Добірка наукової літератури з теми "Proprotein convertase 1 – génétique"

Membrane type-1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP) is the prototypical member of a subgroup of membrane-anchored proteinases that belong to the matrix metalloproteinase family. Although synthesized as a zymogen, MT1-MMP plays an essential role in extracellular matrix remodeling after an undefined process that unmasks its catalytic domain. We now report the existence of a proprotein convertase–MT1-MMP axis that regulates the processing and functional activity of the metalloproteinase. Two sets of basic motifs in the propeptide region of MT1-MMP are identified that potentially can be recognized by the proprotein convertase family of subtilisin-like proteases. Processing of proMT1-MMP as well as the expression of its proteolytic activity were blocked by mutating these recognition motifs or by inhibiting the proprotein convertases furin and PC6 with the serpin-based inhibitor α1 antitrypsin Portland. Furthermore, both furin-dependent and furin-independent MT1-MMP processing pathways are identified that require tethering of the metalloproteinase to the cell surface. These findings demonstrate the existence of a proprotein convertase–MT1-MMP axis that can regulate extracellular matrix remodeling.

Proprotein convertase (PC) deficiency is a rare autosomal recessive disorder caused by mutations in proprotein convertase subtilisin/kexin type 1 (<i>PCSK1</i>). It is characterized by severe malabsorptive early-onset diarrhea, obesity, and systemic endocrinopathies. Only few cases have been reported in the literature; we have add two female sisters with some difference in clinical progress. Herein, we describe two sisters with congenital osmotic diarrhea diagnosed with PC1/3 deficiency, causing malabsorptive diarrhea and enteroendocrine dysfunction, who presented with chronic enteropathy with hypernatremia but with different expressivity. PC1/3 deficiency presents with symptoms and signs that mimic glucose-galactose malabsorption. Because of the clinical paucity and heterogeneity of congenital enteropathies, whole-exome sequencing may be of great help towards early diagnosis and effective treatment.

L'obésité commune est une maladie multifactorielle, dont l'émergence récente comme maladie de masse, est liée à l'occidentalisation du mode de vie. Elle est la conséquence d'une diminution de l'activité physique et d'un accès illimité à une alimentation calorique. Néanmoins, les facteurs génétiques influencent la prédisposition individuelle, comme l'attestent des études familiales et l'identification de formes monogéniques d'obésité. Les déterminants des formes polygéniques fréquentes (95%) sont encore peu caractérisés, même si des études récentes ont montré notamment le rôle de certains gènes dans la signalisation de l'insuline (ENPP1) et les voies métaboliques de neurotransmetteurs (GABA, sérotonine), qui prédisposeraient à l'obésité dans un environnement peu favorable. L'implication des facteurs génétiques dans les maladies polygéniques tel que l'obésité est abordée par des approches directes d'analyses de gènes candidats physiologiques et indirectes par l'étude de gènes candidats positionnels localisés dans des régions chromosomiques de liaison à des traits phénotypiques. Deux études " génome entier " sur des familles caucasiennes françaises ont permis de souligner l'importance du locus 5cen-q comme région de susceptibilité à la variation du taux de leptine et à l'obésité. Parmi les nombreux gènes localisés dans cette région ; les gènes CART (5q12-q13) et PCSK1 (5q15-q21) sont exprimés au niveau du système nerveux central dans des régions impliquées dans le contrôle de la prise alimentaire et le maintien de l'homéostasie énergétique et sont des acteurs de la voie de la leptine. L'analyse de 5,4 kb du gène CART (Cocaine and Amphetamine Regulated Transcript), a permis l'identification d'un SNP de la région promotrice (SNP-3608T>C) qui pourrait être un composant des déterminants génétiques de l'obésité polygénique. Ce polymorphisme se révèle également être associé, dans une population générale, avec les sous-fractions de cholestérol et les apolipoprotéines plasmatiques suggérant une implication du gène CART dans l'athérogénèse. Ce SNP aurait également un effet dans le remodelage de la masse osseuse corticale dans une population de femmes danoises. Le gène PCSK1 (Proprotein Convertase Subtilisin/kexin type 1) code une endoprotéase à sérine de type subtilisine, impliquée dans la maturation de pro-hormones et de neuropeptides précurseurs tels que la proinsuline et POMC. Des mutations du gène PCSK1 responsables d'une forme monogénique rare d'obésité sévère de l'enfant ont été décrites. L'analyse de ce gène dans un contexte polygénique a permis l'identification de SNP fréquents (dont une mutation exonique non-synonyme) associés à l'obésité adulte et/ou infantile. L'approche génétique a validé des hypothèses physiologiques et a amélioré notre compréhension des voies métaboliques impliquées en suggérant l'effet de ces deux gènes dans l'obésité polygénique et le rôle pléiotropique du gène CART
