabilité génétique en altérant la dynamique de réplication qui alors perturbe la ségrégation normale des chromosomes
Sic1p belongs to the CKI family (Cyclin-Dependent-Kinase Inhibitor), like p21 or p27 in mammalian cells, and is expressed from the end of mitosis to the end of G1 phase of the cell cycle in the budding yeast S. Cerevisiae. One of the main goals of my thesis was to gain a better understanding of the molecular basis of the genomic instability observed in cells lacking the SIC1 gene. These strains show a decrease in viability, an increase of chromosome loss and are delayed in mitosis. Previous work in the laboratory had suggested, based on genetic evidences, that sic1 mutants suffer from a reduction in the number of competent replication origins. In the first part of my thesis, to better characterize potential replication defects of sic1 strains, I have developed a set of molecular, electrophoretic and microscopic techniques that allow precise monitoring of S phase progression in yeast cells using BrdU incorporation. In the second part of my thesis, using these techniques, I showed that cells lacking Sic1 initiate DNA replication from fewer origins, have an extended S phase and inefficiently separate sister chromatids during anaphase. To our surprise, sic1d cells were not retarted at metaphase as expected if the S/M checkpoint were triggered to allow completion of replication before mitosis. Sic1d mutants show a 600-fold increase in the frequency of gross chromosomal rearrangements, probably as a consequence of inappropriate entry into anaphase. We propose that precocious CDK activation causes genomic instability by altering the dynamics of S phase which then hinders normal chromosome segregation

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Ravel-Chapuis, Patrick. "Réplication et plasticité de l'ADN chloroplastique et organisation des ADNr nucléaires de l'euglène." Lyon 1, 1988. http://www.theses.fr/1988LYO10026.

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Origine de replication de l'adn chloroplastique chez e. Gracilis, mise en evidence de remaniements dans la region ribosomique chloroplastique; organisation de la replication des adn ribosomiques nucleaire

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Meister, Peter. "Usines de réplication et de réparation de l'ADN chez la levure Schizosaccharomyces pombe." Paris 11, 2004. http://www.theses.fr/2004PA112124.

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En présence de lésions double-brin sur l'ADN, les mécanismes de signalisation et de réparation des cassures sont activés. Cette activation se traduit par la formation de structures sub-nucléaires rassemblant les cassures, les facteurs de réparation et de signalisation des dommages. Dans l'organisme modèle Schizosaccharomyces pombe, nous avons utilisé les techniques de microscopie de fluorescence in vivo et des protéines de fusion fluorescentes pour mettre en évidence ces structures. Dans une première étude, nous avons montré que les facteurs de signalisation des dommages et de réparation des cassures double brin colocalisent après induction de cassures double-brin par irradiation gamma. Ces " foci " ou " usines " colocalisent également partiellement avec PCNA, un facteur ubiquitaire de réparation et de réplication de l'ADN. La levure fissipare permettant une analyse génétique aisée, nous avons également étudié la génétique de la formation de ces usines. Dans une seconde étude, nous nous sommes intéressés à la relation entre réplication et recombinaison lors du blocage des fourches de réplication par déplétion du réservoir de désoxyribonucléotides. L'approche adoptée est basée sur l'utilisation des souches permettant d'observer in vivo simultanément un facteur de recombinaison et un facteur de réplication. Nous avons montré que lorsque les fourches sont bloquées, l'absence du système de surveillance de la structure de l'ADN (checkpoint) intra-S induit l'apparition d'usines de recombinaison. De plus, dans des souches sauvages, nous montrons également que suite à un blocage des fourches, la recombinaison est retardée jusqu'à l'achèvement de la phase S par ce même système de surveillance. Enfin, il semble que la recombinaison induite par l'absence de checkpoint de phase S en absence de nucléotides conduise au moins partiellement à des remaniements de la fourche de réplication et à son inactivation. La troisième étude présentée ici concerne l'organisation spatio-temporelle de la réplication de l'ADN chez S, pombe. Lors de la phase S, PCNA forme de foci subnucléaires. Nous montrons pour la première fois in vivo dans un organisme unicellulaire que ces foci sont des usines de réplication (rassemblement de plusieurs fourches de réplication), Ces usines de réplication présentent une organisation reproductible dans le temps et l'espace intranucléaire. Enfin, nous analysons la dynamique de ces usines, ainsi que l'effet de mutations du checkpoint de phase S sur l'organisation de la réplication de l'ADN
When double-strand breaks are detected on DNA, signaling and repair processes are activated. Activation can be visualized in vivo following the formation of sub-nuclear structures composed of DNA ends, repair and signaling factors. In the model organism Schizosaccharomyces pombe, we revealed these structures in vivo, using fluorescence microscopy and fluorescent fusion proteins. In a first study, we show that signaling factors colocalise with repair factors after induction of DSBs by gamma irradiation. Moreover, these "foci" or "factories" colocalise partially with PCNA, a ubiquitous DNA repair and replication factor. Taking advantage of fission yeast easy genetic analysis, we also studied the genetic determinant of factories formation. In a second study, we were interested by the relationship between replication and recombination after-replication forks blockage by depletion of the desoxyribonucleotides pool. The study is based on strains allowing simultaneous visualization of a replication and a recombination factor. We show that in the presence of replication fork blocks, lack of intra-S phase checkpoint induces appearance of recombination foci. Moreover, in wild-type cells, the intra-S checkpoint delays recombination till replication is almost complete following replication forks blockage. Finally, recombination induced by the absence of intra-S checkpoint in the absence of nucleotides seems to be at least partially responsible for replication fork collapse. In the third study presented here, we describe the spatial and temporal organization of DNA replication in S. Pombe. During S-phase, PCNA forms sub-nuclear foci. We show for the first time in vivo in a unicellular organism that these foci are replication factories (clusters of replication forks). These replication factories display reproducible temporal and spatial organization. Finally, we analyze the dynamics of these factories, as well as the effects of deleting components of the intra-S checkpoint on the organization of DNA replication

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Becherel, Olivier J. "Trafic d'ADN polymérases lors de la réplication de l'ADN endommagé chez Escherichia coli." Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 2001. http://www.theses.fr/2001STR13143.

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Bigot, Sarah. "Trafic de l'ADN dans la bactérie : rôles de l'ADN translocase FtsK d'Escherichia coli." Toulouse 3, 2006. http://www.theses.fr/2006TOU30105.

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Chez Escherichia coli, l’ADN translocase FtsK transporte l’ADN de part et d’autre du site de division de la bactérie et active la recombinaison effectuée par les recombinases XerCD au niveau d’un site spécifique sur le chromosome, appelé dif. Ceci assure une distribution equitable du materiel génétique et une intégrité topologique entre les deux cellules filles au cours des étapes tardives de ségregation. Nous avons montré que les fonctions de transport de l’ADN et d’activation de la recombinaison sont génétiquement séparables. Nous avons également montrés que le transport de l’AND par FtsK est orienté par de courtes sequences asymétriques de 8 pb (KOPS) don’t l’orientation et la distribution sont biases sur le chromosome d’E. Coli. Ces KOPS permettent également le chragement de FtsK sur l’ADN et la translocation est orientée à cette étape
In Escherichia coli, the ATP-dependent DNA translocase FtsK transports DNA across the site of cell division and activates recombination by the XerCD recombinases at a specific site on the E. Coli chromosome, dif, to ensure the equal distribution of the genetic material and the topological integrity of daughter chromosomes during the last stages of chromosome segregation. We showed that DNA mobilization and Xer recombination activation, two functions required to resolve dimers, are genetically separable. We have also shown that DNA transport by FtsK is oriented by 8 bp asymmetric sequences (“KOPS”) displaying a biased orientation and distribution on the E. Coli chromosome and that KOPS promote FtsK loading on DNA and that translocation is oriented at this step

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NELSON, ISABELLE. "Etude de l'organisation de l'adn mitochondrial dans les pathologies neuromusculaires." Rennes 1, 1991. http://www.theses.fr/1991REN10073.

