Добірка наукової літератури з теми "Protéines MFS"

Pour une bonne disponibilité des graines germées sélectionnées et dans un court délai, une technique de "germination par chaleur sèche" modifiée a été initiée. À cet effet les graines ont été traitées à différentes durées de chauffage. Les dosages des polyphénoloxydases (PPO), de la phénylalanine ammonia-lyase (PAL), des composés phénoliques totaux et des protéines ont été réalisés pour 40, 60 et 80 jours à 40 oC. Les résultats obtenus au niveau des albumens sont négligeables. Chez les embryons, les activités enzymatiques et la teneur des protéines ont diminué avec l’augmentation de la durée de chauffage avec respectivement de 177,7 à 35,07 DO/min/g M.S pour les PPO, de 928,54 à 334 mM d’acide cinnamique/min/g M.S pour la PAL et de 92,4 à 50,73 mg/M.S pour les protéines. Quant aux teneurs phénoliques, elles sont significativement plus faibles pour 60 jours (20,64 mg/g M.S). Une durée de chauffage de 40 jours, avec un pourcentage de germination de 49,2%, a entrainé de fortes activités enzymatiques et de fortes teneurs en protéines et en composés phénoliques comparativement à 60 jours (66,3%) et 80 jours (63,73%). Le métabolisme observé varie selon la durée de chauffage.Mots clés : Traitement, durée de chauffage, polyphénoloxydases, phénylalanine ammonia-lyase, composés phénoliques, protéines. English Title: Effect of heating time of oil palm seeds (Elaeis guineensis Jacq.) On some metabolites during the germination processFor a good availability of the selected germinated seeds and within a short time, a modified'''' germination by dry heat'' technique was initiated. For this purpose the seeds were treated at different heating times. Determinations of polyphenoloxidases (PPO), phenylalanine ammonia-lyase (PAL), total phenolic compounds and proteins were performed for 40, 60 and 80 days at 40 oC. The results obtained with albumens are negligible. In embryos, enzymatic activities and protein content decreased with increasing heating time, with respectively 177.7 to 35.07 DO/min/g M.S for PPOs, 928.54 to 334 mM cinnamic acid/min/g M.S for PAL and 92.4 to 50.73 mg/M.S for proteins. Phenolic levels are significantly lower for 60 days (20.64 mg/g M.S.). A 40-day heating period, with a germination rate of 49.2%, resulted in high enzymatic activity and high levels of protein and phenolic compounds compared to 60 days (66.3%) and 80 days (63.73%). The observed metabolism varies according to the duration of heatKeywords: Treatment, heating time, polyphenoloxidases, phenylalanine ammonia-lyase, phenolic compounds, proteins.

O objetivo deste trabalho foi avaliar fontes de amido (milho moído fino x milho processado como pipoca) e fontes protéicas (farelo de soja x uréia x farinha de peixe) com degradabilidades ruminais diferentes para alimentar vacas leiteiras. Foram utilizadas 56 vacas Holandesas com 112 dias em lactação. Os tratamentos foram: MFS (milho moído fino + farelo de soja); PFS (pipoca + farelo de soja); PFP (pipoca + farelo de soja + farinha de peixe); PU (pipoca + farelo de soja + uréia). O tratamento PFS não afetou a produção de leite, mas diminuiu o teor de gordura, a produção de gordura e o teor de proteína do leite. A produção de leite foi maior no tratamento PFS do que nos tratamentos PFP e PU. O tratamento PFP diminuiu o teor de gordura, a produção de gordura e de leite corrigida para 3,5% de gordura, mas aumentou o teor de proteína no leite.

O presente trabalho foi conduzido com o objetivo de avaliar o efeito de uma dieta alimentar contendo fontes protéicas de diferentes degradabilidades ruminais e silagem de milho preparada com ou sem inoculante PIONEER 1174, no desempenho animal. Foi conduzido um experimento fatorial, em que as fontes protéicas (farinha de carne e osso, uréia e uma mistura de ambas [50:50]) foram combinadas com dois tipos de silagens, formando os seis tratamentos experimentais. Foram utilizados 36 novilhos Santa Gertrudis, com 3,5 anos de idade, distribuídos ao acaso nos tratamentos. Diferenças significativas não foram encontradas entre tratamentos para consumo de matéria seca e as interações entre fontes protéicas ou tipos de silagens também não foram significativas. Para o ganho médio diário de peso não houve diferença significativa entre tratamentos, mas a interação entre fontes protéicas mostrou-se significativa. Os animais alimentados com dietas contendo farinha de carne e ossos apresentaram ganhos significativos em relação aos alimentados com uréia. Contrastes entre tipos de silagens não mostraram diferença.

OBJETIVO:Avaliar o comportamento bioquímico do CPC após trilobectomia no rato adulto jovem subnutrido. MÉTODOS: Foram utilizados 137 ratos "Wistar", machos, subnutridos pela oferta de 33% da ingestão diária normal na fase de adaptação e durante o experimento, distribuídos por sorteio, em 9 grupos experimentais, submetidos a três tratamentos (Controle, Toracotomia, Trilobectomia) e sacrificados em três momentos (7, 30 e 90 dias). Na Trilobectomia foram extirpados os lobos médio, acessório e caudal direitos, que representavam 55% do tecido pulmonar. Estudou-se os seguintes atributos e variáveis: massa corpórea e pulmonar, relação entre massa pulmonar e corpórea e conteúdos protéicos pulmonares. RESULTADOS: No lobo cranial e no pulmão esquerdo, tanto a massa quanto os conteúdos protéicos, nos trilobectomizados, foram maiores em todos os momentos do estudo quando comparados aos demais, sendo este aumento suficiente para compensar a perda dos três lobos. Os conteúdos protéicos do lobo cranial e do pulmão esquerdo, nos trilobectomizados, tiveram o mesmo comportamento da massa pulmonar, mas este aumento não foi suficiente para compensar a perda dos três lobos. CONCLUSÕES: Nos ratos adultos subnutridos trilobectomizados ocorre CPC. A recuperação da massa pulmonar é total, mas o conteúdo protéico pulmonar apesar de aumentar, não chega aos valores dos ratos não trilobectomizados.