Common obesity is a multifactorial disease, whose recent increase, is related to the modernization of life. This epidemic is the consequence of a physical inactivity and an unlimited access to over-nutrition and consumption of caloric food. Nevertheless, many familial studies and the identification of monogenic forms of obesity indicate that genetic factors are also involved. All determinants of the polygenic forms are still unknown, recent studies show the role of genes in the signalling of insulin (ENPP1) and metabolic pathways of neurotransmitters (GABA, serotonin) which would predispose to obesity in a sedentary, high calorie lifestyle. The identification of genetic factors in the polygenic diseases such as obesity is assessed by direct studies of physiological genes and by indirect analyses with positional candidate genes located in chromosomal regions of linkage to phenotype traits. Two genome wide-scans on French Caucasian families show the importance of the locus 5cen-q. Among many genes located in this region ; CART (5q12-q13) and PCSK1 (5q15-q21) genes are expressed in the central nervous system (principally in the hypothalamus) and are involved in the control of food intake and the regulation of energy homeostasis. The analysis of a 5,4 Kb region of the CART gene (Cocaine and Amphetamine Regulated Transcript), including the promoter, 3 exons, introns and the 3'UTR, resulted in the identification of a promoter SNP (SNP-3608T>C) which is associated with the polygenic obesity. In a general population, this polymorphism is also associated, with subfractions of plasma cholesterol and apolipoproteins which suggests that the CART gene maybe implicated in lipid metabolism and atherogenesis. Within a Danish study of menopausal women, the SNP-3608T>C was shown to effect remodelling of the bone mass (on arm BMD). PCSK1 (Proprotein Convertase Subtilisin/kexin type 1) Gene code for a neuroendocrine member of the family of subtilisin-like proprotein convertases and is important for the maturation of pro-hormones and neuropeptides precursors such as the proinsulin and POMC. PCSK1 gene mutations are responsible for a number of rare monogenic forms of severe obesity. The analysis of this gene in a polygenic context enabled the identification of frequent mutations including a non-synonymous exonic variant which is associated with adult and/or childhood polygenic obesity. The genetic approach validates physiological hypotheses and improves current understanding of metabolic pathways, and suggests a pleiotropic effect of the CART gene and that the CART and PCSK1 genes are implicated in polygenic obesity

Quatre études de liaison génome entier ont mis en évidence une région commune de5,6 Mb dans la région du chromosome 5q15 liée à des traits associés à l’obésité, cette région incluant le gène de la prohormone convertase 1 (PCSK1). Une mutation Pc1 chez la souris a été associée à l’obésité, l’hyperphagie et à une augmentation de l’efficacité du métabolisme. La déficience complète en PCSK1 a été associée à une forme récessive rare d’obésité chezl’homme, et depuis 1997 seuls trois patients présentant cette déficience ont été décrits dans la littérature. Les porteurs de mutations délétères PCSK1 présentent des phénotypes sévères,incluant l’obésité, des hypoglycémies post-prandiales et des problèmes intestinaux ethormonaux. Contrairement aux observations faites chez la souris, les membres des famillesporteurs hétérozygotes ont été considérés comme cliniquement sains. Toutes ces études ontdésigné PCSK1 comme un gène candidat important pour l’obésité.Dans un premier temps, la contribution du gène PCSK1 au risque d’obésitépolygénique a été évaluée chez 13,659 individus d’origine européenne issus de huit cohortescas contrôles ou familiales indépendantes. Neuf variants fréquents couvrant 92% de lavariabilité génétique du locus