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RésuméLe transporteur de la sérotonine sodium-dépendant est associé à la membrane plasmatique des plaquettes et des terminaisons nerveuses sérotoninergiques et constitue le mécanisme physiologique d’inactivation de la sérotonine. Un déficit en sérotonine est associé à la pathophysiologie de la dépression, et il a été suggéré que des modifications du transporteur de la sérotonine pouvaient exister au moment des épisodes dépressifs. En particulier, le nombre de sites transporteurs pourrait être diminué sur les plaquettes sanguines de patients déprimés, et des résultats comparables ont été obtenus dans certaines régions du cerveau humain post-mortem. Les inhibiteurs tricycliques et nontricycliques de la capture de sérotonine sont des antidépresseurs efficaces. Cependant, il existe une période de latence de 2 à 3 semaines entre le début du traitement et l’effet thérapeutique maximal. C’est pourquoi les études consacrées aux propriétés biochimiques et à la caractérisation moléculaire du transporteur de la sérotonine sont d’un intérêt particulier. La capture de la sérotonine par le transporteur êeut être inhibée sélectivement par le citalopram, la paroxétine, l’indalpine, la fluoxétine et le SL 81 0385. Cet effet se traduit in vitro par une augmentation de la neurotransmission sérotoninergique comme on a pu le montrer pour la paroxétine et le SL 81 0385 sur la libération de sérotonine induite par stimulation électrique dans des coupes de cortex frontal humain. Les dérivés marqués inhibiteurs de la capture tels que l’imipramine-[3H], la paroxétine-[3H] et le citalopram-[3H] ont été utilisés comme ligands spécifiques pour caractériser le transporteur. Dans les expériences de dissociation de la liaison de la paroxétine-[3H] aux membranes de cortex cérébral de rat, le citalopram, l’indalpine, la fluoxétine, le SL 81 0385, l’imipramine et la sérotonine ont des valeurs de 1½ de dissociation similaires à celle obtenue pour la paroxétine. De plus, le SL 81 0385, la fluoxétine, l’imipramine et la sérotonine induisent une protection contre l’inactivation de la liaison de la paroxétine-[3H] par le N-éthylmaléimide aux membranes de cortex cérébral de rat. Ces résultats suggèrent que le domaine de liaison des inhibiteurs tricyliques et non-tricycliques de la capture de sérotonine correspond à un site d’exclusion mutuelle par rapport au site de reconnaissance du substrat. Le transporteur neuronal de la sérotonine des membranes de cortex cérébral de rat a été solubilisé et purifié par chromatographie d’affinité sur une résine agarose à laquelle un dérivé du citalopram a été fixé par liaison covalente. La liaison de la paroxétine-[3H] à la préparation purifiée est caractérisée par un Kd de 0.71 nM et un Bmax supérieur à 1 962 pmol/mg de protéines. La purification du transporteur se traduit par un accroissement de plus de 3 000 fois de l’activité de la liaison de la paroxétine-[3H] par rapport à celle de la préparation membranaire initiale. Le profil pharmacologique de la liaison de la paroxétine-[3H] à cette préparation purifiée est préservé puisque les valeurs de Ki pour le citalopram, l’imipramine et la sérotonine sont respectivement de 19 nM, 80 nM et 3,5 μM, comparables aux Ki de ces composés sur la liaison de la paroxétine-[3H] aux membranes de cortex cérébral de rat. La purification du transporteur ainsi obtenue est la première étape qui doit permettre d’analyser les propriétés fonctionnelles du transporteur au niveau moléculaire.

Cet article traite des données récentes sur les relations d’équilibre entre les acides aminés dans l’alimentation du porc en croissance, au travers du concept de la protéine "idéale". Après avoir précisé les limites de ce concept, sur le plan de la constance des rapports entre les teneurs en acides aminés indispensables et celle en lysine, prise comme référence, sont considérés les ratios entre les acides aminés limitants secondaires (tryptophane, thréonine, méthionine et acides aminés soufrés) et la lysine, compte tenu des spécificités de leur rôle fonctionnel au plan métabolique et physiologique. Pour cela, l’incidence des écarts entre le profil de composition en acides aminés de la protéine alimentaire et celui de la protéine idéale (excès de protéines) sur l’ingestion alimentaire et les performances de croissance est étudiée selon la nature de l’acide aminé le plus limitant. En raison de sa faible contribution aux processus métaboliques autres que ceux concernant la synthèse de protéines corporelles, la lysine constitue une référence stable pour l’expression des rapports entre les acides aminés. A la différence de la lysine, le tryptophane interagit fortement et négativement avec les protéines excédentaires (acides aminés neutres de grande taille) au niveau de l’appétit et de la croissance, en liaison avec un dysfonctionnement du système sérotoninergique. Ceci met en défaut la constance du rapport tryptophane / lysine, qui devrait être corrigé sur la base d’un ratio minimum tryptophane / acides aminés neutres de 4 %, pour se prémunir d’un risque d’excès de ces derniers dans certaines protéines alimentaires. Dans le cas de la thréonine, lorsqu’elle est limitante, il ressort une interaction positive avec les acides aminés non indispensables (acide glutamique). L’équilibre méthionine / cystine a été reconsidéré en fonction des données récentes de la bibliographie. En conclusion, les recommandations concernant les rapports acides aminés / lysine pour le porc en croissance ont été réactualisées.

