Дисертації з теми "Protéine non structurale NS1"

Parmi les virus émergents transmis par des moustiques (arbovirus), le genre flavivirus est fortement représenté avec les virus Dengue, Zika, et le virus West Nile (WNV). Le WNV est responsable de nombreux cas de maladies neuroinvasives sévères, parfois mortelles, chez l'humain et les chevaux. Ce virus représente donc un problème de santé publique humaine et animale. Il n'existe pour le moment aucun vaccin humain ni aucun traitement spécifique anti-WNV.Parmi les déterminants viraux essentiels à l'infection par les flavivirus, la glycoprotéine non-structurale NS1 possède des propriétés multifonctionnelles. La forme sNS1, sécrétée dans le milieu extracellulaire, est fortement impliquée dans la dérégulation du système immunitaire de l'hôte. Ces mécanismes participent à l'évasion du virus à la réponse antivirale et, paradoxalement, à la pathogenèse observée dans les formes sévères de la maladie. L'essentiel de ces données concernant le virus de la Dengue, nous souhaitions étudier les propriétés fonctionnelles, in vitro, de la protéine sNS1WNV au cours de l'infection de cellules épithéliales, gliales et neuronales de mammifères. En effet, la structure des protéines sNS1 de flavivirus étant très similaire, notre hypothèse suppose un rôle de sNS1WNV dans les infections neuroinvasives.Si la protéine sNS1WNV ne semble pas moduler les étapes de l'infection virale, elle est cependant à l'origine d'un remodelage du cytosquelette d'actine dans les cellules épithéliales. Elle est aussi impliquée dans l'activation de voies antivirales chez les cellules neuronales non infectées. D'autre part, en ciblant sNS1 et la protéine d'enveloppe E du WNV, nous avons pu isoler, par criblage de molécules aRep (protéines artificielles à motifs répétés), des ligands de haute affinité pour ces déterminants viraux. Ces nouvelles molécules, capables de se lier spécifiquement aux protéines sNS1 et E, ont le potentiel pour servir de base au développement de nouveaux outils de diagnostics et d'agents thérapeutiques antiviraux
Among emerging mosquito-borne viruses (arboviruses), flaviviruses like Dengue, Zika and West Nile virus (WNV) are very often involved in outbreaks. WNV causes several neuroinvasive diseases, which can be lethal, in humans and horses each year. This virus is a threat for both, human and animal public health. Furthermore, there is no human vaccine currently or any specific antiviral treatments against WNV.Among viral factors which are essential for flavivirus infection, the nonstructural glycoprotein NS1 is a multifunctional protein. The secreted form sNS1, is released in the extracellular medium from infected cells and is strongly involved in immune system dysregulation. The functions of sNS1 play roles in immune escape and, paradoxically, in pathogenesis which is observed in severe forms of the disease. Because most of this data are about Dengue Virus, we would like to study, in vitro, functional properties of the sNS1WNV during infection of epithelial, glial and neuronal mammalian cells. Based on the high sNS1 protein structure similarities among flaviviruses, our hypothesis suggests a role of sNS1WNV in neuroinvasive infections.The sNS1WNV protein doesn’t seem to modulate viral infection steps. However, it is involved in actin cytoskeleton remodeling in epithelial cells. sNS1WNV is also involved in the activation of antiviral response pathways in non-infected neuronal cells. On the other hand, by targeting sNS1 and envelope protein E of WNV, we performed a screening of aRep molecules (artificial proteins with alphahelicoïdal repeats) and isolated ligands with high affinity for these viral factors. Because this new type of molecules is able to specifically bind to sNS1 and E, they have potential to be used for the development of new diagnostic tools and antiviral therapeutic agents

Le virus respiratoire syncytial (VRS) est une cause majeure d'infections respiratoires sévères, notamment chez les nourrissons et les jeunes enfants. Il parvient à échapper au système immunitaire inné notamment grâce à ses deux protéines non structurales NS1 et NS2. La protéine NS1 joue le rôle d'antagoniste des interférons. Elle inhibe la production d'interférons ainsi que leurs voies de signalisation. Cependant, une nouvelle hypothèse suggère qu'elle pourrait également contribuer à réguler l'expression des gènes de l'hôte via une interaction avec la sous-unité MED25 du complexe médiateur, un coactivateur de la transcription par l'ARN polymérase II. Mon travail de thèse porte sur la caractérisation structurale de cette interaction in vitro.Dans un premier temps, j'ai voulu m'assurer que la protéine NS1 était sous forme native dans les conditions où sont faites les expériences d'interaction. En effet, NS1 peut être produite sous forme de protéine recombinante dans E. coli et une structure cristallographique de NS1 est disponible : elle révèle un domaine globulaire "NS1core" et une hélice C-terminale "NS1α3" située à l'interface d'un dimère. Mais NS1 est difficile à étudier en solution en raison de sa propension à s'auto-associer. J'ai donc analysé le comportement de NS1 dans différentes conditions expérimentales et avec différentes techniques biophysiques : fluorimétrie différentielle à balayage pour la stabilité thermique, dichroïsme circulaire pour la structure secondaire, diffusion de la lumière pour la taille. Cela a permis de mettre en évidence un équilibre entre monomère et dimère de NS1. Un mutant de délétion de NS1, NS1∆α3 qui correspond à NS1core, a pu être étudié à l'échelle du résidu par résonance magnétique nucléaire (RMN). J'ai attribué les fréquences de résonance du squelette peptidique ce qui m'a permis de montrer qu'il était structuré en solution. Les largeurs de raie importantes et les mesures de relaxation 15N pointent vers des phénomènes d'échange. L'attribution de NS1∆α3 m'a permis ensuite d'attribution partiellement la protéine NS1 entière et d'analyser des expériences d'interaction par RMN.La seconde partie de ma thèse s'intéresse à l'interaction entre NS1 et le domaine ACID de MED25. Des études par RMN de la protéine MED25-ACID marquée aux isotopes 15N et 13C avec un peptide correspondant à NS1α3 ont d'abord révélé que NS1α3 interagit avec MED25-ACID. Des expériences de calorimétrie ont montré que la protéine NS1 entière avait une affinité bien supérieure à celle de NS1α3, suggérant une interaction potentielle via le domaine globulaire NS1core en plus de l'hélice NS1α3. Des données obtenues par interférométrie de bio-couches (BLI) ont ensuite confirmé cette interaction. Elles montrent que NS1∆α3 se lie à MED25-ACID avec une affinité plus faible que NS1, en présentant deux modes de fixation. Des modélisations par AlphaFold2 n'ont pas produit de modèle de complexe fiable avec NS1∆α3 ou NS1α3. Mais elles ont permis de prédire avec une certaine fiabilité la structure du complexe MED25-ACID−NS1. Des mutants de NS1, basés sur cette prédiction, ont été testés par BLI, montrant une réduction de l'interaction avec MED25-ACID
Respiratory syncytial virus (RSV) is a major cause of severe respiratory infections, particularly in infants and young children. It evades the innate immune system notably thanks to its two non-structural proteins, NS1 and NS2. The NS1 protein functions as an interferon antagonist, inhibiting both the production of interferons and their signaling pathways. However, a new hypothesis suggests that NS1 could also contribute to the regulation of host gene expression via an interaction with the MED25 subunit of the mediator complex, a coactivator of transcription by RNA polymerase II. My thesis focuses on the structural characterization of this interaction in vitro.In a first step, I wanted to ensure that NS1 was in its native form under the conditions used for interaction experiments. NS1 can indeed be produced as a recombinant protein in E. coli, and a crystallographic structure of NS1 is available: it reveals a globular domain "NS1core" and a C-terminal helix "NS1α3" located at the interface of an NS1 dimer. However, NS1 is challenging to study in solution due to its propensity to self-assemble. I thus analyzed the behavior of NS1 under different experimental conditions and by different biophysical techniques: differential scanning fluorimetry to assess stability, circular dichroism to assess secondary structure, and light scattering to assess size. This allowed providing evidence for an NS1 monomer-dimer equilibrium. A deletion mutant of NS1, NS1∆α3 corresponding to NS1core, was amenable to nuclear magnetic resonance (NMR) for structural analysis at the single residue scale. I performed backbone assignment, and showed that it was well folded in solution. Large line-widths and 15N relaxation measurements pointed at exchange phenomena. Assignment of NS1∆α3 then permitted to partially assign full-length NS1 and to analyze NMR interaction experiments.The second part of my thesis focuses on the interaction between NS1 and the ACID domain of MED25. NMR studies using 15N- and 13C-labeled MED25-ACID protein and a peptide corresponding to NS1α3 first revealed that NS1α3 interacts with MED25-ACID. Additionally, calorimetry experiments showed that full-length NS1 had a much higher affinity than NS1α3, suggesting a potential interaction via the globular NS1core domain in addition to the NS1α3 helix. Data obtained from biolayer interferometry (BLI) then confirmed this interaction. These data showed that NS1∆α3 binds to MED25-ACID with lower affinity than NS1, exhibiting two binding modes. AlphaFold2 modeling did not produce reliable complex models with NS1∆α3 or NS1α3. But it allowed reasonably accurate prediction of the structure of the MED25-ACID−NS1 complex. NS1 mutants based on this prediction were tested by BLI, showing a reduction in interaction with MED25-ACID

