Дисертації з теми "Protéines effectrices de type III"

Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) est responsable de la nervation noire sur les Brassicaceae, notamment les choux, les radis, la moutarde et l'espèce modèle Arabidopsis thaliana. Au cours de l'infection, Xcc transloque des protéines effectrices de type 3 (T3E) dans les cellules végétales via le système de secrétion de type 3 (T3SS), pour moduler la physiologie de l'hôte et favoriser la maladie. Le répertoire des T3E présents dans une souche donnée influence largement sa niche, sa gamme d'hôtes et son mode de vie. Dans la souche Xcc 8004, vingt-huit gènes ont été prédits pour coder des protéines sécrétées par le T3SS (T3SP). Dans un premier chapitre à l'échelle de l'effectome, nous montrons que la plupart des fonctions des T3SP au sein des cellules végétales restent inconnues. Dans ce projet, différentes stratégies ont été abordées pour caractériser les fonctions biologiques des T3SPs de la souche Xcc 8004 dans les cellules végétales. Bien que la délétion des gènes individuels codant des T3SP n'ait pas eu d'effet significatif sur la virulence de Xcc chez Arabidopsis, l'expression hétérologue de T3SP individuelles chez Arabidopsis a montré des effets marqués sur la physiologie de la plante pour de nombreuses T3SP. De manière surprenante, plusieures T3SP sont capables de déclencher des réponses immunitaires et certaines ont présenté des effets ambivalentes en inhibant simultanément la phosphorylation déclenchée par flg22 de MPK3/6. Dans une deuxième partie, nous avons réalisé une analyse comparative des fonctions in planta des T3SPs XopAG et RipO1 qui sont codées par des gènes orthologues dans Xcc souche 8004 et Ralstonia solanacearum souche GMI1000, respectivement. Dans nos expériences, XopAG a montré une contribution significative à la pathogénicité de Xcc qui ne semble pas liée à la suppression de certaines réponses immunitaires basales. XopAG et RipO1 présentent des similitudes fonctionnelles. En effet, les deux T3SP affectent l'expression de gènes connus de réponse à l'auxine, à l'acide jasmonique et à l'éthylène, ce qui est cohérent avec l'inhibition de la croissance des plantes induite par ces deux effecteurs chez Arabidopsis. Une recherche in silico de cibles végétales potentielles de XopAG suivie d'essais du pouvoir pathoène sur des mutants d'Arabidopsisa a permis d'identifier BRG3 (BOI-RELATED GENE 3) comme cible putative de XopAG. Dans une approche parallèle, nous avons effectué un criblage de suppresseurs pour identifier les mutations qui atténuent le phénotype d'arrêt de croissance induit par XopAG chez Arabidopsis, résultant en l'identification de huit lignées suppresseurs. Ces lignées fournissent une occasion précieuse d'identifier les voies affectées par XopAG chez Arabidopsis. De manière générale, ce projet contribue à la compréhension des activités biologiques exercées par les T3SP de la souche Xcc 8004 dans les cellules végétales
Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) causes black rot disease on Brassicaceae species including cabbages, radish, mustard and the model species Arabidopsis thaliana. During pathogenesis, Xcc secrete Type 3 Effector (T3E) proteins via the Type 3 Secretion System (T3SS) into plant cells to modulate host physiology and promote pathogenicity. The repertoire of T3Es present in a given strain largely influences its niche, host range and lifestyle. In the Xcc strain 8004, twenty-eight genes have been predicted to encode proteins secreted by the T3SS. The functions of most Type 3 Secreted Proteins (T3SPs) within plant cells remain elusive. In this project, different strategies were approached to characterize the biological functions of the T3SPs of Xcc strain 8004 in plant cells. In the first chapter, we showed that the loss of individual T3SPs did not cause a significant effect on Xcc virulence on Arabidopsis. Yet, the heterologous expression of individual T3SPs in Arabidopsis plants revealed many T3SPs with marked effects on plant growth and transcriptome. Several T3SPs also triggered plant immune responses and some exhibited ambivalent activities by simultaneously inhibiting flg22-triggered phosphorylation of MPK3/6. In the second chapter, we conducted a comparative analysis of the in planta functions of the T3E XopAG and RipO1 which are encoded by orthologous genes in Xcc strain 8004 and Ralstonia solanacearum strain GMI1000 respectively. In our experiments, XopAG showed a significant contribution to Xcc pathogenicity that was not related to the suppression of some basal immune responses. XopAG and RipO1 exhibited functional similarities. Indeed, both T3E affected the expression of genes responsive to auxin, jasmonic acid and ethylene suggesting that both effectors inhibit plant growth. Finally, we made some efforts to identify the plant target of XopAG. An in silico search followed by pathogenicity assays posits BRG3 (BOI-RELATED GENE 3) as a candidate target of XopAG. In a parallel approach, we performed a suppressor screen to identify suppressor mutations that alleviate the growth defect induced by XopAG in Arabidopsis plants, resulting in eight suppressor lines. These provide a valuable opportunity to identify the pathways targetted by XopAG in Arabidopsis. Altogether, this project contributes to the better comprehension of the biological activities exerted by the Xcc strain 8004 T3SPs in planta

Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria (Xcv) est l'agent causal de la gale bactérienne sur piment et tomate. L'interaction entre Xcv et ses plantes-hôtes dépend d'un système de sécrétion de type III (SSTT) spécialisé dans la sécrétion de facteurs de virulence. L'un d'entre eux est la protéine AvrBs3 qui appartient à une famille d'effecteurs largement conservée dans le genre Xanthomonas. Sur les plantes sensibles, les souches de Xcv exprimant avrBs3 provoquent la formation de pustules, tandis qu'elles induisent spécifiquement une réaction d'hypersensibilité (HR) sur les lignées de piment résistantes. Des expériences d'immunocytochimie ont permis de détecter AvrBs3 dans des cellules de piment infectées avec Xcv. L'immunodétection d'AvrBs3 s'est avérée dépendre d'un SSTT fonctionnel et du signal de sécrétion N-terminal, démontrant directement l'injection de cet effecteur dans la cellule végétale. En outre, AvrBs3 est détectée dans les noyaux et cette localisation est supprimée en l'absence des signaux de localisation nucléaires (NLS). La présence d'un domaine d'activation de la transcription fonctionnel et nécessaire à l'avirulence d'AvrBs3 suggère que cet effecteur interagit avec la machinerie de transcription eucaryote. Afin d'identifier les protéines de piment cibles d'AvrBs3, nous avons utilisé le système double hybride. Sur les huit classes d'ADNc de piment isolés, deux codent l'importine α qui est un composant du système de transport nucléaire. L'interaction entre AvrBs3 et l'importine α a été analysée en détail dans la levure et in vitro, mettant en évidence l'importance des NLS. Plusieurs modèles expliquant le mode d'interaction d'AvrBs3 avec les facteurs de l'hôte pour éliciter les réactions de défense et assurer sa fonction de virulence sont discutés.

