Добірка наукової літератури з теми "Protéine kinase CK2 – Inhibiteurs"

Les protéine kinases ont été rapidement identifiées comme favorisant l’apparition de cancers, à travers leur implication dans la régulation du développement et du cycle cellulaire. Il y a une vingtaine d’années, la mise sur le marché des premiers traitements par inhibiteur de protéine kinase, ouvrait la voie vers de nouvelles solutions médicamenteuses plus ciblées contre le cancer. Depuis, nombreuses sont les données structurales et fonctionnelles acquises sur ces cibles thérapeutiques. Les techniques informatiques ont elles aussi évolué, notamment les méthodes d’apprentissage automatique. En tirant parti de la grande quantité d’informations disponibles aujourd’hui, ces méthodes devraient permettre prochainement la prédiction fine de l’interaction d’un inhibiteur donné avec chaque protéine kinase humaine et donc, à terme, la construction d’outils de profilage de leurs inhibiteurs spécifiques. Cette approche intégrative devrait aider la découverte de solutions thérapeutiques anti-cancéreuses plus efficaces et plus sûres.

La prise en charge des patients atteints de leucémie myéloïde chronique a été considérablement améliorée avec l’arrivée dans les années 2000 des inhibiteurs de tyrosine kinase qui ont révolutionné le pronostic de la maladie et ont permis l’amélioration de la survie globale des patients. Cependant, des échecs sont observés. L’apparition de mutations dans le domaine tyrosine kinase de la protéine BCR-ABL1, constitue une cause importantede résistance au traitement et représente le mécanisme le plus étudié. Observation - Patient âgé de 20 ans suivi pour une leucémie myéloïde chronique en phase chronique diagnostiquée en 2015. Le suivi biologique a été marqué par une résistance primaire aux inhibiteurs de tyrosine kinase de 1ère et 2ème génération (Imatinib, Dasatinib et Nilotinib). Unedouble mutation a été retrouvée,la Q252Haprès 6 mois de traitement par Imatinib mésylate, et la T315I, 12 mois après son basculement vers Dasatinib puis Nilotinib.

De nombreuses observations établissent un lien entre la dérégulation de la protéine kinase CK2 et certains cancers. Une activité élevée de CK2 dans certains cancers est un marqueur de mauvais pronostique. CK2 favorise la progression tumorale en régulant de nombreux oncogènes et suppresseur de tumeurs, ainsi qu’en protégeant des protéines anti-apoptotiques du clivage par les caspases. En conséquence, CK2 a émergé comme une cible thérapeutique et son inhibition pharmacologique représente une stratégie prometteuse. A l’instar d’autres protéine-kinases, des inhibiteurs ATP-compétitifs de CK2 ont déjà été identifié. Cependant, leur efficacité est variable, ce qui a conduit au développement de stratégies alternatives pour inhiber cette enzyme multi-protéique. Par criblage de chimiothèques à l’aide de CK2a recombinante, j’ai identifié des composés ciblant le site de fixation de l’ATP de la kinase ou un exosite. Ces composés ont été caractérisé structuralement par radiocristallographie aux rayons X ou par diffusion de rayons X aux petits angles (SAXS). Ces composés ont également été testés dans un test rapporteur de l’activité CK2 cellulaire. Certains inhibiteurs sont actifs sur CK2 dans des cellules vivantes. Deux composés (un ATP-compétitif et un allostérique) démontrent une activité anti-tumorale dans des tests de régression de xénogreffes tumorales dans des modèles murins. Ainsi, ces travaux ont conduit à l’identification des premiers inhibiteurs allostériques de CK2. Ceci montre que cibler CK2 hors du site de fixation de l’ATP est une alternative viable qui permettra d’exploiter de nouveaux mécanismes d’action et d’envisager de nouvelles opportunités thérapeutiques
