Добірка наукової літератури з теми "Protéines contrôlant la sécrétion de type III"

Ralstonia solanacearum, l'agent causal du flétrissement bactérien, est considéré comme l'un des agents pathogènes bactériens les plus importants au monde. Le pouvoir pathogène de cette bactérie du sol est principalement basé sur son système de sécrétion de type III (SST3) et ses effecteurs de type III (ET3s), provoquant la maladie sur plus de 250 espèces végétales. R. solanacearum injecte ses ET3s à travers cette seringue moléculaire directement à l'intérieur de la plante hôte. Ces ET3s détournent les réponses de défense de la plante, soit dans le cytoplasme, soit dans le noyau, afin de supprimer l'immunité de la plante et de favoriser la multiplication bactérienne. La sécrétion des ET3s est finement contrôlée au niveau post-traductionnel par des protéines associées au contrôle de la sécrétion de type III, et par des protéines chaperonnes de type III.A ce jour, la fonction in planta de ces effecteurs et protéines chaperonnes, et la manière dont R. solanacearum module l’immunité de la plante en sa faveur restent mal comprises. Mon projet de thèse visait à mieux comprendre le rôle des déterminants de la pathogénicité de R. solanacearum en identifiant certaines des cibles d’A. thaliana, directes ou indirectes, modulées par la bactérie. Pour ce faire, j'ai utilisé des populations naturelles d'A. thaliana à deux échelles géographiques et adopté l'approche consistant à confronter des populations naturelles à des mutants de R. solanacearum dans lesquels des déterminants majeurs de pathogénie sont mutés. Cette approche est nouvelle puisque à ce jour les études d’association pangénomique (GWAS) menées sur les interactions plantes-agents pathogènes utilisent des souches sauvages de phytopathogènes. En outre, cette approche a permis de découvrir une diversité de réponses qui n'avaient pas été détectées auparavant. Dans la première partie de mon projet de thèse, j'ai identifié des QTLs impliqués dans la résistance quantitative à la maladie en réponse à des mutants simples de R. solanacearum, et j'ai validé fonctionnellement ces QTLs (Quantitative Trait Loci) comme facteurs de sensibilité. Dans la deuxième partie de ma thèse, nous avons étudié un gène codant pour une protéine de type NLR que nous avons appelé Bacterial Wilt Susceptibility 1 (BWS1). Nous avons montré que BWS1 agissait comme un facteur de sensibilité quantitatif, ayant un rôle de régulateur négatif dans une réponse immunitaire dépendante de SGT1.)
Ralstonia solanacearum, the causal agent of bacterial wilt, is considered one of the world’s most important bacterial pathogens. This soil-borne bacterium relies mainly on its type III secretion system (T3SS) and type III effectors (T3Es) in order to cause disease in more than 250 plant species. R. solanacearum injects its T3Es through this molecular syringe directly inside the host plant. These T3Es hijack plant defense responses in either the cytoplasm or the nucleus aiming to suppress plant immunity and promote bacterial multiplication. T3E secretion is finely controlled at the post-translational level by helper proteins, called T3SS control proteins, and type III chaperones.To date, the in planta function of these effectors and helper proteins and how R. solanacearum modulates plant genes to its favor remains poorly understood. My thesis project aimed to better understand the role of R. solanacearum pathogenicity determinants by identifying some of the direct or indirect plant targets of A. thaliana, modulated by the bacterium. For this purpose, I used natural populations of A. thaliana on two geographical scales and adopted the approach of challenging mapping populations to R. solanacearum mutants in which major pathogenic determinants are mutated. This approach is new since most of the GWAS (Genome-Wide Association Studies) in plant-pathogen interactions use wild-type strains of phytopathogens. Furthermore, it unveiled a previously undetected diversity of responses. In the first part of my Ph.D. project, I identified QTLs (Quantitative Trait Loci) involved in quantitative disease resistance to R. solanacearum single mutants and I validated these QTLs as susceptibility factors. In the second part of my thesis, we studied a gene encoding for a NLR protein that we called Bacterial Wilt Susceptibility 1 (BWS1). We showed that BWS1 was acting as quantitative susceptibility factor, mediating a negative regulation of an SGT1-dependent immune response