Les complexes PRC1 et PRC2 contrôlent l’expression génique via l’organisation de la structure de la chromatine. Ce contrôle se fait par l’ajout de la marque H2AK119ub1 par le PRC1 et l’ajout de la marque H3K27me3 par le PRC2. Cette étude s’attache à étudier le rôle de la protéine Pcgf1 (membre du complexe PRC1) et de la protéine Ezh2 (membre du complexe PRC2) lors du développement du poisson-zèbre. Les gènes sont inactivés par TALEN. Le complexe PRC1 est formé par différentes protéines dont les Pcgf. Il existe de nombreux homologues Pcgf qui ont des fonctions distinctes. Cette étude s’intéresse au rôle de la protéine Pcgf1 lors du développement du poisson-zèbre. Les individus pcgf1-/- sont viables et fertiles. Cependant, leur développement précoce est retardé et les adultes montrent des signes de vieillissement accéléré. Ce mutant est le premier modèle de vertébré qui met en évidence le rôle de Pcgf1 dans la prolifération cellulaire lors du développement et son association au vieillissement. La protéine Ezh2 est impliquée dans le devenir cellulaire et la différenciation. Les embryons se développent normalement puis les larves meurent à 12 jours post-fécondation. De façon intéressante, les embryons de poisson-zèbre peuvent gastruler en l’absence d’Ezh2, contrairement au modèle murin. Les organes sont correctement mis en place à 5 jours post-fécondation. Les larves présentent un défaut de maintien de la paroi du bulbe intestinal. La protéine Ezh2 est importante pour le maintien du pancréas exocrine. L’absence d’Ezh2 cause une augmentation importante du nombre de cellules apoptotiques. Ezh2 est essentiel lors de la régénération de la nageoire caudale
PCR1 and PRC2 are complexes that control gene expression via chromatin structure reorganization. This expression regulation is maintained by adding epigentics marks H2AK119ub1 by the PRC1 and adding of H3K27me3 by the PRC2. The study devotes to study the role of the protein Pcgf1 (part of the PRC1 complex) and of the Ezh2 protein (part of the PRC2 complex) during the zebrafish development. The PRC1 complex is formed by different proteins including Pcgf proteins. There are several Pcgf homologs that have different functions. The study reveals that some Pcgf proteins have a different expression during caudal fin regeneration and development. We are interested in Pcgf1 protein during the zebrafish development. The pcgf1 gene was inactivated by using TALEN. The fish pcgf1-/- are viable and fertile. However, the early development is delayed and adults show signs of accelerated aging. This mutant is the first vertebrate model showing the role of Pcgf1 in cells proliferation during development and aging. Ezh2 protein is involved in cell-fate decisions and differenciation. Inactivation of ezh2 gene by TALEN reveals the essential role of Ezh2 during development. Indeed, at the beginning embryos develop normally then larvae die at 12 days post-fertilization. Interestingly, zebrafish embryo can gastrulate without Ezh2. This contradicts with observations in mouse model. The organs are properly formed at 5 days postfertilization. Larvae show defects in the intestinal bulb wall. Ezh2 is important for exocrine pancreas maintenance. The absence of Ezh2 causes an increase in apoptic cells. Ezh2 is essential during caudale fin regeneration

Les éléments riches en AU (AU-rich element, ARE) sont des séquences localisées dans la région 3' non traduite (3'UTR) d'ARNm mammifères instables. Par transfection de cellules mammifères, nous avons démontré que la présence de l'ARE du proto-oncogène c-jun (classe III) ou d'une séquence EDEN stimule la traduction tout en déstabilisant un ARNm rapporteur. Les résultats, obtenus par "adressage" de la protéine CUG-BP1 sur un ARNm rapporteur et par inhibition de l'expression de la CUG-BP1 par interférence à l'ARN, impliquent la CUG-BP1 dans ce double effet de déstabilisation et de stimulation traductionnelle causé par un ARE de classe III. L'ensemble de ces données révèle une importante complexité des régulations post-transcriptionnelles de l'expression des gènes liées aux ARE de classe III.