Experimental evidence supports the view that disregulated Protein kinase CK2 is linked to cancers. Elevated CK2 activity in human cancer is an unfavorable prognostic marker. CK2 enhances progression of oncogenesis by regulating various oncogenes, tumor suppressor proteins and protecting anti-apoptotic proteins from caspase-mediated cleavage. Consequently, CK2 has emerged as a therapeutic target and its pharmacological inhibition appears as a promising strategy. Similar to other protein kinases, numerous ATP competitive inhibitors have been identified. However, they display variable effectiveness. Recently, alternative strategies to inhibit this multi-subunit enzyme have been revealed. Screening of chemical libraries using recombinant CK2a could identify compounds that target either the ATP binding site or exosites. These compounds were structurally characterized by analyzing CK2a-inhibitor complexes by means of X-ray structure crystallography or Small-Angle X-ray Scattering (SAXS). These compounds were also evaluated in a novel CK2 cellular activity assay. Several chemically unrelated inhibitors were found to be potent CK2 inhibitor in living cells. Two compounds (ATP-competitive and allosteric, respectively) showed anti-tumor activity, when tested in murine tumor xenograft regression assays. Taken together, this work leads to the identification of the first allosteric inhibitors of CK2, highlighting a new mode of inhibition of CK2. It also demonstrates that targeting an exosite on CK2 is a viable alternative to ATP-competitive inhibitors. This promises new opportunities by exploiting these new mechanisms of action

La protéine kinase CK2 exerce une activité de suppression de l'apoptose, et son inhibition permet de restaurer l’apoptose. La Chimiothèque de l’Institut Curie a été criblée à haut débit, ce qui a permis de découvrir de nouveaux inhibiteurs. L’objectif du travail de thèse consiste à améliorer la constante d’inhibition de ces molécules pour en faire un outil biochimique d’investigation sur le rôle de cette kinase et un potentiel médicament pour traiter certaines formes de cancer. Nous avons synthétisé des analogues des touches identifiées lors du screening à haut débit. La modélisation moléculaire a permis de mieux comprendre comment les molécules se fixent dans le site actif de la protéine. Nous avons obtenu une position dans le site actif de CK2 pour chaque composé actif. La co-cristallisation d’un des inhibiteurs a permis de valider ce modèle. Nous avons aussi tenté de retrouver par criblage virtuel les résultats expérimentaux obtenus lors du criblage de la Chimiothèque
The protein kinase CK2 is engaged in suppression of apoptosis, and its inhibition helps to restore apoptosis. The Library of the Institut Curie was screened, which led to the discovery of new inhibitors. The aim of the thesis work is to improve the inhibition of these molecules to obtain a biochemical tool to investigate the role of this kinase and a potential drug to treat certain forms of cancer. We have synthesized analogues of hit compounds. Molecular modeling allowed a better understanding of how molecules bind in the active site of the protein. We thus obtained a position in the active site of CK2 for each active compound. Co-crystallization of one of the inhibitors helped validating this model. We also performed virtual screening on a subset of compounds from the library

Les nombreux arguments qui plaident en faveur du potentiel oncogénique de la protéine kinase CK2 en font une cible thérapeutique prometteuse en cancérologie. Cette protéine kinase se présente sous la forme d'un complexe de deux sous-unités catalytiques CK2α constitutivement actives et d'un dimère de sous-unités régulatrices CK2ß. Notre laboratoire a montré que l'interaction dynamique entre ces sous-unités dans la cellule est une composante essentielle dans la régulation de cette enzyme. Pour mieux comprendre cette régulation dans les processus cellulaires normaux et pathologiques, il apparaît nécessaire de développer des molécules capables de perturber cette interaction protéine-protéine. Pour cela, trois stratégies complémentaires ont été utilisées : 1) caractérisation des « hot spots » de l'interaction CK2α- CK2ß à partir de la structure cristallographique du tétramère ; 2) conception rationnelle du premier ligand antagoniste de cette interaction sous la forme d'un peptide cyclique mimétique (IC50 = 3 μM) ; 3) définition à partir de ce peptide d'un pharmacophore utilisable pour identifier des molécules chimiques analogues par une approche de criblage virtuel. Un cluster de molécules inhibitrices actives in vitro et in vivo a ainsi été identifié. Elles représentent les premiers inhibiteurs chimiques de cette interaction