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Анотація:

L'apport energetique cellulaire est essentiellement assure par la phosphorylation oxydative, dans les mitochondries. Il a ete demontre recemment que le genome mitochondrial humain, present en plusieurs centaines de copies par cellule, pouvait etre altere par des mutations, notamment des deletions dans le syndrome de kearns-sayre. Nous avons pu montrer chez les patients presentant un syndrome de kearns-sayre que la taille et la position des deletions sur le genome mitochondrial varient d'un individu a l'autre mais qu'elles sont identiques au sein d'un meme patient. Le sequencage des jonctions des molecules deletees suggere l'existence de plusieurs mecanismes pouvant entrainer la formation de la deletion. Nous avons aussi recherche la mutation decrite en position 11778 de l'adnmt chez des patients atteints de la maladie de leber. La mutation a ete retrouvee chez 23 individus sur 32 analysees, de maniere heteroplasmique. La mutation est transmise de maniere maternelle, toutefois elle est presente chez des cas asymptomatiques, indiquant que la mutation est une conditions necessaire mais non suffisante a l'apparition du phenotype. L'ensemble de ces travaux montrent le role critique du genome mitochondrial dans le metabolisme energetique cellulaire, en particulier dans ces pathologies ou il y a coexistence de populations differentes d'adnmt. L'intervention de facteurs nucleaires dans l'etablissement du genotype et du phenotype reste a demontrer

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Barome, Pierre-Olivier. "Phylogeographie du genre acomys (rodentia, muridae) fondee sur l'adn mitochondrial." Paris 11, 1998. http://www.theses.fr/1998PA112350.

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Анотація:

Les relations phylogenetiques a l'interieur du genre acomys (rodentia, muridae) ont ete inferees a partir des sequences de deux marqueurs mitochondriaux, le gene du cytochrome b et la zone non-codante. Les deux analyses fournissent la meme phylogenie, dont la topologie est soutenue de facon robuste par differents algorithmes de reconstruction. Cette phylogenie apporte des elements de reponse a plusieurs problemes taxinomiques, la systematique au sein du genre etant particulierement controversee. La proximite phylogenetique des specimens d'acomys presents en crete et a chypre avec l'espece type a. Cahirinus d'egypte suggere leur appartenance a cette derniere. L'ancien complexe cahirinus-dimidiatus, regroupant par defaut des formes morphologiquement tres proches, est redefini de facon positive comme etant le clade forme par les especes nees de la radiation evolutive datee de la fin du pliocene. Le scenario biogeographique propose pour la dispersion d'acomys dans sa vaste aire de repartition actuelle comprend six phases chronologiques, du miocene moyen a l'antiquite. Les cinq premieres vagues de migration partent du centre d'origine du genre situe en afrique orientale. La premiere part vers le sud du continent au miocene moyen et donne naissance a a. Subspinosus et a. Spinosissimus. S'individualisent ensuite au miocene superieur les lignees a. Russatus vers le proche-orient et a. Wilsoni en afrique de l'est, suivies de celle d'a. Ignitus a la limite miocene-pliocene, qui reste egalement en afrique de l'est. La radiation du groupe cahirinus-dimidiatus sensu cyt b debute vers la fin du pliocene avec le depart d'a. Dimidiatus vers la peninsule arabique et d'une autre lignee vers l'afrique de l'ouest, ancetre des especes actuelles de cette region (a. Johannis, a. Gautuni). Peu apres, une seconde vague de migration se produit dans les memes directions, a. Airensis se dirigeant vers l'ouest et a. Cahirinus vers le nord, l'ouverture de la mer rouge lui interdisant cependant l'acces a la peninsule arabique. La sixieme et derniere phase du scenario est beaucoup plus recente, c'est la dispersion d'acomys par l'homme en mediterranee. L'ensemble de ce scenario montre que le traditionnel regroupement des especes en fonction de leur aire geographique actuelle est souvent errone.

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Reynier, Pascal. "Etude des délétions de l'ADN mitochondrial dans diverses maladies musculaires." Aix-Marseille 2, 1995. http://www.theses.fr/1995AIX22061.

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La coexistence de differents variants de l'adnmt dans le tissu musculaire est un phenomene frequent, du en partie, a l'accumulation de mutations tout au long de la vie. Les deletions multiples de l'adnmt sont bien mises en evidence grace aux techniques de longue pcr (8,7 a 16,5 kb), qui permettent en outre de visualiser et de quantifier les genomes mitochondriaux non affectes par des deletions. Le dosage de la deletion commune de 4 977 pb est probablement insuffisant pour apprecier l'instabilite du genome mitochondrial. Nous montrons qu'une quantification plus exhaustive des differents variants pourrait permettre de mieux expliquer le dysfonctionnement mitochondrial que l'on observe dans les maladies degeneratives ou lors du vieillissement. Notre etude a principalement portee sur le muscle squelettique de sujets ages et de sujets presentant une myopathie associee a une forme particuliere de rhumatisme du sujet age, ainsi que sur le myocarde de patients presentant une myocardiopathie dilatee. Nous rapportons en outre, la coexistence de deux types de mutations deleteres de l'adnmt dans le muscle d'une patiente porteuse d'une cytopathie mitochondriale a expression oculaire. Nous discutons enfin, de l'interet d'explorer le genome mitochondrial dans son ensemble en montrant que son apparente simplicite (genome de faible taille, bien caracterise et redondant) masque en realite une tres large heterogeneite moleculaire

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Ducoux, Manuelle. "Caractérisation de p66, sous-unité C de l'ADN polymérase delta de mammifère." Paris 5, 2002. http://www.theses.fr/2002PA05S003.

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La polymérase delta (pol delta) chez les eucaryotes est une enzyme majeure impliquée dans la réplication de l'ADN lors de la phase S, et dont l'activité est fortement stimulée par le PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen). La pol delta de "Schizosaccharomyces pombe" comprend quatre sous-unités (A, B, C et D) alors que chez "Saccharomyces cerevisiae", elle en contient trois (A, B et C). Chez les deux levures, la sous-unité C fait le lien entre le PCNA et la pol delta, et la stimulation par le PCNA de l'activité de la polymérase dépend de sa présence. Au début de notre travail, le complexe pol delta isolé chez différents mammifères ne comportait que les sous-unité A et B. .
In eukaryotes, DNA polymerase delta (pol delta) is a major enzyme implicated in DNA replication during S phase and whose activity is strongly stimulated by PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen). In "Schizosaccharomyces pombe", pol delta is composed of four subunits (A, B, C and D), whereas only three subunits are found in "Saccharomyces cerevisiae" (A, B and C). In both organisms, the C-subunit is the link between pol delta and PCNA and is responsible for the PCNA-stimulation of the polymerase activity. Prior to our work, only the A and B-subunits of pol delta complex had been isolated from several mammalian species. .

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Rouillon, Christophe. "La réplication de l'ADN chez l'euryarchaea pyrococcus abyssi : mise en place et dynamique du complexe." Rennes 1, 2006. http://www.theses.fr/2006REN1S066.

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La réplication de l'ADN se fait par le biais d'un complexe protéique appelé réplisome. La compréhension des aspects structuraux et dynamique nécessite sa reconstitution in vitro à partir des sous-unités individuelles. Chez tous les organismes vivants, la phase d'élongation de l'ADN, effectuée par les ADN polymérases, met en jeu un facteur de processivité (PCNA) qui est chargé sur l'ADN par un facteur de chargement (RF-C). Généralement, les protéines des archées, impliquées dans la réplication de l'ADN, ont plus de similitudes avec leurs homologues eucaryotes que bactériens. L'étude présentée ici a porté sur les mécanisme de chargement du PCNA et de la synthèse d'ADN chez l'Euryarchaea hyperthermophile Pyrococcus abyssi. Afin de mieux cerner certaines interactions protéine-protéine et protéine-ADN, des versions mutantes du PCNA et des ADN polymérases (Pol B et Pol D) ont été produites. Il a été montré que le PCNA est capable de se charger spontanément sur l'ADN ; ce chargement est stimulé par le RF-C mais également par la Pol B qui stabilise son facteur de processivité par un motif essentiel. D'un autre côté, le complexe PCNA/Pol B est déstabilisé en présence d'ARN et de dNTPs. De plus, il a été montré que la Pol D présente plus d'un motif de liaison au PCNA. Malgré ce motif additionnel, la Pol D est déplacé du PCNA par la Pol B. Ces résultats, couplés à ceux précédemment obtenus, permettent de proposer un modèle moléculaire dynamique de la fourche de réplication pour le phylum Euryarchaea.

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Huvet, Maxime. "Rôle de la réplication dans l'évolution et l'organisation du génome humain." Paris 7, 2008. http://www.theses.fr/2008PA077032.