Cette thèse est composée de deux parties : Le première partie rend compte de l'étude structurale de la protéine RrgA. RrgA est associée au pilus du pathogène Streptococcus pneumoniae et participe aux premières étapes de colonisation chez l'hôte en se liant à plusieurs composés de la Matrice Extra Cellulaire. Nous avons résolu la structure de cette protéine à 1.9 Å par cristallographie aux rayons-X. RrgA possède une structure allongée formée de quatre domaines alignés d'origine eucaryote et procaryote. En effet, trois domaines ayant des similarités structurales avec les IgG et le domaine Cna-B semblent servir de piédestal pour orienter et présenter le domaine fonctionnel de type Intégrine. Nous avons confirmé la formation de deux ponts isopeptidiques stabilisateurs par spectrométrie de masse. De plus, le domaine intégrine possède deux insertions particulières dont la présence pourrait être impliquée dans la reconnaissance des divers substrats par RrgA. La deuxième partie de cette thèse est axée sur l'étude structurale du complexe ATPase et de ExsB, la pilotine présumée du système de sécrétion de type III chez Pseudomonas aeruginosa, bactérie opportuniste et jouant un rôle majeur dans l'infection des patients atteints de mucoviscidose. Pour la première fois, nous avons mis au point un protocole d'expression et de purification sous forme soluble de l'ATPase PscN en complexe avec une protéine partenaire, PscL. Des cristaux de ce complexe ont été obtenus au robot du PSB. Par ailleurs, nous avons confirmé l'expression de la lipoprotéine ExsB chez P. aeruginosa que nous avons localisée au sein de la membrane externe. De plus, nous avons résolu la structure de cette protéine qui présente un nouveau repliement et qui établie les bases structurales pour l'étude des pilotines pour tous les systèmes de sécrétion de type III de la famille Ysc
This manuscript is made up of two parts The first part describes the structural study of RrgA from Streptococcus pneumoniae. This protein is a pilus-associated adhesin that is able to bind to several components of the Extra Cellular Matrix and thus, participates in the first steps of host colonization. We solved the structure of RrgA to 1.9 Å by X-Ray crystallography. We showed that RrgA folds into an elongated 4-domain structure, and these domains display both eukaryotic and prokaryotic origins. Actually, three out of the four domains are reminiscent of IgG and Cna-B structures and act like stalks to orient and display the large Integrin-like domain. We confirmed the presence of two isopeptide bonds by mass spectrometry and hypothesised that the two inserted arms in the integrin domain could explain the wide variety of substrates RrgA can bind. The second part of this manuscript focuses on the structural studies of the ATPase complex as well as ExsB, the putative pilotin of the type III secretion system from Pseudomonas aeruginosa. This bacterium is a major threat in hospital-acquired infections and the main pathogen found in cystic-fibrosis suffering patients. For the first time we were able to express and purify the ATPase PscN in complex with its partner PscL. Crystallization trials led to a very promising condition that is being refined. Moreover, we confirmed expression of the lipoprotein ExsB in P. aeruginosa that we localised in the outer membrane. To have a better understanding of this protein, we also solved its high-resolution structure that displays a novel fold and our study paves the way for coming studies concerning pilotins

Pseudomonas aeruginosa, une bactérie à Gram négatif responsable d'infections nosocomiales, possède de nombreux facteurs de virulence lui permettant d'infecter ses hôtes. En particulier, le Système de Sécrétion de Type III (SST3) lui permet d'injecter des effecteurs directement dans le cytoplasme de la cellule cible eucaryote. Durant cette thèse, deux protéines du SST3 de P. aeruginosa ont été étudiées : l'ATPase PscN et la protéine ExsB. Plusieurs approches ont été utilisées afin d'étudier l'ATPase PscN, indispensable à l'activité du SST3. Des mutations ponctuelles réalisées dans PscN conduisent à des souches de P. aeruginosa non cytotoxiques, et cet effet est dominant négatif. Une autre approche a permis l'obtention de fractions partiellement purifiées de l'ATPase PscN active, sous forme de grands complexes visualisés en microscopie électronique. Ces fractions contiennent également d'autres protéines du SST3, qui pourraient être des partenaires de PscN. La protéine ExsB a été caractérisée pour la première fois. Après avoir vérifié son expression chez P. aeruginosa, son association à la membrane externe de la bactérie a été démontrée. Son rôle a ensuite été étudié par une analyse du phénotype d'une souche de P. aeruginosa dépourvue du gène exsB. Nous n'avons pas identifié d'activité de ExsB dans la régulation du SST3. Après avoir constaté l'implication de ExsB dans la virulence de la bactérie dans des modèles d'infections aiguës chez les animaux, son rôle dans l'activité du SST3 a été établi. Nous avons enfin pu montrer que ExsB a une activité de pilotine, car elle participe à l'assemblage de la sécrétine, le composant de la membrane externe du SST3
Pseudomonas aeruginosa, a Gram negative bacterium responsible for nosocomial infections, exhibits numerous virulence factors to infect its hosts. In particular, the Type III Secretion System (T3SS) allows the injection of effectors directly into the host cell cytoplasm. This work focuses on the study of two proteins from the T3SS of P. aeruginosa: the ATPase PscN and the ExsB protein. Several approaches were used to study the ATPase PscN, an enzyme essential for T3SS activity. Site-directed mutations, made on PscN, lead to non cytotoxic strains, and this effect is dominant negative. Another approach allowed the partial purification of active PscN, visualized as large complexes by electron microscopy. These partially purified samples also contain other T3SS proteins, which could interact with PscN. The ExsB protein was characterized for the first time. After checking its expression in P. aeruginosa, its association with the outer membrane was shown. The phenotypic analysis of a strain lacking exsB gene gave insights into the role of this protein. We did not identified any function of ExsB in the T3SS regulation. After showing the involvement of ExsB in the bacterial virulence during acute animal infections, ExsB role in T3SS activity was established. Finally, we showed that ExsB has a pilotin activity as it participates in the assembly of the secretin, the outer membrane component of T3SS

Un nombre croissant de protéines est localisé dans des régions spécifiques de la bactérie, cette localisation subcellaire étant la clé de leur fonction. Cependant en l'absence de compartiment intracellulaire membranaire, le mécanisme qui sous-tend la localisation des protéines de E. Coli au pôle par exemple de la cellule reste incompris. Nous montrons ici que la polarisation d'IpaC, composé du translocon du système de sécrétion de type III de Shigella flexneri est dépendante de son association avec la protéine chaperonne DnaK. Une construction d'IpaC fusionnée à la protéine fluorescente Venus (Civ) induit la formation de complexes de DnaK, exclus par le nucléoïde et accumulés au pôle bactérien, indépendamment de ses co-chaperons. Des expériences de FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching) ont montré que la diffusion de Civ au pôle était limitée, probablement par son association avec Dnak. Dnak empêche l'accumulation létale de Civ agrégée à travers le corps bactérien, permettant sa séquestration réversible au pôle. Nous pensons que ces résultats mettent en évidence un nouveau moyen pour la bactérie de confiner certaines protéines à un pôle, par exclusion par le nucléoïde des complexes DnaK-substrats, pouvant ensuite servir de réservoir de protéines dépliées ou partiellement dépliées. Ces résultats sont le point de départ de nouvelles études visant à caractériser le lien entre ces complexes polaires DnaK-substrats et les processus fonctionnels impliquant le dépliement des protéines, comme par exemple la sécrétion bactérienne
An increasing number of proteins are localized in specific regions of the bacteria, this subcellular localization being key to their function. In the absence of intracellular membrane-bound compartment, however, the mechanism underlying the localization of E. Coli proteins to the cell pole has remained elusive. Here, we show that polarization of the Shigella type III secretion system translocon component IpaC is driven by its association with the DnaK chaperone. An IpaC construct fused to the Venus fluorescent protein (Civ) induced DnaK complexes that were excluded from the nucleoid and accumulated at the bacterial pole independent of its co-chaperones. Fluorescence alter photobleaching (FRAP) analysis indicated that Civ diffusion at the pole was restricted, likely by DnaK association. DnaK prevented the lethal accumulation of aggregated Civ through the bacterial body, to allow its reversible sequestration at the pole. We believe that these findings are shedding new lights a bacterial means to confine proteins at the pole through the nucleoid-mediated exclusion of DnaK-substrate complexes, that may then serve as a reservoir of , unfolded or partially unfolded proteins. It is anticipated that these findings will be the starting point of further studies aiming at characterizing the link between these polar DnaK-substrate complexes and functional processes involving protein unfolding, such as bacterial secretion

Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) est une bactérie phytopathogène responsable de la bactériose vasculaire du riz, maladie pouvant engendrer de fortes pertes de rendement à travers le monde. La course à l'armement entre la bactérie et sa plante hôte correspond d'une part à la mise en place de la virulence par le microorganisme et d'autre part en la résistance du végétal face à l'agression. Comprendre les mécanismes par lesquels Xoo accompli son cycle infectieux est d'une importance cruciale pour le développement futur de nouvelle méthode de luttes. Plusieurs approches complémentaires ont été mises en uvre afin de caractériser des éléments associés au pouvoir pathogène de Xoo.Dans un premier temps nous avons effectué une analyse protéomique comparative. Cette approche a permis l'identification chez une souche Africaine de Xoo d'un jeu de protéines induites par HrpX et susceptibles de jouer un rôle dans la virulence. Dans un second temps, l'implication de deux peptides dans la virulence Xoo a été étudiée. Le premier de ces peptides, supposé être le facteur d'avirulenceAvrXa21, a fait l'objet d'une caractérisation fonctionnelle et phylogénique. Le second peptide est synthétisé par un cluster NRPS, similaire à l'un de ceux présent chez Xanthomonas albilineans. Afin d'élucider l'importance de la molécule synthétisée par cette voie pour Xoo, une étude préliminaire impliquant la mutation d'un élément régulateur des NRPS a été effectuée. En dernier lieu, des informations nouvelles ont été apportées sur la topologie de la protéine membranaire HrcR qui est une composante essentielle du système de sécrétion de type III chez la plupart des bactéries appartenant au genre Xanthomonas
Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) is the agent of bacterial leaf blight BLB in rice, a disease which causes considerable yield losses throughout the world. In the arms race underlying the interactions between the microorganism and the host, the presence of virulence factors in the former parallels that of resistance factors in the latter. Understanding the mechanisms of Xoo's infectious cycle is of paramount importance for the elaboration of new fighting strategies to combat BLB. To achieve this, several complementary approaches to characterize components of Xoo's pathogenicity have been employed.First, we performed comparative proteomics that allowed us to identify novel HrpX-induced candidate pathogenicity factors of an African Xoo strain. Second, the involvement of two peptides in Xoo's pathogenicity has been investigated. One was speculated to be the avirulence factor AvrXa21 and has been characterized both functionally and phylogenetically. The other one was found to be synthesized by a Non-Ribosomal Peptide Synthetase (NRPS), reminescent to NRPS genes found in Xanthomonas albilineans. In order to determine the role of NRPS-mediated synthesis in Xoo virulence, we studied a strain carrying a mutated regulatory gene of the NRPS pathway. Finally, we provide new information on the topology of the HrcR membrane protein which is a conserved component of the type III secretion system of most Xanthomonas

La bactérie phytopathogène Ralstonia solanacearum est l'agent responsable du flétrissement bactérien sur plus de 200 espèces végétales, dont des espèces agronomiques, faisant de cette bactériose une des plus importantes dans le monde. Le pouvoir pathogène de la bactérie repose en grande partie sur sa capacité à injecter des protéines, appelées effecteurs de type III (ET3s), via le système de sécrétion de type III (SST3). La dernière décennie a été notamment marquée par la découverte chez les bactéries pathogènes de nombreuses protéines impliquées dans le contrôle du processus de sécrétion de type III. Chez R. Solanacearum, ces mécanismes de contrôle de la sécrétion restent méconnus, contrairement aux mécanismes de régulation transcriptionnelle. Au cours de ces travaux, nous nous sommes attachés à caractériser les fonctions des protéines HpaB (RSp0853), HpaD (RSp0848) et FliT-like (RSc2897) pour lesquelles plusieurs éléments suggèrent un potentiel rôle comme chaperonnes de type III (CT3s), ainsi que de la protéine HpaP (RSp0862) qui présente un domaine T3S4 (Type III Secretion Substrate Specificity Switch). Nous avons pu mettre en évidence la capacité de certaines CT3s à interagir entre elles et, pour HpaB et HpaD, à interagir avec de nombreux ET3s. De plus, les trois CT3s putatives semblent impliquées dans le pouvoir pathogène de R. Solanacearum, HpaB s'avérant même indispensable à la virulence de la bactérie. D'autre part, nos travaux mettent en exergue l'importance de la protéine HpaP pour le pouvoir pathogène de la bactérie et son implication dans le contrôle de la sécrétion de substrats du SST3. Les résultats suggèrent notamment que HpaP promeut la sécrétion de l'ET3 PopP1 en interagissant physiquement avec ce dernier. Finalement, la caractérisation de séquences conservées du domaine T3S4 révèle l'importance de cette région pour la fonction de la protéine HpaP. L'ensemble de ces travaux suggère l'implication de plusieurs protéines de R. Solanacearum dans le contrôle du processus de sécrétion de type III et souligne la diversité des mécanismes mis en jeu impliquant les protéines de type T3S4 chez les bactéries pathogènes
The plant pathogenic bacterium Ralstonia solanacearum is the causative agent of the bacterial wilt on more than 200 plant species, including agronomic species, making it one of the most important bacterial disease in the world. The pathogenicity of the bacteria is largely based on its ability to inject proteins, called type III effectors (T3Es) via the type III secretion system (T3SS). The last decade has been particularly marked by the discovery of many proteins involved in the control of the type III secretion process in pathogenic bacteria. In R. Solanacearum , these control mechanisms remain unknown , unlike the transcriptional regulatory mechanisms. In this work, we focused on the functional characterization of the proteins HpaB (Rsp0853), HpaD (RSp0848) and FliT-like (RSc2897) for which several elements suggest a potential role as type III chaperones (T3Cs). We also focused on the HpaP protein (Rsp0862) which harbors a T3S4 domain (Type III Secretion Substrate Specificity Switch). We showed the ability of some CT3s to interact with each other and, concerning HpaB and HpaD, to interact with many T3Es. In addition, the three putative T3Cs seem to be involved in the pathogenicity of R. Solanacearum, HpaB being even strictly required for bacterial virulence. Furthermore, our work highlights the importance of HpaP in pathogenicity and its involvement in the control of the secretion of T3SS substrates. The results suggest in particular that HpaP promotes the secretion of the T3E PopP1 by physically interacting with the latter. Finally, the characterization of conserved sequences in the T3S4 domain reveals the importance of this region for the function of the HpaP protein. On the whole, this work suggests the involvement of several proteins of R. Solanacearum in the control of the type III secretion process and highlights the diversity of mechanisms in which T3S4 proteins are involved in pathogenic bacteria