Un nombre croissant de protéines est localisé dans des régions spécifiques de la bactérie, cette localisation subcellaire étant la clé de leur fonction. Cependant en l'absence de compartiment intracellulaire membranaire, le mécanisme qui sous-tend la localisation des protéines de E. Coli au pôle par exemple de la cellule reste incompris. Nous montrons ici que la polarisation d'IpaC, composé du translocon du système de sécrétion de type III de Shigella flexneri est dépendante de son association avec la protéine chaperonne DnaK. Une construction d'IpaC fusionnée à la protéine fluorescente Venus (Civ) induit la formation de complexes de DnaK, exclus par le nucléoïde et accumulés au pôle bactérien, indépendamment de ses co-chaperons. Des expériences de FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching) ont montré que la diffusion de Civ au pôle était limitée, probablement par son association avec Dnak. Dnak empêche l'accumulation létale de Civ agrégée à travers le corps bactérien, permettant sa séquestration réversible au pôle. Nous pensons que ces résultats mettent en évidence un nouveau moyen pour la bactérie de confiner certaines protéines à un pôle, par exclusion par le nucléoïde des complexes DnaK-substrats, pouvant ensuite servir de réservoir de protéines dépliées ou partiellement dépliées. Ces résultats sont le point de départ de nouvelles études visant à caractériser le lien entre ces complexes polaires DnaK-substrats et les processus fonctionnels impliquant le dépliement des protéines, comme par exemple la sécrétion bactérienne
An increasing number of proteins are localized in specific regions of the bacteria, this subcellular localization being key to their function. In the absence of intracellular membrane-bound compartment, however, the mechanism underlying the localization of E. Coli proteins to the cell pole has remained elusive. Here, we show that polarization of the Shigella type III secretion system translocon component IpaC is driven by its association with the DnaK chaperone. An IpaC construct fused to the Venus fluorescent protein (Civ) induced DnaK complexes that were excluded from the nucleoid and accumulated at the bacterial pole independent of its co-chaperones. Fluorescence alter photobleaching (FRAP) analysis indicated that Civ diffusion at the pole was restricted, likely by DnaK association. DnaK prevented the lethal accumulation of aggregated Civ through the bacterial body, to allow its reversible sequestration at the pole. We believe that these findings are shedding new lights a bacterial means to confine proteins at the pole through the nucleoid-mediated exclusion of DnaK-substrate complexes, that may then serve as a reservoir of , unfolded or partially unfolded proteins. It is anticipated that these findings will be the starting point of further studies aiming at characterizing the link between these polar DnaK-substrate complexes and functional processes involving protein unfolding, such as bacterial secretion

Les bactéries entéropathogènes du genre Salmonella et Shigella sont transmises par les aliments ou l’eau et sont responsables de nombreuses infections entériques chez les animaux et les humains. Ces maladies infectieuses restent une cause importante de morbidité et de mortalité dans les pays en voie de développement. L’existence de multiples sérotypes de Salmonella et de Shigella ainsi que l’émergence de souches résistantes aux antibiotiques, nécessite le développement de vaccins efficaces et large spectre. Ces bactéries utilisent un système d’injection de leurs protéines effectrices, appelé injectisome ou encore Système de Sécrétion de Type III (SST3), nécessaire à leur pathogénicité. Alors que les protéines effectrices injectées au moyen de cet injectisome sont variées et dépendent essentiellement du type cellulaire cible et donc de la spécificité du pathogène, certaines des protéines structurales composant l’injectisome sont relativement bien conservées parmi les différentes bactéries pathogènes, notamment les protéines de l’aiguille : PrgI et MxiH, et celles de la coiffe de l’aiguille : SipD et IpaD, respectivement de Salmonella et Shigella. Ces protéines, fortement impliquées dans la virulence des bactéries, semblent donc être des cibles de choix pour lutter contre des infections opportunistes impliquant ces bactéries pathogènes.Le premier objectif de cette thèse était d’évaluer l’immunogénicité et l’effet protecteur des protéines structurales de l’injectisome citées précédemment contre les infections à Salmonella et Shigella. Les protéines recombinantes préparées et produites au laboratoire ont été utilisées de façon séparée ou en combinaison pour immuniser des souris par différentes