O objetivo nesta pesquisa foi avaliar o efeito de dois ingredientes protéicos da dieta (farelo de soja e de algodão) e de dois processamentos físicos do concentrado (farelado e extrusado) na terminação de 16 bovinos machos não-castrados da raça Canchim. Avaliaram-se ainda a excreção de nutrientes nos dejetos e o potencial de produção de biogás. Os animais tinham 12 meses de idade e 315 kg PC, em média, e foram confinados em baias individuais durante 147 dias (os primeiros 35 dias foram de adaptação). Como volumoso utilizou-se silagem de milho, em uma relação volumoso:concentrado de 50:50, com base na MS. Os resultados foram analisados em delineamento inteiramente casualizado, em esquema fatorial 2 × 2 (fonte protéica × processamento físico). A fonte protéica influenciou o ganho de peso corporal (1,50 e 1,35 kg/dia para o farelo de soja e de algodão, respectivamente), a conversão alimentar (4,73 e 5,31 kg MS ingerida/kg de ganho de peso, respectivamente) e a eficiência protéica (1,78 e 1,59 kg de ganho de peso/kg PB ingerida, respectivamente). O tratamento físico do concentrado e a fonte protéica não influenciaram a ingestão de MS, a área de olho-de-lombo e a espessura de gordura, estimadas por ultra-som. O balanço de nutrientes foi semelhante entre tratamentos para MS, FDN e FDA, mas a fonte protéica determinou diferenças no balanço de PB. Entre os macro e microminerais quantificados nas fezes, os teores de P e Mg diferiram entre as fontes protéicas e a extrusão aumentou o conteúdo de Ca, com médias de 0,39 e 0,43 g/100 g de MS de dejetos, respectivamente, para os concentrados farelado e extrusado. Os dejetos produziram biogás de maneira efetiva entre o 70º e o 200º dia.

O objetivo deste trabalho foi determinar a digestibilidade, usando óxido crômico (Cr2O3) e FDN indigestível, como indicadores, e a degradação de dietas compostas de milho desintegrado com palha e sabugo (MDPS) em três graus de moagem (3/8, 9/16 e 3/4 de polegadas) e duas fontes protéicas, o farelo de amendoim e o glúten de milho-20, em um experimento fatorial com seis tratamentos. Os graus de moagem de MDPS e as fontes protéicas não tiveram efeito sobre pH, concentração de amônia ruminal, digestibilidade das rações (matéria seca - MS, proteína bruta - PB, extrato etéreo - EE, amido, fibra em detergente neutro - FDN e fibra em detergente ácido - FDA) e degradação ruminal de matéria seca e amido. Os coeficientes de digestibilidade para todos os nutrientes diferiram entre os dois indicadores, sendo maiores para o Cr2O3. Houve interação significativa entre fonte protéica e graus de moagem do MDPS para pH e amônia, somente para a moagem 9/16 polegadas, com menor pH ocorrendo com o farelo de amendoim e a menor concentração de amônia com o glúten de milho-20. Para a degradação ruminal da MS não houve efeito de grau de moagem de MDPS, mas houve efeito de fonte protéica, com degradação efetiva maior com o uso do glúten de milho-20. Quanto à degradação ruminal de amido do MDPS incubado com o concentrado protéico, não houve diferença entre as fontes protéicas, mas, ao se incubar somente o MDPS, a degradação do amido foi maior em animais que estavam recebendo glúten de milho-20.

Foram utilizadas 12 vacas da raça Holandesa distribuídas em três quadrados latinos 4 x 4, organizados de acordo com os dias em lactação, com o objetivo de avaliar o efeito de diferentes fontes protéicas na dieta sobre o consumo e a digestibilidade dos nutrientes e a produção e composição do leite. Utilizou-se silagem de milho como volumoso, na proporção de 60% da MS total. Os concentrados foram constituídos de diferentes fontes protéicas (FS - farelo de soja; FA38 - farelo de algodão 38% PB; FA28 - farelo de algodão 28% PB e FSU - farelo de soja + 5% de uréia/sulfato de amônia na MS do concentrado). Os consumos de MS e MO não diferiram entre as dietas, mas os de NDT foram maiores na dieta controle. Os coeficientes de digestibilidade (CD) da MS e MO foram menores para as dietas FA38, FA28 e FSU. A produção de leite (PL), corrigida ou não para 3,5% (PLC) de gordura, o teor e a produção de gordura do leite não foram influenciados pelas diferentes fontes protéicas, mas a eficiência de utilização da MS e do nitrogênio dietético para a PL e o teor e a produção de proteína do leite foram inferiores para as dietas contendo farelo de algodão em relação àquela com FS. Vacas com produção média de 25 kg de leite/dia podem ser alimentadas com dietas contendo 5% de uréia/sulfato de amônia na MS do concentrado ou farelo de algodão (38% PB) quando utilizada silagem de milho como volumoso na proporção de 60% da MS total das dietas.

Foram estudados 283 idosos do sexo masculino e feminino pertencentes ao projeto multicêntrico "Identificação de Necessidades dos Idosos Residentes em Zona Urbana do Município de São Paulo", estratificados por nível socioeconômico em três regiões do Município de São Paulo, SP - Brasil. Utilizou-se o método de freqüência de alimentos para se obter o padrão alimentar do grupo analisado. Os resultados indicam que no grupo de alimentos energéticos, mais de 90% dos indivíduos das três regiões ingerem feculentos, arroz, pão e macarrão; porém, apenas o arroz e o pão são utilizados diariamente. Quanto ao grupo de alimentos protéicos, 70% ou mais dos idosos consomem feijão, carne de boi, aves, leite e ovos, entretanto, no consumo diário, existe uma diferenciação entre as regiões analisadas. Dos reguladores, mais de 85% dos indivíduos têm por hábito consumir frutas, verduras folhosas e legumes, mas, ao se avaliar o consumo diário, verifica-se que a prática é maior na região de melhor nível socioeconômico. As informações dietéticas mostram que os idosos analisados apresentam o mesmo padrão alimentar de outros grupos populacionais no tocante aos alimentos energéticos, porém, diferem quanto aos protéicos e reguladores.

Objetivou-se avaliar o efeito do fornecimento, no período das águas, de suplementos formulados com diferentes fontes de proteína sobre os parâmetros nutricionais de bovinos de corte em recria. Foram utilizados cinco novilhos mestiços Holandês × Zebu com peso vivo médio inicial de 300 kg, fistulados no esôfago e no rúmen, distribuídos em cinco piquetes de Brachiaria decumbens de 0,3 ha, em delineamento quadrado latino incompleto (5 × 5), com quatro períodos e cinco tratamentos, em quatro períodos experimentais de 14 dias. Como tratamentos, avaliaram-se suplementos à base de farelo de soja (FS), farelo de algodão (FA, 38% PB), farelo de glúten de milho (FGM, 60% PB) e farelo de trigo + uréia (FTU) e um tratamento testemunha, constituído apenas de mistura mineral (MM). A quantidade diária de suplemento fornecida foi fixada para fornecer aproximadamente 180 g de PB/dia. As fontes protéicas afetaram apenas o consumo de carboidratos não-fibrosos (CNF) e o de PB, que foi maior quando fornecido o suplemento à base de farelo de algodão e menor quando fornecida a mistura mineral. Não houve efeito das fontes protéicas sobre as digestibilidades total e parcial dos nutrientes. O pH e os níveis de nitrogênio amoniacal do líquido ruminal (N-NH3) não foram influenciados pelas fontes protéicas avaliadas, mas todos os valores mantiveram-se nos limites favoráveis à digestão da forragem. As fontes de proteína não afetaram a eficiência microbiana, em média 9,96 g PBmic/100g NDT, nem as concentrações de nitrogênio uréico no plasma (NUP), média de 12,78 mg/dL, e a excreção de nitrogênio na urina (NUr), média de 63,14 g/dia.