Abstract Expressed sequence tag (EST) projects offer a rapid route to the discovery of novel genes. Genes expressed in a wide range of parasitic nematodes of medical or veterinary importance have been investigated using EST analysis but these techniques have not yet been applied to plant parasitic nematodes. We describe a small scale EST project using cDNA libraries made from the two species of potato cyst nematode, Globodera rostochiensis and G. pallida, and assess the utility of this approach to identify mRNAs encoding abundantly expressed secreted proteins and other proteins present in the nematode at the onset of parasitism. Approximately 1000 sequences were obtained from G. rostochiensis and 100 from G. pallida. A variety of genes was characterised and approximately 11% of the cDNAs sequenced were apparently PCN specific. Secreted proteins identified included a novel PCN homologue of chorismate mutase, a cDNA recently cloned from the gland cells of Meloidogyne javanica. The results obtained justify a much larger scale application of this technology to these parasites. Utilisation de L'Expressed Sequence Tag pour l'analyse de gènes s'exprimant chez les juvéniles de deuxième stade des nématodes à kyste de la pomme de terre Globodera rostochiensis et G. pallida - l'Expressed Sequence Tag (EST) ouvre une voie rapide vers la découverte de nouveaux gènes. Des gènes s'exprimant chez un large éventail de nématodes parasites d'importance médicale ou vétérinaire ont été étudiés par analyse EST alors que cette technique n'a pas encore été appliquée aux nématodes phytoparasites. Nous décrivons ici un projet EST à petite échelle utilisant les banques d'ADNc constituées à partir de deux espèces de nématodes à kyste de la pomme de terre (PCN), Globodera rostochiensis et G. pallida et nous évaluons l'utilité de cette approche pour identifier les ARNs codant les protéines abondamment sécrétées - et les autres protéines - présentes chez les nématodes lors de l'attaque parasitaire. Mille séquences environ ont été obtenues chez G. rostochiensis et 100 chez G. pallida. Des gènes variés ont été caractérisés et environ 11% des ADNc séquencés sont apparemment spécifiques des PCN. Parmi les protéines sécrétées identifiées figurent un nouvel homologue PCN de la chorismate mutase ainsi qu'un ADNc récemment cloné à partir de cellules glandulaires de Meloidogyne javanica. Les résultats ainsi obtenus justifient une utilisation à plus grande échelle de l'EST pour l'étude de ces parasites.

La pharmacocinétique de la sulfaméthoxypyridazine (SMPD) a été étudiée chez le dromadaire après administrations intraveineuse et orale. Les résultats obtenus, après injection intraveineuse, indiquent que la cinétique de cet antibactérien suit un modèle à deux compartiments. Le volume de distribution (Vss) de 0,47 l/kg suggère que la SMPD est essentiellement diffusée dans le compartiment vasculaire et les tissus hautement vascularisés. La demi-vie d'élimination [t1/2(ß)] et la clearance plasmatique (CL) ont des valeurs moyennes respectives de 9,5 h et 0,037 l/kg.h. Quant à l'administration orale, la concentration maximale du produit n'a été atteinte qu'après un délai de 17 h et la biodisponibilité absolue a été de l'ordre de 57 % Enfin, l'étude de la liaison de la SMPD aux protéines plasmatiques du dromadaire a montré que la fixation variait de 47 à 72 % et qu'elle dépendait de la concentration du médicament. La constante de dissociation à l'équilibre (Kd) a été de 196 µg/ml et la capacité maximale de fixation a été de l'ordre de 335 µg/ml.

Le liquide cérébrospinal (LCS) est produit par les plexus choroïdes des ventricules cérébraux avec pour rôle de protéger le système nerveux central des agressions mécaniques (chocs) et infectieuses (virus, bactéries, parasites) et de lui apporter des nutriments essentiels à son fonctionnement optimal. Il est anatomiquement à l'interface entre le compartiment sanguin, le liquide interstitiel cérébral et le compartiment lymphatique. Sa composition est fortement influencée par ces structures. Deux barrières permettent de réguler le passage moléculaire dans le système nerveux central et limitent fortement l'accès à ce dernier : la barrière hématoencéphalique et la barrière hématoméningée. La diffusion des antibiotiques dans le LCS, mais également dans le parenchyme cérébral dépend de plusieurs facteurs : la taille de la molécule, sa lipophilie, la liaison aux protéines plasmatiques et l'intégrité des barrières hématoencéphalique et hématoméningée. Les phénomènes d'inflammation méningée observés dans les méningites bactériennes augmentent la perméabilité des barrières et facilitent la diffusion des agents antibiotiques. Les molécules diffusant le mieux dans le LCS sont les fluoroquinolones, le linézolide, l'association triméthoprime- sulfaméthoxazole, la rifampicine et la fosfomycine. Les bêtalactamines présentent une diffusion assez faible mais qui augmente fortement en cas d'inflammation méningée. Des posologies journalières très élevées permettent de contourner l'écueil de la diffusion. De nombreux paramètres influencent la diffusion des antibiotiques dans le LCS. Le choix de l'antibiothérapie adaptée se fait en fonction de ces paramètres et du type d'infection à traiter en concertation pluridisciplinaire.