Many arguments in favour of oncogenic potential of CK2 protein kinase make it a promising therapeutic target in oncology. This protein kinase is composed of a tetrameric complex of two catalytic subunits CK2a constitutively active and a dimmer of two regulatory subunits CK2b. Our laboratory showed that dynamic interaction between these two subunits in cell is an essential component for this enzyme regulation. For better understanding this regulation in normal and pathologic processes, it seems necessary to develop compounds able to perturb this proteinprotein interaction. In this respect, three complementary strategies were used: 1) hot spots characterization for CK2a-CK2b interaction based on tetramer crystal structure. 2) rational conception of the first antagonist of this interaction as a mimetic cyclic peptide (IC50 = 3 mM). 3) pharmacophore definition based on this peptide allowing to identify chemical molecules analogs by virtual screening. A cluster of chemical compounds active as well in vitro as in vivo has been identified. They represent the first inhibitors for this interaction

La protéine kinase caséine kinase 2 (CK2) est une sérine/thréonine kinase hautement pléiotrope dont la liste des substrats est supérieure à 500 protéines, lesquelles sont impliquées dans un large éventail de fonctions cellulaires. Les sous-unités catalytiques de CK2 (alpha et/ou alpha') sont constitutivement actives soit seules soit en combinaison avec les sous-unités régulatrices béta pour former une protéine hétérotétramérique (holoenzyme). Une troisième isoforme de la sous-unité catalytique, désignée CK2α'', a été découverte plus récemment et peu d'informations sont actuellement disponibles. L'activité hautement constitutive de CK2 est suspectée de contribuer au phénomène de néoplasie. Une stratégie de conception d'inhibiteurs tétracycliques ciblant le site ATP de la CK2 a permis l'élaboration de trois séries de composés comportant le motif indéno[1,2-b]indole. Un procédé multi-étapes de synthèse a permis de fonctionnaliser précisément le cycle D du noyau indéno[1,2-b]indole et de générer une première chimiothèque de molécules originales. Toutes les molécules finales ont été testées sur la protéine kinase humaine CK2 (Muenster) et certaines ont présentées des CI50 de l'ordre du submicromolaire. L'analyse des Relations Structure-Activité (SAR) et la construction d'un modèle 3D-QSAR (Duesseldorf) a contribué à affiner le choix des substituants introduits sur le châssis moléculaire développé. Les indéno[1,2-b]indoles fonctionnalisés les plus prometteurs ont été également testés sur d'autres cibles biologiques comme la phosphatase CDC25A (Metz) et la kinase DYRK1B (Saarbruecken). Des études de modélisation moléculaire (Duesseldorf) utilisant les données cristallographiques disponibles de l'enzyme ont permis d'analyser les interactions ligand-protéine. Les inhibiteurs les plus puissants in vitro ont été testés sur quatre lignées cellulaires normales afin d'établir leur profil cytotoxique (Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon)
Synthesis and evaluation of indéno[1,2-b]indole derivatives as potential inhibitors of human protein kinase CK2 Protein kinase casein kinase 2 (CK2) is a serine/threonine kinase highly pleiotropic listed substrates it is greater than 500 proteins, which are involved in a wide range of cellular functions. The catalytic subunits of CK2 (α and/or α') are constitutively active either alone or in combination with the regulatory subunits to form a hetero- beta protein holoenzyme). A third isoform of the catalytic subunit, designated CK2 α', was discovered more recently and little information is currently available. The high constitutive activity of CK2 is suspected of contributing to the phenomenal of neoplasia. A design strategy tetracyclic inhibitors targeting the ATP site of CK2 resulted in the development of three series of