Quarenta bovinos machos, com 30 meses de idade e 371 kg, foram distribuídos em um delineamento em blocos casualizado com esquema fatorial 3 x 3, para avaliar o desempenho e rendimento de carcaça quando alimentados com diferentes fontes protéicas (Amiferm, uréia e farelo de soja) e volumosos (pastagem de capim-braquiária, cana-de-açúcar e silagem de milho). As dietas foram balanceadas para conterem níveis semelhantes de EM e PB. A interação volumoso x fonte de N não foi significativa para nenhum dos parâmetros estudados. O ganho de peso vivo diário (GPV/dia) dos animais alimentados com cana-de-açúcar (0,83 kg) não diferiu dos mantidos em pastagem (0,82 kg), mas ambos foram menores que dos animais alimentados com silagem de milho (1,09 kg). As diferentes fontes de N proporcionaram GPV/dia semelhantes, com valores de 0,94; 0,83 e 0,97 kg, para os animais que receberam uréia, Amiferm e farelo de soja, respectivamente. As dietas contendo farelo de soja proporcionaram maior ganho de carcaça diário (0,57 kg) em relação ao uso de Amiferm, não diferindo da uréia (0,55 kg). Não houve diferença entre volumosos e fontes nitrogenadas para rendimento de carcaça, rendimento de carcaça do corpo vazio, rendimento de carcaça do ganho de peso e espessura de gordura, com média de 51,03%, 54,49%, 60,10% e 8,5 mm, respectivamente. O uso de Amiferm proporcionou ganhos de peso e rendimento de carcaça semelhantes às demais fontes protéicas.