La classe C des Récepteurs Couplés aux Protéines G (RCPG) comprend plusieurs membres aux fonctions physiologiques importantes comme par exemple les récepteurs des principaux neurotransmetteurs excitateurs (glutamate) et inhibiteurs (GABA) du système nerveux, les récepteurs des goûts umami et sucré et les récepteurs sensibles au calcium. Ces récepteurs possèdent une architecture moléculaire particulière, caractérisée par la présence d’un large domaine extracellulaire (ECD) relié à un domaine membranaire composé de 7 hélices transmembranaires (7TM). De plus, ils forment tous des dimères obligatoires, la dimérisation étant fondamentale pour leur fonction. La fixation d’agoniste dans l’ECD induit l’activation du récepteur. L’activité des agonistes peut être modulée de manière allostérique par des modulateurs positifs (PAM) ou négatifs (NAM), se liant au domaine 7TM. Il est important de comprendre comment les changements de conformation induits par la liaison des agonistes au sein du domaine extracellulaire sont transmis au domaine transmembranaire mais aussi de comprendre les bases structurales et moléculaires de la régulation allostérique des récepteurs de la classe C. Les progrès récents de la microscopie électronique en conditions cryogéniques (cryoEM) ont permis des avancées sans précédent dans le décryptage des bases structurelles et moléculaires des mécanismes d’activation des RCPG de classe C, et notamment du récepteur métabotropique du glutamate de type 5 (mGlu5). Le glutamate entraîne une fermeture et un changement d’orientation des domaines extracellulaires qui induit un mouvement important entre les sous-unités, rapprochant les 7TM et stabilisant la conformation active du récepteur. La diversité de conformations inactives pour les récepteurs de la classe C était inattendue mais propice à une activation possible par des PAM. Ces derniers stabilisent une conformation active des 7TM, indépendante des changements conformationnels induits par les agonistes, représentant un mode alternatif d’activation des récepteurs mGlu. Nous présentons et discutons ici les caractérisations structurales récentes des récepteurs de classe C, en soulignant les résultats qui rendent cette famille de récepteurs unique. La compréhension de la base structurelle de la signalisation des dimères de mGlu représente une réalisation historique et ouvre la voie à l’analyse de la signalisation des dimères de RCPG en général. Ces analyses structurales devraient également ouvrir de nouvelles voies pour la conception de médicaments ciblant cette famille de récepteurs qui sont aussi des cibles thérapeutiques.

Les protéines ribonucléiques hétérogènes nucléaires (ou hnRNPs : beterogenous nuclear ribonucleonrotein) bifonctionnelles sont des protéines capables de lier à la fois des partenaires nucléiques et des partenaires protéiques impliqués dans différentes voies de signalisation cellulaire. Les protéines humaines de liaison aux ARNs Sam68 (. Src- ssociated ifl. Mitosis 68) et G3BP (RasGAP-SHJ Binding frotein) appartiennent à cette famille de protéines. Sam68 est le principal substrat et partenaire du produit de l'oncogène src au cours de la mitose. G3BP est le premier partenaire du domaine SH3 de la protéine RasGAP, effecteur de l'oncoprotéine Ras. L'interaction RasGAP/G3BP est dépendante de l'état d'activation de Ras sous forme liée au GTP, ce qui suppose que la protéine G3BP ait une fonction dans la transmission des signaux de prolifération cellulaire en aval de Ras. Etant donné le rôle supposé des protéines Sam68 et G3BP dans la transmission des signaux de prolifération cellulaire en aval des molécules Src et RasGAP, nous avons décidé de préciser par quels mécanismes moléculaires elles pouvaient jouer un rôle sur la régulation de la prolifération cellulaire. Nous avons identifié un variant d'épissage de la protéine Sam68, Sam68ΔKH, délété de son domaine KR de liaison aux ARNs. En inhibant la transition G1/S du cycle cellulaire et l'expression de la cycline Dl , Sam68ôKH régule négativement la prolifération cellulaire et se comporte comme un dominant négatif de Sam68. Ces résultats mettent pour la première fois en évidence un rôle de la protéine Sam68 dans la régulation du cycle cellulaire, pendant la phase G1. Nous avons ensuite démontré que Sam68 interagit avec la protéine RasGAP de façon dépendante des domaines SH3 et/ou SH2 de RasGAP, et que cette interaction a lieu exclusivement pendant la mitose. Ces résultats indiquent que Sam68 pourrait également avoir des fonctions mitotiques, et que celles-ci participeraient aux cascades non seulement en aval de Src, mais aussi en aval de la protéine RasGAP. Nous avons aussi étudié les protéines de la famille G3BP. Nous avons tout d'abord cloné l'ADNe codant une protéine humaine homologue à G3BP, G3BPh, puis montré que cette protéine, codée par un autre gène, possède des éléments de séquence et des propriétés qui divergent de G3BP, suggérant que les deux isoformes ont, au moins en partie, des fonctions différentes. Par les techniques de western blot et northem blot, nous avons montré que la protéine G3BP est surexprimée dans un grand nombre de tumeurs et de lignées cellulaires tumorales humaines. Nous avons observé que cette surexpression est indépendante des caractéristiques des différentes tumeurs ainsi que de l'évolution des patients. Nous avons aussi mis en évidence que G3BP stimule la transition G1/S du cycle cellulaire de façon dépendante de son domaine de liaison aux ARNs. Ainsi, nous proposons que les protéines des familles Sam68 et G3BP, qui constituent un lien entre les molécules de la signalisation cellulaire et le métabolisme des ARNs, exercent un contrôle du cycle cellulaire au travers de leurs interactions avec leurs ARNs cibles. Nous proposons aussi que la protéine G3BP soit un nouveau marqueur de détection des cancers humains.