Les bactéries entéropathogènes du genre Salmonella et Shigella sont transmises par les aliments ou l’eau et sont responsables de nombreuses infections entériques chez les animaux et les humains. Ces maladies infectieuses restent une cause importante de morbidité et de mortalité dans les pays en voie de développement. L’existence de multiples sérotypes de Salmonella et de Shigella ainsi que l’émergence de souches résistantes aux antibiotiques, nécessite le développement de vaccins efficaces et large spectre. Ces bactéries utilisent un système d’injection de leurs protéines effectrices, appelé injectisome ou encore Système de Sécrétion de Type III (SST3), nécessaire à leur pathogénicité. Alors que les protéines effectrices injectées au moyen de cet injectisome sont variées et dépendent essentiellement du type cellulaire cible et donc de la spécificité du pathogène, certaines des protéines structurales composant l’injectisome sont relativement bien conservées parmi les différentes bactéries pathogènes, notamment les protéines de l’aiguille : PrgI et MxiH, et celles de la coiffe de l’aiguille : SipD et IpaD, respectivement de Salmonella et Shigella. Ces protéines, fortement impliquées dans la virulence des bactéries, semblent donc être des cibles de choix pour lutter contre des infections opportunistes impliquant ces bactéries pathogènes.Le premier objectif de cette thèse était d’évaluer l’immunogénicité et l’effet protecteur des protéines structurales de l’injectisome citées précédemment contre les infections à Salmonella et Shigella. Les protéines recombinantes préparées et produites au laboratoire ont été utilisées de façon séparée ou en combinaison pour immuniser des souris par différentes routes. Ensuite, les réponses immunitaires des souris ainsi immunisées ont été analysées par des tests immunométriques. Enfin, le potentiel immunogène et vaccinant de ces protéines structurales a été évalué en infectant les souris immunisées avec 100 DL50 de Salmonella par voie orale ou de Shigella par voie intranasale. Le meilleur résultat a été obtenu en utilisant la voie intra-gastrique pour les immunisations avec environ 70% de protection. Cette stratégie a permis également d’évaluer la pertinence de cette approche vaccinale dans un modèle murin de protection croisée (entre 25 et 60%). Le deuxième objectif de cette thèse était d’évaluer le pouvoir protecteur d’anticorps monoclonaux murins reconnaissant les régions conservées des protéines SipD et IpaD. Les anticorps obtenus ont été caractérisés et leur pouvoir neutralisant a été évalué in vivo dans un modèle murin d’infection avec Salmonella ou Shigella (jusqu’à 60% de protection).L’ensemble de ces travaux montre que l’utilisation de certaines protéines structurales conservées de l’injectisome de bactéries entéropathogènes présente un intérêt vaccinal et immunothérapeutique pour aider au traitement de certaines salmonelloses et shigelloses
Salmonella and Shigella species are food and water borne pathogens that are responsible for enteric infections in both humans and animals. These infectious diseases are still the major cause of morbidity and mortality in the emerging countries. The existence of multiple Salmonella and Shigella serotypes as well as the emergence of antibio- resistant strains, require the development of protective and broad-spectrum vaccines. All these bacteria utilize a system for injection of their effectors, called injectisome or Type III Secretion System (T3SS), necessary for their pathogenicity. While effector proteins are varied and depend essentially on the cellular target and thus on the specificity of the pathogen, the structural proteins that form the injectisome are common to all virulent Salmonella and Shigella spp., particularly the needle proteins PrgI and MxiH and the needle-tip proteins SipD and IpaD of Salmonella and Shigella respectively. These proteins, strongly involved in the virulence of the bacteria, appear to be ideal candidate antigens for a subunit-based, broad spectrum vaccine.The first aim of my PhD was to evaluate the immunogenicity and protective efficacy of structural proteins of the above-mentioned injectisome against Salmonella and Shigella infections. The recombinant proteins were prepared and produced in the laboratory and were used alone or in combination to immunize mice using different routes. The immune responses of immunized mice were then analyzed by immunometric assays. Finally, the protective efficacy was evaluated in a mouse model of intestinal (Salmonella) or pulmonary (Shigella) challenge. The best result was obtained by orogastric immunization with 70% of protection. This strategy also allowed to estimate the relevance of this approach in a mouse model of crossed protection (from 25 to 60%). The second objective of my PhD was to evaluate the protective efficacy of murine monoclonal antibodies recognizing conserved regions of SipD and IpaD proteins. The obtained antibodies were characterized and their therapeutic effect was evaluated in vivo with a Salmonella and Shigella infection murine model (up to 60% of protection).To conclude, this work showed that some conserved structural proteins composing the injectisome of enteropathogenic bacteria is of interest for treatment of enteric diseases caused by Salmonella and Shigella