routes. Ensuite, les réponses immunitaires des souris ainsi immunisées ont été analysées par des tests immunométriques. Enfin, le potentiel immunogène et vaccinant de ces protéines structurales a été évalué en infectant les souris immunisées avec 100 DL50 de Salmonella par voie orale ou de Shigella par voie intranasale. Le meilleur résultat a été obtenu en utilisant la voie intra-gastrique pour les immunisations avec environ 70% de protection. Cette stratégie a permis également d’évaluer la pertinence de cette approche vaccinale dans un modèle murin de protection croisée (entre 25 et 60%). Le deuxième objectif de cette thèse était d’évaluer le pouvoir protecteur d’anticorps monoclonaux murins reconnaissant les régions conservées des protéines SipD et IpaD. Les anticorps obtenus ont été caractérisés et leur pouvoir neutralisant a été évalué in vivo dans un modèle murin d’infection avec Salmonella ou Shigella (jusqu’à 60% de protection).L’ensemble de ces travaux montre que l’utilisation de certaines protéines structurales conservées de l’injectisome de bactéries entéropathogènes présente un intérêt vaccinal et immunothérapeutique pour aider au traitement de certaines salmonelloses et shigelloses
Salmonella and Shigella species are food and water borne pathogens that are responsible for enteric infections in both humans and animals. These infectious diseases are still the major cause of morbidity and mortality in the emerging countries. The existence of multiple Salmonella and Shigella serotypes as well as the emergence of antibio- resistant strains, require the development of protective and broad-spectrum vaccines. All these bacteria utilize a system for injection of their effectors, called injectisome or Type III Secretion System (T3SS), necessary for their pathogenicity. While effector proteins are varied and depend essentially on the cellular target and thus on the specificity of the pathogen, the structural proteins that form the injectisome are common to all virulent Salmonella and Shigella spp., particularly the needle proteins PrgI and MxiH and the needle-tip proteins SipD and IpaD of Salmonella and Shigella respectively. These proteins, strongly involved in the virulence of the bacteria, appear to be ideal candidate antigens for a subunit-based, broad spectrum vaccine.The first aim of my PhD was to evaluate the immunogenicity and protective efficacy of structural proteins of the above-mentioned injectisome against Salmonella and Shigella infections. The recombinant proteins were prepared and produced in the laboratory and were used alone or in combination to immunize mice using different routes. The immune responses of immunized mice were then analyzed by immunometric assays. Finally, the protective efficacy was evaluated in a mouse model of intestinal (Salmonella) or pulmonary (Shigella) challenge. The best result was obtained by orogastric immunization with 70% of protection. This strategy also allowed to estimate the relevance of this approach in a mouse model of crossed protection (from 25 to 60%). The second objective of my PhD was to evaluate the protective efficacy of murine monoclonal antibodies recognizing conserved regions of SipD and IpaD proteins. The obtained antibodies were characterized and their therapeutic effect was evaluated in vivo with a Salmonella and Shigella infection murine model (up to 60% of protection).To conclude, this work showed that some conserved structural proteins composing the injectisome of enteropathogenic bacteria is of interest for treatment of enteric diseases caused by Salmonella and Shigella

Cette thèse est composée de deux parties : Le première partie rend compte de l'étude structurale de la protéine RrgA. RrgA est associée au pilus du pathogène Streptococcus pneumoniae et participe aux premières étapes de colonisation chez l'hôte en se liant à plusieurs composés de la Matrice Extra Cellulaire. Nous avons résolu la structure de cette protéine à 1.9 Å par cristallographie aux rayons-X. RrgA possède une structure allongée formée de quatre domaines alignés d'origine eucaryote et procaryote. En effet, trois domaines ayant des similarités structurales avec les IgG et le domaine Cna-B semblent servir de piédestal pour orienter et présenter le domaine fonctionnel de type Intégrine. Nous avons confirmé la formation de deux ponts isopeptidiques stabilisateurs par spectrométrie de masse. De plus, le domaine intégrine possède deux insertions particulières dont la présence pourrait être impliquée dans la reconnaissance des divers substrats par RrgA. La deuxième partie de cette thèse est axée sur