Des études récentes ont montré que le contrôle post-transcriptionnel des ARNms joue un rôle essentiel sur la croissance et le guidage axonal, processus permettant la mise en place de circuits neuronaux. Afin d’étudier ce type de régulation in vivo, mon projet de thèse visait à caractériser Hrp48, une protéine de liaison aux ARNs appartenant à la famille conservée des hnRNPA/B. J’ai montré que l’inactivation d’hrp48 entraîne des défauts de croissance axonale comme des neurones projetant leurs axones dans une mauvaise direction ou au-delà de leur cible classique, défauts remarquablement plus forts chez les femelles que chez les mâles. Mes travaux ont révélé que la protéine femelle-spécifique Sex-léthal s’accumule ectopiquement dans le noyau des cellules mutantes hrp48, ce qui pourrait être à l’origine des défauts sexe-spécifiques de migration axonale observés. En parallèle, j’ai montré que l’inactivation de sema-1a, une cible ARNm putative d’Hrp48, provoque des défauts proches des mutants hrp48, et qu’hrp48 et sema-1a interagissent génétiquement. Par ailleurs, le niveau général d’ARNm sema-1a est plus faible chez les femelles que chez les mâles. Ces résultats suggèrent donc qu’une dérégulation de sema-1a pourrait induire les défauts sexe-spécifiques de croissance axonale observés en contexte mutant hrp48. Ce travail a permis de proposer un modèle préliminaire de régulation post-transcriptionnelle par une protéine de liaison aux ARNs de la famille hnRNPA/B in vivo et a mis en évidence des différences cryptiques entre les femelles et les mâles. Il s’inscrit dans le cadre d’études récentes révélant des différences sexe-spécifiques dans le contrôle de l’expression des gènes<br>Recent studies have shown that post-transcriptional regulatory mechanisms play essential roles in axon growth and guidance, processes involved in the establishment of neuronal circuits during development. To study these mechanisms in vivo, my project aimed at characterizing the role of the RNA-binding protein Hrp48, which belongs to the conserved hnRNP A/B family. I showed that inactivating hrp48 function leads to strong and specific axon migration defects, including axon misguidance and overextension. Notably, I have observed that the frequency of hrp48 mutant phenotypes is much higher in females than in males. Moreover, I showed that the female-specific Sex-lethal protein ectopically accumulates in the nucleus of mutant cells. This abnormal nuclear accumulation could explain the sex-specific defects observed in axonal migration. In parallel, I could show that inactivation of sema-1α, an Hrp48 putative mRNA target, causes defects similar to those observed in hrp48 mutants, and that hrp48 and sema-1 α genetically interact. Moreover, the overall levels of sema-1 α transcripts are much lower in females than in males. These results suggest that sema-1 α misregulation may induce the sex-specific defects in axonal growth observe upon hrp48 downregulation. Tis work has allowed us to propose a preliminary in vivo model for a post-transcriptional regulatory mechanism controlled by a member of the hnRNP A/B family. Furthermore, it has revealed cryptic differences between females and males in the context of recent studies revealing sex-specific differences in the control of gene expression

CUGBP1 est une protéine de liaison aux ARN impliquée dans le contrôle de l'épissage alternatif, la stabilité et la traduction des ARNm. Des situations de sur ou sous-expression de la CUGBP1 peuvent induire des conditions pathologiques liées à ses fonctions. Pour comprendre le rôle biologique et élucider le mode d’action de la CUGBP1, il est important d’identifier le répertoire global de ses cibles. A cette fin, nous avons donc développé deux approches. Une approche bioinformatique à permis d’identifier l’ARNm codant pour la tetraspanine CD9, comme une nouvelle cible régulée par la CUGBP1. La deuxième approche, basée sur le séquençage massivement parallèle des ARN co-immunoprécipités avec la CUGBP1, nous a permis d’identifier l’ensemble de ses cibles in vivo. A terme ces résultats nous permettront à la fois d’identifier les conséquences de la fixation de la CUGBP1 sur chacun de ces ARN et d’affiner le motif de fixation de la CUGBP1 qui pourra être ensuite utilisé pour la recherche des cibles dans d’autres types cellulaires<br>The RNA binding protein CUGBP1 is involved in regulation of alternative splicing, mRNA stability and translation. These functions appear conserved across evolution and may lead to pathological conditions in situations of CUGBP1 gain or loss of function. In order to determine the real extent of the regulations by CUGBP1 we realised two different studies aimed at identifying the targets for CUGBP1. First, based on an in silico approaches, we identify the mRNA encoding the protein CD9 as a direct target for CUGBP1-mediated regulation. In the second study I developed a Cross-link ImmunoPrecipitation procedure for CUGBP1 in human cells and identified the in vivo binding sites and targets by SOLiD deep sequencing. The in vivo binding sites identified allow us to present a genome wide landscape of CUGBP1 binding targets. These targets are potentially dis-regulated in loss of function for CUGBP1. The binding sites identified should allow us to refine the prediction algorithms for CUGBP1 binding sites thereby permitting the identification of the CUGBP1 target in any cellular context. This approach may prove especially useful in conditions where CUGBP1 is either misexpressed or mislocalized