La 4e de couverture indique : "L'infection par le virus de l'Hépatite C conduit fréquemment à une hépatite chronique pouvant évoluer vers un carcinome hépatocellulaire et n'est soignable que dans 40-50% des cas. Le développement d'un vaccin s'avère donc nécessaire mais se heurte à la méconnaissance des corrélats immunitaires de protection et à l'impossibilité d'utiliser des vaccins conventionnels du fait de l'absence de systèmes de réplication disponibles in vitro et in vivo. L'objectif de cette thèse a été d'évaluer à partir de vaccins génétiques et de vecteurs viraux, l'immunogénicité de la protéine non structurale 3 (NS3), impliquée dans la réplication mais également dans l' élimination virale au cours de l'infection naturelle. Pour cela, l'induction d'une réponse cellulaire médiée par les lymphocytes T CD8+ dirigée contre des épitopes décrits dans l'infection naturelle a été testée dans un modèle de souris transgéniques pour la molécule HLA-A2. 1. Les vaccins génétiques testés avaient pour objectifs : 1) d'exprimer NS3 sous le contrôle du promoteur du cytomégalovirus (pCI. NS3) ou du réplicon du virus de la forêt de Semliki (SFV) (pSFV. NS3) ou 2) de la cibler au niveau des compartiments riches en molécules de classe II (pLAMP. NS3). Nos résultats ont montré que ces vecteurs, quelle que soit leur nature, ont conduit à l'induction de réponses spécifiques de longue durée mais restreintes à un épitope (sur 4) (aa 1073-1081), la réponse la plus vigoureuse étant obtenue avec le vecteur pCI. NS3. L'expression de la protéine NS3 sous forme de particules virales dérivées du SFV (rSFV. NS3) injectées seules ou en combinaison avec pCI. NS3 n'ont ni permis d'élargir, ni d'accroître la vigueur de cette réponse. La présence du plasmide pCI. NS3 dans le contexte d'une vaccination combinée avec des protéines recombinantes réalisée chez le chimpanzé semble, néanmoins, confirmer un rôle protecteur de la réponse anti-NS3. Globalement, l'ensemble de nos travaux indiquent que de nouvelles stratégies vaccinales doivent être développées afin de potentialiser la réponse anti-NS3. "

L’émergence récente de nouvelles thérapies antivirales efficaces est une avancée considérable pour lutter contre l'infection chronique par le virus de l'hépatite C (VHC). Cependant, un pic de carcinomes hépatocellulaires, représentant l'atteinte hépatique ultime liée à l'infection, est attendu dans la prochaine décennie. Approfondir les connaissances des différentes étapes du cycle viral et de l’interférence du VHC avec l'hépatocyte hôte permet de mieux comprendre la pathogénèse associée à ce virus. Les travaux présentés dans cette thèse ont eu pour objectif d'identifier le réseau de partenaires cellulaires et viraux de la protéine non-structurale NS2 du VHC et de mieux comprendre les mécanismes d'action et de régulation de cette protéine transmembranaire multi-fonctionnelle, qui est un acteur clé du clivage protéolytique de la polyprotéine virale et de la morphogénèse des virions. Dans une première partie, nous avons analysé comparativement les mécanismes moléculaires de l’activité enzymatique des protéines NS2 du VHC et de plusieurs hepacivirus non-humains, qui infectent des primates du Nouveau Monde (GBV-B) ou qui ont été récemment identifiés chez plusieurs autres espèces animales (NPHV, RHV, BHV et GHV). Des analyses phylogénétiques, des modèles structuraux tridimensionnels et des Études dans un contexte d'expression transitoire de précurseurs polypeptidiques viraux ou dans des modèles d'infection ont montré que l’activité des protéases NS2 de divers hepacivirus (1) s'exerce à la jonction NS2/NS3 sous la forme d'homodimères formant deux triades catalytiques composites ; (2) est régulée dans le contexte de la polyprotéine virale par quelques résidus de surface du domaine N-terminal de NS3 (NS3N) nécessaires à son activation ; (3) est efficace en l'absence complète de NS3N, suggérant un rôle négatif ou régulateur, plutôt qu'activateur de NS3N, contrairement au dogme en vigueur actuellement. Ces travaux soulignent l'importance fonctionnelle des mécanismes protéolytiques de NS2 conservés parmi les différents hepacivirus. Dans une deuxième partie, nous avons identifié un réseau de facteurs cellulaires et viraux interagissant avec NS2 au cours du cycle infectieux par un crible interactomique reposant sur la purification par affinité et l'analyse par spectrométrie de masse des complexes protéiques isolés de cellules hépatocytaires infectées, ainsi que par un test de complémentation enzymatique fonctionnelle. Par une approche d'ARN interférence, nous avons ensuite montré qu'un nombre limité de facteurs cellulaires interagissant avec NS2 sont impliqués dans la production et la sécrétion de particules virales infectieuses, incluant des protéines du complexe de la peptidase signal (SPCS) au sein du réticulum endoplasmique, des protéines chaperonnes (DNAJB11, HSPA5) et une protéine impliquée dans le transport intracellulaire (SURF4). Notamment, nos Études suggèrent que plusieurs membres du SPCS forment un complexe multi-protéique avec NS2, impliquant Également la glycoprotéine virale E2, qui jouerait un rôle dans une Étape précoce de l'assemblage ou lors de l’enveloppement de la particule virale. En conclusion, mes travaux de thèse ont permis d'identifier pour la première fois une série limitée de facteurs hépatocytaires interagissant spécifiquement avec la protéine NS2 du VHC au cours de l'infection et de déterminer parmi ceux-ci les facteurs essentiels la morphogenèse virale. Par ailleurs, nos résultats ont permis d’enrichir les connaissances naissantes des hepacivirus non-humains récemment identifiés et de montrer que ceux-ci partageaient avec le VHC des mécanismes clés mis en jeu au cours du cycle viral, ce qui contribue consolider leur intérêt comme modèles animaux de substitution
The recent emergence of a panel of direct acting antivirals will certainly help combat chronic hepatitis C in the future. However, in the current context worldwide, a peak of hepatitis C virus (HCV)-induced hepatocellular carcinoma is expected in the next decade. Deepening our understanding of HCV life cycle and HCV interference with host cells may help monitor HCV-associated pathogenesis. The aim of my PhD work was to identify the network of host and viral interactors of HCV nonstructural protein 2 and to unravel the mechanisms of action and regulation of this multifunctional, transmembrane protein, which is key both for the viral polyprotein cleavage and virion morphogenesis.In the first part of the work, we comparatively characterized molecular mechanisms underlying the enzymatic activity of NS2 proteins from HCV and from various non-human hepaciviruses that infect small New World primates (GBV-B) or that were recently identified in the wild in several mammalian species (NPHV, RHV, BHV, GHV). A combination of phylogenetic analyses, tridimensional structural models, and studies relying on the transient expression of viral polypeptide precursors or on infection models showed that NS2 proteases of the various hepaciviruses (1) act as dimers with two composite active sites to ensure NS2/NS3 junction cleavage, (2) are regulated in the polyprotein backbone via a hydrophobic patch at the surface of NS3 N-terminal domain (NS3N) that is essential to activate NS2 protease, and (3) are efficient in the complete absence of NS3N, which is unprecedented and suggests that NS3N has rather a negative or regulating role on NS2 activity. These data underline the functional importance of NS2 proteolytic mechanisms that are conserved across hepaciviruses.In the second part, we identified a network of cellular factors and viral proteins that interact with NS2 in the course of HCV infection using an interactomic screen based on affinity purification and mass spectrometry analysis of protein complexes retrieved form HCV infected hepatoma cells, as well as a split-luciferase complementation assay. Next, using a gene silencing approach, we found that a limited set of NS2 interactors among these host factors were involved in HCV particle assembly and/or secretion. This includes members of the endoplasmic reticulum signal peptidase complex (SPCS), chaperone proteins (DNAJB11, HSPA5) and a factor involved in intracellular transport (SURF4). Notably, our data are in favor of the existence of a multiprotein complex involving NS2, several members of the SPCS, and the viral E2 glycoprotein, which likely plays a role in an early step of HCV particle assembly or during particle envelopment. Altogether, my PhD work allowed us to identify a limited set of hepatocyte factors interacting with HCV NS2 during infection and to pinpoint those that are essential for HCV morphogenesis. Additionally, our results contributed to the molecular characterization of the recently identified non-human hepaciviruses and revealed that these hepaciviruses share with HCV key mechanisms in the course of their infectious life cycles. This highlights the value of non-human hepaciviruses as surrogate animal models of HCV infection