l'étude structurale du complexe ATPase et de ExsB, la pilotine présumée du système de sécrétion de type III chez Pseudomonas aeruginosa, bactérie opportuniste et jouant un rôle majeur dans l'infection des patients atteints de mucoviscidose. Pour la première fois, nous avons mis au point un protocole d'expression et de purification sous forme soluble de l'ATPase PscN en complexe avec une protéine partenaire, PscL. Des cristaux de ce complexe ont été obtenus au robot du PSB. Par ailleurs, nous avons confirmé l'expression de la lipoprotéine ExsB chez P. aeruginosa que nous avons localisée au sein de la membrane externe. De plus, nous avons résolu la structure de cette protéine qui présente un nouveau repliement et qui établie les bases structurales pour l'étude des pilotines pour tous les systèmes de sécrétion de type III de la famille Ysc
This manuscript is made up of two parts The first part describes the structural study of RrgA from Streptococcus pneumoniae. This protein is a pilus-associated adhesin that is able to bind to several components of the Extra Cellular Matrix and thus, participates in the first steps of host colonization. We solved the structure of RrgA to 1.9 Å by X-Ray crystallography. We showed that RrgA folds into an elongated 4-domain structure, and these domains display both eukaryotic and prokaryotic origins. Actually, three out of the four domains are reminiscent of IgG and Cna-B structures and act like stalks to orient and display the large Integrin-like domain. We confirmed the presence of two isopeptide bonds by mass spectrometry and hypothesised that the two inserted arms in the integrin domain could explain the wide variety of substrates RrgA can bind. The second part of this manuscript focuses on the structural studies of the ATPase complex as well as ExsB, the putative pilotin of the type III secretion system from Pseudomonas aeruginosa. This bacterium is a major threat in hospital-acquired infections and the main pathogen found in cystic-fibrosis suffering patients. For the first time we were able to express and purify the ATPase PscN in complex with its partner PscL. Crystallization trials led to a very promising condition that is being refined. Moreover, we confirmed expression of the lipoprotein ExsB in P. aeruginosa that we localised in the outer membrane. To have a better understanding of this protein, we also solved its high-resolution structure that displays a novel fold and our study paves the way for coming studies concerning pilotins

La bactérie phytopathogène Ralstonia solanacearum est l'agent responsable du flétrissement bactérien sur plus de 200 espèces végétales, dont des espèces agronomiques, faisant de cette bactériose une des plus importantes dans le monde. Le pouvoir pathogène de la bactérie repose en grande partie sur sa capacité à injecter des protéines, appelées effecteurs de type III (ET3s), via le système de sécrétion de type III (SST3). La dernière décennie a été notamment marquée par la découverte chez les bactéries pathogènes de nombreuses protéines impliquées dans le contrôle du processus de sécrétion de type III. Chez R. Solanacearum, ces mécanismes de contrôle de la sécrétion restent méconnus, contrairement aux mécanismes de régulation transcriptionnelle. Au cours de ces travaux, nous nous sommes attachés à caractériser les fonctions des protéines HpaB (RSp0853), HpaD (RSp0848) et FliT-like (RSc2897) pour lesquelles plusieurs éléments suggèrent un potentiel rôle comme chaperonnes de type III (CT3s), ainsi que de la protéine HpaP (RSp0862) qui présente un domaine T3S4 (Type III Secretion Substrate Specificity Switch). Nous avons pu mettre en évidence la capacité de certaines CT3s à interagir entre elles et, pour HpaB et HpaD, à interagir avec de nombreux ET3s. De plus, les trois CT3s putatives semblent impliquées dans le pouvoir pathogène de R. Solanacearum, HpaB s'avérant même indispensable à la virulence de la bactérie. D'autre part, nos travaux mettent en exergue l'importance de la protéine HpaP pour le pouvoir pathogène de la bactérie et son implication dans le contrôle de la sécrétion de substrats du SST3. Les résultats suggèrent notamment que HpaP promeut la sécrétion de l'ET3 PopP1 en interagissant physiquement avec ce dernier. Finalement, la caractérisation de séquences conservées du domaine T3S4 révèle l'importance de cette région pour la fonction de la protéine HpaP. L'ensemble de ces travaux suggère l'implication de plusieurs protéines de R. Solanacearum dans le contrôle du processus de sécrétion de type III et souligne la diversité des mécanismes mis en jeu impliquant les protéines de type T3S4 chez les bactéries pathogènes
