Добірка наукової літератури з теми "Réplication de l'ADN mitochondrial"

La mitochondrie est une organelle essentielle possédant son propre ADN circulaire. Cet ADN peut présenter des mutations et/ou des délétions, consécutives à l’exposition à différents types de dommages ou en raison de protéines mutées. Ces mutations ou délétions sont impliquées dans de nombreuses pathologies, dont les cancers, et le vieillissement. Leur apparition peut survenir notamment lors de la réplication ou de la réparation. A ce jour, la réplication et la réparation mitochondriales ne sont pas encore bien élucidées. L’objectif de ce projet est donc de mieux en appréhender les mécanismes et de mieux comprendre l’émergence d’anomalies en nous intéressant plus particulièrement à une délétion appelée « Common Deletion ». Ce travail reposait sur l’hypothèse que cette délétion put résulter d’une mauvaise réparation de cassure(s) double-brin et/ou d’une erreur durant la réplication de l’ADN mitochondrial. L’analyse de ces résultats révèle que la formation de la « Common Deletion » ne nécessite qu’une seule cassure double-brin proche des séquences répétées entourant cette dernière et implique les protéines de la réplication de l’ADN mitochondrial. Ainsi, ce travail permet de mieux saisir les mécanismes de réplication et de réparation assurant la stabilité de l’ADN mitochondrial. Un second projet a été de proposer un modèle d’étude in vitro des topoisomérases en utilisant des minicercles d’ADN permettant la visualisation du complexe covalent, étape clef de la réaction de relaxation de ces enzymes
Mitochondria is an essential organelle with its own circular DNA. This DNA may exhibit mutations and/or deletions, as a result of exposure to different types of damage or due to mutated proteins. These mutations or deletions are involved in many pathologies, including cancers, and aging. They may occur during replication or repair. For now, mitochondrial replication and repair have not yet been fully elucidated. The objective of this project is therefore to better understand the mechanisms and the emergence of anomalies by focusing on a deletion called "Common Deletion". This work was based on the assumption that this deletion could result from poor repair of double-strand break(s) and/or error during mitochondrial DNA replication. Analysis of these results reveals that the formation of the "Common Deletion" requires only a single double-strand break close to the repeated sequences surrounding the latter and involves the proteins of mitochondrial DNA replication. Thus, this work makes it possible to better understand the mechanisms of replication and repair ensuring the stability of mitochondrial DNA. A second project was to propose an in vitro model for topoisomerases using DNA minicircles allowing visualization of the covalent complex, a key step in the relaxation reaction of these enzymes

La mitochondrie est un organite intracellulaire d'origine bactérienne possédant son propre génome, qui joue des rôles clés dans le métabolisme énergétique et dans l'apoptose. La dynamique mitochondriale résulte de la fusion et de la fission membranaire, conduisant à un changement de la morphologie du réseau mitochondrial. La dynamine mitochondriale OP Al joue un rôle clé dans la structuration de la membrane interne, requise pour la fusion du réseau mitochondrial, le métabolisme énergétique, et le contrôle de l'apoptose. OP Al est aussi responsable de l'Atrophie Optique Dominante, et elle existe sous forme de 8 isoformes générés par l'épissage alternatif de 3 exons : 4, 4b et Sb. L'objectif de ma thèse a consisté à étudier les fonctions associées aux différents isoformes d'OPA1. J'ai montré que les variants contenant l'exon 4 sont impliqués dans la fusion mitochondriale, tandis que les variants contenant l'exon Sb, sont impliqués dans l'apoptose, par la structuration des jonctions des crêtes mitochondriales responsable du piégeage du cytochrome c dans le volume intra-crête. De plus, j'ai mis en évidence pour la première fois chez les mammifères un lien entre OP A1-4b et le maintien du génome mitochondrial. En effet, je montre le peptide, résultant du clivage d'OP AI-4b, permet l'ancrage du nuc1éoide à la membrane interne, processus indispensable à l'initiation de la réplication et à la distribution des nucléoides. Ces observations corroborent les travaux obtenus chez les levures avec MGMl/Mspl, les orthologues d'OPA1, et permettent de définir un nouveau concept corrélant la dynamique de la membrane interne mitochondriale au maintien de l'intégrité du génome mitochondrial