Le virus de la fièvre de la Vallée du Rift (RVFV) est un arbovirus appartenant à la famille des Bunyaviridae et au genre Phlebovirus. Il est transmis par les moustiques et infecte l'homme et les ruminants. De graves épidémies/épizooties ont eu lieu en Afrique et le virus circule maintenant en Arabie Saoudite ainsi qu'au Yémen. Le génome viral est composé de trois segments d'ARN simple brin: les segments L. M sont de polarité négative et le segment S utilise une stratégie ambisens. Bien que le cycle viral ait heu dans le cytoplasme, la protéine NSs (256 acides aminés, 31 kDa), codée par le segment S, a une localisation nucléaire où elle forme des filaments. NSs est un facteur de pathogenèse du virus qui inhibe la synthèse des ARNm du gène codant pour l'IFN bêta sans perturber pour autant l'enhanceosome (NF-KB, IRF3 et ATF2/cjun). Pour comprendre les mécanismes par lesquels NSs inhibe la réponse anti-virale, nous avons recherché ses partenaires cellulaires. Nous avons montré que l'infection par le VFVR a pour conséquences : i) une rapide diminution de la synthèse des ARN cellulaires parallèle à la décroissance de la concentration du facteur de transcription TFIIH, ii) l'inhibition du recrutement de CBP et de l'acétylation des histones au niveau du promoteur IFNp et iii) la protéolyse de STAT1. Par les techniques du double hybride, d'immunoprécipitations de protéines ou de la chromatine et en microscopie confocale, nous avons démontré que chacun des événements est lié aux interactions de la protéine NSs avec respectivement - la sous unité p44 du TFIIH, la sous unité SAP30 de certains co-répresseurs dont Sin3 et N-coR et la protéine Socs 1 présente dans une E3 ligase : ces différents partenaires de NSs sont présents dans les filaments nucléaires. NSs en interagissant avec p44 empêche la néo-formation du TFIIH. NSs, via SAP30 et son association avec le facteur de transcription YY1, stabilise des co-répresseurs responsables de la déacétylation des histones et empêche l'interaction entre CBP et YY1 au niveau du promoteur IFNp. Enfin NSs provoque l'accumulation de Socs 1 qui recrute un complexe E3 ligase CBCSo' responsable de la dégradation de STAT1 inhibant l'induction par l'IFNy. Ainsi la protéine multifonctionnelle NSs inhibe par trois mécanismes indépendants la réponse anti-virale de l'hôte
The Rift Valley fever virus is a phlebovirus of the Bunyaviridae family transmitted by mosquitoes and affecting cattle, sheep, goats and humans. It causes many dramatic epidémies and epizootics in Africa and recently it was introduced in Yemen and in Saudi Arabia with a high mortality rate. The viral genome is composed of three segments of RNA: the L and M segments are of negative polarity and encode respectively for the RNA polymerase RNA dependent and the precursor of envelope glycoproteins. The S segment utilises an ambisense strategy and codes for the nucleoprotein N and the non structural protein NSs. Although the viral cycle is cytoplasmic, the NSs protein (256 amino acids, 31 kDa) is nuclear and forms filament. Moreover, it was shown that NSs is the major pathogenicity factor, inhibiting IFN beta messenger RNA synthesis but do not disturb the formation of the enhanceosome (NF-KB, IRF3 and ATF2/cjun). We found that infection by RVFV leads to i) a rapid and drastic suppression of host cellular RNA synthesis that parallels a decrease of the TFIIH transcription factor concentration, ii) an inhibition of CBP recruitment and histones acetylation on IFNp promoter and iii) STAT1 proteolysis. Using yeast two hybrid System, immunoprecipitations, Chips and confocal microscopy, we further demonstrated that each event is linked to the association of the nonstructural viral NSs protein with respectively the TFIIH subunit p44, co-repressors subunit SAP30 and Socs 1 in the nuclear filaments. NSs prevents the assembly of newly synthesized TFIIH subunits. NSs, through the interaction between SAP30 and YY1 transcription factor, stabilizes co-repressors like N-coR or Sin3 responsible of histones deacetylation on IFNp promoter and preventing the association between CBP and YY1. Finally NSs provokes Socs 1 accumulation and, through a Socs 1 containing-E3 ligase complex, it degrades STAT1 and inhibes induction by IFNy. These observations shed light on the mechanisms utilized by RVFV to evade the host response

Environ 150 millions de personnes sont infectées par le virus de l'hépatite C (VHC) et présentent un risque de développer à terme un carcinome hépatocellulaire. Ce travail a eu pour objectif d'étudier le rôle de la protéine non structurale 2 (NS2) du VHC et, plus particulièrement, de déterminer si les caractéristiques structurales et fonctionnelles de NS2 du VHC sont conservées pour deux virus phylogénétiquement proches, le virus GB-B (GBV-B) et l'hepacivirus non primate (NPHV) qui infectent respectivement des petits primates et des chevaux. Nos études structurales ont révélé que, malgré une identité de séquence limitée, les protéines NS2 du VHC et du GBV-B possédaient des organisations topologiques similaires, avec trois segments transmembranaires dans leur région N-terminale et un domaine cytosolique C-terminal. Nous avons démontré que NS2 du GBV-B et du NPHV étaient des protéases à cystéine permettant le clivage de la jonction NS2/NS3 et que NS2 du GBV-B était une protéase dimérique possédant une triade catalytique composite, comme NS2 du VHC. Cependant, contrairement au VHC et au NPHV, la région transmembranaire de NS2 du GBV-B est indispensable à son activité protéolytique. Nous avons montré que le rôle de NS2 dans l'assemblage des particules virales est virus- et génotype-spécifique. De plus, des interactions spécifiques entre les domaines N- et C-terminaux de NS2 du VHC semblent critiques pour la morphogenèse des virions. Nous avons également entrepris de développer une méthodologie d'imagerie permettant le suivi dynamique de NS2 du VHC dans des cellules vivantes infectées afin de mieux comprendre les mécanismes d'action de cette protéine dans le cycle des hepacivirus
Hepatitis C virus (HCV) chronically infects approximately 150 million persons worldwide and is associated with cirrhosis and hepatocellular carcinoma. The objective of this work was to gain insight into the role of HCV nonstructural protein 2 (NS2) in the viral life cycle. With this aim, we undertook to determine whether structural and functional features of NS2 were conserved between HCV and two phylogenetically related viruses, GB virus B (GBV-B) and the non-primate hepacivirus (NPHV) that infect small primates and horses, respectively. Our membrane association and structural analyses revealed that despite limited sequence similarity, HCV and GBV-B NS2 proteins share a similar topological organization, with three transmembrane segments located in their N-terminal region and a cytosolic C-terminal domain. We further demohstrated that GBV-B and NPHV NS2 are cysteine auto-proteases responsible for the cleavage at the NS2/NS3 junction and that GBV-B NS2 is a dimeric protease containing a composite catalytic triad, as previously shown for HCV NS2. However, unlike for HCV and NPHV NS2, the transmembrane region of GBV-B NS2 is required for its proteolytic activity. Chimeric and trans-complementation approaches revealed that the role of HCV NS2 in particle assembly is virus and genotype specific. Moreover, our data suggested that functional interactions between the N- and C-terminal subdomains of HCV NS2 are critically involved in virion morphogenesis. Finally, we developed a fluorescent microscopy approach to follow HCV NS2 trafficking in live infected cells in order to gain further insight into the mechanisms of action of this protein during HCV life cycle