ont été génotypés. Les méta-analyses des huit études pour levariant commun rs6232 et pour le cluster rs6234-rs6235 ont montré une associationreproductible avec l’obésité chez l’adulte et chez l’enfant (P=7.27x10-8 et P=2.31x10-12respectivement). Le rs6232 était associé à une augmentation du risque d’obésité de 34%, alorsque le cluster rs6234-rs6235 augmentait le risque d’obésité de 22%. Les analysesfonctionnelles ont montré une diminution significative de 10,4% de l’activité catalytique de laprotéine PC1/3 pour le N221D, et une diminution non significative de l’activité catalytique dela protéine PC1/3 pour le cluster Q665E/S690T.L’implication du gène PCSK1 dans l’obésité monogénique a ensuite été entreprise parle séquençage des exons de PCSK1 chez 845 sujets obèses non-consanguins d’origineeuropéenne,. Huit nouvelles mutations non-synonymes ont été identifiées. L’étude des conséquences fonctionnelles des mutations détectées sur la protéine PC1/3 a montré que62.5% de ces mutations détectées étaient prédites délétères par les analyses in silico et 87.5%de ces mutations avaient un effet sur l’auto-activation ou sur l’activité enzymatique de PC1/3in vitro. Dans le but d’estimer le degré de pénétrance pour ces sept mutations pathogéniques,6,060 obèses et 6,274 sujets minces ont été génotypés, démontrant un enrichissement par sixde ces mutations PCSK1 chez les sujets obèses (P=0.007). Cette étude a mis en évidence pourla première fois une augmentation du risque d’obésité chez les porteurs hétérozygotes de mutations perte de fonction du gène PCSK1, confirmant un mode de transmission codominantde l’obésité avec une pénétrance incomplète. La pénétrance de l’obésité a été105estimée à 54.5% pour les porteurs hétérozygotes de mutations délétères PCSK1. Unedéficience partielle en PCSK1 pourrait expliquer environ 0.83% des formes extrêmesd’obésité et représenter la seconde forme la plus fréquente d’obésité monogénique après ladficience en MC4R.Pour conclure, en plus des formes syndromiques très rares d’obésité dues à unedéficience complète en PCSK1, ce travail a permis de démontrer le rôle des variants codantsfréquents non-synonymes dans le risque d’obésité, ainsi que l’importance longtempsinsoupçonné d’une déficience partielle en PCSK1 dans les formes monogéniques d’obésité
Four whole genome studies basing on positional cloning approach revealed a region ofchromosome 5q linked to traits related to obesity, this region contained the gene coding forthe prohormone convertase 1 named PCSK1. Pc1 mutation in mice has been associated withobesity, hyperphagia and increased metabolic efficiency. In human, PCSK1 deficiency is amonogenic form of obesity. The first case of complete PCSK1 deficiency has been identifiedin 1997 and since two other cases were discovered. Deleterious PCSK1 mutations carrierswere either homozygous or compound heterozygous and presented severe phenotypes, such asobesity, intestinal troubles and endocrine disorders. Surprisingly, the family members whowere heterozygous for these mutations appeared clinically unaffected. Overall of these studieshighlighted PCSK1 as a candidate gene for obesity.We have therefore decided to assess the contribution of PCSK1 gene to polygenicobesity risk. To assess the contribution of PCSK1 to polygenic obesity risk, we genotyped tagsingle nucleotide polymorphisms in a total of 13,659 European individuals from eightindependent case-control or family-based cohorts. The non-synonymous variants rs6232,encoding N221D, and cluster rs6234-rs6235, encoding the Q665E-S690T pair, wereconsistently associated with obesity in adults and children (P=7.27 x 10-8 and P=2.31 x 10-12,respectively). Functional analysis revealed a significant impairment of the N221D mutant onPC1/3 protein catalytic activity.In continuity of this study we decided to assess the involvement of PCSK1 gene inmonogenic obesity, knowing that only three cases of complete PCSK1 deficiency have beenreported up to now. The objectives of this study were to evaluate the prevalence of rarePCSK1 mutations contributing to human obesity and to investigate the mode of inheritance ofobesity in the context of PCSK1 deficiency. We sequenced exons of the PCSK1 gene in 845non-consanguineous extremely obese subjects of European origin and we identified eightnovel PCSK1 non-synonymous mutations in eight carriers, all heterozygous. Wecharacterized the functional consequences of the detected mutations on PC1/3 protein and wefound that 62.5% of mutations detected were