compounds containing the motif indeno[1,2-b]indole. A multi-step synthesis process has specifically functionalize the D ring of the core indeno[1,2-b]indole and generate a first combinatorial library of original molecules. All final compounds were tested on human protein kinase CK2 (Muenster), and some have reported IC50 of the order of sub-micromolar. Analysis of Structure-Activity Relationships (SAR) and the construction of a 3D-QSAR model (Duesseldorf) helped to refine the choice of substituents introduced into the moleculair frame developed. The indeno[1,2-b]indole the most promising functionalized indoles were also tested on other biological targets such as phosphatase CDC25 A (Metz) and kinase DYRK1B (Saarbruecken). Of molecular modeling studies (Duesseldorf) using the crystallographic data of the enzyme were used to analyze protein-ligand interactions. The most potent in vitro inhibitor were tested on four normal cell lines to determine their cytotoxic profile (Cancer Research Center of Lyon)

L’incidence du cancer du rein et sa mortalité associée se sont accrues au cours des dernières années. Le type de cancer rénal le plus fréquent est celui nommé Cancer Rénal à Cellules Claires (CRCC) où le plus souvent, le gène suppresseur de tumeur Von Hippel Lindau (VHL) est inactivé. Malgré une détection plus précoce, l’évolution de la pathologie demeure incertaine, en particulier quand les patients développent des métastases ou acquièrent une résistance au traitement (25-30% des patients). De nouvelles thérapies ciblant des kinases (Sunitinib, Sorafenib ou Temsirolimus) bien que très prometteuses conduisent très souvent à l’acquisition de résistance. Dans ce contexte, il est urgent de développer de nouveaux modèles prédictifs de la réponse des patients aux traitements et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.Ma thèse de science visait trois objectifs complémentaires : 1) Identifier par criblage chimio-génomique des kinases comme cibles thérapeutiques combinées. 2) Etablir deux modèles de culture 3D de cancer du rein qui intègrent le microenvironnement d’une tumeur: les sphéroïdes et la culture organotypique de coupe de tissus. 3) Etudier la chimio-sensibilité de ces modèles à une combinaison de molécules identifiées dans le criblage.Un criblage cellulaire a été réalisé sur la plateforme de Criblage de Molécules BioActives (CEA- Grenoble). Il a consisté à tester 80 molécules inhibitrices de protéine-kinases en combinaison avec l’extinction génique par interférence ARN (shRNAs lentiviraux) de 36 cibles potentielles connues pour leur implication dans divers cancers. La lignée cellulaire choisie (786-O) est dérivée d’une tumeur rénale à cellules claires radio et chimio-résistante et dépourvue de VHL. Parmi les touches qui compromettent la viabilité des cellules 786-O, la combinaison choisie pour son efficacité cible deux kinases importantes dans le contrôle de la survie cellulaire et de la réparation de l’ADN CK2 et ATM. Le statut VHL des cellules module de façon dramatique leur sensibilité à cette combinaison, l’association de ces deux inhibiteurs étant plus efficace sur les cellules 786-O (VHL -) que sur les mêmes cellules dans lesquelles VHL a été réintroduit (VHL+). Au sein d’une tumeur, les différents niveaux d’oxygénation constituent une variation environnementale supplémentaire créant des susceptibilités ou des résistances aux traitements thérapeutiques. Pour déterminer l’impact de nos molécules dans ce contexte, nous avons testé la viabilité des cellules 786-O VHL+ et VHL- dans des conditions normoxiques (21% O2) ou hypoxiques (1,5% O2), en présence des molécules seules ou en combinaison. En normoxie, une diminution synergique de la viabilité des cellules 786-O VHL- est observée en présence de la combinaison, alors que cet effet n’a pas lieu sur les cellules 786-O VHL+. Cette synergie est potentialisée en condition hypoxique. Au niveau mécanistique, les voies de signalisation de stress cellulaires sont d’avantage activées dans les cellules VHL- en présence de la combinaison de molécules comparé au traitement avec chacune des molécules seules. Dans les