A l’heure actuelle, suite à une mauvaise utilisation des antibiotiques, nous faisons face à un problème majeur de santé publique. En effet la résistance aux antibiotiques de certaines souches bactériennes rend le traitement des infections très complexe. Dans ce contexte, le présent projet de thèse concerne l'étude d'un complexe d'efflux bactérien capable de transporter des antibiotiques du cytoplasme vers l'extérieur de la cellule. Ce complexe est composé d'un transporteur de la membrane interne appartenant à la Major Facilitator Superfamily (MFS) (EmrB, E. coli multidrug resistance), d'un canal de la membrane externe TolC (Tolerance to Colicin E1) et d'un adaptateur périplasmique (EmrA, E. coli multidrug resistance). Contrairement aux systèmes d'efflux de type RND (tels que AcrAB-TolC), peu de choses sont connues sur le système EmrAB-TolC de type MFS. Il est donc important d'étudier l'ensemble du complexe sur le plan structurale et fonctionnel afin d'identifier les différences entre ces deux types de systèmes d’efflux. L'objectif de mon projet de thèse était d'étudier au moins un complexe EmrAB-TolC d'un point de vue structurale. Ainsi durant mes études, le but était d'isoler le complexe directement des bactéries surexprimant les trois partenaires protéiques. Dans un premier temps, 15 systèmes homologues EmrAB-TolC ont été identifiés et leurs gènes correspondants amplifiés à partir de l'ADN génomique de différentes bactéries à Gram négatif. Parmi les gènes des 15 systèmes, les gènes codant pour les systèmes d’E. coli et de V. cholerae ont été étudiés plus en détail. Les vecteurs d'expression codaient pour des marqueurs fluorescents pour la mesure des niveaux d'expression de différentes protéines et pour l'étude de la formation des complexes. Dans un premier temps, les différents niveaux d'expression des protéines (EmrB-mRFP1 et EmrA-sfGFP) ont été étudiés pour plusieurs souches d'expression d'E. coli en mesurant les niveaux de fluorescence rouge et verte et par Western blot (anti-His, Myc et Strep pour EmrB, EmrA et TolC). La souche d'E. coli C41(DE3) était la mieux adaptée pour la co-expression d’EmrAB-TolC. Dans un deuxième temps, la méthodologie FSEC (Fluorescence detection Size Exclusion Chromatography) a été utilisée pour identifier un complexe adapté à l'étude structurale. Ainsi, cette méthode a permis d'observer que le complexe EmrAB-TolC d'E. coli était produit en plus grande quantité que celui de V. cholerae. Le protocole final de co-purification consiste à effectuer une lyse douce des bactéries à l'aide du lysozyme, puis après solubilisation avec le DDM, la purification est débutée par une étape de chromatographie d'affinité Ni2+-NTA suivie d'une étape de chromatographie d'exclusion stérique. Enfin, les fractions contenant les trois partenaires protéiques sont utilisées pour l'échange de détergent par l'amphipol A8-35 avant l'étude structurale par microscopie électronique. Les images de microscopie électronique en coloration négative montrent des objets allongés d'une longueur de 33 nm en vue de côté. Une image moyenne d'EmrAB-TolC montre des similitudes avec celle du complexe AcrAB-TolC observé dans des conditions similaires. Les similitudes concernent les densités caractéristiques de TolC. Des différences ont été trouvées pour la partie inférieure d'EmrAB qui est plus fine que la partie inférieure d'AcrAB. Les densités visibles au-dessus de l'anneau d'amphipol correspondent à EmrA, qui présente une structure en forme de canal comme observé avec AcrA. Le canal semble cependant s'étendre plus loin vers la ceinture d'amphipol. Comme EmrB n'a pas de domaine périplasmique étendu présent dans le cas des protéines RND, ces densités sont donc uniquement attribuées à EmrA. EmrA, de l'autre côté, contacte TolC de manière similaire à l'interaction d'AcrA/MexA avec leurs canaux de la membrane externe respectifs (TolC/OprM) de façon «tip-to-tip»
Currently, due to the misuse of antibiotics, we are facing a major public health problem. The resistance to antibiotics of certain bacterial strains makes the treatment of infections very complex. In this context, the present thesis project concerns the study of a bacterial efflux complex capable of transporting antibiotics from the cytoplasm to the outside of the cell. This complex is composed of an inner-membrane Major Facilitator Superfamily (MFS) transporter (EmrB, E. coli multidrug resistance), a channel of the outer membrane TolC (Tolerance to Colicin E1) and a periplasmic adapter (EmrA, E. coli multidrug resistance). Unlike RND-type efflux systems (such as AcrAB-TolC), little is known about the MFS-type EmrAB-TolC system. It is therefore important to study the entire complex on a structural and functional level, to analyse the marked differences between these two types of transport systems. The goal of my thesis project was to study at least one EmrAB-TolC complex from a structural point of view. For my studies the aim was to isolate the complex directly from bacteria overexpressing the three protein partners. In a first step, 15 homologous EmrAB-TolC systems were identified and their corresponding genes amplified from genomic DNA of different Gram-negative bacteria. Among the genes of the 15 systems, the genes coding for the E. coli and V. cholerae systems were further studied. The expression vectors encoded fluorescent markers for the monitoring of the expression levels of different proteins and for studying the formation of complexes. In a first step, the different protein expression levels (EmrB-mRFP1 and EmrA-sfGFP) were studied for several expression strains of E. coli by measuring the red and green fluorescence levels and by Western blot (anti-His, Myc, and Strep for EmrB, EmrA, and TolC). The E. coli strain C41(DE3) was best suited for co-expression of EmrAB-TolC. In a second step, the FSEC (Fluorescence detection Size Exclusion Chromatography) methodology was used to identify a complex suitable for structural study. Thus this method enabled the observation that the EmrAB-TolC complex of E. coli was produced in higher amount than that of V. cholerae. The final co-purification protocol consists in perfoming a gentle lysis of the bacteria using lysozyme, then after solubilization with DDM, the purification is started by a Ni2+-NTA affinity chromatography step followed by a size exclusion chromatography step. Finally, the fractions containing the three protein partners are used for the detergent-exchange by amphipol A8-35 before the structural study by electron microscopy. Negative stain EM-micrographs displayed elongated objects with a length of 33 nm in side view. An average image of EmrAB-TolC shows similarities to that of the AcrAB-TolC complex observed under similar conditions. Similarities included the characteristic densities of TolC. Whereas differences were found in the lower part of EmrAB which is thinner than the lower part of AcrAB. The densities visible above the amphipol-ring correspond to EmrA, which displays a channel-like structure as in AcrA. The channel however seems to extend further towards the amphipol belt. Since EmrB does not have an extended periplasmic domain as the RND proteins have, these densities are therefore solely assigned to EmrA. EmrA, on the other side, contacts TolC akin to the interaction of AcrA/MexA to their cognate outer membrane channels (TolC/OprM) in a ‘tip-to-tip’ fashion
Aufgrund des Missbrauchs von Antibiotika stehen wir derzeit vor einem großen Problem deröffentlichen Gesundheit. Die Antibiotikaresistenz bestimmter Bakterienstämme macht die Behandlungvon Infektionen sehr komplex.In diesem Zusammenhang befasst sich diese Arbeit mit der Untersuchung eines bakteriellenEffluxkomplexes, der Antibiotika vom Zytoplasma zur Außenseite der Zelle transportieren kann. DieserKomplex besteht aus einem Major Facilitator Superfamily (MFS) Transporter der inneren Membran(EmrB, E. coli multidrug resistance), einem Kanal der äußeren Membran TolC (Tolerance to Colicin E1)und einem periplasmatischen Adapter (EmrA, E. coli multidrug resistance).Im Gegensatz zu Effluxsystemen vom RND-Typ (wie AcrAB-TolC) ist über das EmrAB-TolCSystemvom MFS-Typ wenig bekannt. Es ist daher wichtig, den gesamten Komplex auf struktureller undfunktioneller Sicht zu untersuchen, um die deutlichen Unterschiede zwischen diesen beiden Arten vonEffluxsystemen zu analysieren.Ziel meiner Doktorarbeit war es, mindestens einen EmrAB-TolC-Komplex aus struktureller Sichtzu untersuchen. Ziel meiner Studien war es, den Komplex direkt aus Bakterien, die die dreiProteinpartner überexprimieren, zu isolieren. In einem ersten Schritt wurden 15 homologe EmrAB-TolCSystemeidentifiziert und ihre entsprechenden Gene aus der genomischen DNA verschiedenergramnegativer Bakterien amplifiziert. Unter den Genen der 15 Systeme wurden die Gene, die für die E.coli und V. cholerae Systeme kodieren, weiter untersucht. Die Expressionsvektoren codiertenfluoreszierende Marker zur Untersuchung der Expression verschiedener Proteine und zur Untersuchungder Komplexbildung. In einem ersten Schritt wurden die verschiedenen Niveaus der Proteinexpression(EmrB-mRFP1 und EmrA-sfGFP) für mehrere E. coli Expressionsstämme untersucht durch Messen derroten und grünen Fluoreszenzniveaus und durch Western Blot (Anti-His, Myc und Strep für EmrB, EmrAund TolC). Der Stamm von E. coli C41(DE3) war am besten für die Koexpression von EmrAB-TolC14 geeignet. In einem zweiten Schritt wurde die FSEC-Methode (Fluorescence Detection Size ExclusionChromatography) verwendet, um einen für Strukturuntersuchungen geeigneten Komplex zuidentifizieren. Somit konnte mit dieser Methode festgestellt werden, dass der EmrAB-TolC-Komplex vonE. coli in größerer Menge als der von V. cholerae produziert wurde.Das endgültige Ko-Reinigungsprotokoll besteht darin, eine sanfte Lyse der Bakterien unterVerwendung von Lysozym durchzuführen. Nach der Solubilisierung mit DDM wird die Reinigung durcheinen Ni2+-NTA Affinitätschromatographieschritt gefolgt von einemGrößenausschlusschromatographieschritt gestartet. Schließlich werden die Fraktionen, die die dreiProteinpartner enthalten, für den Detergensaustausch durch Amphipol A8-35 vor derStrukturuntersuchung durch Elektronenmikroskopie verwendet.EM-Aufnahmen mit negativer Kontrastierung zeigten längliche Objekte mit einer Länge von 33nm in Seitenansicht. Ein durch Mittlung der Partikel erhaltenes Bild von EmrAB-TolC zeigt Ähnlichkeitenmit dem des AcrAB-TolC-Komplexes, der unter ähnlichen Bedingungen beobachtet wurde.Ähnlichkeiten schlossen die charakteristischen Dichten von TolC ein. Während im unteren Teil vonEmrAB Unterschiede festgestellt wurden, der dünner ist als der untere Teil von AcrAB. Die über demAmphipolring sichtbaren Dichten entsprechen EmrA, das wie bei AcrA eine kanalartige Strukturaufweist. Der Kanal scheint sich jedoch weiter in Richtung des Amphipolgürtels zu erstrecken. Da EmrBkeine erweiterte periplasmatische Domäne aufweist wie die RND-Proteine, werden diese Dichten daherausschließlich EmrA zugeordnet. Auf der anderen Seite kontaktiert EmrA TolC, ähnlich der Interaktionvon AcrA/MexA mit ihren jeweiligen Außenmembrankanälen (TolC/OprM), von “tip-to-tip”