Mitochondria is an intracellular organelle from bacterial origin with its own genome, which plays key roles in energy metabolism and apoptosis. The mitochondrial dynamics resu1ting from fusion and fission of the membranes, leading to a change in the morphology of mitochondrial network. The mitochondrial dynamin OP Al plays a key role in structuring the inner membrane required for fusion of the mitochondrial network, energy metabolism, and control of apoptosis. OP A1 is also responsible for the Dominant Optic Atrophy, and it exist's in the fonn of 8 isofonns generated by alternative splicing of 3 exons: 4, 4b and Sb. The objective of my thesis was to study the functions associated with different isofonns of OP A1. I have shown that variants containing exon 4 are involved in mitochondrial fusion, whereas variants containing exon Sb, are invojved in apoptosis, by structuring the cristae junctions responsible for mitochondnal cytochrome c trapping in the intra-cristae volume Furthemore, I demonstrated for the first tune m mammals a link between OPA1-4b and the maintenance of mitochondrial genome Indeed, I show that the peptide resulting from cleavage of OP AI-4b, allows anchoring the nucleoid to the inner membrane, a process essential for the initiation of replication and distribution of nucleoids. These observations corroborate the work produced in yeast with MGMI/Mspl, the orthologs of OPA1, and help define a new concept correlating the dynamics of inner mitochondrie membrane to maintain the integrity of the mitochondrial genome

Au cours de la croissance des levures, la cellule doit dupliquer sont génome nucléaire et mitochondrial, le processus de réplication est bien moins étudié dans les mitochondries. Néanmoins, si de multiples ADN polymérases sont impliquées dans les processus de réplication et de réparation dans le noyau, il est considéré jusqu’à aujourd’hui qu’une seule ADN polymérase est impliquée dans ces processus dans la mitochondrie. Des résultats récents mettent en exergue le fait que la situation est bien plus compliquée qu’il n’y apparait au départ. Pour élucider le processus de réplication dans la mitochondrie de levure, j’ai focalisé mon intérêt à tenter de purifier et de caractériser le complexe de réplication. Ce travail était important à développer étant donné la découverte au laboratoire d’une seconde ADN polymérase supplémentaire à la polymérase gamma, dans les mitochondries de levure. Une première partie de ma thèse a été de m’investir afin d’obtenir suffisamment de protéines dans le but d’une identification par spectrométrie de masse, compte tenu de la faible proportion des ADN polymérases dans la cellule et en particulier dans la mitochondrie. Nous avons démontré que cette polymérase est codée par le gène unique POL1. Par des techniques d’ultracentrifugation et d’analyse biochimiques, j’ai réussi à isoler et caractériser un complexe de réplication mitochondrial. Des techniques d’exclusion chromatographiques ont permis d’attribuer une masse native à ce complexe. Sa composition a été étudiée grâce à des colonnes ioniques et hydrophobes, une autre méthode d’analyse repose sur l’utilisation de colonnes d’affinité afin de reconstituer in-vitro les interactions existant entre plusieurs protéines présumées impliquées. Ainsi, un réseau d’interactions impliquant les deux ADN polymérases mitochondriales avec cinq autres protéines a été reconstitué. La masse native de différentes formes stables de ce complexe se situent à 500 kDa ou au-delà de 1 MDa