L'angiogenèse est le processus de formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants. Ce processus repose sur la modification des propriétés adhésives des cellules endothéliales vasculaires ainsi que sur la production et l'assemblage de leur matrice extracellulaire (MEC) spécialisée, appelée membrane basale. L'adhésion des cellules endothéliales est médiée par des interactions entre les composants de la matrice extracellulaire (MEC) et les récepteurs transmembranaires (intégrines) qui, une fois engagés, entraînent la formation de complexes d'adhésion multimoléculaires dynamiques qui régulent l'organisation du cytosquelette et la transmission des forces (mécanotransduction) pour la migration et la fonction des cellules. Des études récentes suggèrent que la production locale de protéines aux sites d'adhésion contribue à leur consolidation et à leur maturation.Récemment, les cribles protéomiques réalisés sur les sites d'adhésion ont identifié la présence de protéines de liaison à l'ARN (RBP) ayant des fonctions de régulation de l'expression génétique. SAM68 (Src associated in mitosis, of 68 kDa), un membre de la famille STAR (signal transduction and activation of RNA metabolism), est l'une de ces protéines connues pour réguler à la fois la biogenèse de l'ARN et la transduction du signal en jouant un rôle d'échafaudage après l'activation du récepteur à la surface de la cellule. En effet, il a été démontré que SAM68 s'associe à la kinase Src et participe à l'épissage alternatif des gènes codant pour la MEC et les protéines associées à la MEC, comme la tenascine-C et la glycoprotéine de surface cellulaire CD44 impliquée dans l'adhésion/migration. Dans le contexte de l'angiogenèse et de l'adhésion des cellules endothéliales, nous avons émis l'hypothèse que la RBP SAM68 pourrait constituer un relais moléculaire pendant la mécanotransduction (médiée par les intégrines) en participant à la formation d'adhésions focales et aux réponses transcriptionnelles/post-transcriptionnelles en aval qui régule le phénotype angiogénique.En utilisant des cultures de cellules endothéliales primaires en 2 et 3 dimensions, nous avons montré que la RBP SAM68 participe à l'établissement d'adhésions focales par sa contribution à l'approvisionnement localisé d'ARNm (y compris le transcrit β-actine) requis pour la maturation des adhésions focales. De plus, nous avons démontré que SAM68 régule l'expression de gènes codant pour les protéines de la membrane basale, notamment via la régulation du promoteur du gène FN1, conditionnant ainsi la matrice sous-endothéliale et le phénotype angiogénique des cellules. En effet, dans un contexte tridimensionnel, nous avons constaté que la déplétion de SAM68 entrave le bourgeonnement des cellules endothéliales ainsi que leur organisation en pseudo-capillaires.Ces travaux ouvrent la voie à l'exploration du rôle d'autres protéines de liaison à l'ARN en tant que régulateurs de la signalisation d'adhésion et à l'évaluation de leur fonction dans les processus d'angiogenèse physiologiques et pathologiques<br>Angiogenesis is the process underlying the formation of new blood vessels from pre-existing ones. This process relies on the modification of the adhesive properties of vascular endothelial cells as well as the production and assembly of their specialized extracellular matrix (ECM) known as the basement membrane. Endothelial cell adhesion is mediated by interactions between extracellular matrix (ECM) components and transmembrane receptors (integrins) that, upon engagement, drive the formation of dynamic multimolecular adhesion complexes that regulate cytoskeletal organization and force transmission (mechanotransduction) for cell migration and function. Recent studies suggest that local protein production at adhesion sites contributes to their consolidation and maturation.Proteomics screens performed on adhesion sites have identified the presence of RNA-binding proteins (RBP) with gene expression regulatory functions. SAM68 (Src associated in mitosis, of 68 kDa), a member of the STAR (signal transduction and activation of RNA metabolism) family of RBPs, is one such protein known to regulate both RNA biogenesis and signal transduction by playing a scaffolding role following receptor activation at the cell surface. Indeed, SAM68 has been shown to associate with Src kinase following receptor activation and to participate in alternative splicing of genes encoding ECM and ECM-associated proteins, such tenascin-C and the cell surface glycoprotein CD44 involved in adhesion/migration. In the context of angiogenesis and endothelial cell adhesion, we hypothesized that the RBP SAM68 may constitute a molecular relay during integrin-mediated mechanotransduction at adhesion sites by participating in the formation of focal adhesions and downstream transcriptional/post-transcriptional responses that regulates the angiogenic phenotype.Using 2- and 3-D cultures of primary endothelial cells, we showed that the RBP SAM68 participates in the establishment of focal adhesions through its contribution to the localized supply of mRNAs (including the β-actin transcript) required for adhesion site maturation. Further, we demonstrated that SAM68 regulates the expression of genes encoding basement membrane proteins, in particular via regulation of the promoter of the FN1 gene, thus conditioning the sub-endothelial matrix and angiogenic phenotype of cells. Indeed, in a 3-D context, SAM68-depletion was found to hamper endothelial cell sprouting activity and capillary-like tube formation.This work paves the way to explore the role of other RNA-binding proteins as regulators of adhesion signaling and assessment of their function in physiological and pathological angiogenesis processes