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Bien que la position des gènes soit généralement considérée comme aléatoire dans les génomes eucaryotes, des groupes de gènes co-exprimés ont été mis en évidence pour divers organismes. Cependant, l'importance de ces groupes est controversée chez l'homme. Notre objectif est d'analyser l'organisation des gènes en fonction de leur distance aux origines de réplication. Nous nous sommes appuyés sur des résultats montrant l'existence d'un biais de composition nucléotidique réplicatif. Nous avons développé une méthode d'analyse multi-échelles du profil de biais de composition, basée sur la transformée en ondelettes. Un tiers du profil de biais humain est constitué de structures remarquables, les N-domaines, caractérisées par une paire de sauts ascendants (origines de réplication potentielles) encadrant un segment linéaire décroissant. Ces structures semblent avoir été conservées chez les mammifères et les oiseaux. L'analyse de données de chronologie de réplication confirme que les bords des N-domaines sont répliqués plus précocement que le centre. Autour de ces origines, les gènes sont nombreux, exprimés dans un grand nombre de tissus et co-orientées au sens de propagation des fourches de réplication. Ces caractéristiques diminuent avec la distance à l'origine. Cette organisation spécifique résulterait de contraintes sur l'initiation de la réplication et de la transcription, et de la minimisation de collision frontale entre ADN et ARN polymérases. Nos résultats permettent de proposer un nouveau modèle d'organisation des gènes chez l'homme, dans lequel la transcription, la réplication et la structure chromatinienne agissent de façon coordonnée sur l'architecture des génomes
Although genes are generally considered as randomly positioned in the genome, clusters of co-expressed genes have been identified in many organisms, from yeast to human. However, in human, the importance of these clusters is controversial. Our goal is to study human gene organisation according to replication origins. For this purpose, we based our study on previous results showing the existence of a nucleotide compositional asymmetry associated with replication. We developed a multi-scale methodology using the wavelet transform to analyse the profile of compositional asymmetries in the human genome. In one third of the genome, the skew profile is composed of structures, named N-domains, characterised by a pair of upward jumps framing a linearly decreasing segment. These jumps are associated with putative replication origins. These structures seem to have been conserved, during evolution, in mammals and birds. Analysis of replication timing data shows that in most cases, the N-domain borders are associated with replication initiation sites active in the early S phase. Around these origins, genes are abundant, broadly expressed, and co-orientated with the replication fork orientation. These properties decrease progressively with the distance to the closest putative origin. In the centre of N-domains, genes are rare and expressed in few tissues. This organisation likely results from constraints to reduce head-on collisions between the DNA and RNA polymerases. Our findings provide a new model of gene organisation in the human genome, which integrates transcription, replication, and chromatin structure as coordinated determinants of genome architecture

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Humbert, Catherine. "Exploration in situ de la réplication de l'ADN dans le noyau de cellule eucaryote." Grenoble 1, 1992. http://www.theses.fr/1992GRE10011.

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Ces travaux s'inscrivent dans le contexte de l'etude in situ des mecanismes de la replication de l'adn, plus precisement dans le cadre d'une analyse topographique de marqueurs specifiques (brdurd, pcna. . . ) pour la localisation intranucleaire des evenements intervenant au cours de la phase s d'une cellule eucaryote. Le double marquage adn/brdurd a ete optimise pour la cytometrie par analyse d'images. La revelation de l'adn en synthese par incorporation de brdurd et immunofluorescence revele une variete internucleaire de distribution des sites de replication. Ces facies de replication varient au cours de la phase s. L'utilisation d'une approche quantitative basee sur l'analyse spectrale des images (transformee de fourier) associes a un outil de classification automatique, nous a permis de valider de facon objective la sequence de ces facies. La sequence ainsi definie s'est averee correlee a la quantite d'adn mesuree dans les noyaux. Nous avons mis au point des parametres topographiques pour caracteriser la proportion, la localisation moyenne et son heterogeneite, de trois classes d'activite de replication. Les parametres calcules sont independants de la surface du noyau et de l'intensite de fluorescence. De plus, ils sont directement interpretables par reference a l'experience visuelle du cytologiste. Nous avons ainsi montre que chaque instant de la phase s du cycle cellulaire se caracterise par un facies de replication de l'adn. Les principales variations de distribution des sites de replication au cours de la phase s concernent la taille des sites (petits au debut et larges a la fin), et leur localisation (nucleoplasmique au debut et au milieu; perinucleaire et perinucleolaire ensuite; et principalement perinucleaire a la fin de la phase s). L'evolution de ce facies offre un fil conducteur utile pour ordonner dans le temps les evenements qui marquent la replication de l'adn. Enfin, pour replacer l'etude topographique dans le contexte proteique implique dans le processus de la replication de l'adn, nous avons associe le marquage brdurd au marquage d'une proteine du complexe de replication, le pcna. La visualisation simultanee de ces deux marqueurs, au moyen de la microscopie confocale a balayage laser, nous a permis de suivre cellule a cellule une enzyme du complexe de replication et le produit de la reaction de ce complexe proteique: l'adn nouvellement synthetise

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Filée, Jonathan. "Phylogénie moléculaire des gènes viraux impliqués dans le métabolisme et la réplication de l'ADN." Paris 11, 2002. http://www.theses.fr/2002PA112324.

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Un faisceau de preuves tend à démontrer que les virus sont des éléments génétiques très anciens, d'une origine probablement antérieure à la divergence des trois domaines du vivant. Cette longue histoire suggère fortement que les virus aient pu jouer un rôle important dans l'évolution de leurs hôtes. Cette hypothèse est particulièrement pertinente en ce qui concerne les gènes viraux ayant des homologues cellulaires et soulève la question de leur relation phylogénétique. Les génomes viraux codent pour diverses enzymes impliquées dans le métabolisme et la réplication de l'ADN. Les gènes correspondants sont très souvent phylogénétiquement éloignés de ceux de leurs hôtes; par contre, quand ils sont étroitement apparentés, souvent, l'explication la plus probable indique que le gène cellulaire est d'origine virale. La situation est particulièrement intéressante dans le cas des mitochondries, où au moins trois enzymes cellulaires auraient été remplacées par des contre parties virales. Ces propositions s'inscrivent dans la problématique plus générale de l'évolution et de l'origine des enzymes informationnelles. Nous montrons que les répartitions phylogénétiques de ces enzymes ne supportent pas l'hypothèse d'une double invention de l'ADN: une dans la lignée des Archéobactéries/Eucaryotes et une dans la lignée des Bactéries. Pour rendre compte de ces répartitions, il est plus vraisemblable d'imaginer de nombreux évènements de transferts horizontaux de gènes entre les trois domaines cellulaires du vivant, et entre cellule et virus, suivis, ou non, du remplacement non-homologue du gène initialement présent. Ces travaux posent aussi clairement l'importance de l'échantillonnage de séquences utilisé: une meilleure connaissance de la biodiversité des virus et des êtres cellulaires pourra sans aucun doute éclaircir les points encore en suspens à l'issue de ce travail.

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Menezes, Braganca Nikita. "Cartographie pangénomique à haut débit et en molécule unique de la réplication de l'ADN." Electronic Thesis or Diss., Paris Sciences et Lettres (ComUE), 2019. http://www.theses.fr/2019PSLEE040.