Cette thèse est composée de deux parties : Le première partie rend compte de l'étude structurale de la protéine RrgA. RrgA est associée au pilus du pathogène Streptococcus pneumoniae et participe aux premières étapes de colonisation chez l'hôte en se liant à plusieurs composés de la Matrice Extra Cellulaire. Nous avons résolu la structure de cette protéine à 1.9 Å par cristallographie aux rayons-X. RrgA possède une structure allongée formée de quatre domaines alignés d'origine eucaryote et procaryote. En effet, trois domaines ayant des similarités structurales avec les IgG et le domaine Cna-B semblent servir de piédestal pour orienter et présenter le domaine fonctionnel de type Intégrine. Nous avons confirmé la formation de deux ponts isopeptidiques stabilisateurs par spectrométrie de masse. De plus, le domaine intégrine possède deux insertions particulières dont la présence pourrait être impliquée dans la reconnaissance des divers substrats par RrgA. La deuxième partie de cette thèse est axée sur l'étude structurale du complexe ATPase et de ExsB, la pilotine présumée du système de sécrétion de type III chez Pseudomonas aeruginosa, bactérie opportuniste et jouant un rôle majeur dans l'infection des patients atteints de mucoviscidose. Pour la première fois, nous avons mis au point un protocole d'expression et de purification sous forme soluble de l'ATPase PscN en complexe avec une protéine partenaire, PscL. Des cristaux de ce complexe ont été obtenus au robot du PSB. Par ailleurs, nous avons confirmé l'expression de la lipoprotéine ExsB chez P. aeruginosa que nous avons localisée au sein de la membrane externe. De plus, nous avons résolu la structure de cette protéine qui présente un nouveau repliement et qui établie les bases structurales pour l'étude des pilotines pour tous les systèmes de sécrétion de type III de la famille Ysc.

La bactérie phytopathogène Ralstonia solanacearum possède, parmi son répertoire d'effecteurs de type III, une famille de sept protéines nommées GALA. Les GALA sont collectivement requises pour le pouvoir pathogène de R. Solanacearum sur différentes plantes hôtes. De plus, les GALA sont homologues à des protéines à domaine F-box, impliquées dans le système ubiquitine-protéasome des eucaryotes. Les GALA pourraient donc permettre à la bactérie de manipuler la stabilité de certaines protéines végétales lors de l'infection. Au cours de ce travail, nous avons montré que les membres de la famille GALA ont subi une divergence fonctionnelle au cours de l'évolution. En intégrant des analyses bioinformatiques avec des données expérimentales, nous avons montré que les GALA possédaient des spécificités fonctionnelles, notamment dans leur contribution au pouvoir pathogène sur différents hôtes. Cette divergence fonctionnelle a sans doute permis la conservation de cette famille d'effecteurs dans les différentes souches de R. Solanacearum. Nous avons ensuite analysé la fonction de virulence de GALA7 qui est un facteur de spécificité d'hôte sur Medicago truncatula. Une analyse structure-fonction a été initiée dans le but d'identifier les acides aminés nécessaires à la fonction de cet effecteur au cours de l'infection. En parallèle, l'étude de plantes transgéniques exprimant GALA7 indique que cet effecteur semble posséder une activité E3-ubiquitine ligase dans les cellules végétales. Enfin, des interacteurs potentiels des GALA ont été identifiés lors d'un crible double-hybride chez la levure. Notre travail fournit ainsi de nouvelles perspectives sur les forces sélectives agissant au cours de l'évolution des effecteurs de type III et contribue à une meilleure compréhension de la fonction des GALA lors de l'infection
The plant pathogenic bacterium Ralstonia solanacearum possesses a large repertoire of type III effectors, among which a family of seven proteins called GALAs. GALAs are collectively required for the virulence of R. Solanacearum on different host plants. Interestingly, GALAs are homologous to plant F-box proteins which are involved in the eukaryotic ubiquitine-proteasome system. Thus GALAs could enable R. Solanacearum to manipulate the stability of some plant proteins during infection. Through this work, we demonstrated that the GALA family members underwent functional divergence during evolution. Integrating bioinformatics studies along with experimental data, we showed that GALA proteins display functional specificities and show differential requirement for pathogenicity on different hosts. This functional divergence likely contributed to the remarkable conservation of the GALA family among R. Solanacearum strains. We then analyzed more specifically the virulence function of GALA7 which had been shown to be a host specificity factor on Medicago truncatula. A structure-function analysis was initiated in order to identify the amino-acids which are required for GALA7 function during infection. Using transgenic plants expressing GALA7, we showed that this effector is probably an active E3-ubiquitine ligase enzyme within plant cells. Finally, using a yeast two-hybrid screen, we identified several putative GALA interactors. Our work thus provides new insights into the selective forces driving the evolution of type III effectors and contributes to a better understanding of GALA functions during infection

"Les plantes ont un système immunitaire inné pour combattre les pathogènes. Pour reconnaître les agents pathogènes les systèmes immunitaires des plantes dépendent de protéines dites de surveillance. Le concept de relation " géne-pour-géne " gouverne établi que a un géne de résistance (R) de l'hôte correspond un géne d'avirulence (avr) du pathogène. Quand les deux sont exprimes par le pathogène et son hôte une réaction dite de résistance, ou la plante limite l'infection, est mise en place. Si l'un ou/et l'autre sont inactifs ou manquants une réaction sensible, ou la plante se fait coloniser, se met en place. Les génes de type R chez les plantes codent pour la famille de protéines NB-LRR. L'étude de l'interaction entre la plante modèle Arabidopsis thaliana et le pathogène modèle Pseudomonas syringae a permis de comprendre en partie les voies de signalisation mediees par les NB-LRR. Pendant le processus de l'infection RIN4 une protéine de fonction inconnue, identifiée chez Arabidopsis, est ciblée par trois effecteurs bacteriens, AvrRpm1, AvrB et AvrRpt2, exprimés par le pathogène bactérien Pseudomonas syringae. Deux protéines NB-LRR, RPM1 et RPS2, sont associées moléculairement a RIN4 et répondent aux effecteurs de Type III en déclenchant une réaction de résistance. Lors de mon travail doctoral nous avons mis en place plusieurs lignes d'expérimentation afin de comprendre les voies de signalisation assurées par RPM1 et RPS2. Nous demontrons que RIN4 est un regulateur negatif des voies de signalisation de RPM1 et RPS2. "
Plants express a finely tuned immune system. Recognition specificity resides in a limited number of protein families, the largest of which contains N-terminal signaling domains, a central nucleotide-binding (NB) cassette with broader homology to Apaf-1 and CED3 and various lengths of Leucine-Rich Repeats (LRRs). There are roughly 150 NB-LRR genes in the complete Arabidopsis thaliana genome. They are predicted to encode intracellular proteins. Each NB-LRR allele is typically activated by a single signal, usually a protein, encoded by particular alleles of pathogen genes. Thus, this branch of the plant immune system exhibits specificity. Phytopathogenic bacteria, like Pseudomonas syringae, use evolutionarily conserved type III delivery pili to transit type III effector proteins into the host cytosol. Type III effector proteins, and presumably other virulence factors, can contribute to disease by dampening the host's basal defense response to pathogen associated molecular patterns (PAMPs), or by providing a more nourishing microniche for the growing pathogen colony. Following infection, Arabidopsis RIN4, a plant protein of unknown function, is targeted by three different type III effector proteins, AvrRpm1, AvrB and AvrRpt2 from the bacterial pathogen Pseudomonas syringae, and the two NB-LRR disease resistance proteins, RPM1 and RPS2 physically associated with RIN4, respond specifically to the their presence to trigger disease resistance. To further investigate the R gene signaling pathways mediated by RPM1 and RPS2, several lines of experimentation were initiated. Here, we further characterize RIN4 function. We describe that RIN4 is a negative regulator of RPM1 and RPS2