Les virus à ARN de polarité positive (ARN(+)) partagent la capacité de réorganiser les membranes cellulaires en organelles vésiculaires. Ces compartiments, appelés organelles de réplication (OR), fournissent un environnement approprié permettant d’héberger la machinerie de réplication virale, ses cofacteurs cellulaires et les ARN viraux néo-synthétisés. En raison de leur rôle indispensable à la réplication virale, ces compartiments et les mécanismes moléculaires nécessaires à leur assemblage ont suscité un réel intérêt ces dernières années. Alors que des progrès significatifs ont été réalisés dans ce domaine pour d’autres virus à ARN(+), peu de données relatives au mécanisme de formation des ORs des Alphavirus ont été produites. Ces virus ont pourtant été associés à des enjeux majeurs de santé publique au cours de la dernière décennie, en particulier avec la propagation récente du virus Chikungunya (CHIKV). CHIKV est en effet un virus réémergent transmis par les moustiques et à l’origine d’épidémies ayant des conséquences socio-économiques dévastatrices dans les pays où il se propage. Les symptômes se caractérisent par une forte fièvre et une éruption cutanée, avec un pourcentage significatif de patients qui souffrent de douleurs articulaires à long terme, souvent invalidantes. À l’heure actuelle, il n’existe aucun vaccin ou traitement antiviral pour ce virus.Les OR de CHIKV se présentent comme des sphérules de 50 à 60 nm résultant d’une courbure négative de la membrane plasmique. À l’intérieur de ces compartiments, la machinerie de réplication est ancrée à la membrane par l’interaction directe de la protéine non structurale 1 (nsP1) avec la bicouche lipidique. Cette protéine virale, exprimée de façon isolée, conduit à des déformations membranaires de type filopodes. Ainsi, nsP1 apparait comme un acteur majeur du remodelage membranaire au cours de l’infection par les Alphavirus. Dans ce contexte, le but de cette thèse, centrée sur nsP1, est de caractériser les interactions de nsP1 avec les membranes cellulaires et de définir les conséquences fonctionnelles de ces interactions dans la réplication virale. Nous avons mis en évidence le rôle du métabolisme lipidique dans l’ancrage membranaire de nsP1 et dans l’infection virale. Nos résultats indiquent que la production d’acides gras est nécessaire au cycle infectieux et favorise l’interaction de nsP1 avec les membranes. Ils mettent en évidence le rôle complètement nouveau des acides gras insaturés dans l’étape de réplication des Alphavirus. Nous avons également démontré l’affinité de la forme palmitoylée de nsP1 pour les microdomaines lipidiques riches en cholestérol de la membrane plasmique. Nous avons établi les conséquences fonctionnelles de cette affinité sur la localisation des autres protéines non structurales et sur la réplication virale. Enfin, nous avons défini l’interactome fonctionnel de nsP1, de façon à identifier les cofacteurs cellulaires pouvant contribuer aux déformations membranaires induites par cette protéine virale. Ce travail permet de mieux comprendre les mécanismes de déformation membranaires observés au cours de l’infection par les Alphavirus
Positive strand RNA ((+) RNA) viruses share the common capacity to rearrange cellular membranes into vesicular organelles. These membranous compartments referred to as replication organelles (ROs), are seen as providing an appropriate environment recruiting all viral components and cofactors required for replication. Because of their strict necessity for viral replication, these compartments and the molecular mechanisms required for their assembly have generated an intense interest in recent years. Contrasting with the consequential advances made in this field for other (+)RNA viruses, virtually no mechanistic data has been produced on the formation of ROs by Alphaviruses which in the last decade have proven to be medically paramount viruses, especially with the recent spread of Chikungunya virus (CHIKV). CHIKV is a re-emerging virus transmitted by mosquitoes that has caused outbreaks with devastating socio-economic impact in countries where it propagates. Symptoms include high fever and rash, with a significant percentage of patients suffering of long-term, often incapacitating, joint pain. Currently there is no vaccine or anti-viral treatment for this virus.CHIKV ROs appear as 50-60 nm electron translucent bulb-shaped spherules resulting from negative curvature at the plasma membrane. Inside these compartments, the replication machinery is anchored to the membrane through the direct interaction of the non-structural protein 1 (nsP1) with the lipid bilayer. When expressed as an isolated protein nsP1 dramatically remodels cellular membranes into filopodia-like protrusions. Therefore, this designated nsP1 as a critical factor in cellular membrane reshaping observed during infection. In this context, the aim of this thesis, with nsP1 at its centerpiece, is to characterize nsP1 interactions with cellular membranes and to define their functional consequences on viral replication. In this investigation, we have demonstrated the role of host cell lipid metabolism in nsP1 membrane anchoring and viral infection. Our results indicate that fatty acid synthesis is required for viral life cycle and favors nsP1 interaction with membranes. We also provide the very first information on the role of unsaturated fatty acids in Alphavirus replication. In-depth studies on the role of cholesterol revealed that palmitoylated nsP1 anchored CHIKV non-structural proteins to cholesterol-rich microdomains with functional consequences on replication. Finally, we have identified nsP1 interactome in order to identify host-cofactors required for the membrane deformation induced by this viral protein. Taken together, this thesis provides new information on nsP1/membrane lipids and host cofactors interplay. This work will allow the further comprehension of the mechanisms behind membrane deformation observed during Alphavirus replication

La peste équine est une arbovirose qui affecte les équidés et plus particulièrement les chevaux dont elle provoque très fréquemment la mort. Les conséquences dues au caractère meurtrier de la maladie mais surtout aux mesures de prophylaxie qu'elle nécessite sont préjudiciables pour l'économie de la filière chevaline des pays touchés. Nous avons développé des tests d'amplification en chaîne par polymérase spécifiques de type qui permettent, en 24 heures, la détection et le typage du virus équipestique (qui compte 9 sérotypes). Cette technique a été validée sur 54 échantillons codés. Les résultats obtenus sur 7 de ces échantillons ont permis de mettre en évidence la difficulté du typage (classique et moléculaire) lorsque plus d'un type viral est présent dans l'échantillon. Le typage moléculaire par RT-PCR a été appliqué avec succès à des prélèvements nécropsiques. Dans le but de différencier les anticorps induits par une vaccination et par une infection, deux tests ELISA, utilisant comme antigènes deux domaines de la protéine NS3, ont été développés. Les deux ELISA ont présenté une sensibilité et spécificité satisfaisantes, mais leur capacité à discriminer les sérums d'animaux infectés de ceux d'animaux vaccinés reste à confirmer. Parallèlement, des sérums de lapins produits contre les deux domaines de la protéine NS3, précédemment utilisés comme antigène dans l'ELISA, ont permis de préciser partiellement la topologie de NS3 au niveau de la membrane cellulaire. Ainsi, l'immunofluorescence sur cellules infectées a confirmé la localisation extra-cellulaire (prédite par certains auteurs) du domaine N-terminal de NS3. Enfin, la détermination des séquences nucléotidiques du segment génomique 10 (qui code pour les protéines NS3/NS3A) des sérotypes 2, 4, 5, 6 et 7 a permis de compléter les données existantes sur ce gène et de confirmer l'importante variabilité génétique de ce segment et de la protéine NS3 par rapport à celle des autres Ortivirus.

Les protéines non-structurales NS2 du parvovirus minute de souris (MVMp) sont capables de se lier à CRM1 et RanGTP pour former un complexe d'export nucléaire fonctionnel. Nous avons caractérisé le signal d'export nucléaire (NES) de NS2, un motif riche en résidus hydrophobes (MTKKFGTLTI) correspondant au site de liaison de CRM1 à NS2. L'analyse de deux virus mutants, MVM-NES21 (F86Q/G87R) et MVM-NES22 (L89Q/T90S), nous a permis de corréler la rétention nucléaire des protéines mutées NS2-NES(-) à la séquestration de capsides virales néoformées dans le noyau des cellules infectées. Le mutant MVM-NES22 s'avère capable de produire des virions infectieux mais libérés tardivement dans le milieu extracellulaire. Le mutant MVM-NES21 conduit à une infection virale abortive, indiquant que les mutations F86Q/G87R induisent de nouvelle(s) fonction(s) de la protéine NS2. Notre étude met en évidence un rôle clé de l'interaction NS2-CRM1 dans la production et la libération des particules filles de MVMp hors des cellules infectées
The non-structural NS2 proteins of parvovirus minute virus of mice (MVMp) are able to form a functional nuclear export complex with CRM1 and RanGTP. We characterized the NS2 nuclear export signal (NES), a motif enriched in hydrophobic residues (MTKKFGTLTI) that corresponds to the CRM1 binding site in NS2. Through analysis of two mutant viruses, MVM-NES21 (F86Q/G87R) and MVM-NES22 (L89Q/T90S), we could correlate the nuclear retention of the mutated proteins NS2-NES(-) with the nuclear sequestration of newly assembled capsids in infected cells. The MVM-NES22 mutant is further able to produce infectious progeny particles, which release out of the infected cells is delayed. The MVM-NES21 mutant leads to an abortive infection, indicating that the mutations F86Q/G87R induce new function(s) of the viral NS2 protein. Our study argues for a critical role played by the NS2-CRM1 interaction in the production and release of progeny MVMp viruses from infected cells

Avec environ 500 000 décès annuels, les rotaviroses représentent l'une des causes majeures de gastroentérites infectieuses dans le monde. L'agent étiologique virale de ces infections, le rotavirus, code pour six protéines structurales (VP) et six protéines non structurales (NSP). Parmi celles-ci, la protéine NSP3 interagit avec l'ARN viral et le facteur de traduction eIF4G, et joue un rôle central dans la traduction des ARNm viraux. Un nouveau partenaire pour NSP3, la protéine cellulaire RoXaN (Rotavirus X protein associated with NSP3), a été identifiée. Ce travail avait pour objet l'étude de l'interaction NSP3-RoXan et la caractérisation des propriétés de la protéine RoXan. Les domaines d'interaction ont été identifiés sur les deux protéines. Ils impliquent la région centrale de NSP3 (aa 170-234), prédite en coiled-coil, et un domaine putatif Ld présent dans la région amino-terminale de RoXan (aa 255-279). RoXan a une distribution nucléo-cytoplasmique dans la cellule. Par ailleurs, nous avons pu montrer qu'elle était phosphorylable et que l'extrémité amino-terminale (aa 1-174), qui contient un domaine tétratricopeptidique (TPR), co-localisait partiellemnt avec le réseau de vimentine. L'existence, enfin, d'un complexe ternaire RoXan-NSP3-eIF4G, et la co-immunoprécipitation ARN-dépendante de la poly(A)-binding protein (PABP) avec la région carboxy-terminale de RoXan suggèrent un rôle traductionnel pour cette dernière. Cette hypothèse requirt cependant des investigations supplémentaires et ne permet pas d'écarter une ou plusieurs autres fonctions pour la protéine.