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La réplication de l'ADN est un processus vital qui assure la transmission l'information génétique aux cellules filles. Chez les eucaryotes, la réplication du génome s'effectue en utilisant de multiples origines de réplication. Chez les métazoaires, la cartographie de la réplication demeure difficile. Les cartographies pangénomiques des origines de réplication chez l’Homme réalisées à l'aide de techniques de séquençage, ne s’accordent que modérément. Une explication possible de ces incohérences est que ces approches utilisent de grandes populations cellulaires qui ne nous donne qu’une image moyenne de la réplication. Ainsi, pour mieux comprendre la réplication de l'ADN et accéder à cette variabilité inter-cellulaire, il est fondamental de développer des techniques en molécule unique telle que le peignage moléculaire. Cependant, cette dernière est réfractaire à l'automatisation et empêche l'analyse pangénomique de la réplication. Pour surmonter ces obstacles, nous avons ré-employé un dispositif de cartographie optique basé sur de la microfluidique, le système Bionano Genomics Irys, pour le High Throughput Optical MApping of Replicating DNA (HOMARD). Typiquement, pour un “run”, nous recueillons plus de 34 000 images et plus de 63 000 Mpb d'ADN. Nos nouveaux outils open source, qui ont nécessité l'adaptation du logiciel propriétaire fourni, nous permettent de visualiser simultanément les profils d'intensité de l’ensemble des molécules d'ADN cartographiées, de vérifier la qualité de la cartographie réalisée et, en particulier, de voir où sont situés les segments répliqués au niveau du génome en molécule unique. Nous démontrons la robustesse de notre approche en fournissant, avec une couverture sans précédent (23 311 x), une carte de la réplication de l'ADN bactériophage dupliqué dans des extraits d'œufs Xenopus et mettons en évidence le potentiel du système Irys pour l’étude de la réplication de l'ADN et autres études de génomiques fonctionnelles, en plus de son utilisation standard
DNA replication is a vital process ensuring accurate conveyance of the genetic information to the daughter cells. In eukaryotic organisms, genome replication is carried out by using multiple start sites, also known as replication origins. In metazoans, the mapping of replication remains challenging. Genome wide mapping of human replication origins performed using sequencing techniques only modestly agree. These existing genome wide approaches use large cell populations that smooth out variability between chromosomal copies that could explain this inconsistency. Thus, to get a better understanding of DNA replication and to uncover the cell-to-cell variability, the development of single molecule techniques is fundamental. DNA combing, a widespread technique used to map DNA replication at a single molecule level, is refractory to automation, forestalling genome-wide analysis. To overcome these impediments, we repurposed an optical DNA mapping device based on microfluidics, the Bionano Genomics Irys system, for High-throughput Optical MApping of Replicating DNA (HOMARD). We typically collect, for a single run, over 34 000 images and more than 63 000 Mbp of DNA. Our new open source tools, that required the adaptation of the provided proprietary software, empower us to simultaneously visualize the intensity profiles of all mapped DNA molecules, check the optical mapping performed and, in particular, see where the replication tracks are located genome-wide at a single molecule level. We demonstrate the robustness of our approach by providing an ultra-high coverage (23,311 x) replication map of bacteriophage DNA in Xenopus egg extracts and the potential of the Irys system for DNA replication and other functional genomic studies apart from its standard use

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Kieffer, Kyong-Rim. "Stimulation de la réparation de l'ADN par des activateurs de la transcription." Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 2002. http://www.theses.fr/2002STR13085.

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Les gènes eucaryotes sont organisés, grâce aux protéines d'histones, en une structure appelée la chromatine. La compaction de l'ADN au sein de la chromatine permet non seulement à l'ensemble du génome d'être contenu dans un noyau cellulaire mais également de restreindre l'accès de cette ADN à une multitude de protéines de régulation impliquées dans des processus essentiels tel que la réplication, la transcription ou la recombinaison. La chromatine adopte une structure dynamique capable localement de se condenser ou de se décondenser, c'est-à-dire capable de se remodeler en réponse à des signaux spécifiques. Le remodelage de la chromatine nécessite un ensemble d'enzymes spécifiques qui agit au niveau du nucléosome, unité de base de la chromatine. Ce travail montre d'une part que les processus de réparation de l'ADN sont également entravés par une structure condensée de la chromatine et d'autre part, que les enzymes de remodelage de la chromatine sont nécessaires pour permettre une fonctionnalité optimale des processus de réparation de l'ADN. L'action des enzymes de remodelage est gérée par des activateurs de la transcription, qui facilitent et stimule la réparation dans les régions promotrices des gènes. Cette stimulation est totalement indépendante des machineries d'initiation et d'élongation de la transcription et ce malgré le fait que tous ces processus coexistent. En effet des activateurs inactifs sur la transcription sont tout de même aptes à stimuler les processus de réparation de l'ADN. Il est probable que la fonction des activateurs soit double. Ils permettent une décondensation locale de la chromatine, phénomène commun à tous processus génomiques et en parallèle ou séquentiellement voir de manière coopérative recrutent les facteurs spécifiques impliqués dans la transcription, la réparation de l'ADN ou la réplication
Eukaryotic genes are contained within a higher order complex of DNA and histones called chromatin. Although packaging of DNA into chromatin provides the means for compaction of the entire genome to fit in the nucleus, it restricts the access of the many regulatory proteins required for essential biological processes such as DNA replication, transcription, and recombination. The chromatin, however, is not a static structure, but rather a dynamic assembly that condenses and decondenses (remodeling) in response to specific signals during cell life. Chromatin remodeling requires a specific set of enzymes that modify the nucleosome, the building block of chromatin. These enzymes fall into two classes: the first includes ATP-dependent chromatin remodeling activities that use energy derived from ATP hydrolysis to alter nucleosomal structure and/or arrangement, whereas the second class includes enzymes that add acetyl groups to the histone N termini. This thesis has described that DNA repair is also hindered by chromatin structure and requires a subset of chromatin remodeling enzymes from each class to optimally occur. In the promoter region, chromatin remodeling enzymes are dictated by sequence-specific activators, resulting in facilitated damage removal in the proximity of transcription initiation site. The mechanism of this preferential repair is independent of transcription machinery and transcription per se, although two events pass on the same template. Furthermore, transcriptionally inactive activator accomplishes the stimulation of repair by binding to its cognate sequences. It is likely that the function of activators is dual : (i) they help to derepress chromatin, a step common to DNA processes, (ii) in parallel or subsequently, and possibly in a cooperative manner according to activities demanded by the surrounding DNA, they recruit specific factors involved in transcription, DNA repair or replication

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Platel, Marie. "Régulation du programme spatio-temporel de la réplication de l'ADN lors du développement précoce du Xénope." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2015. http://www.theses.fr/2015SACLS043.

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Chez les eucaryotes supérieurs, la réplication de l'ADN est initiée à partir de plusieurs milliers d'origines. Mais la régulation spatio-temporelle de leur activation reste mal caractérisée. Une voie de contrôle (checkpoint) de la phase S est activée lorsque les fourches de réplication sont bloquées, inhibant ainsi l'activation d'origines tardives. L'objectif de ma thèse consistait à étudier deux facteurs essentiels dans le programme spatio-temporel de la réplication, dans le système du xénope : la protéine « checkpoint » Chk1, qui est un facteur inhibiteur de l'activation des origines, et les désoxyribonucléotides (dNTPs), précurseurs de la synthèse de l'ADN. Chez le xénope, après douze divisions embryonnaires, a lieu la transition mid-blastuléenne (MBT). A cette étape, une augmentation du ratio nucléo-cytosolique va entrainer la titration des facteurs de réplication, ce qui active le point de contrôle et ralentit la phase S. Il est possible de mimer in vitro les phases S rapides des embryons pendant le développement précoce en augmentant la concentration en noyaux dans l'extrait d'œufs.Nous avons pu voir par l'inhibition, la déplétion ou la surexpression de Chk1 que cette protéine régulait l'activation des origines lors d'un stress, mais également dans une phase S non perturbée, grâce à la technique du peignage moléculaire. Ce résultat montre que le niveau de Chk1 doit être finement régulé pour permettre une réplication correcte dans une phase S non perturbée, chez les eucaryotes supérieurs. Nous avons ensuite cherché à savoir si la concentration en dNTPs pouvait être limitante pendant le développement et comment elle modulait le programme de réplication. Nous avons comparé l'effet de l'ajout de dNTPs sur la réplication en mimant plusieurs stades précoces du développement pré-MBT. La variation de la concentration en dNTPs agit sur la réplication en augmentant à la fois l'activation des origines et, en fonction de la concentration en noyaux, aussi la vitesse des fourches. Cet effet est indépendant du checkpoint de la réplication dans ce système et d'autres études sont nécessaires pour comprendre les mécanismes moléculaires
DNA replication in higher eukaryotes initiates at thousands of origins according to a spatio-temporal regulation program which is not well characterized. The S phase checkpoint is activated when replication forks are blocked which inhibits the firing of late origins. The aim of my thesis consisted to study two essentials factors in spatio-temporal replication program in Xenopus system: the checkpoint protein Chk1, inhibitor of origin activation, and the deoxyribonucleotides (dNTPs), DNA synthesis precursors. In Xenopus, the mid-blastula transition (MBT) occurs after twelve embryonic divisions. An increase of the nucleo-cytosolic ratio induces a titration of replication factors, that activates the checkpoint and slows down the S phase. It is possible to mimic in vitro the rapid S phases of early Xenopus development stages by increasing the nuclei concentration. By DNA combing combined with Chk1 inhibition, depletion and overexpression experiments, we show that Chk1 controls origins activation in perturbed but also unperturbed S phase. My results show that Chk1 levels needs to be tightly regulated in order to properly control the replication program during normal S phase in higher eukaryotes. In order to determine whether the concentration of dNTPs could be another limiting replication factor, we compared the effect of dNTPs addition on replication by mimicking in vitro several early stages of pre-MBT development. Addition of dNTPs affects DNA replication, by increasing origin activation and, dependent on nuclei concentration, also the fork speed. This effect is independent of the S phase checkpoint and further studies are needed in order to understand the molecular mechanisms behind

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Barthélémy, Cyrille. "Variations spontanées et induites du nombre de copies de l'ADN mitochondrial." Paris 7, 2001. http://www.theses.fr/2001PA077125.