sphéroïdes tumoraux multicellulaires reproduisant l’organisation d’une micro-tumeur, nos résultats montrent que notre combinaison de molécules induit d’avantage l’apoptose des cellules VHL- que les molécules seules, alors que les cellules VHL+ ne sont sensibles à aucun des traitements.Ces résultats montrent que l’action de nos molécules combinées est clairement plus efficace dans un modèle 3-D. Ils démontrent également qu’il est possible d’objectiver une pharmaco-modulation de la viabilité de cultures organotypiques de tumeur du rein par des combinaisons d’inhibiteurs chimiques de protéine-kinases. Les perspectives de ce travail sont la validation de cette combinaison sur des tumeurs humaines et l’exploitation des cultures organotypiques comme test personnalisé de réponse aux traitements
Renal cell carcinoma accounts for 3% of all malignant diseases in adults making it the 10th most common cancer in France. The most frequent type of Kidney cancer is Clear Cell Renal Cell Carcinoma (CCRCC). Almost all CCRCC show an inactivation of the Von Hippel Lindau tumour suppressor gene (VHL). Between 25-30% of the patients will develop metastatic renal cell carcinoma (mRCC) by the time they are diagnose or become unresponsive to all treatments and in these cases, the disease has a rapid progression. Over the past years, kinase-targeted therapies (Sunitinib, Sorafenib, Temsirolimus) have become the mainstay of treatment for mRCC, however, most, if not all, patients acquire resistance to these approaches over time.In this context my PhD had 3 goals: a) to find a new combinatory targeted therapy through a High Throughput Screening; b) to establish 3D models mimicking the real environment of the tumours (spheroids, Tissue Slice Culture); c) to validate the Hits through different molecular and cellular biology studies.We conducted a synthetic lethal screen on the CMBA platform (CEA-Grenoble), choosing 36 potential genes targets and 80 kinases inhibitors drugs. Each of the target gene was silenced by a transduction with shRNA Lentivirus into the 786-O cell line derived from ccRCC that lacks the tumour suppressor VHL, is radio- and chemo-therapy resistant, has increased mobility and is highly metastatic. Among the hit combinations that affect cell viability, one of them was chosen because it targets two important kinases involved in cell survival and DNA repair: CK2 and ATM. Moreover, this combination is specifically more active in the 786-O VHL- cells than in 786-O VHL+ cell line. We evaluated the effect of our drugs on the viability of our 786-O VHL+ and VHL- cells in normoxic (21% O2) or hypoxic (1.5% O2) conditions that reflect different environments that are present in a tumour. Surprisingly, in normoxia, we found a synergetic effect of the drug mix only on the 786-O VHL- cells but not on 786-O VHL+ cells. Furthermore, this effect was even stronger in conditions of Hypoxia (up to 20% of synergism).Mechanistically, an up-regulation of the stress pathways was much stronger in the VHL- cells in the presence of the combination than with the drugs alone. No apoptosis was detected in this 2D models. In Multi-Cellular Tumour Spheroid (MCTS) where the organization of a micro-tumour is reproduced, our drugs are even more effective in inducing cell apoptosis than in 2D monolayers of 786-O VHL- cells. These results also demonstrate that pharmaco-modulation of viability of renal tumour organotypic culture by chemical combination targeting protein kinases can be studied. Perspectives of this work are the validation of this drug combination on human renal tumours and the use of organotypic culture as a test for personalized treatment response