Les rotavirus constituent un groupe de virus classe dans la famille des Reoviridae et sont reconnus comme l'agent étiologique majeur des gastro-entérites néonatales de nombreuses espèces animales. Notre connaissance du cycle viral est encore très incomplète et en particulier du rôle joué par les cinq protéines non structurales dans la réplication virale. La protéine non structurale NS53 codée par le segment 5 est synthétisée à faible niveau dans la cellule. Pour étudier ses propriétés fonctionnelles, l'ADNc du gène 5 de rotavirus bovin a été cloné dans un vecteur de transfert baculovirus sous le contrôle du promoteur fort de la polyédrine. Les baculovirus recombinants expriment, dans les cellules d'insecte, la protéine NS53 en quantité importante sous une forme stable mais insoluble. L'expression abondante de la protéine recombinante nous a permis d'obtenir un antisérum spécifique de la protéine NS53 naturelle présente dans les cellules MA104 infectées par le rotavirus. A l'aide de ce sérum, nous avons confirmé que la protéine NS53 n'est pas associée aux particules virales simple ou double capside, mettant ainsi fin aux controverses sur sa nature non structurale. L'analyse de la séquence de la protéine révèle la présence de deux arrangements de cystéines caractéristiques d'un motif « doigt à zinc » récemment identifié dans la séquence de nombreuses protéines régulatrices qui fixent les acides nucléiques. De plus, bien que le segment 5 montre une extrême variabilité de séquence, le motif « doigt à zinc » de l'extrémité NH2 terminale de la protéine NS53 reste hautement conservé au sein des souches de rotavirus des groupes A et C. Par l'utilisation de plusieurs méthodes, nous avons montré que la protéine recombinante fixe spécifiquement le zinc et que celui-ci est impliqué dans la conformation compacte de la protéine en solution. En outre, la purification de la protéine recombinante par FPLC nous a permis de mettre en évidence la fixation de l'ARN simple brin sur la protéine. L'ensemble de ces résultats nous conduit à formuler l'hypothèse que la protéine NS53 pourrait être impliquée dans la formation des particules précoces RI et le regroupement ou l'encapsidation de l'ARN (+) dans les particules virales immatures.

Les ARN non codants (ARNnc) sont des ARN qui ne sont généralement pas traduits en protéine. Ils sont impliqués dans la régulation de processus physiologiques variés tels que la réplication, la transcription et la traduction et parfois dans la virulence bactérienne. Ils sont classés en deux groupes selon leur mode d’action : (i) les ARN agissant par appariement à un ou plusieurs ARNm cibles et qui font intervenir, chez Escherichia coli (E. Coli), un partenaire protéique appelé Hfq ; (ii) les ARN régulant l’activité de protéines cibles. Staphylococcus aureus (S. Aureus) est une bactérie commensale responsable de vingt pour cent des infections nosocomiales en France. Il occasionne des infections superficielles mais aussi plus profondes. L’expression de sa virulence est régulée par un ARN, l’ARNIII. Au laboratoire, un précédent travail a abouti à l’identification de sept nouveaux ARNnc exprimés chez S. Aureus. Dans un premier temps, nous avons montré par des expériences de retard sur gel, Northern Blot et biopuces que la protéine Hfq a un rôle limité dans les relations ARNnc/ARNm chez S. Aureus comparé à E. Coli. Ensuite, nous avons étudié de manière structurale et fonctionnelle l’un de ces nouveaux ARNnc : SprA (Small pathogenicity island RNA). Des expériences de digestions montrent l’existence de deux pseudonoeuds centraux. SprA est fortement structuré ce qui est compatible avec son appartenance à la deuxième classe. Nous avons également mis au point les outils génétiques permettant l’étude la fonction de SprA : (i) une souche surexprimant cet ARNnc (ii) ainsi qu’une souche de délétion. L’étude des phénotypes engendrés par les variations d’expression de SprA est en cours
Non coding RNAs (ncRNAs) are non conventionnal RNAs ususally untranslated. They are involved in regulation of physiological processes such as replication, transcription, translation and for some of them bacterial virulence. They are divided in two groups : (i) those interacting with target(s) mRNA(s), the pairing being assisted, in Escherichia coli (E. Coli) by the RNA chaperone Hfq; (ii) and those exerting direct regulation on protein activities. Staphylococcus aureus (S. Aureus) is an opportunistic Gram positive bacterium responsible of twenty per cent of hospitally acquired infections in France. It is a causative agent of diseases ranging from minor skins infections to life threatening conditions as well as toxin mediated diseases. The expression of virulence in S. Aureus is mediated by an RNA known as RNAIII. In our laboratory, a previous work lead to the identification of seven new ncRNAs expressed by S. Aureus. At first, we showed, through gel shifts and Northern Blot experiments and microarrays, that Hfq has a limited role in ncRNAs mediated regulation in S. Aureus compared to E. Coli. Secondly, we have studied structure and function of one of the new ncRNAs : SprA (Small pathogenicity island RNA). Enzymatic et chemical probing lead to the discovery of two central pseudoknots in solution. SprA is much more structured than expected, suggesting that it belongs to the second class. We also constructed genetic tools to characterize SprA’s functions : (i) a strain overproducing SprA and (ii) a strain where the SprA gene is disrupted. The phenotypical effects induced by the modulation of SprA expression are still in progress

Comprendre les interactions réalisées entre un candidat médicament et sa protéine cible est un enjeu crucial pour orienter la recherche de nouvelles molécules. En effet, ce processus implique de nombreux paramètres qu'il est nécessaire d'analyser séparément pour mieux comprendre leurs effets.Nous proposons ici deux nouvelles approches observant les relations protéine/ligand. La première se concentre sur la comparaison de cavités formées par les sites de liaison pouvant accueillir une molécule. Cette méthode permet d'inférer la fonction d'une protéine mais surtout de prédire " l'accessibilité " d'un site de liaison pour un médicament. La seconde tactique se focalise sur la comparaison des interactions non-covalentes réalisées entre la protéine et le ligand afin d'améliorer la sélection de molécules potentiellement actives lors de criblages virtuels, et de rechercher de nouveaux fragments moléculaires, structuralement différents mais partageant le même mode d'interaction.

Le virus de l'encephalite japonaise (vej) est un arbovirus de la famille des flaviviridae qui sevit dans de nombreux pays de l'asie du sud-est. Chez l'homme, il est responsable d'encephalites aigues et le taux de mortalite s'eleve a plus de 50000 cas par an. L'essor de la biologie moleculaire est a l'origine du developpement de prophylaxies anti-virales basees sur l'utilisation de sous-unites antigeniques. Afin de lutter contre la maladie de l'ej, nous avons ainsi cherche a produire les proteines d'enveloppe e et non structurale ns1 du vej, qui sont decrites comme les antigenes protecteurs majeurs contre une infection par un flavivirus, a l'aide du systeme d'expression du baculovirus. Les proteines e et ns1 ont ete exprimees sous la dependance de leur peptide signal en cellules de lepidoptere (spodoptera frugiperda, sf9) a l'aide de baculovirus recombinants. La proteine e recombinante a ete deletee de son domaine d'ancrage transmembranaire carboxy-terminal (etr) dans le but de la faire secreter dans le compartiment extracellulaire. Les modifications post-traductionnelles necessaires a la maturation de ces deux proteines du vej, telles que la n-glycosylation, la formation des ponts disulfures natifs ou encore l'oligomerisation, semblent s'effectuer selon un processus similaire a celui observe pour les proteines authentiques. En l'absence d'un taux de secretion suffisant, les proteines recombinantes etr et ns1 ont ete purifiees a partir du compartiment intracellulaire. Les deux proteines recombinantes, surexprimees par les cellules sf9, se retrouvent rapidement impliquees dans la formation d'agregats, plus generalement appeles corps d'inclusion. Les proteines ont ete purifiees a partir de ces corps d'inclusion, solubilises par l'action d'un agent denaturant puissant. Un procede de renaturation in vitro des proteines recombinantes, incluant la reoxydation des groupements sulfhydryls, a ensuite ete elabore. L'immunogenicite et le pouvoir protecteur des proteines recombinantes purifiees ainsi obtenues ont ensuite ete etudies chez le modele animal de la souris. La proteine etr est capable d'induire une protection contre une epreuve mortelle par du virus sauvage vej alors que la proteine ns1 ne peut, a elle seule, proteger les souris immunisees. La protection pourrait etre correlee a la presence d'anticorps neutralisants mais les mecanismes de l'immunite antivirale mis en jeu devront etre explores plus precisement, en particulier chez l'homme. Il restera egalement a determiner l'efficacite a long terme de ce type de preparation vaccinale