Dans les cellules eucaryotes, l’expression d’un gène peut être régulée à de nombreux niveaux. Les études réalisées sur le contrôle de l’expression génique se sont généralement intéressées aux mécanismes de contrôle transcriptionnel. Cependant de nombreux exemples mettent de plus en plus en évidence l’importance des mécanismes post-transcriptionnels dans cette régulation. Les contrôles post-transcriptionnels de l’expression génique reposent essentiellement sur des interactions spécifiques entre les régions 5’ et 3’ non traduites de l’ARNm et des protéines agissant en trans qui contrôlent spécifiquement la maturation des ARNs messagers (ARNms), leur localisation cytoplasmique, leur stabilité et/ou leur traduction. Les éléments riches en adénine et en uridine (ARE), localisés dans la région 3’ non traduite de nombreux ARNms, font partie des séquences régulatrices les plus étudiées. Elles sont notamment présentes dans les ARNms codant pour des cytokines et des proto-oncogènes. Les protéines de liaison à l’ARN jouent donc un rôle central dans la régulation de l’expression des gènes. Les protéines TIA-1 et TIAR appartiennent à la famille des protéines qui fixent l’ARN et qui contiennent des domaines RRM (RNA Recognition Motif). Elles sont impliquées dans des mécanismes permettant la régulation de l’expression génique tels que l’épissage alternatif et la traduction. En particulier, elles participent à l’arrêt général de la traduction qui accompagne un stress environnemental en séquestrant les ARNms poly(A)+ non traduits dans des foci cytoplasmiques appelés granules de stress (SGs). Elles sont également impliquées dans la répression traductionnelle d’ARNms spécifiques en liant les ARE présents dans les extrémités 3’ non traduites de certains ARNms, et notamment des ARNs messagers codant pour le TNF-α et la cyclooxygénase-2 (Cox-2). L’invalidation des gènes tia-1 et tiar chez la souris conduit à une létalité embryonnaire élevée suggérant que ces protéines jouent également un rôle important au cours de l’embryogenèse. Afin de comprendre les mécanismes par lesquels les protéines TIA-1 et TIAR remplissent leurs différentes fonctions, nous avons réalisé un criblage par la technique du double hybride en levure afin d'identifier des partenaires d’interaction de ces deux protéines. Les protéines TIA-1 et TIAR interagissent avec les protéines FBPs (Fuse Binding Proteins). Celles-ci participent notamment à la maturation et à la dégradation des ARNs. Nous avons montré que les protéines FBPs co-localisent parfaitement avec TIA-1 dans le noyau et migrent dans les granules de stress en réponse à un stress oxydatif. De plus, des expériences de retard de migration sur gel réalisées à partir d’extrait cytosolique de macrophages ont montré que les protéines FBPs sont présentes dans le même complexe liant l’ARE du TNF-α que TIA-1. Enfin, la surexpression du domaine de liaison à l’ARN KH3 de FBP2 en fusion à l’EGFP induit la séquestration spécifique des protéines TIA-1 et TIAR dans des foci cytoplasmiques, empêchant ainsi leur accumulation nucléaire. Nos résultats indiquent que les protéines TIA-1/R et FBPs pourraient être fonctionnellement impliquées dans des étapes communes du métabolisme de l’ARN dans le noyau et/ou le cytoplasme.<br>Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire<br>info:eu-repo/semantics/nonPublished

Ce travail de thèse concerne deux protéines impliquées dans la traduction chez Plasmodium falciparum, parasite responsable du paludisme chez l’Homme. Elles ont en commun de reconnaître les ARN de transfert (ARNt): (i) l’aspartyl-ARNt synthètase (AspRS) reconnaît spécifiquement l’ARNtAsp et catalyse l’attachement de l’acide aspartique sur son extrémité 3’ et (ii) une protéine de fonction inconnue, appelée PftRBP (tRNA binding protein) qui elle, interagit avec tous les ARNt. L’AspRS cytoplasmique de P. Falciparum, qui s’accumule au cours du stade sanguin du développement du parasite est plus courte que ne l’indique la banque de données génomique. De plus, deux domaines fonctionnels caractéristiques de cette enzyme ont été identifiés : un motif riche en lysines dans l’extension N-terminale et une courte insertion présente dans le domaine de liaison à l’anticodon. Comme ces deux domaines, essentiels pour l’activité de l’AspRS du parasite, sont absents dans son homologue humain, ils ont été utilisés dans diverses approches prometteuses pour la recherche de molécules pourvues de propriétés potentiellement antipaludiques. La deuxième protéine, PftRBP n’est retrouvé que chez Plasmodium et comporte un domaine de liaison aux ARNt à son extrémité C-terminale. Nous avons pu montrer in vitro que†PftRBP: (i) lie spécifiquement et avec une forte affinité tous les ARNt, (ii) reconnaît le coude formé par les boucles D et T dans la structure conservée en L des ARNt, (iii) s’organise en tétramère et (iv) est localisée à la surface du parasite. L’ensemble de ces données suggère une fonction unique et originale pour cette protéine impliquant un trafic d’ARNt entre le parasite et son hôte<br>This PhD work concentrates on two proteins of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. They are both involved in the protein synthesis process of this parasite and interact with transfer RNAs (tRNAs): (i) aspartyl-tRNA synthetase (AspRS) specifically recognizes tRNAAsp and catalyzes the binding of aspartic acid to its 3’ end and (ii) a protein of unknown function, PftRBP (tRNA binding protein), that interacts with all tRNAs. It has been shown that the plasmodial AspRS, which accumulates during the erythrocytic stage of the parasite is shorter than expected, based on the genome database. This AspRS has two unique functional domains: a lysine-rich tRNA binding motif in the N-terminal extension of the protein and a short insertion in the anticodon binding domain. It has been demonstrated that these two motifs are essential for the parasite’s AspRS activity. Since they are absent in the human homologue, they were targeted to identify specific inhibitors with putative antimalarial effects. The second protein, PftRBP, displays a tRNA binding domain at its C-terminus that binds to all tRNA sequences. Indeed, in vitro PftRBP (i) binds only tRNAs with a high affinity, (ii) recognizes the elbow formed by the D and T loops of the conserved tRNA L-shaped structure, (iii) forms a tetramer and (iv) is exposed at the parasite’s surface. These results suggest a unique and original function for this protein implicating tRNA trafficking between the parasite and its host