During yeast growth, cells must duplicate their nuclear and mitochondrial DNA. The replication process involved is less studied in mitochondria. Nevertheless, if multiple DNA polymerases are implicated in the nuclear replication and repair mechanisms, until now it is believed that only one DNA polymerase is involved in these processes in mitochondria. Recent results pointed out that the situation is more complicated than preliminary believed. To elucidate the replication process in yeast mitochondria I focused my interest in attempts to purify and characterize the replication complexes. This work was important to develop in accord with the discovery in the laboratory of a second DNA polymerase in addition to the polymerase gamma in yeast mitochondria. One first part of my thesis was to hardly purify enough of this enzyme to be allowed to identify it by mass spectrometry as the DNA polymerase alpha, encoded by the unique POL1 gene. By ultracentrifugation and biochemical techniques, I succeeded to purify the complex. Exclusion chromatographies were managed to elucidate the native mass of this complex. In addition ionic and hydrophobic chromatographic columns were carried out to determine its composition. Another way to study the complex was the reconstitution in vitro of the interactions happening with some usual suspect proteins with the help of chromatographic affinity columns. I reconstituted partly an interactions model network, including the two mitochondrial DNA polymerases and 5 others proteins implicated in replication. I determined the mass of different stable forms of the isolated complexes, around 500 kDa and over 1 MDa

Le processus de vieillissement correspond à un déclin fonctionnel des tissus en fonction du temps. On considère généralement que la sénescence cellulaire, l'attrition des télomères et le dysfonctionnement mitochondrial contribuent au processus de vieillissement. La sénescence cellulaire est un état permanent d'arrêt du cycle cellulaire, caractérisé par des changements dans la structure de la chromatine et l'activation d'un phénotype pro-inflammatoire. Les télomères sont les structures situées à l'extrémité des chromosomes et sont protégés par un complexe protéique composé de six protéines (TRF1, TRF2, RAP1, TPP1, TIN2 et POT1) appelé shelterin. Il existe de plus en plus de preuves de l'existence de liens multiples entre la fonction mitochondriale et les télomères. Le dysfonctionnement mitochondrial entraîne une augmentation des niveaux d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), qui provoquent un raccourcissement des télomères, et ce raccourcissement peut induire un dysfonctionnement mitochondrial par le biais de l'activation de p53. Des études récentes ont suggéré que la télomérase et certaines sous-unités de la shelterin régulent la fonction mitochondriale indépendamment de leur rôle télomérique, peut-être par le biais de leur localisation directe dans les mitochondries. Par exemple, la transcriptase inverse de la télomérase (TERT) se localise dans les mitochondries et protège l'ADN mitochondrial (ADNmt) dans les neurones en réduisant les niveaux de ROS. La protéine shelterin TIN2 se trouve dans les mitochondries où elle régule la phosphorylation oxydative. TRF2 régule l'expression de la sirtuine mitochondriale SIRT3 dans les cellules musculaires squelettiques. Dans l'ensemble, ces résultats suggèrent une boucle de rétroaction positive entre le dysfonctionnement des télomères et des mitochondries et soulèvent la question de savoir comment le lien entre les télomères et les mitochondries contribue à la sénescence.Pour répondre à cette question, nous avons étudié les fonctions de toutes les sous-unités de shelterin dans les mitochondries en utilisant des cellules de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF). Nous avons étudié leur rôle dans le métabolisme mitochondrial et leur implication dans la réplication de l'ADN mitochondrial (ADNmt) en utilisant une technique d'analyse in situ de la réplication de l'ADN mitochondrial (MIRA). Nous avons montré que TIN2, TPP1 et TRF2 affectent le métabolisme mitochondrial, mais que seule la déplétion de TRF2 a un effet néfaste sur la réplication de l'ADNmt. Fait important, nous avons constaté que TRF2 était localisé dans les mitochondries en utilisant diverses techniques, y compris la microscopie électronique. Nous avons approfondi la caractérisation des différents domaines de TRF2 et découvert que le domaine N-terminal de TRF2 (domaine B) était nécessaire et suffisant pour sa localisation mitochondriale et pour son rôle dans la réplication de l'ADNmt. Ce domaine a déjà été impliqué dans la reconnaissance des intermédiaires de réplication, où il les protège de la dégradation par les nucléases les intermédiaires réplicatifs de l'ADN. Nous avons également constaté que les niveaux de TRF2 diminuaient au fur et à mesure que les MEF entraient en sénescence et que l'expression ectopique de TRF2 était suffisante pour maintenir les niveaux de réplication de l'ADNmt au même niveau que ceux des jeunes MEF. Dans l'ensemble, nos résultats démontrent que la protéine shelterin TRF2 régule la réplication mitochondriale au cours de la sénescence