La protéine NS5A est essentielle pour la réplication et l'assemblage du virus de l'hépatite C (VHC), et elle constitue une cible thérapeutique prometteuse pour le développement d'antiviraux. Cependant, aucune fonction claire n'a encore été décrite pour NS5A, et les connaissances structurales restent limitées. Ainsi, nous avons caractérisé l'état intrinsèquement désordonné des domaines D2 et D3 de NS5A en décrivant leurs espaces conformationnels et leurs potentialités de repliement en combinant différentes méthodes biophysiques. Nous avons aussi mis en évidence la variabilité structurale du domaine D2 au sein des génotypes du VHC, ce qui pourrait être en rapport avec les différences de pathogénie et d'efficacité des thérapies observées selon les génotypes. L'interaction de D2 et D3 avec la cyclophiline humaine A (CypA) a été étudiée par résonance plasmonique de surface (SPR). Bien que des mutations au sein du domaine D2 rendent la réplication du VHC moins dépendante de la présence de CypA, ces mutations n'empêchent pas la liaison entre D2 et CypA. En revanche, elles induisent des perturbations structurales qui pourraient affecter la cinétique d'interconversion des conformères de D2. Nous avons montré par SPR que D2 et D3 interagissent avec le domaine de fixation à l'ADN du récepteur nucléaire FXR. Cette interaction pourrait inhiber la fixation de FXR sur sa cible ADN, suggérant une implication de NS5A dans la modulation de l'activité transcriptionnelle de ce récepteur nucléaire. L'ensemble de ces informations, nous a permis de proposer un modèle de la structure globale de NS5A permettant une meilleure compréhension des propriétés structurales et fonctionnelles de cette protéine énigmatique
NS5A is essential for HCV replication and particle assembly, and constitutes a very promising drug target. However, no clear function has yet been described for NS5A, and structural knowledge remains limited. We characterized the intrinsically disordered nature of NS5A domains D2 and D3, and describe their folding propensity and their overall conformational behaviour by combining different biophysical methods. We also highlighted the structural variability of D2 domain in HCV genotypes, which might be correlated with the disparities observed between genotypes in terms of pathogenesis and efficiency of therapies. The interactions between D2 and D3 with human cyclophilin A (CypA) was analysed by surface plasmon resonance (SPR). We showed that mutations in the D2 domain conferring resistance of HCV replication to CypA inhibitors did not prevent the interaction between D2 and CypA. However, they induce structural perturbations that may affect the kinetics of conformers interconversion of D2. We also showed by SPR that D2 and D3 interact with the of DNA-binding domain of the nuclear receptor FXR (farnesoid X receptor alpha). This interaction reduce the binding of FXR to its DNA target, suggesting an involvement of NS5A in the modulation of the transcriptional activity of FXR. All this data led us to propose a model of the overall structure of NS5A, which provides a useful template for a better understanding of structural and functional properties of this enigmatic protein

Les rotavirus sont constitués d'une triple capside icosaédrique. La glycoprotéine VP7 constitue la couche externe de la capside. VP7 intervient dans la régulation de la transcription et l'entrée du virus. Ces différentes fonctions dépendent de sa conformation structurale, laquelle est conditionnée par la présence ou l'absence de certains cations. Au cours de ce travail, nous avons caractérisé les intéractions cationiques essentielles à l'assemblage de VP7 sur VP6 et à sa solubilisation. Nous avons comparé des structures de particules possédant ou pas VP7. Nos résultats montrent que VP7 inhibe la transcription en imposant un changement de position et d'orientation des trimères de VP6 situés autour des axes 5 qui provoque le rétrécissement des canaux de type I. Enfin, nous avons précisé le rôle de VP7 et d'un peptide (pep46) dans l'entrée du rotavirus et du birnavirus respectivement. Ces deux virus utilisent le même mécanisme d'entrée, une endocytose suivie d'une perméabilisation de la membrane endosomale faisant intervenir un gradient calcique et une protéase
Résumé anglais

Récemment, plusieurs études ont permis de mettre en évidence un lien possible entre la maturation des snoARN et celle des microARN, deux familles d’ARNnc impliquées respectivement dans la maturation d’autres ARN, tels les ARNr, et dans la régulation de l’expression des gènes. En effet, ces études ont montré que certains microARN pouvaient être issus de la maturation d’un snoARN précurseur, formant alors une nouvelle classe d’ARNnc, les sdARN (ARN dérivés de snoARN). Le manque d’informations disponibles sur les mécanismes de maturation possibles des sdARN nous a conduit à réaliser un crible double-hybride chez la levure S. cerevisiae entre différentes protéines impliquées dans la biogenèse des snoARN et des microARN. Ce crible a permis d’identifier une nouvelle interaction entre les protéines TRBP, impliquée dans la maturation du pré-microARN en microARN, et RPAP3, un protéine du complexe d’assemblage hR2TP. L’observation de cette interaction soulève plusieurs questions, telles que son implication possible dans la maturation de microARN à partir de snoARN précurseurs, ou encore sur l’implication possible de TRBP et RPAP3 dans la biogenèse des snoRNP ou des microARN, respectivement. Nous avons alors entrepris de caractériser l’interaction entre TRBP et RPAP3. Par des approches de biologie moléculaire, de biochimie et de biologie structurale, nous avons d’une part confirmé l’existence du complexe in vitro et in vivo et identifié les domaines respectifs de TRBP et de RPAP3 impliqués dans l’interaction, ainsi qu’identifié plusieurs mutations intéressantes au niveau de l’interface d’interaction. L’utilisation de ces mutants devrait nous permettre d’étudier l’effet de la perte d’interaction entre TRBP et RPAP3 sur la maturation de différents ARNnc. Enfin, nos travaux ont également permis d’observer que l’interaction entre TRBP et RPAP3 n’était pas compatible avec la formation du complexe entre TRBP et la RNase Dicer. Or, il avait été montré que l’absence de TRBP au niveau de Dicer entraînait dans certains cas la génération de microARN avec des extrémités, et donc des spécificités, altérées (iso-miRs). La formation d’un complexe entre les protéines TRBP et RPAP3 pourrait donc constituer un moyen possible de réguler la disponibilité de TRBP et, indirectement, l’activité de Dicer
Recently, several studies have described a possible link between snoRNA and microRNA maturation, two ncRNA families involved in the maturation of other RNAs, such as rRNA, and in the regulation of gene expression, respectively. Indeed, these studies have shown that some microRNAs could be maturated from a snoRNA precursor, forming a new class of ncRNAs, the sdRNAs (snoRNA-derived RNAs). The mechanism of sdRNA maturation are still poorly understood. Therefore, we have performed a two-hybrid screen in the yeast S. cerevisiae between different proteins involved in microRNAs and snoRNAs biogenesis. Interestingly, we observed a novel interaction between TRBP, involved in the maturation of microRNAs, and RPAP3, a member of the hR2TP complex. The observation of this interaction raises several questions, such as its possible involvement in the maturation of microRNAs from snoARN precursors, or on the possible involvement of TRBP or RPAP3 in snoRNP or microRNA biogenesis, respectively. Using various molecular biology and biochemical approaches, we undertook the functional and structural characterization of the TRBP/RPAP3 interaction. First, we confirmed the interaction both in vitro and in vivo and we identified the TRBP and RPAP3 domains involved in the interaction, as well as several interesting mutations in the binding interface. Using these mutants should allow us to study the effects of this mutations on the maturation of differents ncRNAs. Additionally, we showed that the interaction between TRBP and RPAP3 and between TRBP and the RNase Dicer were mutually exclusive. Interestingly, it was shown that in the absence of TRBP, Dicer processig resulted, in some cases, in the generation of microRNAs with different ends, and thus, with altered specificity(iso-miRs). The interaction between TRBP and RPAP3 could therefore also constitute a possible way to regulate the availability of TRBP, and eventually the activity of Dicer