L’inhibition de protéines kinases constitue une voie pleine de promesses pour la découverte de nouvelles thérapies ciblées contre le cancer. En 2003, le criblage de la chimiothèque de l’Institut Curie/CNRS a permis de mettre en évidence une famille de composés actifs sur deux de ces enzymes : CK2 et Pim-1. L’objectif de cette thèse était de synthétiser des analogues des « hits » de la chimiothèque possédant le squelette 5-azaindole afin d’en améliorer les propriétés biologiques. La préparation de tels composés étant peu décrite dans la littérature, trois voies de synthèse flexibles et efficaces ont été développées. L’élaboration de 5-azaindoles diarylés symétriques a tout d’abord été mise au point par hétéroannélation pallado-catalysée à partir de dérivés de la 4-aminopyridine. Les composés monosubstitués en position 2 ont ensuite été obtenus par réaction domino sila-Sonogashira/cyclisation 5-endo. Enfin, un procédé one-pot couplage de Sonogashira/aminopalladation/élimination réductrice a permis d’accéder aux molécules diarylées non symétriques avec une régiosélectivité contrôlée. L’application de ces méthodologies a conduit à la préparation de 70 composés fonctionnalisés dont la cytotoxicité et l’activité inhibitrice sur CK2 ont été évaluées. Une étude structure-activité a été réalisée et les fragments d’intérêt que doit posséder une molécule de type 5-azaindole pour inhiber efficacement la kinase ont ainsi été identifiés
Protein kinases represent promising targets for anti-cancer drug design. In 2003, inhibitors of two of these enzymes, CK2 and Pim-1, were identified by the screening of the Curie Institute/CNRS small-molecule library. The aim of this thesis was to synthesize derivatives of these hits with a 5-azaindole scaffold in order to optimize their biological activity. As the synthesis of such molecules was not reported in the literature, efficient and flexible procedures were developed to access to these structures. Diarylated symmetrical 5-azaindoles were thus prepared by palladium-catalyzed heteroannulation from 4-aminopyridines derivatives. The methodology was subsequently extended to silylalkynes and led to monoarylated products through domino sila-Sonogashira/5-endo cyclization. Finally, a one-pot Sonogashira coupling/aminopalladation/reductive elimination afforded unsymmetrical compounds with a total control of the regioselectivity. Using these methodologies, 70 functionalized molecules were easily prepared. Their cytotoxicity and biological activity as CK2 inhibitors were then evaluated. A structure-activity relationship study was performed, which led to the identification of two key structural elements for the CK2 inhibitory potency of 5-azaindoles

La combrétastatine A-4 est un produit naturel isolé d'un arbuste africain Combretum caffrum et qui possède de très intéressantes propriétés biologiques: inhibition de la polymérisation de la tubuline et propriétés antiprolifératives auprès de nombreuses cellules tumorales. Malheureusement, ce produit possède de propriétés pharmacocinétiques non optimales qui limitent son application clinique. Par conséquent de nombreux dérivés synthétiques ont été testés et parmi ceux-ci, l'isocombrétastatine A-4 (isoCA-4). Dans notre travail de thèse, nous avons donc synthétisé des analogues de l'isoCA-4 dont un des cycles aromatiques a été remplacé par des hétérocycles thiophènes et benzothiophènes diversement substitués. Certains de ces produits ont montré des activités du même ordre que la colchicine, substance de référence sur la polymérisation de la tubuline, et sur la prolifération de cellules mélanocytaires IC8. Les composés présentant une structure benzo[b]thiophène montrent une meilleure activité que ceux ayant une simple structure thiophène. De plus, les composés portant une chaine latérale en position 2 montrent une activité supérieure à ceux substitués en position 3.D'autre part, les stuctures indénoindoles sont connues comme étant de puissants inhibiteurs de la caséine kinase 2 (CK2), celle-ci joue un rôle important dans de nombreux processus cellulaires. A partir de cette structure indénoindole et, en utilisant une stratégie proche de celle utilisée pour la série précédente (par introduction d'un atome d'iode en position ortho et cyclisation pallado-catalysée), nous avons synthétisé des analogues indénohétérocycliquesen remplaçant le noyau indolepar des noyauxthiophèneetbenzo[b]thiophène. L'activité inhibitrice de ces dérivés vis-à-vis de la CK2 a été évaluée et l'un de ces composés a montré une forte activité