La protéine de liaison aux ARN MEX-3 est un régulateur essentiel du développement embryonnaire chez le nématode Caenorhabditis elegans. Une famille de quatre gènes homologues à hMex-3 (dénommés hMex-3A, 3B, 3C et 3D) a été identifiée chez les mammifères par notre équipe. Afin de mieux comprendre la fonction physiologique in vivo des protéines Mex-3, nous avons invalidé le gène Mex-3B chez la souris. Cette approche expérimentale a révélé que Mex-3B est un acteur majeur de la spermatogenèse. Les souris mâles nullizygotes présentent une obstruction des tubes séminifères conduisant à une réduction importante du nombre des spermatozoïdes produits. L’ablation de Mex-3B ciblée à la cellule de Sertoli, cellule somatique essentielle à la fonction de l’épithélium séminifère, a permis d’établir que le phénotype testiculaire a pour origine une perturbation des propriétés biologiques de cette cellule. En effet, les cellules de Sertoli déficientes pour Mex-3B présentent des défauts de la phagocytose qui conduisent à une élimination défectueuse des corps résiduels au cours de la spemiogenèse. L’exploration des mécanismes moléculaires impliqués a montré que Mex-3B contrôle la phagocytose via la régulation de l’activité et de la localisation membranaire de Rap1GAP, une protéine qui régule négativement la petite protéine G Rap1. En accord avec ces données, l’absence de Mex-3B provoque une déstabilisation de la barrière hémato-testiculaire due à un défaut de localisation à la membrane plasmique des molécules de jonction connexine 43 et N-Cadhérine, protéines dont la translocation et la stabilité dépendent de Rap1. En conclusion, mes travaux de thèse ont permis de mettre en évidence un rôle clé de Mex-3B dans le contrôle spatial de la voie de signalisation Rap1 au cours de la spermatogenèse<br>The RNA binding-protein MEX-3 is a post-transcriptional regulator involved in early embryogenesis of the nematode Caenorhabditis elegans. We have recently reported the characterization of a novel family of four mammalian genes homologous to hMex-3 (called hMex-3A, 3B, 3C and 3D). To gain insight into the biological functions of these proteins in vivo, we disrupted the Mex-3B gene in mice. Using this experimental approach, we found that Mex-3B is as a major regulator of spermatogenesis. We observed that male Mex-3B null mice hypofertile and present an obstruction of seminiferous epithelium. Phagocytic properties of Sertoli cells were impaired, thus impeding the clearance of residual bodies released during spermiogenesis. Exploration of the underlying molecular mechanisms revealed that Mex-3B regulates phagocytosis through the activation and the transport at the peripheral membrane of Rap1GAP, a protein that downregulates the small G protein Rap1. Consistently, the Rap1-dependent recruitment of the junction proteins, connexin 43 and N-Cadherin at the cell surface was compromised in Mex-3B deficient mice. In conclusion, my work highlights a key role gor Mex-3B in the spatial control of Rap1 signaling during spermatogenesis

Plusieurs données expérimentales suggèrent que la protéine Core du virus de l’Hépatite B (HBV), en plus de ses fonctions structurales pour la formation des nucléocapsides dans le cytoplasme, pourrait avoir des fonctions régulatrices importantes dans le noyau des hépatocytes infectés. En effet, Core s’associe à l’ADNccc et aux promoteurs de certains gènes cellulaires dans le noyau des hépatocytes infectés et pourrait ainsi contrôler leur régulation transcriptionnelle. De plus, de par sa capacité à lier les ARN, elle pourrait également participer au métabolisme post-transcriptionnel de gènes viraux et/ou cellulaires. Pour caractériser ces fonctions, nous avons réalisé une analyse protéomique des facteurs cellulaires qui interagissent avec la protéine Core dans le noyau d’hépatocytes humains. Cet interactome a mis en évidence un grand nombre de protéines de liaison aux ARN (RBP), qui participent au métabolisme des ARN et en particulier aux mécanismes d’épissage. Deux interactants majeurs de Core ont été plus particulièrement étudiés, SRSF10 et RBMX, impliqués notamment dans l’épissage et la réparation de l’ADN. Une analyse fonctionnelle effectuée par une approche siRNA a montré que SRSF10 et RBMX affectent différemment le niveau des ARN viraux, vraisemblablement en agissant à des étapes différentes du cycle viral. De même, un composé ciblant l’activité de certaines RBP diminue fortement la réplication d’HBV en affectant l’accumulation des ARN viraux. Ainsi, ces résultats suggèrent que Core pourrait interagir avec certaines RBP pour contrôler le destin des ARN viraux et/ou cellulaires, une piste intéressante pour le développement de nouvelles stratégies antivirales ciblant l’hôte<br>Converging evidences suggest that the Hepatitis B virus (HBV) core protein, beside its well-known structural role to form nucleocapsids in the cytoplasm, could have important regulatory functions in the nucleus of infected hepatocytes. Indeed, nuclear Core was shown to associate with the cccDNA and to the promoters of some cellular genes, suggesting that Core may control viral and/or cellular gene expression. In addition, Core has the capacity to bind RNA, and may thus regulate HBV RNA metabolism. To elucidate these functions, we performed a proteomic analysis of the cellular factors interacting with nuclear Core in human hepatocytes. This interactome revealed a majority of highly interconnected RNA-binding proteins (RBPs), which participate in several steps of mRNA metabolism, including transcription, splicing and nuclear egress. We focused on two major Core-interacting factors, SRSF10 and RBMX that were previously involved in splicing and DNA repair. Functional analyses performed by a siRNA approach indicated that RBMX and SRSF10 were able to differentially regulate the levels of all viral RNAs most likely by acting at different steps of the viral life-cycle. Similarly, a small compound, affecting the activity of selected RBPs, severely impaired HBV replication by strongly reducing viral RNA accumulation. Altogether, these results strongly suggest that Core interacts with some selected RBPs to control the fate of viral and/or cellular RNAs and provide new critical information for the development of novel host-targeting antiviral agents (HTA)