Les Chlamydia sont des bactéries parasites intracellulaires obligatoires qui infectent de nombreuses espèces animales dont l'homme. L'identification de facteurs utilisés par Chlamydia pour coloniser son hôte et résister aux mécanismes de défense est un prérequis à la meilleure compréhension de la pathogénie de cette maladie. La comparaison de souches intra- ou inter-espèce offre la possibilité de mettre en évidence de tels facteurs. Dans cette étude, la souche mutante C. Psittaci 1B, a été comparée à sa souche parentale. Seule une technique élaborée de biologie moléculaire basée sur l'amplification sélective de fragments de restriction a permis de visualiser quelques-unes des mutations survenues dans le génome de cette souche mutante. Suite à l'identification d'un locus associé au système de sécrétion de type III chez Chlamydia, celui-ci a été recherché et mis en évidence chez C. Psittaci et C. Pecorum. La forte conservation de ce locus souligne le rôle vraisemblablement essentiel de ce système dans la biologie des Chlamydia. L'analyse de plusieurs génomes de Chlamydia a fait ressortir une famille de protéines, les Pmp. L'analyse par RFLP de plusieurs segments des gènes Pmp menée sur différentes souches de C. Psittaci a permis de mettre en évidence l'existence d'un polymorphisme pour les souches isolées des petits ruminants, mais également au sein des souches aviaires, posant la question de l'incidence de ces variations sur la virulence des souches. La forte conservation de cette famille de gènes au sein de l'espèce C. Psittaci a été mise à profit pour améliorer la sensibilité de la technique de PCR pour le diagnostic spécifique des infections à C. Psittaci. En effet, C. Pecorum, un résident avirulent des ruminants, n'est pas dépisté. Les réactions croisées d'un anticorps monoclonal spécifique d'une des protéines Pmp de C. Psittaci avec C. Pecorum suggèrent cependant l'existence de telles protéines chez C. Pecorum.

La protéine BamB est une lipoprotéine de membrane externe appartenant au complexe BAM (β-Barrel Assembly Machinery) et impliquée dans l’assemblage des protéines de membrane externe (PME), la sensibilité aux antibiotiques, le contrôle de l’expression des trois systèmes de sécrétion de type III (T3SS) et la virulence de Salmonella. Chez E. coli, au sein du complexe BAM, elle interagit directement avec la protéine BamA. De plus, chez cette bactérie, BamB présente une activité sérine-thréonine kinase. Afin de mieux caractériser le rôle de BamB, nos objectifs ont été d’étudier (1) l’impact de l’altération de l’interaction de BamB avec le complexe BAM ou de sa séquestration dans le cytoplasme sur l’ensemble des rôles décrits de BamB et (2) l’activité kinase putative de BamB chez Salmonella. Nos résultats montrent que certains rôles de BamB sont dissociables entre eux et que l’interaction BamA/BamB n’est pas requise pour le rôle de BamB dans le contrôle de l’expression des T3SS, la virulence de Salmonella et l’assemblage des PME à la membrane externe. Aucune activité kinase ni aucune activité cytoplasmique de la protéine n’a pu être formellement démontrée
BamB is an outer-membrane lipoprotein belonging to the BAM complex (β-Barrel Assembly Machinery). In Salmonella, it is involved in the assembly of outer membrane proteins (OMP), in antibiotic susceptibility, in the transcriptional control of the three Type-Three-Secretion-Systems (T3SS) related genes and also in virulence. In E. coli, BamB interacts directly with the BamA protein. Moreover, BamB has been shown to have a serine-threonin kinase activity in this bacterium. In order to better characterize the roles of the BamB protein, our purposes were to study (1) the impact of the alteration of the interaction of BamB with the BAM complex or of its cytoplasmic sequestration and (2) its putative kinase activity in Salmonella. Our results show that some of the BamB roles are dissociable and that the BamA/BamB interaction is not required for T3SS expression, Salmonella virulence or OMP assembly in the outer membrane. Currently, neither a kinase activity nor a cytoplasmic activity has been clearly demonstrated for this protein