La ferroportine-1 (FPN1), seul exportateur de fer connu chez les mammifères, est exprimée à la surface de différentes cellules spécialisées du métabolisme de fer. Cette protéine appartient à la famille des protéines MFS « Major Facilitator Superfamily » et libère le fer intracellulaire au travers de changements conformationnels oscillant entre une structure ouverte vers le cytoplasme (« Inward-Facing ») et une structure ouverte vers la circulation sanguine (« Outward-Facing » ; OF). Il a été rapporté que FPN1 est préférentiellement localisée dans les radeaux lipidiques, des microdomaines de la membrane plasmique particulièrement enrichies en cholestérol (CHOL). Au début de la thèse nous avons formulé l’hypothèse que des interactions directes entre FPN1 et les lipides environnants, notamment le CHOL, sont nécessaires pour stabiliser FPN1 dans la conformation OF et/ou favoriser certains changements conformationnels. J’ai confirmé la colocalisation préférentielle de FPN1 dans les radeaux lipidiques des cellules embryonnaires de rein humain. La dépendance de la fonction d’export de fer de FPN1 au CHOL a été examinée par déplétion/réplétion (CHOL/épicholestérol). Des expériences de criblage mutationnel appuyées par des analyses structurelles de la structure expérimentale 3D de FPN1 dans un état OF ont permis d’identifier trois sites de liaison possibles au CHOL (de types CARC/CRAC). Sur la base de simulations de dynamique moléculaire dans un environnement lipidique simplifié de type POPC, nous identifions certaines interactions entre des résidus chargés de la structure 3D FPN1 humaine et les têtes polaires de phospholipides environnants, qui pourraient faciliter les changements conformationnels du transporteur. Je montre également, pour la première fois, que la fonction de FPN1 est modulée par des composés amphiphiles de synthèse, l’ohmline et ses dérivés. Au travers du développement d’une nouvelle approche in vitro (PLA : « Proximity Ligation Assay »), j’indique que l’ohmline délocalise FPN1 des radeaux lipidiques, diminuant ainsi son interaction avec son partenaire fonctionnel, la céruloplasmine (CP), une ferroxydase qui catalyse l'oxydation du fer ferreux, et en conséquence la fonction d’export du fer
Ferroportin-1(FPN1), the only known mammalian iron exporter, is expressed on the surface of various specialized cells involved in iron metabolism. This protein belongs to the Major Facilitator Superfamily (MFS) and releases intracellular iron through conformational changes oscillating between an open structure towards the cytoplasm (Inward-Facing) and an open structure towards the bloodstream (Outward-Facing; OF). It has been reported that FPN1 is preferentially localized in lipid-rafts, microdomains of the plasma membrane particularly enriched in cholesterol (CHOL). Early in the thesis, we hypothesized that direct interactions between FPN1 and surrounding lipids, notably CHOL, are necessary to stabilize FPN1 in the OF conformation and/or promote certain conformational changes. I confirmed the preferential colocalization of FPN1 in the lipid rafts of human embryonic kidney cells. The dependence of FPN1's iron export function on CHOL was examined by depletion/repletion (CHOL/epicholesterol). Mutational screening experiments supported by structural analyses of the experimental 3D structure of FPN1 in an OF state have identified three possible CHOL-binding sites (of the CARC/CRAC type). Based on molecular dynamics simulations in a simplified POPC-type lipid environment, we identify certain interactions between charged residues of the human FPN1 3D structure and the polar heads of the surrounding phospholipids, which could facilitate conformational changes of the transporter. Besides, I show, for the first time, that FPN1 function is modulated by synthetic amphiphilic compounds, ohmline and its derivatives. Through the development of a novel in vitro approach (PLA: Proximity Ligation Assay), I show that ohmline delocalizes FPN1 from lipid-rafts, thereby decreasing its interaction with its functional partner, ceruloplasmin (CP), a ferroxidase that catalyzes the oxidation of ferrous iron, and consequently its iron export function

Malgré sa diffusion rapide dans le domaine des biomolécules, plusieurs problèmes restent à résoudre avant que la RMN du solide à haute résolution soit prête à faire face à des applications complexes. Afin d’étendre ses capacités, les objectifs de cette thèse sont de deux ordres: a) établir un nouveau système modèle, plus complexe que les petites protéines globulaires et b) développer de nouvelles expériences de RMN afin d'améliorer la sensibilité et la résolution des méthodes pour l'attribution de résonances. Le domaine N-terminale de l’unité de l'ADN polymérase III de E. coli a été choisi comme système cible. Les conditions de préparation de l’échantillon sont obtenues grâce aux processus de screening à haut débit, et l'attribution quasi exhaustive des résonances est effectuée par l'application des expériences bien établies basées sur les irradiations rf à haute puissance et la rotation à l'angle magique (MAS) à basse fréquence. Nous montrons que l'utilisation de vitesses à l'angle magique "ultra-rapides" (60 kHz) rend possible l'usage d'expériences aux "puissances faibles" affichant une augmentation extraordinaire de résolution et sensibilité, et permettant l'acquisition des transferts par polarisation croisée, des corrélations entre les liaisons chimiques et des corrélations détectées par 1H. Des faibles largeurs de pics sur les spectres 1H sont obtenues pour des échantillons de protéines entièrement protonées à l’état solide sans qu'une dilution dans un milieu deutéré soit nécessaire. La dernière partie de la thèse concerne l’étude de phases cristaux liquides (LX) thermotropes d'un smectogen de Vries , le dérivé (S)-hexyl-lactate, abrégé 9HL, sélectivement deutéré
Despite the rapid diffusion of solid-state NMR (ssNMR) in the area of biomolecules, its application is far away of being systemic, and many problems remain however tobe solved before it is applied to the study of challenging solid protein assemblies. In order to extend the capabilities of ssNMR to larger substrates, the objectives of this thesis are twofold: a) to establish a new, large and more complex model system, and b) to develop new, sophisticated NMR experiments in order to improve the sensitivity and the resolution of the currently existing schemes for resonance assignment. The N-terminal domain of the Polymerase subunit III of E. coli was chosen as a target system. Sample preparation conditions are obtained, notably in combination with automated screening processes, and almost complete resonance assignment is performed based on high-power rf irradiations and slow magic-angle spinning (MAS. We show that the use use of MAS at so-called ultra-fast spinning rates (60 kHz makes possible the use of "totally low power" experiments. This yields an extraordinary increase in resolution and sensitivity, enabling the acquisition of selective cross polarization (CP) transfers, through-bond correlations and 1H-detected correlations. Narrow 1H NMR line widths and robust backbone assignment can be obtained for fully protonated medium-size protein samples in the solid state under ultra-fast magic-angle spinning, without any need for dilution against a deuterated background. The final part of this thesis concerns the study of thermotropic liquid crystals (LX) phases of a de Vries smectogen, the (S)-hexyl-lactate derivative abbreviated as 9HL, selectively deuterated
Nonostante la rapida diffusione della RMN allo stato solido (ssNMR) nell’ambito delle biomolecule, molti problemi rimangono da risolvere prima che quest’ultima possa essere applicata ad applicazioni più complesse. Allo scopo di estendere le sue potenzialità, gli obiettivi di questa tesi sono duplici. a) stabilire un nuovo sistema modello, più complesso delle semplici proteine globulari e b) sviluppare nuovi e piu sofisticati esperimenti NMR al fine di migliorare la sensibilità e la risoluzione dei metodi attualmente esistenti per l'assegnazione delle risonanze. Il dominio N-terminale dell’unita ε della DNA Polimerasi III di E.Coli è stato scelto come sistema bersaglio. Le condizioni di preparazione del campione sono ottenute grazie a processi di screening ad alta capacita, e l’assegnazione quasi complete delle risonanze è effettuata tramite l’applicazione di esperimenti routinari basati su irradiazioni RF a alta potenza e rotazioni all’angolo magico a bassa frequenza. Mostriamo che l’utilizzo di rotazioni all’angolo magico “ultra-MAS” (60 kHz) rende possibile l’uso di esperimenti “a basse potenze” mostrando uno straordinario aumento di risoluzione e sensibilità, e permettendo l’acquisizione di trasferimenti di polarizzazione selettivi, di correlazioni scalari attraverso i legami chimici e di correlazioni acquisite al protone. Larghezze di linea sottili al protone sono ottenute per campioni di proteine interamente protonate allo stato solido senza che sia necessaria diluizione in ambiente deuterato. L’ultima parte della tesi riguarda lo studio di fasi liquido-cristalline termotropiche di uno smettogeno de Vries, il derivato dello (S)-esil-lattato, abbreviato come 9HL, selettivamente deuterato