Du gène à la protéine, l'étude des régulations de l'expression des gènes n'a fait que mieux révéler la complexité du monde eucaryote. Les mécanismes post transcriptionnels ont un rôle fondamental indiscutable. Une queue poly(A) est mise en place à l'extrémité de presque tous les ARNm après transcription. Elle joue un rôle important dans le contrôle de la stabilité et de la traduction des ARNm. C'est par la famille des protéines de liaison à la queue poly(A) (PABP) que la queue poly(A) intervient dans l'expression génique. Nous avons montré chez la levure que la PABP n'intervient pas seulement dans l'initiation de la traduction mais aussi dans la dernière étape de la synthèse protéique via son interaction avec le facteur de terminaison de la traduction eRF3. La PABP interagit in vivo avec eRF3 chez les eucaryotes, de la levure à l'homme, suggérant que la fonction associée à cette interaction dans la terminaison de la traduction est conservée. Nous avons caractérisé une nouvelle PABP de classe I chez le Xénope, appelée ePABP pour PABP embryonnaire. EPABP est capable de substituer fonctionnellement le gène levure PAB1. L'analyse du profil d'expression des protéines PABP de Xenope (ePABP et PABP1) au cours du développement précoce et dans les tissus adultes révèle une expression différente pour ces deux protéines. Nous proposons différents rôles clefs que peuvent jouer ces protéines dans la régulation de l'expression des gènes au cours du développement. La surproduction du facteur de terminaison eRF3 seul dans des cellules humaines en culture est sans effet sur la terminaison, mais elle modifie l'abondance de certains ARNm. L'effet de la surexpression d'eRF3 est différent en fonction du promoteur, suggérant un rôle d'eRF3 via la transcription ou un mécanisme couplé. De plus, nos analyses de localisation d'eRF3 n'ont pas permis de détecter cette protéine dans le noyau, suggérant que l'effet d'eRF3 est cytoplasmique et donc probablement indirect.

Lors de stress génotoxiques, une programmation rapide, spécifique et hautement contrôlée de l'expression des gènes est nécessaire, pour permettre aux cellules de s'adapter aux nouvelles conditions environnementales. La traduction des ARNm, l'étape finale de l'expression de l'information génétique est un processus finement régulé. Ainsi, sous différents stress, bien que la traduction de la plupart des ARNm soit inhibée, certains ARNm, codant des protéines impliquées dans le contrôle de la mort cellulaire, de la réparation de l'ADN ou du cycle cellulaire, sont préférentiellement traduits. Afin d'étendre la compréhension de ces mécanismes, nous nous sommes intéressés à la régulation de la traduction de l'ARNm de la GTPase rhoB sous UV. RhoB est un gène de réponse précoce, qui est induit sous UV pour participer à la réponse apoptotique. De plus, au cours de l'oncogénèse rhoB a un rôle suppresseur de tumeur et son expression protéique est diminuée dans plusieurs cancers. Nos résultats montrent que la traduction de l'ARNm codant rhoB est réprimée par l'action interdépendante du microARN miR-19 et de la protéine de liaison aux ARNm HuR. Nous mettons en évidence un nouveau mécanisme par lequel l'ARNm de rhoB résiste à l'inhibition générale de la traduction sous UV. Cet effet n'est pas associé à une variation de l'expression de miR-19 sous UV, mais implique la dissociation de HuR et de miR-19 de l'ARNm de rhoB, levant ainsi la répression traductionnelle de l'ARNm de rhoB exercée par ces facteurs. Nos travaux démontrent également que cette régulation contribue au rôle anti-apoptotique de RhoB sous UV. En conclusion, cette étude suggère que la régulation de la traduction par des microRNAs et des protéines de liaison aux ARNm puisse être déterminante dans de nombreux processus cellulaires et plus particulièrement dans la réponse au stress<br>When confronted with genotoxic stress, a highly specific and controlled gene expression program is necessary to allow cells to adapt rapidly to environmental changes. MRNA translation, the final step of gene expression, is finely regulated. Although global protein synthesis is inhibited by different cell stresses, mRNAs encoding some stress response proteins are preferentially translated. To study stress-dependent regulation of translation, we have investigated the translational regulation of the immediate-early response gene rhoB upon UV exposure. UV-induced RhoB expression contributes to the regulation of keratinocyte cell survival after UV exposure. RhoB has also been proposed to act as a tumor suppressor and its expression is often down-regulated in several cancers. We have shown that miR-19 and HuR bind to rhoB mRNA in an interdependent manner to inhibit RhoB expression. We have identified a novel mechanism by which the rhoB mRNA evades global repression of translation upon UV exposure. This effect is not associated with UV-dependant regulation of miR-19 expression but involves the loss of the interdependent binding of HuR and miR-19 on the rhoB mRNA upon UV exposure. Thus, inhibition of rhoB mRNA translation mediated by those factors is relieved. Furthermore, we have shown that this regulation contributes to the anti-apoptotic function of RhoB. This work suggests that the regulation of translation by microRNAs and mRNA binding proteins may be determinant in several cellular processes including the response to stress

Les ARNs non codant constituent une classe de transcrits qui ne sont pas traduits en protéines, mais qui jouent un rôle majeur dans les fonctions essentielles de la cellule, telles que la transcription, la traduction ou la régulation de l’expression des gènes. De nouveaux ARNs non codant ont été identifiées récemment chez les archées, grâce aux nouvelles techniques de séquençage et aux outils bio-informatiques.