Le phosphate inorganique (Pi) est un minéral essentiel de notre organisme, qui intervient dans la composition des acides nucléiques et des phospholipides, dans la minéralisation des os et des dents, dans la production d’énergie, et dans la régulation des voies de signalisation. L’homéostasie du Pi est étroitement régulée par différents transporteurs, et des anomalies du transport de Pi peuvent avoir des conséquences cliniques sévères. Chez l’homme, ils existent 3 transporteurs de Pi distincts de type SLC (solute carrier) avec une distribution tissulaire large et initialement identifiés en tant que récepteurs de rétrovirus : PiT1/SLC20A1, PiT2/SLC20A2, et XPR1/SLC53A1.Des mutations dans PiT2 sont associées à une maladie rare, la calcification cérébrale primaire familiale (PFBC), caractérisée par des dépôts de phosphate de calcium dans les noyaux gris centraux et par l’expression de troubles neuropsychiatriques. Alors que PiT1 ne semble pas être impliqué dans cette maladie, nous avons découvert que des mutations dans XPR1 étaient présentes chez des patients PFBC, renforçant le lien entre la maladie PFBC et les désordres de l’homéostasie du phosphate.Dans ce travail, nous avons cherché à comprendre comment PiT2 et XPR1, deux transporteurs de Pi mais de flux opposés peuvent conduire à une même maladie. Pour cela, nous avons étudié le lien entre PiT2 et XPR1 dans la régulation du Pi ainsi que les domaines de XPR1 impliqués dans le transport. Nous avons d’abord identifié de nouveaux variants PFBC dans PiT2 et XPR1 et confirmé l'effet délétère de ces mutations sur l’import et l’export. Nous avons pu distinguer des mutations qui abolissaient l’expression en surface de XPR1, et donc indirectement l’export de Pi, alors que d’autres avaient un impact fonctionnel direct sur les transporteurs pourtant présents à la membrane plasmique.L’inactivation de XPR1 dans des cellules haploïdes humaines induit une altération profonde de l’export de Pi sans effet notable sur l’import. De manière surprenante, l’inactivation de PiT2 entraine un effet modéré sur l’import, probablement dû à l'activité complémentaire de PiT1, avec une chute de l’export dépendant de XPR1. Cet effet identifie une boucle de régulation que nous avons montrée être essentielle au maintien des niveaux de phosphate et d’ATP. Ces résultats révèlent que le défaut d’export de phosphate par inactivation de PiT2 et XPR1 est susceptible d’être l’étape-clé qui conduit à une maladie commune, la PFBC.Nous nous sommes concentrés sur cette étape d‘export régulée en étudiant le domaine SPX de XPR1 dans lequel la plupart des mutations PFBC ont été retrouvées. Nous avons identifié la tankyrase (TNK) comme interactant cellulaire, et localisé son site d’interaction à la bordure carboxyle de SPX. Nous avons observé que la délétion de SPX entrainait un défaut d’export de Pi, et que la perte d’interaction de TNK à XPR1 par mutagenèse ponctuelle avait le même effet, suggérant que TNK et SPX sont 2 composants essentiels à l’export de phosphate. Enfin, nous avons identifié de nouvelles mutations de XPR1 à l'extrémité C-terminale qui abolissaient l’export de Pi, et montré que la délétion de ce domaine entrainait un défaut d’expression de XPR1 à la membrane plasmique. Nos résultats indiquent donc que les domaines N- et C-terminaux jouent un rôle clé dans l’export, et donc dans l’homéostasie du phosphate, avec le domaine C-terminal jouant plutôt un rôle dans le trafic en surface de XPR1.L’ensemble de ce travail a permis de documenter de nouvelles mutations PFBC dans les gènes PiT2 et XPR1, de démontrer que ces transporteurs étaient impliqués dans l’homéostasie intracellulaire du phosphate, en dévoilant que l’export de phosphate est vraisemblablement l’étape clé de la PFBC, ouvrant ainsi de nouvelles pistes dans la compréhension de cette maladie. Nous avons également identifié des domaines de XPR1 et un partenaire cellulaire, essentiels à l’export de Pi et/ou au trafic membranaire
Phosphate (Pi) is a key mineral that participates directly in the synthesis of nucleic acids and membranes, bone and tooth mineralization, energy production, and signal transduction. Pi homeostasis is tightly regulated by transporter-mediated fluxes that adjust Pi concentration in real time, and defect in Pi transport has been associated with several pathologies. In humans, three Pi transporters, which belong to the solute carrier (SLC) superfamily, are widely expressed: PiT1/SLC20A1, PiT2/SLC20A2, and XPR1/SLC53A1. Interestingly, all three were initially identified as receptors for mammalian gammaretroviruses.Mutations in PiT2/SLC20A2 are responsible for a rare neurodegenerative disorder, the primary familial brain calcification (PFBC), characterized by deposits of calcium Pi in the basal ganglia and other regions of the brain, and associated with diverse neuropsychiatric clinical manifestations. While PiT1/SLC20A1 has not been involved in PFBC, we recently identified mutations in XPR1/SLC53A1 as causative for PFBC, thus linking further the disease with cellular Pi homeostasis dysfunction.In this work, we aimed to understand how defects of opposite Pi transport functions lead to PFBC, investigated the relationship between PiT2 and XPR1 in cellular Pi regulation, and studied XPR1 domains in Pi transport. We first identified several PFBC mutations in PiT2/SLC20A2 and XPR1/SLC53A1, and confirmed their impact on Pi import or export, respectively. Some of the mutations altered transporter cell surface expression, resulting in Pi transport impairment, while others did neither alter cell surface expression, nor retroviral receptor functions, confirming that Pi transport function and viral envelope glycoprotein binding can be structurally distinguished.Using single gene knock-out human haploid cells, we showed that depletion of XPR1/SLC53A1 resulted in a dramatic Pi export alteration, with no detectable effect on Pi import, in agreement with Pi exporter function of XPR1. Interestingly, depletion of PiT2/SLC20A2 had little impact on Pi uptake, most likely due to compensatory function of PiT1/SLC20A1, with, however, a surprising impact on Pi export mediated by XPR1. This effect is reminiscent to a regulation loop that we found to maintain both Pi and ATP constant. This results unveil for the first time that Pi export alteration, and not Pi import, is likely to be the common pathophysiological impact of mutations in both PiT2 and XPR1. This would explain the synonymous pathological effects of two transporters that have opposite transport activity.We further explored this regulated phosphate export by characterizing the SPX N-terminal cytoplasmic domain of XPR1, which harbors most of the PFBC mutations. We identified a cellular tankyrase (TNK) as a binding partner and mapped the TNK-binding site to the carboxyl border of SPX; furthermore, we found that mutations that abolished TNK binding resulted in loss of Pi export. Full deletion of SPX domain maintained cell surface expression but altered export, suggesting that both TNK and SPX are essential components for Pi export. Finally, during this work, we identified mutations in the XPR1 C-terminal domain as responsible for PFBC that also impaired Pi export, and showed that deletion of this domain prevented XPR1 cell surface expression. Our results therefore indicate that N- and C-terminal domains of XPR1 play a key role in phosphate homeostasis, the latter domain appearing to exert a more prominent role in XPR1 membrane trafficking and/or folding