The plant pathogenic bacterium Ralstonia solanacearum is the causative agent of the bacterial wilt on more than 200 plant species, including agronomic species, making it one of the most important bacterial disease in the world. The pathogenicity of the bacteria is largely based on its ability to inject proteins, called type III effectors (T3Es) via the type III secretion system (T3SS). The last decade has been particularly marked by the discovery of many proteins involved in the control of the type III secretion process in pathogenic bacteria. In R. Solanacearum , these control mechanisms remain unknown , unlike the transcriptional regulatory mechanisms. In this work, we focused on the functional characterization of the proteins HpaB (Rsp0853), HpaD (RSp0848) and FliT-like (RSc2897) for which several elements suggest a potential role as type III chaperones (T3Cs). We also focused on the HpaP protein (Rsp0862) which harbors a T3S4 domain (Type III Secretion Substrate Specificity Switch). We showed the ability of some CT3s to interact with each other and, concerning HpaB and HpaD, to interact with many T3Es. In addition, the three putative T3Cs seem to be involved in the pathogenicity of R. Solanacearum, HpaB being even strictly required for bacterial virulence. Furthermore, our work highlights the importance of HpaP in pathogenicity and its involvement in the control of the secretion of T3SS substrates. The results suggest in particular that HpaP promotes the secretion of the T3E PopP1 by physically interacting with the latter. Finally, the characterization of conserved sequences in the T3S4 domain reveals the importance of this region for the function of the HpaP protein. On the whole, this work suggests the involvement of several proteins of R. Solanacearum in the control of the type III secretion process and highlights the diversity of mechanisms in which T3S4 proteins are involved in pathogenic bacteria

Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) est responsable de la nervation noire sur les Brassicaceae, notamment les choux, les radis, la moutarde et l'espèce modèle Arabidopsis thaliana. Au cours de l'infection, Xcc transloque des protéines effectrices de type 3 (T3E) dans les cellules végétales via le système de secrétion de type 3 (T3SS), pour moduler la physiologie de l'hôte et favoriser la maladie. Le répertoire des T3E présents dans une souche donnée influence largement sa niche, sa gamme d'hôtes et son mode de vie. Dans la souche Xcc 8004, vingt-huit gènes ont été prédits pour coder des protéines sécrétées par le T3SS (T3SP). Dans un premier chapitre à l'échelle de l'effectome, nous montrons que la plupart des fonctions des T3SP au sein des cellules végétales restent inconnues. Dans ce projet, différentes stratégies ont été abordées pour caractériser les fonctions biologiques des T3SPs de la souche Xcc 8004 dans les cellules végétales. Bien que la délétion des gènes individuels codant des T3SP n'ait pas eu d'effet significatif sur la virulence de Xcc chez Arabidopsis, l'expression hétérologue de T3SP individuelles chez Arabidopsis a montré des effets marqués sur la physiologie de la plante pour de nombreuses T3SP. De manière surprenante, plusieures T3SP sont capables de déclencher des réponses immunitaires et certaines ont présenté des effets ambivalentes en inhibant simultanément la phosphorylation déclenchée par flg22 de MPK3/6. Dans une deuxième partie, nous avons réalisé une analyse comparative des fonctions in planta des T3SPs XopAG et RipO1 qui sont codées par des gènes orthologues dans Xcc souche 8004 et Ralstonia solanacearum souche GMI1000, respectivement. Dans nos expériences, XopAG a montré une contribution significative à la pathogénicité de Xcc qui ne semble pas liée à la suppression de certaines réponses immunitaires basales. XopAG et RipO1 présentent des similitudes fonctionnelles. En effet, les deux T3SP affectent l'expression de gènes connus de réponse à l'auxine, à l'acide jasmonique et à l'éthylène, ce qui est cohérent avec l'inhibition de la croissance des plantes induite par ces deux effecteurs chez Arabidopsis. Une recherche in silico de cibles végétales potentielles de XopAG suivie d'essais du pouvoir pathoène sur des mutants d'Arabidopsisa a permis d'identifier BRG3 (BOI-RELATED GENE 3) comme cible putative de XopAG. Dans une approche parallèle, nous avons effectué un criblage de suppresseurs pour identifier les mutations qui atténuent le phénotype d'arrêt de croissance induit par XopAG chez Arabidopsis, résultant en l'identification de huit lignées suppresseurs. Ces lignées fournissent une occasion précieuse d'identifier les voies affectées par XopAG chez Arabidopsis. De manière générale, ce projet contribue à la compréhension des activités biologiques exercées par les T3SP de la souche Xcc 8004 dans les cellules végétales
Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) causes black rot disease on Brassicaceae species including cabbages, radish, mustard and the model species Arabidopsis thaliana. During pathogenesis, Xcc secrete Type 3 Effector (T3E) proteins via the Type 3 Secretion System (T3SS) into plant cells to modulate host physiology and promote pathogenicity. The repertoire of T3Es present in a given strain largely influences its niche, host range and lifestyle. In the Xcc strain 8004, twenty-eight genes have been predicted to encode proteins secreted by the T3SS. The functions of most Type 3 Secreted Proteins (T3SPs) within plant cells remain elusive. In this project, different strategies were approached to characterize the biological functions of the T3SPs of Xcc strain 8004 in plant cells. In the first chapter, we showed that the loss of individual T3SPs did not cause a significant effect on Xcc virulence on Arabidopsis. Yet, the heterologous expression of individual T3SPs in Arabidopsis plants revealed many T3SPs with marked effects on plant growth and transcriptome. Several T3SPs also triggered plant immune responses and some exhibited ambivalent activities by simultaneously inhibiting flg22-triggered phosphorylation of MPK3/6. In the second chapter, we conducted a comparative analysis of the in planta functions of the T3E XopAG and RipO1 which are encoded by orthologous genes in Xcc strain 8004 and Ralstonia solanacearum strain GMI1000 respectively. In our experiments, XopAG showed a significant contribution to Xcc pathogenicity that was not related to the suppression of some basal immune responses. XopAG and RipO1 exhibited functional similarities. Indeed, both T3E affected the expression of genes responsive to auxin, jasmonic acid and ethylene suggesting that both effectors inhibit plant growth. Finally, we made some efforts to identify the plant target of XopAG. An in silico search followed by pathogenicity assays posits BRG3 (BOI-RELATED GENE 3) as a candidate target of XopAG. In a parallel approach, we performed a suppressor screen to identify suppressor mutations that alleviate the growth defect induced by XopAG in Arabidopsis plants, resulting in eight suppressor lines. These provide a valuable opportunity to identify the pathways targetted by XopAG in Arabidopsis. Altogether, this project contributes to the better comprehension of the biological activities exerted by the Xcc strain 8004 T3SPs in planta

Cette thèse est composée de deux parties : Le première partie rend compte de l'étude structurale de la protéine RrgA. RrgA est associée au pilus du pathogène Streptococcus pneumoniae et participe aux premières étapes de colonisation chez l'hôte en se liant à plusieurs composés de la Matrice Extra Cellulaire. Nous avons résolu la structure de cette protéine à 1.9 Å par cristallographie aux rayons-X. RrgA possède une structure allongée formée de quatre domaines alignés d'origine eucaryote et procaryote. En effet, trois domaines ayant des similarités structurales avec les IgG et le domaine Cna-B semblent servir de piédestal pour orienter et présenter le domaine fonctionnel de type Intégrine. Nous avons confirmé la formation de deux ponts isopeptidiques stabilisateurs par spectrométrie de masse. De plus, le domaine intégrine possède deux insertions particulières dont la présence pourrait être impliquée dans la reconnaissance des divers substrats par RrgA. La deuxième partie de cette thèse est axée sur l'étude structurale du complexe ATPase et de ExsB, la pilotine présumée du système de sécrétion de type III chez Pseudomonas aeruginosa, bactérie opportuniste et jouant un rôle majeur dans l'infection des patients atteints de mucoviscidose. Pour la première fois, nous avons mis au point un protocole d'expression et de purification sous forme soluble de l'ATPase PscN en complexe avec une protéine partenaire, PscL. Des cristaux de ce complexe ont été obtenus au robot du PSB. Par ailleurs, nous avons confirmé l'expression de la lipoprotéine ExsB chez P. aeruginosa que nous avons localisée au sein de la membrane externe. De plus, nous avons résolu la structure de cette protéine qui présente un nouveau repliement et qui établie les bases structurales pour l'étude des pilotines pour tous les systèmes de sécrétion de type III de la famille Ysc.