1. USP7, un partenaire cellulaire de la protéine non-structurale NSP5 du Rotavirus. Le rôle de NSP5 dans l’encapsidation et la réplication du Rotavirus restant mal connu. Nous avons co-purifié et identifié les partenaires cellulaires de la protéine NSP5 par la technique de co-immunoprécipitation. Nous avons identifié la protéine USP7, comme partenaire de NSP5. Nous avons cartographié les domaines d’interaction. Le rôle de l’interaction entre USP7 et NSP5 lors de l’infection virale reste inconnu. 2. Inhibition de l’entrée du Rotavirus par des inhibiteurs de l’endocytose. Nous avons montré que le MG132 et Lactacystine bloquent l’infection à une étape précoce du cycle viral. Nous avons effectué une cinétique d’entrée du Rotavirus en présence du Dynasore qui a confirmé la dépendance de l’entrée du virus de la dynamine. De plus, l’observation par ME de l’internalisation du Rotavirus montre la présence du virus dans des vésicules d’endocytose Donc le Rotavirus est internalisé par endocytose
1. USP7, a cellular partner of the non-structural protein NSP5 of Rotavirus. As the role of NSP5 in viral RNA encapsidation and replication is not well characterized. Finding cellular partners would provide insight of its role. We identified the protein USP7, as cellular partner of NSP5. The interaction domains were mapped. The role of the interaction USP7-NSP5 during rotavirus replication remains to be elucidated. 2. Inhibitions of rotavirus cell entry by inhibitors of endocytosis. The mechanisms by which rotaviruses enter cells are still not fully resolved. We show that the proteasome inhibitors MG132 and Lactacystin block rotavirus infection at an early stage of infection. We performed a rotavirus cell entry kinetics in the presence of the dynamine inhibitor Dynasore that confirmed the dynamin dependence of virus entry. The internalization of rotavirus into cells observed by EM showed the virus enclosed inside vesicles. Hence, our results are in favor of endocytosis of rotavirus

Les petites protéines G sont des protéines capables de fixer du GDP ou du GTP, ce qui va induire des changements de conformation au sein de la protéine qui lui permettront d'interagir avec des partenaires cellulaires distincts, et ainsi de jouer un rôle "d'interrupteur moléculaire". Le cycle GDP/GTP des petites protéines G ne fonctionne pas seul, il est régulé par un facteur d'échange GDP/GTP (GEF) et une protéine activatrice de la GTPase (GAP). Les petites protéines G sont impliquées dans des processus cellulaires fondamentaux et divers, comme la différentiation et la prolifération cellulaire, l'organisation et la dynamique du cytosquelette, et les transports intracellulaires. Un certain nombre de structures de petite protéine G sont maintenant connues, et ont permis de définir le repliement général des petites protéines G et les changements de conformation au cours du cycle GDP/GTP. Le premier projet porte sur l'étude structurale par diffraction des rayons X de la petite protéine G Rap2A, homologue de l'oncogène Ras dans un complexe non catalytique avec le GTP. Cette étude a permis de mettre en évidence la présence d'une nouvelle interaction au niveau du site nucléotidique entre la tyrosine 32 et le phosphate gamma du GTP. Et, nous avons montré que les changements de conformation de Rap2A au cours de son cycle GDP/GTP sont caractérisés par deux transitions désordre/ordre. Le second projet porte sur l'étude structurale par diffraction des rayons X de la petite protéine G Arf6 en complexe avec du GDP. Cette étude a montré que deux protéines qui possèdent une forte homologie de séquence peuvent avoir des structures assez différentes pour être distinguées. Les principaux partenaires des formes GDP des petites protéines G sont les GEF, ce qui suggère une base structurale pour la spécificité des GEF. En conclusion, nous discutons des bases structurales qui permettent aux petites protéines G d'être distinguées les unes des autres.

La protéine Bcd1 est un facteur nucléaire essentiel à la viabilité cellulaire de la levure Saccharomyces cerevisiae. Il est décrit comme requis pour assurer la stabilité des snoRNA à boîtes C/D. Ces petits ARN non codants s’assemblent à un jeu de 4 protéines invariables pour former les snoRNP à boîtes C/D qui sont des acteurs cruciaux de la biogenèse des ribosomes. En effet, quelques-unes de ces particules participent aux mécanismes assurant la maturation du précurseur des ARN ribosomiques et la grande majorité des autres particules sont des catalyseurs de la modification par 2’-O-méthylation des riboses. Bcd1p n’est pas présente au sein des particules matures, mais fait partie de ses facteurs d’assemblage, au même titre que les sous-complexes Rsa1p:Hit1p et R2TP (Rvb1p:Rvb2p:Tah1p:Pih1p). Notre analyse de différents fragments de Bcd1p a dans un premier temps montré que sa région N-terminale (résidus 1 à 96) suffit à lui conférer son caractère essentiel. Cette région comprend un domaine à double doigt à zinc de la famille zf-HIT, également présent chez un autre facteur d’assemblage des snoRNP à boîtes C/D, la protéine Hit1. Nous avons résolu la structure 3D en solution de ces doigts à zinc et montré que ce sont des modules d’interaction avec les protéines Rvb1/2. Dans un second temps nous avons identifié la région C-terminale (résidus 120 à 303) de la protéine Bcd1 comme étant suffisante pour interagir avec la chaperonne d’histone Rtt106p. La structure 3D en solution de ce domaine a été déterminée par RMN. Différentes approches de cinétique d’échange hydrogène/deutérium et d’expériences de cross-link suivies par des analyses par spectrométrie de masse, des expériences de titrage par RMN et de SAXS nous ont permis d’obtenir des informations sur les surfaces d’interaction de chacune de ces deux protéines. Un fragment, défini à partir des données de RMN de Bcd1p libre, nous a permis d'obtenir des cristaux du complexe Bcd1p:Rtt106p ouvrant la perspective de résoudre sa structure 3D par diffraction aux rayons X. De plus, des études fonctionnelles ont débuté visant à déterminer l’importance de la formation de ce complexe sur la biogenèse des snoRNP à boîtes C/D et l’impact de Bcd1p sur l’interaction entre Rtt106p et les nucléosomes
The protein Bcd1 is a nuclear factor essential for the cellular viability of the yeast Saccharomyces cerevisiae. It is described as required to ensure box C/D snoRNA stability. These small non-coding RNAs associate with an invariable set of 4 proteins to form the box C/D snoRNPs that are crucial players in ribosome biogenesis. Indeed, some of these particles participate in mechanisms for the maturation of the ribosomal RNA precursor (prerRNA) and the vast majority of the other particles are catalysts of 2’-O-methylation of riboses. Bcd1p is not present in mature particles, but is one of the assembly factors in addition to the Rsa1p:Hit1p and R2TP (Rvb1p:Rvb2p:Tah1p:Pih1p) sub-complexes. Our analysis of the different Bcd1p fragments has firstly shown that the essential function of Bcd1p relies on its N-terminal region (residues 1 to 96). It comprises a double zinc finger domain from the zf-HIT family, also present in another box C/D snoRNP assembly factor, the protein Hit1. We solved the 3D solution structure of these two zinc fingers and showed that these are modules for the interaction of Bcd1p with the Rvb1/2 proteins. Secondly, we identified the C-terminal region (residues 120 to 303) of Bcd1p as being sufficient to interact with the histone chaperone Rtt106p. The 3D solution structure of this domain of Bcd1p was determined by NMR. Different approaches of hydrogen/deuterium kinetic exchange and cross-link experiments followed by mass spectrometry analysis, NMR titration, and SAXS allowed us to obtain information about the interaction surfaces on each of the two proteins. A fragment defined from NMR data on the free Bcd1p allowed us to obtain crystals of the Bcd1p:Rtt106p complex, opening the perspective to solve its 3D structure by X-ray diffraction. Furthermore, functional studies started in order to determine the importance of this complex formation in box C/D snoRNP biogenesis and the impact of Bcd1p on the interaction of Rtt106p with nucleosomes