predicted to be deleterious in silico and werevealed that 87.5% of mutations had an effect on the autoactivation or on the enzymaticactivity of PC1/3 in vitro. In order to estimate the degree of penetrance for the sevenpathogenic mutations, we genotyped 6,060 obese and 6,274 lean subjects. We assessed a 6-fold enrichment of these PCSK1 mutations in obese subjects (P = 0.007). We provided thefirst evidence of an increased obesity risk in heterozygous carriers of loss of functionmutations in PCSK1 gene, confirming a co-dominant mode of transmission of obesity withincomplete penetrance for this gene. The penetrance of obesity was estimated to 54.5% for108heterozygous carriers of deleterious PCSK1 mutations. Partial PCSK1 deficiency mightexplain ~ 0.83% of extreme obesity.To conclude, in addition of the syndromic forms of obesity due to a complete PCSK1deficiency, we provided the strong evidence of the contribution of common non-synonymousvariants in obesity risk and we highlighted that a partial PCSK1 deficiency is associated withan increased risk of obesity

L'obésité est une maladie multifactorielle complexe avec une forte composante génétique. Contrairement à l'obésité commune qui est une maladie polygénique, les formes d'obésité monogénique sont causées par un seul variant génétique rare avec un effet fort et délétère. Ces formes sont rares, précoces et généralement sévères, affectant environ 5% des individus atteints d'obésité. La plupart des mutations rares liées aux formes monogéniques de l'obésité ont été identifiées dans les gènes de la voie leptine-mélanocortine, qui est essentielle pour la régulation de la prise alimentaire. L'identification de ces gènes est cruciale dans la compréhension de la physiopathologie de l'obésité et l'élaboration de nouveaux traitements.J'ai tout d'abord étudié les variants rares hétérozygotes du gène PCSK1 qui code l'enzyme prohormone convertase 1 (PC1/3). PC1/3 est impliqué dans la voie leptine-mélanocortine. Les mutations bialléliques de PCSK1 causent une obésité précoce avec une endocrinopathie sévère. Les patients déficients en PCSK1 (hétérozygotes ou homozygotes) peuvent dorénavant être traités avec des injections de setmélanotide pour perdre du poids. Or l'impact des variants rares hétérozygotes de PCSK1 sur l'obésité, et leur pertinence en médecine de précision sont encore mal définis. Dans l'étude RaDiO incluant 9320 participants, 65 variants rares hétérozygotes de PCSK1 ont été identifiés et analysés in vitro. Ces variants ont été classés en cinq groupes suivant la sévérité de leur impact sur l'activité enzymatique de PC1/3. Les résultats d'analyses d'association ont révélé que les variants rares induisant une perte totale de fonction augmentaient fortement le risque d'obésité et l'indice de masse corporelle (IMC) alors que les variants des autres groupes avec un effet partiel ou neutre sur l'activité de PC1/3 n'avaient aucun effet sur l'adiposité. Nous avons observé que les outils de prédiction in silico étaient peu fiables pour détecter les mutations entraînant une perte totale de fonction.Dans un second temps, je me suis intéressée aux variants rares du gène DYRK1B. Bien que ce gène ne soit pas impliqué dans la voie leptine-mélanocortine, des variants pathogènes de DYRK1B ont été décrits chez plusieurs patients avec une obésité centrale, un diabète de type 2 (DT2) et une maladie des artères coronaires. Cependant, l'impact des variants rares de DYRK1B n'a pas été évalué à grande échelle. A partir de l'étude RaDiO incluant 9353 participants, 65 variants rares dans DYRK1B ont été détectés. Après une analyse in vitro de chaque variant, nous avons identifié 20 variants pathogènes ou probablement pathogènes (P/LP) d'après les critères de l'American College of Medical Genetics and Genomics. Parmi ces variants P/LP, six montraient un effet entrainant une perte totale de fonction de DYRK1B (P/LP-full). Les analyses d'association ont montré que les variants P/LP-full de DYRK1B étaient fortement associés à une augmentation de l'IMC et de la glycémie à jeun, et à un risque accru d'obésité et de DT2, alors que les variants P/LP n'avaient qu'un effet modeste sur l'adiposité et aucun impact sur l'homéostasie glucidique.En conclusion, l'utilisation de la génétique fonctionnelle a permis de mettre en évidence que seuls les variants hétérozygotes de PCSK1 et DYRK1B avec une perte de fonction totale causaient une obésité monogénique. Pour DYRK1B, l'obésité est en plus associée à un DT2. Ces résultats soulignent l'importance cruciale de déterminer in vitro l'impact fonctionnel des mutations en vue du diagnostic génétique et de l'éventuel choix d'un traitement approprié. Nous avons démontré que les tests de prédiction in silico ne sont pour l'heure pas assez précis