Pseudomonas aeruginosa, une bactérie à Gram négatif responsable d'infections nosocomiales, possède de nombreux facteurs de virulence lui permettant d'infecter ses hôtes. En particulier, le Système de Sécrétion de Type III (SST3) lui permet d'injecter des effecteurs directement dans le cytoplasme de la cellule cible eucaryote. Durant cette thèse, deux protéines du SST3 de P. aeruginosa ont été étudiées : l'ATPase PscN et la protéine ExsB. Plusieurs approches ont été utilisées afin d'étudier l'ATPase PscN, indispensable à l'activité du SST3. Des mutations ponctuelles réalisées dans PscN conduisent à des souches de P. aeruginosa non cytotoxiques, et cet effet est dominant négatif. Une autre approche a permis l'obtention de fractions partiellement purifiées de l'ATPase PscN active, sous forme de grands complexes visualisés en microscopie électronique. Ces fractions contiennent également d'autres protéines du SST3, qui pourraient être des partenaires de PscN. La protéine ExsB a été caractérisée pour la première fois. Après avoir vérifié son expression chez P. aeruginosa, son association à la membrane externe de la bactérie a été démontrée. Son rôle a ensuite été étudié par une analyse du phénotype d'une souche de P. aeruginosa dépourvue du gène exsB. Nous n'avons pas identifié d'activité de ExsB dans la régulation du SST3. Après avoir constaté l'implication de ExsB dans la virulence de la bactérie dans des modèles d'infections aiguës chez les animaux, son rôle dans l'activité du SST3 a été établi. Nous avons enfin pu montrer que ExsB a une activité de pilotine, car elle participe à l'assemblage de la sécrétine, le composant de la membrane externe du SST3
Pseudomonas aeruginosa, a Gram negative bacterium responsible for nosocomial infections, exhibits numerous virulence factors to infect its hosts. In particular, the Type III Secretion System (T3SS) allows the injection of effectors directly into the host cell cytoplasm. This work focuses on the study of two proteins from the T3SS of P. aeruginosa: the ATPase PscN and the ExsB protein. Several approaches were used to study the ATPase PscN, an enzyme essential for T3SS activity. Site-directed mutations, made on PscN, lead to non cytotoxic strains, and this effect is dominant negative. Another approach allowed the partial purification of active PscN, visualized as large complexes by electron microscopy. These partially purified samples also contain other T3SS proteins, which could interact with PscN. The ExsB protein was characterized for the first time. After checking its expression in P. aeruginosa, its association with the outer membrane was shown. The phenotypic analysis of a strain lacking exsB gene gave insights into the role of this protein. We did not identified any function of ExsB in the T3SS regulation. After showing the involvement of ExsB in the bacterial virulence during acute animal infections, ExsB role in T3SS activity was established. Finally, we showed that ExsB has a pilotin activity as it participates in the assembly of the secretin, the outer membrane component of T3SS

Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) est une bactérie phytopathogène responsable de la bactériose vasculaire du riz, maladie pouvant engendrer de fortes pertes de rendement à travers le monde. La course à l'armement entre la bactérie et sa plante hôte correspond d'une part à la mise en place de la virulence par le microorganisme et d'autre part en la résistance du végétal face à l'agression. Comprendre les mécanismes par lesquels Xoo accompli son cycle infectieux est d'une importance cruciale pour le développement futur de nouvelle méthode de luttes. Plusieurs approches complémentaires ont été mises en uvre afin de caractériser des éléments associés au pouvoir pathogène de Xoo.Dans un premier temps nous avons effectué une analyse protéomique comparative. Cette approche a permis l'identification chez une souche Africaine de Xoo d'un jeu de protéines induites par HrpX et susceptibles de jouer un rôle dans la virulence. Dans un second temps, l'implication de deux peptides dans la