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Goullet, de Rugy Théo. "Etude de l'effondrement rapide des fourches de réplication lors d'un stress réplicatif." Thesis, Toulouse 3, 2016. http://www.theses.fr/2016TOU30238.

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Le Stress Réplicatif est caractérisé par une accumulation de fourches bloquées et est connu pour être une source majeure d'instabilité génétique dans les cellules humaines. Le Stress Réplicatif et l'instabilité génétique sont des marqueurs précoces de la tumorigenèse. Il est connu que les fourches de réplication bloquées peuvent dégénérer en cassures double brin. En effet, après un stress réplicatif prolongé (24h) induit par l'hydroxyurée (HU), l'endonucléase MUS81-EME1 peut promouvoir l'effondrement des fourches de réplication. Cette endonucléase prévient l'accumulation de régions sous-répliquées en G2 et des défauts de ségrégation chromosomique en mitose. Dans cette étude, en suivant l'apparition de cassures double brin (CDB) par les techniques sensibles d'essai comète neutre et de QIBC (Quantitative Image-Based Cytometry), nous avons pu mettre en évidence que l'effondrement des fourches est un événement qui peut être visualisé rapidement suite au stress réplicatif (dès 2h après HU). Nous avons pu caractériser cet effondrement rapide comme étant un mécanisme indépendant de MUS81, sous unité catalytique du complexe MUS81-EME1. De plus, en réalisant des extinctions de l'expression de gènes par siARN, nous avons identifié deux nucléases, Artémis et XPF, comme étant impliquées dans ce mécanisme d'effondrement rapide des fourches de réplication. Nos résultats suggèrent un rôle de ce mécanisme d'effondrement rapide dans la prévention d'intermédiaires mitotiques et de la transmission de lésions aux cellules filles. Nous avons également identifié l'ADN polymérase alternative, Pol theta comme étant un facteur impliqué dans la prévention de la mort cellulaire induite par ce mécanisme. L'exploration de données de qPCR sur des prélèvements de tissus cancéreux nous a permis d'identifier la surexpression de Pol theta comme étant corrélée à des gènes de la HR. Ceci suggère un potentiel mécanisme d'adaptation pour prévenir de l'accumulation de fourches effondrées dans les cellules cancéreuses. L'ensemble de ces données révèle que les cellules humaines ont acquis au cours de l'évolution la capacité de cliver rapidement des fourches bloquées qui pourrait s'avérer importante pour la stabilité du génome, notamment en contexte de stress réplicatif
Replicative stress is characterized by an accumulation of stalled replication forks and is known to be a major source of genetic instability in human cells. Replicative stress and genetic instability are early markers of tumorigenesis. It is known that stalled replication forks can degenerate into double strand breaks (DSB), a process called replication fork collapse. Indeed, after an extended replicative stress (24h) induced by hydroxyurea (HU), the endonuclease MUS81-EME1 can promote the collapse of replication forks. This endonuclease prevents accumulation of under replicated regions in G2 and mitotic segregation defects. Here, by monitoring DSB with sensitive neutral comet assay and QIBC (Quantitative Image-Based Cytometry) approaches, we found that replication forks can also collapse rapidly after replicative stress (as early as 2 hours after HU). We characterised this rapid replication fork collapse as a MUS81-independent mechanism. Moreover, by performing siRNA based knock down, we identified two nucleases, Artemis and XPF, involved in rapid replication fork collapse mechanism. Our results point toward a role of this rapid collapse mechanism in preventing mitotic intermediates and lesion transmission to daughter cells. Also, we identified the role of an alternative DNA polymerase Pol theta as a molecular factor involved in preventing this mechanism to induce cell death. Data mining of expression data from tumour samples allowed us to identify Pol theta verexpression as correlated with HR genes, underpinning a potential adaptation mechanism to prevent collapsed fork accumulation in cancer cells. Collectively, these data reveal that human cells have evolved a quick cleavage response to stalled forks that might be important for genome stability notably in cells undergoing replicative stress

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Buchsbaum, Samuel. "Régulation du facteur de réplication de l'ADN MCM7 par poly-ubiquitinylation : rôles d'Int6 et BRCA1." Phd thesis, Ecole normale supérieure de lyon - ENS LYON, 2006. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00120941.

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MCM7, une des sous unités de l'ADN hélicase MCM, est poly-ubiquitinylée quand elle est sur la chromatine en réplication ou en réparation. Pendant la réplication, l'ubiquitinylation dégradative de MCM7 provoque son départ de la chromatine. La proto-oncoprotéine Int6 interagit avec les formes ubiquitinylées de MCM7 pour les protéger de la dégradation. Son absence entraîne la déstabilisation de MCM7 et l'apparition de lésions à l'ADN. La capacité d'Int6 à réguler la dégradation de MCM7 et peut-être d'autres facteurs semble donc primordiale pour la stabilité génomique. Suite à une irradiation causant des cassures de l'ADN, l'ubiquitinylation de MCM7 la stabilise et est stimulée par BRCA1, un suppresseur de tumeur doté d'une activité ubiquitine ligase. Cette stabilisation participerait au rôle de MCM7 dans le signalement des lésions de l'ADN. Ces travaux ajoutent MCM7 à la liste des protéines dont l'ubiquitinylation régule le métabolisme de l'ADN pour maintenir l'intégrité génomique.

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Renty, Christelle de. "Analyse de la dynamique de réplication préméiotique chez Saccharomyces cerevisiae par peignage moléculaire de l'ADN." Montpellier 2, 2007. http://www.theses.fr/2007MON20168.