Obesity is a complex multifactorial disease with a strong genetic component. Unlike common obesity, which is a polygenic disease, monogenic forms of obesity are caused by a single rare genetic variant with a strong and deleterious effect. These monogenic forms are rare, early-onset and generally very severe, affecting around 5% of individuals with obesity. Most rare mutations associated with monogenic obesity are found in genes within the leptin-melanocortin pathway, which is crucial for the regulation of food intake. Identifying these genes is crucial for understanding the pathophysiology of obesity and developing new treatments.I initially studied rare heterozygous variants of the PCSK1 gene, which encodes the prohormone convertase 1 (PC1/3) enzyme. PC1/3 is involved in the leptin-melanocortin pathway. Biallelic mutations in PCSK1 cause early-onset obesity with severe endocrinopathy. Patients with PCSK1 deficiency (heterozygous or homozygous) can now be treated with setmelanotide injections to promote weight loss. However, the impact of rare heterozygous variants of PCSK1 on obesity and their relevance in precision medicine are still not well-defined. In the RaDiO study, which included 9,320 participants, 65 rare heterozygous variants of PCSK1 were identified and assessed in vitro. These variants were classified into five groups based on the severity of their impact on the enzymatic activity of PC1/3. Association analysis results revealed that rare variants inducing a complete loss of function significantly increased the risk of obesity and body mass index (BMI), whereas variants in other groups with partial or neutral effects on PC1/3 activity had no impact on adiposity. We observed that in silico prediction tools were unreliable in detecting mutations leading to a complete loss of function.Subsequently, I focused on rare variants of the DYRK1B gene. Although this gene is not directly involved in the leptin-melanocortin pathway, pathogenic variants of DYRK1B have been described in several patients with central obesity, type 2 diabetes (T2D), and coronary artery disease. However, the impact of rare DYRK1B variants has not been assessed on a large scale. In the RaDiO study, which included 9,353 participants, 65 rare variants in DYRK1B were detected. Following in vitro analysis of each variant, we identified 20 pathogenic or likely pathogenic variants (P/LP) according to the criteria of the American College of Medical Genetics and Genomics. Among these P/LP variants, six showed an effect leading to a complete loss of function of DYRK1B (P/LP-full). Association analyses showed that P/LP-full variants of DYRK1B were strongly associated with increased BMI and fasting glucose levels, as well as a heightened risk of obesity and T2D, whereas P/LP variants had only a modest effect on adiposity and no impact on glucose homeostasis.In conclusion, the use of functional genetics has demonstrated that only heterozygous variants of PCSK1 and DYRK1B with a complete loss of function cause monogenic obesity. For DYRK1B, obesity is additionally associated with T2D. These results underscore the critical significance of assessing the functional impact of mutations in vitro for genetic diagnosis and the potential selection of appropriate treatments. We have demonstrated that in silico prediction tests are currently not precise enough

Biopeptides are synthesised as large pro-protein precursors that have to undergo proteolytic cleavage at positively charged amino acids (Lys and Arg) in order to become active. This cleavage is mediated by a family of subtilin/kexin related calcium dependent serine endoproteinases named prohormone convertases. The present thesis focuses on the endocrine member of the family named PC1/3. PC1/3 is expressed in the regulated secretory pathway of endocrine and neuroendocrine cells, where it was shown to activate various peptide hormones such as proopiomelanocortin (POMC), pro-insulin and pro-glucagon. PC1/3 is synthesized as a large precursor containing a signal peptide, a propeptide, a catalytic domain, a P domain and a C-terminal domain. The activation of the enzyme requires the sequential removal of the signal peptide, the propeptide and ultimately the C-terminal domain.