virulence Xoo a été étudiée. Le premier de ces peptides, supposé être le facteur d'avirulenceAvrXa21, a fait l'objet d'une caractérisation fonctionnelle et phylogénique. Le second peptide est synthétisé par un cluster NRPS, similaire à l'un de ceux présent chez Xanthomonas albilineans. Afin d'élucider l'importance de la molécule synthétisée par cette voie pour Xoo, une étude préliminaire impliquant la mutation d'un élément régulateur des NRPS a été effectuée. En dernier lieu, des informations nouvelles ont été apportées sur la topologie de la protéine membranaire HrcR qui est une composante essentielle du système de sécrétion de type III chez la plupart des bactéries appartenant au genre Xanthomonas
Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) is the agent of bacterial leaf blight BLB in rice, a disease which causes considerable yield losses throughout the world. In the arms race underlying the interactions between the microorganism and the host, the presence of virulence factors in the former parallels that of resistance factors in the latter. Understanding the mechanisms of Xoo's infectious cycle is of paramount importance for the elaboration of new fighting strategies to combat BLB. To achieve this, several complementary approaches to characterize components of Xoo's pathogenicity have been employed.First, we performed comparative proteomics that allowed us to identify novel HrpX-induced candidate pathogenicity factors of an African Xoo strain. Second, the involvement of two peptides in Xoo's pathogenicity has been investigated. One was speculated to be the avirulence factor AvrXa21 and has been characterized both functionally and phylogenetically. The other one was found to be synthesized by a Non-Ribosomal Peptide Synthetase (NRPS), reminescent to NRPS genes found in Xanthomonas albilineans. In order to determine the role of NRPS-mediated synthesis in Xoo virulence, we studied a strain carrying a mutated regulatory gene of the NRPS pathway. Finally, we provide new information on the topology of the HrcR membrane protein which is a conserved component of the type III secretion system of most Xanthomonas

Les Chlamydia sont des bactéries parasites intracellulaires obligatoires qui infectent de nombreuses espèces animales dont l'homme. L'identification de facteurs utilisés par Chlamydia pour coloniser son hôte et résister aux mécanismes de défense est un prérequis à la meilleure compréhension de la pathogénie de cette maladie. La comparaison de souches intra- ou inter-espèce offre la possibilité de mettre en évidence de tels facteurs. Dans cette étude, la souche mutante C. Psittaci 1B, a été comparée à sa souche parentale. Seule une technique élaborée de biologie moléculaire basée sur l'amplification sélective de fragments de restriction a permis de visualiser quelques-unes des mutations survenues dans le génome de cette souche mutante. Suite à l'identification d'un locus associé au système de sécrétion de type III chez Chlamydia, celui-ci a été recherché et mis en évidence chez C. Psittaci et C. Pecorum. La forte conservation de ce locus souligne le rôle vraisemblablement essentiel de ce système dans la biologie des Chlamydia. L'analyse de plusieurs génomes de Chlamydia a fait ressortir une famille de protéines, les Pmp. L'analyse par RFLP de plusieurs segments des gènes Pmp menée sur différentes souches de C. Psittaci a permis de mettre en évidence l'existence d'un polymorphisme pour les souches isolées des petits ruminants, mais également au sein des souches aviaires, posant la question de l'incidence de ces variations sur la virulence des souches. La forte conservation de cette famille de gènes au sein de l'espèce C. Psittaci a été mise à profit pour améliorer la sensibilité de la technique de PCR pour le diagnostic spécifique des infections à C. Psittaci. En effet, C. Pecorum, un résident avirulent des ruminants, n'est pas dépisté. Les réactions croisées d'un anticorps monoclonal spécifique d'une des protéines Pmp de C. Psittaci avec C. Pecorum suggèrent cependant l'existence de telles protéines chez C. Pecorum.