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Chez les eukaryotes, la duplication des chromosomes est initiée à partir des origines de réplication selon une chorégraphie spatio-temporelle bien définie qui contribue au bon déroulement des autres évènements du cycle cellulaire, assurant ainsi la transmission correcte du patrimoine génétique. Ce programme spatio-temporel n'est pas rigide et peut varier selon le type cellulaire et s'adapter aux conditions physiologiques. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, par exemple, la méiose est un exemple de différentiation cellulaire au cours de laquelle une cellule diploïde va générer quatre cellules haploïdes génétiquement différentes, et où la phase de réplication des chromosomes est deux à trois fois plus longue que lors du cycle végétatif. Mon travail de thèse a consisté principalement à définir les causes de cette extension, en utilisant la technique très résolutive du peignage moléculaire de l'ADN qui permet, à partir de molécules uniques, de déterminer la cinétique d'activation des origines et la progression des fourches de réplication. L'analyse d'un chromosome isolé (Chr. VI) indique que les mêmes origines sont utilisées en mitose et méiose, mais selon un programme d'activation différent. Nos résultats suggèrent aussi qu'en méiose les fourches de réplication ralentiraient au niveau de sites de pause. J'ai alors tenté d'élucider les causes moléculaires de ces pauses et leur lien éventuel avec la mise en place de la recombinaison méiotique, une étape fondamentale pour la ségrégation correcte des chromosomes et le brassage génétique lors de la formation des gamètes. Ce processus est initié par la formation des Cassures Double Brin (CDB) qui requiert l'intervention d'un complexe protéique spécifique de la méiose, constitué notamment de Mer2, Rec114 et Spo11. La dynamique de réplication a été étudiée dans des souches mutées pour ces protéines. Parallèlement à ces travaux sur la méiose, j'ai aussi amélioré la technique du peignage moléculaire et démontré son utilité pour déterminer avec précision la fin de la réplication des chromosomes, une donnée qui n'était pas accessible par les techniques classiques. J'ai ainsi pu montrer que des cellules dépourvues en Cdc14, une protéine phosphatase essentielle pour la ségrégation de l'ADN ribosomique (rDNA) et la sortie de mitose, terminaient la réplication plus tardivement que les cellules contrôles. Le fort retard de réplication du rDNA dans le mutant cdc14-1 pourrait être responsable de son défaut de ségrégation en anaphase
The duplication of chromosomes in eukaryotes initiates from numerous origins that are activated during S phase according to specific spatio-temporal replication programs. These replication programs are connected to downstream cell cycle events and contribute to accurate transmission of the genetic material to progeny, yet they are flexible and can adapt to varying physiological conditions. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, for example, meiosis can be considered as a differentiation program whereby a diploid cell gives rise to four genetically different haploid cells. Interestingly, premeiotic DNA replication is usually two to three times longer than during vegetative cell division (mitosis), in multiple organisms, yet no one really knows why. The aim of my thesis work was to uncover the reasons for this S phase extension in meiosis, using a state-of-the-art imaging technique called DNA combing. With this technique that I contributed to improve, the firing of origins as well as replication fork progression rates can be monitored on the level of single DNA molecules. My data indicate that the same number of origins is used in mitosis and meiosis. However, by focusing on a single chromosome (Chr. VI) we discovered that, although the same set of origins is used, it is activated following a different program. A first subset of origins fires with high efficiency, then replication forks seem to pause for a long while before a second subset of origins fires. I tried using various mutants to determine the nature of these replication pausing sites and their potential link with the induction of meiotic recombination, which is essential for correct chromosome segregation in meiosis. This process begins with the formation of double-strand breaks (DSBs) that require the concerted action of a number of meiotic-specific proteins, among which Mer2, Rec114 and Spo11. In order to see if these DSB proteins are responsible the lengthening of S in meiosis, I analyzed replication dynamics in strains lacking these proteins. Besides this work, I also demonstrated the utility of DNA combing for defining when DNA replication is completed in mitotic cells, a measure that was not available from current techniques. This way I was able to show that yeast cdc14-1 cells, defective for a conserved protein phosphatase needed for ribosomal DNA (rDNA) segregation and mitotic exit, finish rDNA replication much later than control cells. It is likely that the failure of cdc14-1 cells to finish rDNA replication in time is responsible for its non-segregation in anaphase

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Herrick, John. "Aspects positifs et négatifs de la régulation de la réplication de l'ADN chez "Echerichia coli"." Paris 11, 1994. http://www.theses.fr/1994PA11T031.

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Lévy, Nicolas. "XRCC1, un élément clef de la réparation des dommages de l'ADN couplée à la réplication." Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 2007. https://publication-theses.unistra.fr/public/theses_doctorat/2007/LEVY_Nicolas_2007.pdf.

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XRCC1 est un facteur central des voies de réparation des cassures simple brin (SSBR) ou des bases endommagées (BER). Il organise un réseau complexe d’interactions protéiques avec les acteurs de la réparation grâce à ses domaines BRCT1 et BRCT2. Le domaine BRCT1 interagit avec l'enzyme qui détecte et signale les cassures dans l'ADN, PARP-1, ainsi qu'avec le poly(ADP-ribose) (PAR), permettant son recrutement rapide au site de dommage. Afin de mieux comprendre les fonctions du domaine BRCT1 de XRCC1 dans la réparation des dommages de l’ADN, nous avons cherché à isoler de nouveaux partenaires par une approche protéomique s'appuyant sur la spectrométrie de masse. Nous avons identifié deux nouveaux partenaires : la sous unité catalytique de la protéine kinase DNA-PK impliquée dans la réparation de l'ADN par recombinaison non homologue (NHEJ) et la sous unité p58 du complexe ADN polymérase α-primase impliqué dans la replication de l'ADN. XRCC1 interagit avec DNA-PK et stimule son activité in vitro de phosphorylation de la sérine 15 de p53. En retour, XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK au niveau de sa sérine 371 en réponse à une exposition aux rayonnements X et cette phosphorylation régule la transition entre une forme monomère et une forme dimère de XRCC1 et est requise pour la réparation efficace des casssures double brin in vitro. Le mutant non phosphorylable XRCC1-S371L perd sa capacité à stimuler DNA-PK, et induit un défaut de réparation des cassures double brin induites par des rayonnements X. Nos résultats suggèrent que XRCC1 pourrait recruter DNA-PK pour engager la voie de réparation NHEJ lorsqu'une cassure simple-brin a été convertie en cassure double-brin lors de la phase S. XRCC1 interagit par son domaine BRCT1 avec la sous-unité p58 du complexe replicatif Pol α-primase et les deux protéines co-localisent in vivo. Nous montrons que p58 lie le PAR ce qui entraîne l’inhibition de l’activité primase. La surexpression du domaine BRCT1 de XRCC1 dans des cellules HeLa induit l’hétéromodification du domaine BRCT1 surexprimé et l’accumulation des cellules en début de phase S après traitement par un agent alkylant. Nous montrons que ce blocage de la réplication à lieu entre la formation des complexes de pré-initiation et le recrutement de PCNA, et qu’elle est dépendante de la synthèse de PAR Ce travail révèle une nouvelle fonction de XRCC1 et du PAR, qui est de réguler l'initiation de la réplication lorsque l'ADN est endommagé. L’ensemble de nos résultats décrivent XRCC1 et PARP-1 comme des éléments centraux de la coordination entre réparation et réplication de l’ADN, ainsi que dans la transition entre SSBR et DSBR. Lors de la réplication d’un ADN endommagé, le couple XRCC1/PARP-1, via le PAR porté par le domaine BRCT1 de XRCC1, freine l’avancement de la fourche de réplication en interagissant avec p58, inhibant de la sorte l’ADN primase. Ceci permettrait à la cellule de réparer les lésions présentes sur l’ADN afin d’éviter la collision entre la fourche de réplication et une cassure simple-brin de l’ADN non réparée. Néanmoins, en cas de conversion du SSB en DSB, XRCC1 stimule l’activité de DNA-PK afin de promouvoir la réparation du DSB.

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Nassar, Joelle. "Caractérisation de la fonction de OBI1, une E3 ubiquitine ligase, dans la réplication de l'ADN." Thesis, Montpellier, 2019. http://www.theses.fr/2019MONTT039.