Isocombretastatin A-4 (isoCA-4), a modified combretastatin A-4 (CA-4), was recently discovered known as a strong activity compound to inhibit tubulin polymerization. The vinyl derivatives opened a new series which is hardly exploited. Based on the structure of isoCA-4, we synthesized isoheterocycles series by replacing the B-ring of isoCA-4 by thiophene and benzo[b]thiophene derivatives. These two series were evaluated in their ability to inhibit tubulin assembly. The benzo[b]thiophene derivativesshowed better activity than thiophene derivatives, the binding position 2 of benzo[b]thiophene showed higher activity than position 3. Indenoindoles was known as a potent series to inhibit casein kinase 2 which plays important role in many processes in cell. Based on the structure of indenoindole, we synthesized indenoheterocycles by replacing indole by thiophene and benzo[b]thiophene derivatives. These two series were evaluated in their ability to inhibit CK2. One of the compoundsshowed high activity

La proteine-kinase ck2 est une serine/threonine proteine-kinase ubiquiste dans le monde eucaryote. Elle se compose de deux sous-unites catalytiques differentes alpha et alpha' et d'une sous-unite regulatrice beta qui s'assemblent sous la forme d'heterotetrameres. La ck2 utilise l'atp comme le gtp, phosphoryle des proteines et peptides substrats acides et necessite une concentration extraphysiologique d'ions magnesiums pour pouvoir exhiber son activite catalytique maximale. Bien que plusieurs evidences suggerent qu'in vivo, la ck2 joue un role indispensable, aucun mode de regulation cellulaire n'a pu etre propose pour cette kinase a l'heure actuelle. Parmi les candidats susceptibles de porter une telle fonction regulatrice, les polyamines sont des composes vis-a-vis desquels de nombreuses etudes ont ete realisees. Presentes en concentrations submillimolaires, ces molecules sont capables de stimuler l'activite catalytique de la ck2 d'un facteur 10 a 20 dans des conditions de concentrations physiologiques d'ions magnesiums. Lors de ces travaux, les parametres cinetiques regissant l'activation de la ck2 en presence de polyamines, ont ete definis. L'effet de la spermine sur la ck2 a ete analyse par dichroisme circulaire. L'interaction spermine-ck2 a ete caracterisee en presence de molecules analogues de la spermine ainsi qu'en ce qui concerne le type et le nombre de liaisons mises en jeu. L'utilisation d'un analogue photoactivable de la spermine a permis d'identifier un site majeur de liaison des polyamines sur la sous-unite beta au niveau du peptide t72-m78. Deux autres sites ont ete detectes au niveau des residus h108 de cette sous-unite et l220 de la sous-unite alpha. La construction, l'expression et la purification de proteines de fusion impliquant le domaine d51-p110 de la sous-unite beta ou la sous-unite beta entiere ont permis de confirmer les resultats du marquage de photoaffinite d'une part et de definir ce domaine comme autonome et fonctionnel d'autre part. Son utilisation a conduit entre autre a la mise en evidence des domaines impliques dans l'interaction des proteines fgf-2 et ck2. Aujourd'hui, la poursuite de ce travail par une approche cellulaire pourrait permettre d'apporter des elements de reponse quant a l'existence d'un role de regulateurs physiologiques joue par les polyamines vis-a-vis de la ck2

La proteine kinase ck2 est une serine/threonine kinase qui se presente classiquement apres purification sous la forme d'un heterotetramere, compose de deux sous-unites catalytiques ck2alpha et/ou ck2alpha' associees fortement a deux sous-unites dites regulatrices ck2beta. Il s'agit d'une enzyme ubiquiste et phylogenetiquement conservee de la levure a l'homme dont la regulation et la fonction biologique sont encore meconnues. L'objectif de ce travail a ete de determiner la place et le role eventuel de la sous-unite catalytique ck2alpha dans la signalisation mitogenique et d'etudier la fonction de la proteine kinase ck2 dans la proliferation cellulaire des lignees de fibroblastes nih3t3 et ccl39. Au cours de cette etude, j'ai pu montrer que ck2alpha forme un complexe moleculaire avec la proteine phosphatase 2a (pp2a) et cible l'activite