The structural characterisation of the enzyme is compromised by the difficulty in producing a sufficient amount of recombinant PC1/3. In this thesis it is clearly demonstrated that the production of PC1/3 using Baculovirus technology can be greatly improved by modifying the expression vector in insect cells (Spodoptera frugiperda). In addition, the intracoelemic injection of insect larvae (Tricoplusia ni) with the Baculovirus encoding the recombinant PC1/3 is shown to be a very efficient method for the production of a large amount of prohormone convertases.
It was previously demonstrated that the propeptide is essential for the folding of the enzyme and act as a tight binding inhibitor of the enzyme until the latter reaches the appropriate compartment for substrate cleavage. To assess the role of certain residues within the propeptide in the inhibition of the cognate enzyme, a mutational analysis by alanine scan was conducted. The results demonstrate that the substitution of a single amino acid can affect markedly the inhibition behavior, potency and selectivity of the propeptide towards the enzyme. Moreover, this mutational analysis allowed the first experimental mapping of the sequence involved in propeptide degradation once its function is achieved.
However, PC1/3 also possesses a C-terminal domain which must also be cleaved to allow the full activation of the enzyme. Previous studies showed that this domain is implicated in the sorting of the enzyme to secretory granules. In addition, over expression experiments showed that the C-terminal domain can inhibit the cleavage of certain substrates by PC1/3. The results, presented here, suggest that the CT-peptide acts as a non-essential activator of PC1/3, in vitro, which adds a supplementary level of complexity to the activation process of the enzyme.
Finally, based upon our results, it can be proposed that PC1/3 is a very complex enzyme capable of controlling its enzymatic activity through the coordinate action of its various domains. This exceptional mode of self-regulation is unique among all protease families.

The family of proprotein convertases has been recently implicated in tumorigenesis and metastasis in animal models. However, these studies have not yet been completely corroborated in human tumors. Here, we show that mRNA, protein expression, and protein cleavage profiles of proprotein convertases 1 and 2 are altered in liver colorectal metastasis, compared to unaffected and normal liver. Active PC1 is overexpressed in tumor, correlating with its mRNA profile. Moreover, the enhanced PC2 processing pattern in tumor correlates with the overexpression of its specific chaperone 7B2, which in turn may represent a target for early diagnosis and treatment. The increased PC2 maturation, as well as the overexpression and altered processing of PC1 may be either a cause or a consequence for the observed metastasic phenotype. Nevertheless, they may result in the alteration of the secretory pathway, which could therefore, modify the cellular microenvironment and thus favor tumor growth and/or metastasis.