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La division cellulaire est l’un des processus cellulaires les plus complexes. Pour que cette division se déroule correctement, la cellule doit répliquer de manière fiable l’intégralité de son génome. Durant ce processus, la réplication de l’ADN est initiée a des sites prédéfinis du génome, appelés « origines de réplication ». Vu qu’un dysfonctionnement de l'activité des origines est lié à plusieurs pathologies humaines, leur activation doit être hautement régulée. Plusieurs protéines ont été trouvées aux origines de la réplication, mais aucune n’explique comment ces origines sont reconnues et sélectionnées pour l’activation. Notre groupe de recherche vise à comprendre comment les origines de réplication sont régulées dans les cellules de métazoaires. Dans ce but, une approche protéomique a été réalisée pour définir l'interactome des origines de réplication humaine, dans l’objectif d'identifier de nouveaux facteurs qui pourraient être impliqués dans la régulation des origines. À l'aide de cette approche, une nouvelle ubiquitine ligase, nommée OBI1 (ORC-ubiquitine-ligase-1), a été identifiée avant mon arrivée au laboratoire. OBI1 se lie au complexe de reconnaissance des origines (complexe ORC) et mon projet vise à mieux caractériser le rôle de cette nouvelle protéine dans la réplication de l'ADN. Notre stratégie expérimentale est basée sur deux modèles différents: un modèle in vivo de cellules humaines en culture et un système de réplication de l'ADN in vitro dérivé d'œufs de Xénope.Nos analyses sur des cellules humaines ont d’abord révélé qu’OBI1 était crucial pour la prolifération cellulaire. Cette observation a été ensuite attribuée à son rôle dans la réplication de l’ADN et plus précisément dans l’activation des origines de réplication. En effet, la déplétion d’OBI1 a montré une diminution de recrutement à la chromatine de facteurs impliqués dans l’activation des origines. De plus, une analyse fonctionnelle a montré qu'OBI1 multiubiquitine ORC3 et ORC5, deux sous-unités du complexe ORC. Cette ubiquitination a été ensuite liée au rôle d’OBI1 dans l’activation des origines de réplication, après que la surexpression des mutants ORC3 / 5 non-ubiquitinables ait donné des résultats similaires à ceux observés lors de la déplétion d’OBI1. Dans l’ensemble, nos résultats ont démontré qu’OBI1 est une protéine essentielle à l’activation des origines et nous ont permis de mettre en place une hypothèse suggérant qu’en ubiquitinant ORC3/5, OBI1 pourrait jouer un rôle dans la sélection des origines destinées à l’activation, parmi toutes les origines définies antérieurement. Après cette étude, maintenant publiée, nous avons voulu aborder le rôle de la multiubiquitination des ORC dans l’activation des origines. Nos expériences préliminaires suggèrent un rôle de l'histone acétyl-transférase (HAT) GCN5 / KAT2A.Dans la deuxième partie de mon projet, nous avons utilisé le système in vitro, basé sur des extraits d'œufs de xénope, pour étudier le rôle de l'OBI1 et de l'ubiquitination dans l'activation des origines de réplication. Nos analyses ont confirmé la conservation d’OBI1 chez Xenopus Laevis et son recrutement a la chromatine lors de la réplication. Nous avons montré que l'ubiquitination se produit sur la chromatine lors de l'activation de l'origine. De plus, en utilisant des inhibiteurs de E1, nous avons constaté que l’ubiquitination est importante pour l’activation des origines. De façon intéressante, la déplétion de OBI1 dans ce système embryonnaire a suggéré un rôle diffèrent d’OBI1 dans l’activation des origines dans le système embryonnaire comparé aux conditions plus somatiques.Finalement, la découverte de ce nouveau facteur d'initiation a fourni des informations essentielles sur le rôle de l'ubiquitination et d’OBI1 dans l'activation et la sélection des origines de réplication. Une telle sélection pourrait également participer à la régulation du « timing » de la réplication de l'ADN
Cell division is one of the most complex processes a cell undergoes. For this to happen properly, the genetic material stored in a cell must be faithfully copied or replicated. During this process, DNA replication is initiated at pre-defined sites in the genome, called "origins of replication". The activation of these origins is highly regulated, as a dysfunction in origin activity is linked to several human pathologies. Several proteins have been found at replication origins, but none of them explain how to be activated origins are recognized and selected. Our research group aims to understand how DNA replication origins are regulated in metazoan cells, to this aim, a proteomic approach was performed to define the interactome of human replication origins. Our goal was to identify new factors that could be involved in replication origin regulation. Using this methodology, a novel E3 ubiquitin ligase, named OBI1 (for ORC-ubiquitin-ligase-1), was identified prior to my arrival in the laboratory. OBI1 binds the origin recognition complex (ORC complex) and my project aimed at further characterizing the role of this new protein in DNA replication. Our experimental strategy used two different model systems: an in-vivo model based on human cells in culture, and an in-vitro DNA replication system derived from Xenopus eggs.Our analyses in human cells revealed that OBI1 was a crucial gene involved in cellular proliferation, this observation was later attributed to OBI1’s role in DNA replication and more specifically, to replication origin activation. Indeed, OBI1 knockdown resulted in a deficient origin firing and a decrease in the chromatin recruitment of factors involved in origin firing. A further functional analysis showed that OBI1 multiubiquitylates two subunits of the ORC complex, ORC3 and ORC5. This ubiquitylation was directly linked to OBI1’s role in origin firing, after the over-expression of non-ubiquitylable ORC3/5 mutants yielded similar results to OBI1’s knock down. Altogether, our results demonstrated that OBI1 encoded for a protein essential for origin activation, and allowed us to propose its main role: by multiubiquitylating a subset of the ORC complex, OBI1 could select the replication origins to be activated amongst all the potential replication origins set in G1 phase of the cell cycle. After this set of experiments, now published, we wanted to address the mechanistic impact of the multiubiquitylation of ORC on origin activation. Our preliminary experiments suggest a role of the histone acetyl-transferase (HAT) GCN5/KAT2A in the “OBI1 pathway”In the second part of my project, we used the in vitro DNA replication system, based on Xenopus laevis egg extracts, to study the role of OBI1 and ubiquitylation in origin activation. Our in-vitro analyses confirmed the conservation of OBI1 in Xenopus Laevis and its recruitment to the chromatin during DNA replication. We showed that de novo ubiquitylation takes place on chromatin during origin activation. Moreover, using E1 inhibitors, we found that active ubiquitylation is important for efficient origin firing. Interestingly, our loss of function experiments suggested that OBI1’s impact on origin activation could defer in early development when compared to somatic-like conditions.Taken together, the discovery of this new replication initiation factor provided key information on the role of ubiquitylation in general and OBI1 in particular on origin activation and selection. Such selection could participate as well in the regulation of the timing of DNA replication

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Daboussi, Fayza. "Relations épistatiques entre RAD51 et ses paralogues chez les mammifères : étude de la sensibilité aux stress génotoxiques, la recombinaison homologue, la duplication des centrosomes et la réplication." Paris 7, 2005. http://www.theses.fr/2005PA077199.

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La recombinaison homologue (RH) est un processus fondamental conservé chez les tous les organismes vivants. Chez les mammifères, ce processus implique de nombreuses protéines parmi lesquelles Rad51 et ses paralogues. Afin de déterminer si ces paralogues agissent dans la même voie que RAD51, nous avons réalisé une étude d'épistasie en associant la sur-expression d'un dominant négatif de RAD51 avec une mutation dans un des paralogues, le gène XRCC2. Cette étude montre que les protéines Xrcc2 et Rad51 sont impliquées dans la même voie pour la résistance aux stress génotoxiques, la recombinaison homologues et la duplication des centrosomes. Nous avons également montré que les lignées défectives pour la RH présentent spontanément un ralentissement de la vitesse de progression des fourches de réplication et l'activation d'un « checkpoint » S/G2 dépendant d'ATM/ATR
Homologous recombination (HR) is a fundamental biological process, conserved in all organisms. In mammals, Rad51 protein and its paralogues are involved in this process. Here, we address the question whether RAD51 and its paralogs act in the same pathway. To answer this question, we examined the consequences of the overexpression of a dominant negative form of RAD51 in the irs 1 cell line, mutated in the XRCC2 paralogue gene. This work demonstrated that Rad51 and Xrcc2 proteins act in the same. . Pathway with respect to résistance to genotoxic stresses, homologous recombination and centrosome duplication. In cell lines defective for HR, we also observed a slowing down in the progression of replication forks and the activation of S/G2 checkpoint dependent on ATM/ATR

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Pillaire, Marie-Jeanne. "Influence de la lésion majoritaire de l'agent antitumoral "cisplatine" sur la réplication de l'ADN in vivo et in vitro ; conséquences mutagènes de cette réplication." Toulouse 3, 1994. http://www.theses.fr/1994TOU30254.

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La lesion majoritaire qui pourrait etre impliquee dans la cytotoxicite et la mutagenese engendree par le cisplatine, est un pontage intrabrin entre deux guanines adjacentes. Nous avons etudie l'influence de cette lesion sur la replication, in vivo et in vitro, d'un adn monocatenaire sachant que la replication au travers d'une lesion peut etre mutagene. La sequence d'adn cible choisie pour placer la lesion unique, contient les codons 12 et 13 du proto-oncogene h-ras qui sont des points chauds de mutagenese dans les tumeurs humaines. Apres clonage des matrices d'adn lesees sur le codon 13 dans un vecteur monocatenaire, nous avons observe que la survie du vecteur s'accompagnait de la formation de mutation au niveau de la lesion du cisplatine. Pour tenter de comprendre le mecanisme de cette replication mutagene, nous avons etudie la capacite de differentes adn polymerases a repliquer in vitro la matrice d'adn modifiee sur le codon 13. Nous avons observe que les adn polymerases eucaryotes purifiees, , et , ne franchissent pas le pontage intrabrin contrairement a l'adn polymerase i d'e. Coli et a la transcriptase reserve du virus vih. Nos resultats suggerent que si les adn polymerases eucaryotes testees sont impliquees dans la replication du vecteur simple brin in vivo, ce soit en presence d'autres facteurs proteiques qui favoriseraient le franchissement de la lesion. Parallelement, nous avons etudie la capacite d'une adn helicase a deplacer un oligonucleotide d'une matrice contenant une lesion du cisplatine sur deux guanines adjacentes. L'adn helicase etudiee est la proteine ul-9 necessaire a la replication du virus de l'herpes. Nous avons observe que l'activite catalytique est peu affectee par la lesion, suggerant ainsi qu'une adn helicase peut franchir cette lesion du cisplatine

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Luque, Alejandro E. "La réplication de l'ADN nucléaire dans la cellule de blé : étude des facteurs réplicatifs et mise en place d'un système viral de réplication végétale." Bordeaux 2, 1999. http://www.theses.fr/1999BOR28637.