The aging process has been defined as a time-dependent functional decline in tissue functions. Cellular senescence, telomere attrition, and mitochondrial dysfunction are generally considered to contribute to the aging process. Cellular senescence is a permanent state of cell cycle arrest, and it is characterized by changes in chromatin structure and the activation of a pro-inflammatory phenotype. Telomeres are the structures located at the ends of chromosomes and are protected by a protein complex composed of six proteins (TRF1, TRF2, RAP1, TPP1, TIN2 and POT1) called shelterin. There is increasing evidence of multiple links between mitochondrial function and telomeres. Mitochondrial dysfunction leads to increased levels of reactive oxygen species (ROS), which cause telomere shortening, and this shortening can induce mitochondrial dysfunction through p53 activation. Recent studies have suggested that telomerase and some shelterin subunits regulate mitochondrial function independently of their telomeric role, perhaps through their direct localization to the mitochondria. For instance, telomerase reverse transcriptase (TERT) localizes to mitochondria and protects mitochondrial DNA (mtDNA) in neurons by reducing ROS levels. The shelterin protein TIN2 is found at mitochondria where it regulates oxidative phosphorylation. TRF2 regulates the expression of the mitochondrial sirtuin SIRT3 in skeletal muscle cells. Altogether, these findings suggest a positive feedback loop between telomere and mitochondrial dysfunction and raise the question of how the telomere-mitochondria connection contributes to senescence.To address this question, we investigated the functions of all shelterin subunits in mitochondria using mouse embryonic fibroblast cells (MEFs). We investigated their role in mitochondrial metabolism and their implication in mitochondrial DNA (mtDNA) replication by using the in-situ analysis of mitochondrial DNA replication (MIRA) assay. We showed that TIN2, TPP1 and TRF2 affect mitochondrial metabolism, but only TRF2 depletion has a detrimental effect on mtDNA replication. Importantly, we found that TRF2 was located at mitochondria by using a variety of techniques, including electron microscopy. We went deeper into the characterization of the different domains of TRF2 and found that the N-terminal domain of TRF2 (B domain) was required and sufficient for its mitochondrial location and for its role in mtDNA replication. This domain has previously been implicated in the recognition of replication intermediates, where it protects them from nuclease degradation in a sequence-independent manner. We also found that TRF2 levels decreased as the MEFs entered senescence and that ectopic expression of TRF2 was sufficient to maintain mtDNA replication levels as those of young MEFs. Collectively, our results demonstrate that the shelterin protein TRF2 regulates mitochondrial replication during senescence

Les organismes cellulaires appartiennent à l'un des trois domaines du vivant : Archaea, Bacteria, Eucarya. Les Archaea sont des organismes unicellulaires avec un phénotype bactérien mais qui possèdent de nombreux caractères moléculaires eucaryotes. En particulier, la machinerie de réplication archéenne est une version homologue et simplifiée de celle des eucaryotes. Au cours de cette thèse, j'ai étudié la réplication de l'ADN chez les Archaea en combinant des approches in vitro et in silico.
Premièrement, j'ai essayé de purifier la protéine initiatrice de la réplication Cdc6/Orc1, sous une forme native, dans l'espoir de mettre au point le premier système de réplication de l'ADN in vitro chez les Archaea. Malheureusement, cette approche a été infructueuse en raison de l'instabilité et des propriétés d'agrégation de la protéine.