phosphatase sur mek1, composant central de la voie erk/mapk, connue pour reguler la proliferation cellulaire. La surexpression de ck2alpha est capable d'inhiber l'activation de mek1 et de erk/mapk par le serum. J'ai egalement pu montrer que ce mecanisme de regulation etait specifique du module erk/mapk. L'etude des effets biologiques de ce complexe ck2alpha-pp2a indique que la surexpression de ck2alpha inhibe la transformation cellulaire des fibroblastes nih3t3 induite par ras oncogenique, mais n'affecte pas la proliferation cellulaire. La surexpression des differentes formes de ck2 n'a aucun effet detectable sur la proliferation cellulaire. Par contre, l'utilisation d'un mutant dominant inactif de la sous-unite catalytique ck2alpha : ck2alphak68a inhibe la progression en g1 du cycle cellulaire des fibroblastes nih3t3 et ccl39. J'ai ensuite analyse le mecanisme d'action de ce mutant dominant inactif. J'ai pu montrer que ck2alphak68a s'associe a la sous-unite regulatrice ck2beta endogene et qu'il est incapable, ni de moduler l'expression des sous-unites de ck2 endogenes, ni de generer de ck2alpha libre detectable. J'ai montre que l'effet observe sur la proliferation ne depend pas de la capture par ck2alphak68a d'une population de ck2beta libre presente dans la cellule. Le mecanisme d'action de ck2alphak68a semble plutot reposer sur l'inhibition de la phosphorylation de substrats endogenes. Ces derniers restent a caracteriser.

La micelle de caséines est un constituant déterminant dans la fonctionnalité biologique et technologique du lait. Malgré son rôle clé, l’organisation et la dynamique micellaire de cette structure supramoléculaire ne sont toujours pas élucidées. L’objectif de la thèse a été d’acquérir des connaissances sur la morphologie, la structure interne et externe e la micelle de caséines à la fois à l’état natif et modifié sous l’effet de facteurs physycochimiques (pH, température, déplétion calcique) par une double approche biochimique et physique. Afin de réduire la polydispersité des micelles variant par leur taille et leur composition, nous avons centré notre étude sur des populations micellaires fractionnées par ultracentrifugation différentielle. En nous appuyant sur les récents développements de techniques physiques telles que la diffusion des rayons X aux petits angles et la cryomicroscopie électronique à transmission, nous avons montré que les seules sous-structures présentes dans les micelles de caséines sont des nanoclusters de phosphate de calcium colloïdal, de diamètre 2,5 nm, résultant de l’interaction présumée du phosphate de calcium avec les centres phosphates des caséines, notamment as et B
Casein micelles play a key rolein milk for its biological and technoligcal functionality. In spite of that, its micellar organization and dynamics are not yet well known. The objective of the thesis was to gain knowledge on the morphology and internal and external structures of native casein micelle, modified by environmental parameters such as pH, temperature and EDTA addition, using a combined biochemical and physical approach. In order to reduce the polydispersity in size and composition inherent to casein micelles, we used different populations of casein micelles varying in size (large, medium and small), separated by differential ultracentrifugation. The combination of small angle and ultra small angle X-ray scattering (SAXS and USAXS) and cryo-transmission electron microscopy (cryo-TEM) has provided fine structural details of the casein micelles. We have shown that colloidal calcium phosphate nanoculsters were present as numerous electron dense areas of about 2. 5 nm. They appeared to be uniformly distributed in a homogeneous tangled web of casein and were primarily responsible for the behaviour of the SAXS intensity curve at the highest q ectors, corresponding to the internal structure of the casein micelles. Secific demineralization of casein micelles by decreasing the pH from 6. 7 to 5. 2 induced a disappearance of the granular characteristic seen in the cryo-TEM images as well as the characteristic point of inflection on the scattering curves