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Piot, Barbara. "Rôle de la topoisomérase II dans la mise en place du programme d'activation des origines de réplication de l'ADN." Paris 6, 2012. http://www.theses.fr/2012PA066266.

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La topoisomérase II (topo II) est une enzyme essentielle des cellules grâce à sa capacité unique à démêler l’ADN. Dans les extraits interphasiques d’œufs de xénope, où les origines de réplication s’activent par groupes de 5 à 10 tout au long de la phase S, nous avons mis en évidence un nouveau rôle majeur de la topo II en phase G1 pour contrôler le programme d’activation des origines via la quantité de MCM2-7 chargés. La quantité d’hélicases chargées sur la chromatine ayant été corrélée avec l’efficacité des origines (Wyrick J. J. Et al. 2001) et avec le moment d’activation des origines (Yang S. C. Et al. 2010), nous apportons une information clé quant au mécanisme de régulation du programme d’activation des origines. D’autres protagonistes ont récemment été identifiés au cœur de ce mécanisme, comme Rif1 (Hayano M. Et al. 2012) et Fkh1/2 (Knott S. Et al. 2012). De plus, nos résulats suggèrent que l’ICRF-193 ralentit la réplication en piégeant la topo II sur l’ADN, ce qui induirait un ralentissement des fourches et une gêne à l’activation des origines
DNA replication is a complex process that follows an established origin activation program. We demonstrate here that topoisomerase II (topo II) is involved in the establishment of this origin activation program. In interphase xenopus egg extracts, inhibition of topo II by ICRF-193, a drug that traps topo II as closed clamps on DNA, slows down fork progression and delayes origin clusters activation. This was not due to S phase checkpoint activation and only seen if the drug was added during the pre-replicative phase. If added later, during S phase, ICRF-193 does not have effects on DNA replication anymore. Opposite effects of topo II immunodepletion and topo II inhibition indicate that the slower replication with ICRF-193 is not due to topo II catalytic inhibition but to the topo II clamps on DNA that creates obstacles against fork progression. Topo II immunodepletion accelerates S phase by accelerating the activation of origin clusters without altering inter-origin distances. Add-back of recombinant topo II negates these effects. Topo II depletion increases the loading of MCM proteins during origin licensing. Addition of ICRF-193 in G1 does not affect MCM loading. We conclude that i) topo II activity is not required for S phase progression; ii) topo II acts non-catalytically in G1 to cluster origins that undergo reduced MCM loading and thus fire late in S phase; iii) ICRF-193 addition in G1 creates obstacles to origin cluster activation and fork progression, not because of topo II catalytic inhibition, but due to formation of topo II clamps. Topoisomerase II dynamic in G1 phase is important for the determinism of replication origin efficiency

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PEREIRA, DE SOUZA ANETTE. "Structure et expression du gene nad5 dans l'adn mitochondrial des plantes superieures." Paris 11, 1992. http://www.theses.fr/1992PA112070.

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Анотація:

Les genes identifies dans le genome mitochondrial des plantes superieures ne correspondent que a 5 ou 10% de sa capacite codante. Nous avons analyse un fragment de l'adn mt de ble ne contenant pas de genes connus mais qui portait une sequence transcrite et conservee entre differentes especes. Dans une premiere partie du travail, nous avons pu mettre en evidence la presence dans ce fragment de deux exons du gene codant pour la sous-unite 5 du complexe nadh-deshydrogenase (nad5) de la membrane interne mitochondriale. Dans une deuxieme partie, nous avons etudie la structure du gene chez le ble, le mais, l'endive, le chou-fleur, la pomme de terre et le haricot, et son expression chez les quatre premieres especes. Les resultats obtenus ont indique que: i) le gene nad5 est present en copie unique et constitue de 5 exons (i a v) organises dans trois groupes (i-ii, iii, iv-v) disperses dans l'adn mt des 7 especes analysees. Il existe quatre introns, tous du groupe ii, dont deux (introns 2 et 3) sont interrompus dans leur domaine iv par des longues sequences d'adn. La conservation de cette structure chez les monocotyledones et les dicotyledones suggere qu'elle etait deja presente avant la divergence entre ces deux grands groupes; ii) les trois groupes d'exons sont transcrits independamment dans le genome et rassembles dans l'arnm par des reactions d'epissage en cis (exons i-ii et iv-v) et en trans (exons ii-iii et iii-iv). Un modele preliminaire d'assemblage des 5 exons chez le ble et le mais est propose. Les profils de transcription observes sont complexes et suggerent que certaines etapes du mecanisme de maturation post-transcriptionnel actif sont similaires chez les quatre especes analysees

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Cubells, Matthieu. "Identification de séquences Cis-Régulatrices impliquées dans l'activité de l'origine de réplication de l'ADN de la Lamine B2." Montpellier 2, 2007. http://www.theses.fr/2007MON20010.

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Анотація:

Les éléments agissants en cis nécessaires à l’activité des origines de réplication de l’ADN chez les métazoaires sont peu connus. Nous avons étudié le rôle des ces éléments sur l’activation de l’origine de réplication humaine associée au gène de la Lamine B2 (LaminB2-Ori). Nous avons généré des clones de cellules HeLa à partir de l’intégration stable d’un fragment d’ADN de 1. 2 kb, contenant le site d’initiation de la réplication et un îlot CpG. Nous avons étudié l’initiation de la réplication par PCR sur les ADN naissants provenant de cellules asynchrones. Dans la majorité des clones, l’activité de cette origine ectopique était comparable à celle de l’origine endogène. Dans quelques cas, ce fragment montrait une activité réplicative réduite. Pour réduire la variabilité de l’activité due à l’environnement chromatinien du site d’insertion, nous avons développé un outil d’insertion site-spécifique via la recombinase Cre de cassettes contenant la LaminB2-Ori ectopique. Cette méthode présente une homogénéité de l’activité de la LaminB2-Ori ectopique et par conséquent permet de quantifier l’activité de mutants de cette Ori. Une dissection des éléments en cis en proximité de l’origine de la Lamine B2 ectopique a été réalisée. Les résultats indiquent que la séquence centrale de l’origine, où se fixe le complexe ORC, est nécessaire à l’initiation de la réplication et que l’îlot CpG, les sites de fixation des facteurs de transcription et la présence de gènes activement transcrits influencent l’initiation de la réplication. L’ensemble des résultats suggère que la LaminB2-Ori possède une organisation modulaire de séquences en cis. Cette structure peut imposer une configuration chromatinienne spécifique ou favoriser quelques modifications épigénétiques qui promeuvent l’initiation de la réplication et que l’activation de la LaminB2-Ori domine sur les séquences environnantes
The cis-acting elements necessary for the activity of DNA replication origins in metazoan are poorly understood. We studied the role of this elements on the activation of the human origin of replication associated to the Lamin B2 gene. We generated HeLa clones of stable integration of a 1. 2 kb DNA segment, comprising the start site of DNA replication and the CpG island. We assessed the initiation of DNA replication by PCR on nascent DNA isolated from asynchronously cells. In the majority of clones the activity of this ectopic origin was comparable to the endogenous origin. In some cases this segment shows a reduced replication activity. For reducing the variability due to the chromatin environment of the insertion site, we developed a toll of site-specific integration mediated by the Cre recombinase of cassettes containing the ectopic LaminB2-Ori. This method shows homogeneity of activity of the ectopic LaminB2-Ori, and by consequence the possibility to quantify the mutants Ori activity. A dissection of the cis-elements in the closed proximity of the ectopic Lamin B2 origin was carried out. The results indicate that core sequence of the origin which is bound by the ORC complex is required for the initiation of the replication and that the CpG island, binding sites for transcription factors and the presence of actively transcribed genes positively influence the replication initiation. Altogether these results suggest that the LaminB2-Ori shows a modular organization of cis-acting sequences. This structure may impose a specific chromatin configuration or favorite some epigenetic modifications that prompt the initiation of replication and that LamB2-Ori activation is dominant over the surrounding sequences

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Дисертації з теми "Réplication de l'ADN mitochondrial"

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