Deuxièmement, j'ai réalisé une analyse comparative du contexte génomique des gènes de réplication dans les génomes d'Archaea. Cette analyse nous a permis d'identifier une association très conservée entre des gènes de la réplication et des gènes liés au ribosome. Cette organisation suggère l'existence d'un mécanisme de couplage entre la réplication de l'ADN et la traduction. De manière remarquable, des données expérimentales obtenues chez des modèles bactériens et eucaryotes appuient cette idée. J'ai ensuite mis au point des outils expérimentaux qui permettront d'éprouver la pertinence biologique de certaines des prédictions effectuées.
Finalement, j'ai examiné la distribution taxonomique des gènes de la réplication dans les génomes d'Archaea afin de prédire la composition probable de la machinerie de réplication de l'ADN chez le dernier ancêtre commun des Archaea. Dans leur ensemble, les profils phylétiques des gènes de la réplication suggèrent que la machinerie ancestrale était plus complexe que celle des organismes archéens contemporains.

Les déplétions de l'ADN mitochondrial (ADNmt) sont caractérisées par une diminution de la quantité de molécules d'ADNmt et sont une cause importante des déficits de la chaîne respiratoire. Les travaux présentés dans cette thèse ont permis d'identifier un nouveau gène nucléaire de déplétion de l'ADNmt associée à une encéphalomyopathie sévère conduisant au décès dans les premiers mois de vie. Ce gène code pour une petite sous-unité de la ribonucléotide réductase p53R2 induite par le facteur suppresseur de tumeurs p53. La ribonucléotide réductase catalyse la réduction des nucléotides en leurs désoxynucléotides correspondants, ce qui constitue l'étape limitante dans la synthèse de l'ADN. La deuxième partie de ce travail a porté plus précisément sur le rôle de p53R2 dans la réplication de l'ADNmt en abordant les questions de sa localisation subcellulaire ainsi que de la régulation des sous-unités de la ribonucléotide réductase au cours du développement, chez la souris, dans différents tissus
Mitochondrial DNA (mtDNA) depletions are characterized by a decreased number of mtDNA molecules and constitute a major cause of respiratory chain deficiency. This work allowed us to identify a new nuclear gene of mtDNA depletion associated with a severe encephalomyopathy leading to death in the first months of age. This gene encodes a small ribonucleotide reductase (RNR) subunit p53R2 which is a target of the transcription factor p53. RNR catalyses the reduction of the nucleotides into their corresponding desoxyribonucleotides, which is the rate limiting step for DNA synthesis. The second part of this work focuses on the role of p53R2 in mtDNA replication studying its subcellular localization and the expression of the subunits of RNR in several mouse tissues during development

Chez les léporidés, l'ADN mitochondrial manifeste une diversité importante, observée à deux niveaux: 1) des variations de longueur, dues principalement à des changements du nombre de deux motifs répétés en tandem dans la région non-codante de la molécule; 2) un polymorphisme des sites de restriction, dont l'analyse permet de retracer les lignées maternelles. L'étude d'un grand nombre d'individus appartenant à plusieurs espèces montre que les variations de longueur sont suffisamment fréquentés pour entretenir une hétéroplasmie généralisée, et variable d'un individu à l'autre, chez tous les léporidés. D'après les phylogènies mitochondriales, établies par comparaison des cartes de restriction, les trois genres lepus, oryctolagus et sylvilagus semblent s'être individualisés il y a près de 8 millions d'années. Chez les lapins de garenne (oryctolagus cuniculus), a été mise en évidence l'existence de deux lignées mitochondriales bien distinctes (vraisemblablement depuis 2,5 millions d'années), la première limitée au sud de la péninsule ibérique, la seconde occupant le reste de l'aire de répartition actuelle de l'espèce. Cette situation pose quelques questions concernant la biologie et l'histoire de l'espèce