La RMN est un outil analytique extrêmement puissant pour l’analyse quantitative et structurale, et est très utilisée en biologie structurale. C’est dans ce contexte que nous avons choisi d’étudier les interactions par RMN. Le premier système choisi est un système de polymères, les PEO. Ils sont caractérisés par plusieurs grandeurs physiques dont l’indice de polydispersité. Cet indice représente la distribution de taille d’une population de polymères. Nous avons développé une nouvelle méthode de diffusion par RMN, la DOSY afin d’accéder à cet indice : J. Viéville et al. / Journal of Magnetic Resonance 212 (2011)169–173 Le deuxième système complexe étudié est un type de molécules chimiques mimétiques de l’ADN, les PNA, acides nucléiques peptidiques. Les PNA possèdent des bases nucléiques leur permettant de former des liaisons avec l’ADN ou l’ARN. Nous avons montré par des analyses de RMN que les PNA en solution peuvent former des complexes très stables avec des températures de fusion élevées. Ces analyses RMN sont complétées par des analyses de dichroïsme circulaire.Afin de compléter notre panel d’études sur les interactions moléculaires par RMN, nous avons étudié les interactions protéine-ligand avec greffage de la protéine sur phase solide : J.M.P. Viéville et al. / Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 89 (2014) 18–23
NMR is a powerfull technique we decided to extend to follow interactions in complex mixtures. First part is about polydispersity index of polymer which is an important physical parameter when working with polymers. We developed here a new method, based on PEO analysis, using diffusion experiments (DOSY) by NMR to assess the polydispersity index: J. Viéville et al. / Journal of Magnetic Resonance 212 (2011) 169–173. In a second time, we worked on peptidic nucleic acids, PNA. These chemicals molecules are designed to bind DNA or RNA for clinical studies. We studied PNA in solution, by NMR to showwhich kind of interactions they form on themselves. We found very stable complexes with high fusion temperatures. Circular dichroism measurements were helpful for fusion temperature determination and structural studies. To complete this panel, we were interested in the study of protein-ligand interaction. We developed a new way to follow them, using a grafted protein on a solid phase based on HR-MAS NMR technology: J.M.P. Viéville et al. / Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 89 (2014) 18–23

Les protéines membranaires représentent près de 30% des phases ouvertes de lecture des génomes et sont les médiateurs de nombreux événements membranaires vitaux pour la cellule et les organismes. Les bases moléculaires de leurs activités demeurent largement méconnues. Moins de 1% des structures déposées dans la Protein Data Bank correspondent à ce type de protéines. Nos connaissances sur leur dynamique sont rudimentaires, alors que la nature des membranes biologiques laisse penser qu'elle est complexe et essentielle à leurs activités. Au cours des dix dernières années, des progrès techniques et méthodologiques significatifs ont été réalisés en RMN et ont ouvert de nouveaux champs d'applications, notamment celui de l'étude structurale et dynamique des protéines membranaires. L'utilisation conjointe de méthodes de marquage isotopique élaborées (perdeuteriation, protonation sélective des méthyles, marquage fractionnel, marquage inverse), de spectromètres à haut champ équipés de cryosondes et d'expériences multidimensionnelles de type TROSY nous ont permis de déterminer la structure tridimensionnelle du domaine transmembranaire de la protéine OmpA de Klebsiella pneumoniae (KpOmpA) de 210 résidus et de caractériser sa dynamique à différentes échelles de temps en micelles de détergent par RMN en solution. .
The structure determination of integral membrane protein is one of the most challenging applications of current structural biology. They constitute about one third of all proteins in living organisms and are core components of many essential cellular processes. Only 0. 7% entries in the Protein Data Bank represent three-dimensional structures of membrane proteins. Our understanding about their dynamics is even more rudimentary, while the nature of biological membranes suggests that it is both complex and critical to their functions. In this regard, important advances in NMR spectroscopy have been made in the past ten years that have extended the range of molecules that are amenable to investigation, notably membrane proteins. We report herein the three dimensional structure of the transmembrane domain of OmpA from klebsiella pneumoniae (KpOmpA) in detergent micelles (60-70 kDa) by solution state NMR. For such purpose, the so-called Transverse Relaxation-Optimized SpectroscopY approaches at high magnetic field, combined to cryogenic technology and refined isotope labelling strategies has been used. The KpOmpA dynamics was assessed in a residue specific manner at various timescales by [15N, 1H]-NOEs (ps-ns), exchange broadening (ms) and 1H-2H chemical exchange (hours-weeks). .