Les virus sont des parasites intracellulaires obligatoires recrutant des cofacteurs cellulaires afin de détourner les différents processus biologiques leur permettant notamment de répliquer leur génome et de former d'autres particules virales. Si des cofacteurs cellulaires de la réplication du virus Semliki Forest ont été récemment identifiés, très peu d'études ont permis de révéler des partenaires de la réplication du proche Alphavirus Chikungunya (CHIKV). Nous avons découvert, au cours de cette étude, un recrutement d'Hélicases à domaine DExD/H au niveau de sites de réplication du CHIKV. Parmi elles, DHX9 ou RNA Helicase A (RHA), grâce à ses propriétés de liaison et de modulation de structures des ARNs ou de complexes de Ribonucléoprotéines, est impliquée dans diverses fonctions depuis la transcription, la traduction, la réplication de génomes et jusqu'à la production de particules infectieuses de nombreux virus. Dans le cas du virus Chikungunya, nous avons caractérisé une fonction provirale dans la traduction de protéines non-structurales et une fonction antivirale dans la réplication du génome. Cette double fonction opposée est manipulée par le CHIKV afin d'assurer une production de protéines non-structurales composant le complexe de réplication tout en maintenant sa réplication. Ces travaux révèlent un nouveau mécanisme de régulation de la traduction d'ARN génomique de CHIKV et apportent des éléments de compréhension dans la dynamique de passage du phénomène de traduction à l'étape de réplication du génome CHIKV
Viruses are obligate intracellular parasites recruiting cellular cofactors to divert different biological processes enabling them to replicate their genome and to form other viral particles. If cellular cofactors of Semliki Forest virus replication have recently been identified, very few studies have revealed the replication partners of the very close Alphavirus Chikungunya (CHIKV). During this study, We have discovered recruitments of several DExD/H Box Helicases at the CHIKV replication sites. Among them, DHX9 or RNA Helicase A (RHA) through its RNA binding properties and in modulating RNA secondary structures or Ribonucleoproteins complexes, is involved in various functions from transcription, translation, replication of genomes and up to production of infectious particles of many viruses. In the case of Chikungunya virus, we have characterized a proviral function in the translation of non-structural proteins and an antiviral function in the genome replication. These opposite functions are manipulated by CHIKV to ensure production nonstructural proteins, components of the CHIKV replication complex while maintaining its replication. These works reveal a new translation regulation mechanism of CHIKV genomic RNA and bring some knowledge on the passage from the translation stage to the replication step of CHIKV genome

Les protéines de la famille L7Ae sont les constituants de nombreuses RNP essentielles. Chez les vertébrés, les particules snoRNP C/D et H/ACA sont impliquées dans la biogenèse des ribosomes, la UsnRNP U4 dans l'épissage des pré-ARNm, le complexe télomérase dans la réplication des télomères, et les mRNP SECIS dans la traduction des sélénoprotéines. Comme c'est le cas pour la majorité des RNP eucaryotes, leur assemblage, sous forme d'entités fonctionnelles, ne constitue pas un processus autonome et requiert l'intervention de facteurs spécialisés. En basant notre étude sur l'assemblage des snoRNP C/D, dans l'organisme modèle Saccharomyces cerevisiae, et en utilisant des approches de biologie moléculaire, de biochimie et de génétique, nous avons entrepris de caractériser ces événements. Nos travaux ont contribué à identifier un ensemble de protéines, agissant de façon coordonnée au sein d'une machinerie conservée entre la levure et l'homme. Cette dernière est composée de deux principales sous-unités : (i) Rsa1p/NUFIP, une protéine plate-forme, qui interagit avec certaines protéines de la famille L7Ae et facilite l'assemblage des RNP, (ii) le complexe R2TP (Rvb1p/TIP49, Rvb2p/TIP48, Pih1p/PIH1, Tah1p/SPAGH), qui pourrait opérer des remodelages conformationnels nécessaires à la formation des RNP matures. En plus de ces acteurs centraux, d'autres facteurs sont apparus intimement liés à ce mécanisme. La protéine Hit1p/TRIP3, interagit notamment avec Rsa1p/NUFIP et s'est avéré requise pour assurer sa stabilité chez la levure. La chaperonne HSP90, dont le rôle est prédominant chez l'homme, exerce son activité sur certains constituants des RNP. Enfin, la protéine Bcd1p/BCD1 pourrait être associée à cette machinerie dans le cadre spécifique de l'assemblage des snoRNP C/D
The L7Ae family proteins are essential components of many RNPs. In vertebrates, C/D and H/ACA snoRNPs are involved in ribosome biogenesis, the U4 snRNP in pre-mRNA splicing, the telomerase complex in telomeres replication, and mRNP SECIS in selenoproteins translation. Like most eukaryotic RNPs, assembly in functional entities is not an autonomous process and requires the intervention of specialized factors. Basing our study on the assembly of C/D snoRNP in the model organism Saccharomyces cerevisiae, and using approaches of molecular biology, biochemistry and genetics, we undertook to decipher these mechanisms. Our work has helped to identify a set of proteins, acting in a coordinated manner within a machinery conserved between yeast and human. This machinery consists of two major subunits: (i) Rsa1p/NUFIP, a platform protein that interacts with some proteins of the L7Ae family and facilitates the RNPs assembly, (ii) the R2TP complex (Rvb1p/TIP49, Rvb2p/TIP48, Pih1p/PIH1, Tah1p/SPAGH), which could induce conformational remodeling necessary for the formation of mature RNPs. In addition to these key players, other factors appeared closely linked to this mechanism. The Hit1p/TRIP3 protein interacts with Rsa1p/NUFIP and is required to ensure its stability in yeast. HSP90 chaperone, whose role is predominant in human, operates on some components of the RNPs. Finally, the Bcd1p/BCD1 protein is associated specifically with this machinery during C/D snoRNPs assembly

Le virus respiratoire syncytial (RSV) est un virus à ARN de polarité négative. Les études démontrent que toute la population sera infectée par ce virus au moins deux fois avant l’âge de 3 ans. Le RSV peut provoquer plusieurs pathologies respiratoires telles que la bronchiolite aiguë et la pneumonie. Les infections sévères corrèlent avec le développement de l’asthme. Lors d’une infection virale, les particules du RSV sont détectées par le senseur RIG-I qui induit l’activation des facteurs de transcription NF-κB et IRF-3. Respectivement, les facteurs de transcription activeront les réponses inflammatoire et antivirale. Au coeur des pathologies induites par le RSV se trouve une réponse immunitaire mal adaptée. Plus précisément, par l’entremise de NF-κB, le RSV provoque une production exagérée de cytokines et chimiokines qui induisent une réponse inflammatoire démesurée provoquant du dommage tissulaire. Paradoxalement, le RSV est capable d’échapper à la réponse antivirale. Ces deux phénomènes sont contrôlés par l’entremise des protéines non structurales NS1 et NS2. Le mécanisme délimitant le mode d’action de NS1 et NS2 sur la réponse antivirale reste à être déterminé. Avec pour objectif d’élucider comment NS1 et NS2 inhibent la réponse antivirale, nous avons investigué le mécanisme de reconnaissance de l’hôte vis-à-vis de RSV. Nous démontrerons, pour la première fois, que le senseur cytosolique MDA5 est impliqué dans la réponse antivirale contre le RSV. Nous présenterons des résultats préliminaires qui suggèrent que le rôle de MDA5 est non redondant à RIG-I. À l’aide d’ARN interférant dirigé contre RIG-I et de transfection de MDA5, nous démontrerons que MDA5 ne contribue pas à la phosphorylation d’IRF-3, mais plutôt qu’elle régit la stabilité du facteur de transcription. Nous démontrerons aussi que, contrairement à l’hypothèse actuelle sur le fonctionnement de NS1 et NS2, l’inhibition de ces derniers ne provoque pas une augmentation de la cytokine antivirale IFN−β. Cependant, l’expression ectopique de NS1 et NS2 réduit l’activité du promoteur de l’IFN-β et de la protéine cytoplasmic antivirale ISG56 lorsqu’elle est mesurée par essai luciférase.
Respiratory Syncytial Virus (RSV) is a RNA virus with negative polarity. RSV infections are the most common cause of hospitalization among infants. Among populations at risk, infection of RSV can be quite severe. RSV infections can cause bronchiolitis, pneumonia, while severe infections are linked to the development of asthma. Early in the infectious cycle of RSV, the cytosolic sensor RIG-I captures viral particles, and activates the immune response by engaging the transcription factors IRF-3 and NF-κB. At the heart of RSV mediated pathologies is a skewed immune response. More precisely, RSV over stimulates the release of proinflammatory chemokines and cytokines. Intriguingly, while RSV is able to stimulate the production of proinflammatory cytokines and chemokines, RSV under stimulates the antiviral response. The ability of RSV to evade the antiviral response is thought to be mediated by its non-structural proteins: NS1 and NS2. However, the mechanism by which NS1 and NS2 enable RSV to evade the antiviral response remains to be determined. In this memoir we investigated, how RSV is recognized by the innate immune response in airway epithelial cells. With this information we hope to improve our understanding of how NS1 and NS2 allow RSV to circumvent the antiviral response. We show for the first time that cytosolic sensor MDA5 plays a role in the recognition of RSV particles. Using a combination of interfering RNA directed against RIG-I, and transfection of MDA5, we show that MDA5 does not contribute to the phosphorylation of IRF-3. According to the data presented, we suggest that MDA5’s role in the immune response is to prevent the degradation of IRF-3. Contrary to previous research, we show that the inhibition of the nonstructural protein does not increase the production of the antiviral cytokine IFN-β. However, the ectopic expression of NS1 and NS2 does lead to a reduction of the promoter activity of IFN-β and the antiviral protein ISG56 when measured by luciferase assay. This research highlights the importance of MDA5 as a potential therapeutic target in the development of a cure for RSV.