La réplication de l' ADN est un phénomène complexe dans lequel de nombreux facteurs cellulaires sont impliqués. Elle est bien connue chez les procaryotes et les mammifères grâce à l' utilisation de modèles de réplication in vivo utilisant respectivement le bactériophage øx174 et le virus SV 40. En ce qui concerne la réplication de l' ADN chez les végétaux, seules des données fragmentaires, qui révèlent des différences entre les facteurs de réplication végétaux et mammifères, sont disponibles. L' objet de travail présenté dans ce mémoire est l' étude du complexe réplicatif et des facteurs le composant chez le blé, en vue de la reconstitution du complexe in vivo. Dans un premier temps, nous avons mis en place un essai de réplication utilisant comme matrice un plasmide simple brin (pWori) contenant les séquences essentielles du génome d' un virus infectant le blé, le géminivirus du nanisme du blé dont la réplication repose sur la machinerie réplicative de la cellule hôte. Nous avons purifié une fraction protéique à partir de cellules de blé en culture, capable d' assurer la réplication dans l' essai mis en place. Certains facteurs présents dans cette fraction ont été identifiés (protéines de liaison à l' ADN, topoisomérase) et purifiés (ADN polymérase A et B). La deuxième approche utilise la technique "double hybride" pour rechercher les facteurs interagissant au sein du complexe réplicatif avec une protéine centrale de celui-ci, la protéine RF-C. La troisième approche mise en oeuvre est basée sur le pontage chimique des éléments interagissant physiquement au sein du complexe réplicatif. Lors de cette étude nous avons détecté la présence de deux PCNA de taille diférente. L' analyse de séquences nucléotidiques partielles codant les PCNA a permis de mettre en évidence deux types d' ARN messagers, dont la détermination des séquences complètes est en cours
DNA replication requires a large set of proteins. The role played by the various factors of the prokaryotic and eukaryotic DNA replication machinery has been well established using a cell-free system with bacteriophage øx174 for prokaryotes and virus SV40 for eukaryotes. Plant DNA replication studies are scarce and their partial data reveal somme differences between mammalian and plant factors associated to DNA replication. This thesis concerns the analysis of the factors involved in the wheat "replicative complex" for a complete reconstitution in vitro. First, we isolated a wheat protein fraction acting as a DNA replication complex using a template as primed single-stranded phagemid (pWori) containing the geminivirus WDV (wheat dwarf virus) replication origins and the coding sequence of the geminiviral initiation protein (Rep). From the functionnal replicative complex, some factors were identified (DNA binding proteins, topoisomerase) and purified (DNA polymerases A and B and PCNA). Then by a "two hybrid" technique in yeast, we tried to determine the partners interacting with a key DNA replication factor : the RF-C. The last strategy concerns the reversible chemical bindings of physically interacting proteins present in the replicative complex. We detected two PCNA : a short and a long one. The analysis of their partial nucleotidic sequences showed the presence of two different RNA messengers. Their full length sequences are in progress

L'adn mitochondrial (adn mt) code pour des proteines de la chaine respiratoire et de l'atp synthetase. Nous avons retrouve des deletions heteroplasmiques de l'adn mt dans les tissus de patients atteints de myopathies oculaires et des mutations ponctuelles de l'adn mt dans les tissus de patients atteints de syndrome de merrf et de melas. Les deletions sont differentes d'un individu a l'autre (3 a 8,5 kb) et sont identiques dans les tissus d'un meme individu mais la quantite de molecules anormales est variable d'un tissu a l'autre. Elles amputent plusieurs genes codant pour les sous-unites des complexes i, iii, iv, et v et plusieurs genes d'arnt. Plus la quantite de genome mute est importante plus le deficit biochimique est detectable. Le mecanisme implique dans la formation des deletions demeure inconnu pourtant la presence de sequences repetees dans les 3/4 des cas suggere des mecanismes de recombinaison apres appariements de sequences homologues. Les mutations ponctuelles a la position 