Plusieurs études ont découvert et renforcé l'implication de la dynamique mitochondriale dans le cancer. J'ai découvert un rôle inattendu des protéines kinases de la famille PKD dans la fission mitochondriale. La perte de l'activité PKD a conduit à un blocage de la fission et a entraîné une élongation significative des mitochondries par fusion continue. D'un point de vue mécanique, nous avons montré que les protéines PKD régulent la dynamique mitochondriale en activant le facteur de fission mitochondrial (MFF) par phosphorylation de plusieurs sites. MFF agit comme un récepteur principal de la GTPase DRP1, qui resserre les mitochondries, et il est essentiel à une bonne division mitochondriale. Les trois membres de la famille PKD peuvent phosphoryler MFF. La phosphorylation de MFF est médiée par PKD et la fragmentation mitochondriale se produit pendant la mitose. Comme démontré dans études sur les phosphoprotéomes, la phosphorylation du MFF est augmentée dans les cancers très mitotiques. Ainsi, l'axe de signalisation PKD-MFF régulant la dynamique mitochondriale en mitose pourrait devenir une voie thérapeutique attrayante pour le traitement du cancer
Over the last two decades, multiple studies have uncovered and strengthen the implication of mitochondrial dynamics in cancer. During my thesis, I discovered an unanticipated role for the PKD kinase family in mitochondrial fission. Loss of PKD activity led to blockade of mitochondrial fission and resulted in a significant elongation of mitochondria by unopposed fusion. Mechanistically, we showed that PKDs regulated mitochondrial dynamics by activating the mitochondrial fission factor (MFF) through phosphorylation of multiple sites. MFF acts as a main receptor for the large GTPase DRP1, which constricts mitochondria, and it is critical for proper mitochondrial division. All three PKD family members could phosphorylate MFF. PKD-mediated MFF phosphorylation and mitochondrial fragmentation occurred specifically during mitosis. As MFF phosphorylation was found to be significantly upregulated in highly mitotic cancers, which was evidenced in several global phosphoproteome studies, the discovered PKD-MFF signaling axis regulating mitochondrial dynamics in mitosis could become an attractive therapeutic avenue for cancer treatment

La Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) s'est révélée particulièrement efficace dans l'étude des macromolécules biologiques in situ (et in vivo). Les premières applications ont d'abord porté sur l'étude de petites molécules en solution puis, rapidement, l'intérêt s'est déplacé vers l'analyse des protéines en solution. Depuis quelques années, la RMN du solide en rotation à l'angle magique (MAS) est apparue comme une technique adaptée dans l'étude structurale des protéines membranaires dans leurs membranes natives. Il est en effet établi que les deux constituants majeurs des membranes biologiques (lipides et protéines membranaires) sont intimement liés, et l'étude de leurs influences réciproques permettrait d'obtenir une vision plus complète de celles-ci. Afin d'apporter certaines d'informations à cette question, nous avons choisi un modèle particulier : la souche C43(TDE3) et son réseau membranaire formé suite à la sur-expression de la sous-unité b de l'ATP synthase FoFi d'E. Co/i. L'étude de la formation de ce réseau, de l'implication de la sous-unité b (RMN MAS 13C/15N) et des lipides (spectrométrie de masse et RMN 31P), a permis d'obtenir certaines données quant à l'importance de ces deux composants dans la mise en place et stabilisation de ce réseau. De plus, au cours de ce projet, l'utilisation combinée de la RMN 'H et du MAS s'est révélée particulièrement adaptée dans l'étude de la dynamique des membranes de cellules entières selon diverses conditions de croissance. De fait, les différentes méthodes développées et utilisées au cours de projet pourraient s'avérer utiles dans l'étude de diverses membranes biologiques, que ce soit du point de vue protéique ou lipidique
Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy has revealed efficient for in situ (and in vivo) structural studies of biological macro-molecules. The first studies focused on small soluble molecules, and quickly, the interest shifted toward the study of soluble proteins. For few years now, magie-angle spinning (MAS) solid-state NMR has appeared as a technique of choice to obtain structural information about membrane proteins in their native environment (biological membranes). It is now well established that the two major components of biological membranes, that is to say: lipids and membrane proteins, are intimately connected, and the study of their mutual influences constitute a crucial step in die comprehension of biological membranes as a whole. In order to bring some dues regarding this question we have chosen a particular system: the strain C43(70E3) and its network of proliferating membranes, formed after the over-expression of the b subunit of the ATP synthase F1F0 of E. Coli. The analysis of the organisation of this network, and the involvement of the b subunit (via MAS NMR 13C/15N) and lipids (via mass spectrometry and MAS NMR 31P) allowed us to obtain some information regarding the importance of these two components in the establishment and stabilisation of this membrane network. Moreover, during this project, the combination of 2H NMR and MAS appeared as a technique particularly suited for die study of biological membranes of whole cells (alive) under various growth conditions. Also, the methods used and developed during this project could prove beneficial in the study of various biological membranes, from a proteic and lipidic stand point

À ce jour, nos connaissances sur les propriétés structurales et fonctionnelles des métalloprotéines sont essentiellement basées sur des structures résolues par des méthodes de diffraction à rayons X appliquées à des échantillons monocristallins. Cependant, certaines protéines ne cristallisent pas ou cristallisent sous une forme qui n’est pas manipulable ou compatible avec des techniques des diffraction, et même si une structure à très haute résolution est disponible, la nature de l’ion métallique, sa géométrie de coordination ou son état d’oxydation restent souvent indéterminés.La Résonance Magnétique Nucléaire en rotation à l’angle magique (MAS NMR) est une technique très performante pour l’étude de systèmes biologiques et pour la caractérisation de la structure du site actif des métalloprotéines paramagnétiques, mais son application à l’analyse des noyaux proches d’un site paramagnétique est limitée à cause de la résolution et de la sensibilité faibles.L’objectif de cette thèse a été de développer des méthodes RMN basées sur des hautes fréquences de rotation (60-111 kHz MAS) pour faire face à ces problématiques. Un répertoire de séquences d’impulsion pour la détection et l’attribution des noyaux à proximité d’un centre paramagnétique est proposé, et à l’aide de méthodes de calculs de pointes, les données expérimentales acquises sont converties en contraintes structurales afin de déterminer la géométrie du site actif à l’échelle atomique. Cette approche est validée avec l’analyse de sites actifs de deux protéines microcristallines contenants différents ions paramagnétiques : Fe, Cu et Co. Ensuite, des données préliminaires sur un transporteur membranaire d’ions métalliques divalents non cristalline sont présentées.Les méthodes analytiques présentées ici constituent un ensemble d’outils indispensable pour l’élucidation de la structure et la fonction des sites métalliques de systèmes macromoléculaires biologiques
Most of our understanding of metalloproteins derives from atomic or molecular structures obtained from diffraction methods on single crystal samples. However, not all proteins are amenable for diffraction studies, and even when a highly-resolved structure is available, often the nature of the metal ion, its coordination geometry or its oxidation state are not determined. The aim of the present thesis is the investigation of structural properties of metal sites in paramagnetic metalloproteins by Magic-Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance (MAS NMR). MAS NMR is a powerful technique for the investigation of biological systems, and may represent a direct probe of the structure at the active site of paramagnetic metalloproteins. However, it suffers from limited sensitivity and resolution when applied to nuclei close to a paramagnetic center.In this thesis, we address these limitations by developing NMR methods based on ultra-fast (60-111 kHz) MAS rates. A “toolkit” of suitably designed pulse sequences is built for the detection and the assignment of nuclei in close proximity of a paramagnetic center. State-of-the-art computational techniques are also employed to convert the experimental data into structural restraints for obtaining atomic-resolution geometries of active sites. We benchmark this approach with the study of Fe, Cu and Co sites in two microcrystalline proteins, and we also provide preliminary data on a non-diffracting divalent metal ion transporter in lipid membranes. We anticipate that the techniques described here are an essential tool to elucidate many currently unanswered questions about structure and function of metal sites in structural biology

Les mécanismes de type prion sont désormais reconnus comme sous-tendant la plupart des maladies neurodégénératives humaines, avec en premier lieu la maladie d’Alzheimer (MA) au niveau de ses 2 marqueurs spécifiques, l’amyloïde β (Aβ à l’origine de l’hypothèse étiopathogénique de la cascade amyloïde) et la protéine Tau phosphorylée. Par ailleurs la protéine du prion (PrPC) est décrite comme interagissant à de multiples niveaux avec le métabolisme de l’Aβ sans que les mécanismes physiopathologiques sous-jacents n’aient pu être expliqués. Pour sortir de l’impasse actuelle concernant le développement d’approches thérapeutiques efficaces pour la MA, l’industrie pharmaceutique a besoin de modèles expérimentaux innovants. En effet, à ce jour aucun modèle in vivo, en dépit des progrès réalisés avec les souris transgéniques, n’arrive à refléter la complexité cérébrale humaine ni à mimer une MA clinique. Les cultures in vitro en 2D sont quant à elles très éloignées des situations conduisant à l’accumulation d’agrégats protéiques pathologiques. Le but de notre thèse a été d’utiliser dans le domaine des neurosciences les nouvelles perspectives de recherche ouvertes par les technologies des cellules souches pluripotentes induites (cellules iPS) en développant un modèle de différentiation en 3D pour obtenir des organoïdes cérébraux humains (OC) (mini cerveaux). Leur capacité d’auto-organisation en 3D de tissu neuroectodermique nous a permis de recréer un système complexe mimant différentes structures cérébrales humaines dans lesquelles nous avons pu caractériser les marqueurs attendus. L’étude de l’expression des protéines d’intérêt APP et PrPC pendant la différentiation neurale a permis de caractériser la modulation des niveaux des deux protéines en fonction du temps de culture. Afin d’orienter le modèle vers des mécanismes d’accumulation protéique de type MA, nous avons testé différents inducteurs chimiques dont l’Aftin-5 qui est capable de moduler les voies post-traductionnelles de l’APP. Plusieurs stratégies de traitement ont été adoptées pour induire le clivage de l’APP et la génération d’Aβ. La production des fragments solubles Aβ38, Aβ40, Aβ42 a été mise en évidence par ELISA. Les niveaux générés sont reproductibles et l’augmentation du ratio Aβ42/Aβ40 est cohérente avec les données extrapolées des modèles murins et humains, ce qui a permis de valider notre modèle. Les niveaux d’expression génique et protéique de PrPC et de APP suite au traitement ont été analysés afin de mieux déterminer le rôle de l’interaction entre ces deux facteurs. L’objectif à long terme consiste à améliorer ce modèle, dont les limites actuelles sont notamment l’absence de vascularisation et le niveau de maturation du tissu neural. Le défi majeur dans le cadre de la culture des OC consiste donc à favoriser l’intégration du système vasculaire, et par ailleurs à accélérer le vieillissement in vitro pour l’étude de maladies neurodégénératives. La perspective de pouvoir automatiser le système de culture des OC permet d’envisager l’utilisation de ce modèle à plus grande échelle dans le cadre de test de cytotoxicité et/ou de criblage pharmacologique à haut débit pour identifier de nouvelles molécules thérapeutiques pour la MA
Prion-like mechanisms are known to underlie most of human neurodegenerative diseases including Alzheimer’s disease (AD), which is characterized by two important pathological markers, β amyloid (or Aβ at the origin of the etiopathogenic amyloid cascade hypothesis) and phosphorylated tau protein. Furthermore, the prion protein (PrPC) interacts at multiple levels with the metabolism of Aβ, by mechanisms which are not well understood. To overcome the current limits in the development of efficient strategies to treat AD, the pharmaceutical industry requires innovative experimental models. However, even if a lot of progress has been achieved by using transgenic mouse models, to date no in vivo model can reflect the complexity of human brain or reproduce a clinical context. 2D in vitro cell culture models are unable to allow the aggregation and accumulation of pathological proteins as observed in vivo. The aim of this study consists in taking advantage of the research prospects offered by induced pluripotent stem cell (iPSCs) in the field of neurosciences. iPSCs can be used to generate 3D models of differentiation also called human cerebral organoids or mini-brains (MBs). Their ability to self-organise in 3D neuroectodermic tissue leds to a complex system that mimics different human cerebral structures in which we were able to characterize the expected markers. The study of the two proteins of interest (APP and PrPC) during neural differentiation has allowed us to follow the modulation of protein expression level occurring during the in vitro development of the human MBs. In order to use this model to reproduce the protein accumulation mechanisms seen in AD, we have tested chemical inductors such as Aftin-5 in order to modulate the APP post-transcriptional pathway towards a pathological outcome. Many strategies of treatment are adopted to lead APP cleavage and Aβ generation. The production of soluble fragments Aβ38, Aβ40, Aβ42 in the supernatant of organoids has been showed using ELISA technique. The levels generated are reproducible and the increase of Aβ42/Aβ40 ratio is consistent with extrapolated data from mouse and human models thus validating our model. Analysis at the gene and protein level has been assessed in order to understand the interaction between PrPC and APP after treatment. The long-term goal consists in improving this model which is notably hampered by the absence of vascularization and the low level of maturation of the neural tissue. The main challenge in MB culture thus consists in the integration of the vascular system, and also in increasing the speed of ageing process in vitro for the study of neurodegenerative diseases. In the long term, the prospect of automating the culture of MBs would allow the use of the system for cytotoxicity testing and/or high throughput screening for the discovery of new drugs for AD