8344 et 3243 sont specifiques respectivement du syndrome de merrf et du syndrome de melas. Elles se situent dans les genes d'arn de transfert de la lysine au niveau de la boucle t pseudouridine c (8344) et de la leucine au niveau de la boucle dihydouracile (3243). Elles sont heteroplasmiques et se retrouvent a des taux variables suivants les tissus. Les mutations ponctuelles sont transmises selon les lois de l'heredite maternelle. Pour les deletions ce schema n'est pas retrouve: certains cas sont sporadiques, d'autres sont familiaux montrant une heredite autosomale dominante ce qui suggere l'intervention d'une proteine nucleaire dans le processus de formation des deletions

J'ai étudié, durant mon travail de thèse, la réplication de l'ADN chez l'archaea halophile Haloferax volcanii. Le premier objectif de ma thèse était de mettre en place l'utilisation des outils génétiques disponibles chez H. Volcanii, dont la méthode de délétion de gène par intégration/excision de plasmide (pop-in/pop-out), pour un usage routinier au laboratoire. L'annotation partielle des gènes impliqués dans les mécanismes de réplication et réparation de l'ADN a permis d'identifier 16 protéines Initiator Cdc6/Orc1 putatives. L'utilisation des outils génétiques, combinée à une analyse des biais de représentation des nucléotides, nous ont permis d'identifier cinq origines de réplication. Le chromosome majeur possède au moins deux origines de réplication tandis qu'une autre est retrouvée sur les deux épisomes pHV1 et pHV4. L'activité in vivo de ces origines a pu être confirmée par cartographie des sites d'initiation de la réplication (RIP mapping) et par gel bidimensionnels d'ADN. L'étude des peptides interagissant avec PCNA nous a permis d'identifier que RnaseH interagit avec PCNA pour former un complexe inactif. Nos analyses génétiques chez H. Volcanii ont permis d'illustrer l'implication dans les processus de réparation de l'ADN des protéines Fen1 et de manière surprenante de RNAseH I et RnaseHII. Ces analyses ont montré que Fen1 intervient aussi dans la réplication de l'ADN. J'ai pu confirmer que les fragments d'Okazaki font moins de 200 bases et portent une amorce ARN synthétisée par la primase de type eucaryote PriS/L qui est essentielle chez H. Volcanii. En revanche, la primase de type bactérienne putative DnaG peut être inactivée, mais son rôle reste à caractériser. Mes travaux ont démontré qu'avec ses multiples réplicons et des outils génétiques efficaces permettant la caractérisation des gènes, H. Volcanii est un modèle novateur et pertinent pour l'étude de la réplication de l'ADN chez les archaea
During my doctoral work, I have studied DNA replication in the halophilic archaeon Haloferax volcanii. The first aim of this study was to establish the use of available genetic tools for H. Volcanii, including the pop-in/pop-out gene deletion system, for routine work at the laboratory. A partial annotation of the genes implicated in DNA replication and repair allowed the identification of 16 putative Initiator Cdc6/Orc1. The use of genetics combined with nucleotide skews analyses allowed the identification of five replication origins. The main chromosome carries at least two replication origins whereas another origin is used to replicate both pHV1 and pHV4. The in vivo activity of these origins could be confirmed by replication initiation point mapping and DNA two-dimensional gels. The study of PCNA interacting peptides revealed that archaeal RNAseH interacts with PCNA to form an inactive complex. Genetic analyses with H. Volcanii revealed the implication in DNA repair of Fen1 and surprisingly RnaseHI and RnaseHII. These studies also showed that Fen1 is required for DNA replication. I confirmed that H. Volcanii Okazaki fragments are less than 200 bases long and carry an RNA primer synthesized by the essential PriS/L eukaryotic-like primase. On the other hand, the putative bacterial-like primase DnaG can be deleted and its role remains to be characterized. My studies have demonstrated that with its multi-replicon structure and efficient genetic tools for gene characterization, H. Volcanii is a novel and pertinent model for the study of archaeal DNA replication