Subtilisin Kexin Isozyme-1 (SKI-I) also called Site1 Protease (S1P) is a member of mammalian subtilisin family that is involved in cholesterol metabolism, lipid synthesis and viral infections. It is considered as a target for intervention of these diseases or disorders. Herein, vaccinia virus transfected HEK 293 expression system was used in the production of ∼98 kDa C-terminally truncated soluble human hSKI-1 enzyme in enzymatically active form. Partial purification of recombinant (rec) hSKI-1 enzyme was achieved by using modified cell culture condition and affinity column chromatography. In addition, gel filtration size exclusion chromatography was also attempted as an alternative to column chromatography method to purify the enzyme. Purification ofrec-hSKI-1 led to significant dimerization of the enzyme which results the partial loss of protease activity. Nonetheless, it was used to design novel SKI-I inhibitors for biochemical and therapeutic applications. Oxymethylene (-OCH2-) based pseudo and multibranch peptide strategies were used for the design of new hSKI-1 inhibitors. The peptide sequences used in these approaches were obtained from SKI-I prodomain near its autocatalytic cleavage sites. Depending on the length of the peptide sequence, competitive and mixed type inhibition was observed for the Oxymethylene based pseudo peptide inhibitors. However, most of them showed competitive inhibition of hSKI-1 activity, suggesting their interactions with the catalytic domain of SKI-I enzyme. It also indicated that Oxymethylene function might be a good mimicry of peptidyl amide bond (-CONH-). In the pseudopeptide series, ∼5 fold more inhibition was observed for the P7- Tyr mutant peptide. This suggested the preference of aromatic residue at P7 position of the substrate is important for hSKI-1 enzyme recognition. In the multibranch peptide series, the 2- and 4- branch peptides displayed ∼8.6 and ∼13 fold increased inhibition of hSKI-1 enzyme respectively compared to the single branch linear peptide. This suggests that increasing the number of inhibitory peptide chain within a core molecule may be an interesting concept for the design of enzyme inhibitors and should be explored not only for convertase but also for other protease inhibition as well.

Mondialement, le cancer du sein est celui le plus fréquent et mortel chez les femmes. Malgré un programme de dépistage national et de nouveaux traitements, le taux de rechute demeure haut. Ceci illustre le besoin de nouvelles thérapies. Même dans un pays industrialisé comme le Canada, ce cancer est toujours le deuxième plus mortel chez les femmes. Nos travaux précédents ont identifié PACE4, un membre de la famille des proprotéines convertases (PCs), comme étant une nouvelle cible thérapeutique dans le cancer de la prostate. Dans cette étude, nous avons vérifié si PACE4 pourrait aussi être une cible dans le cancer du sein. À l’aide d’échantillons clinique de cancer du sein, nous avons premièrement démontré que PACE4 est spécifiquement surexprimé dans le sous-type moléculaire positif aux récepteurs hormonaux. Par la suite, nous avons sélectionné une lignée cellulaire pour poursuivre nos expériences. Nous avons choisi la lignée de cancer du sein ZR-75-1 parce qu’elle provient du sous-type positif aux récepteurs hormonaux et qu’elle exprime PACE4. En culture cellulaire, nous avons comparé la croissance de cellules ZR-75-1 modifiées qui sous-exprimaient furine, PACE4 ou PC7. Lors de ces expériences, PACE4 était la seule PC importante pour la prolifération cellulaire. L’importance de PACE4 pour la croissance tumorale a aussi été confirmée in vivo à l’aide d’un modèle de xénogreffes de cellules ZR-75-1 chez des souris immunosupprimées. Les inhibiteurs peptidiques spécifiques à PACE4 C23 et Multi-Leu (ML) ont aussi été testés en culture cellulaire où ils étaient en mesure de diminuer la prolifération des cellules ZR-75-1 et MCF-7. Nous avons aussi démontré, à l’aide d’un peptide ML radiomarqué, que l’expression de PACE4 est nécessaire pour que les peptides inhibiteurs pénètrent dans la cellule. De plus, le peptide C23, lorsqu’administré systémiquement à des souris immunosupprimées portant des tumeurs de cancer du sein, était en mesure de diminuer la croissance tumorale. De manière intéressante, les tumeurs sous-exprimant PACE4 et celles traitées avec le peptide C23 démontraient un ralentissement de la croissance tumorale similaire. De plus, lorsque ces tumeurs ont été analysées en immunohistochimie, elles possédaient une diminution du marqueur de prolifération Ki67 et une augmentation de cellules positives aux marqueurs d’arrêt du cycle cellulaire p27KIP1 et p21Waf1/Cip1 comparativement aux tumeurs contrôles. Pour conclure, la sous-expression de PACE4 et l’administration systémique d’un inhibiteur de PACE4 en culture cellulaire ainsi que dans un modèle de xénogreffe résultent en une diminution de la prolifération néoplasique. Nos résultats suggèrent que PACE4 est une cible intéressante dans le cancer du sein positif aux récepteurs hormonaux.
Abstract: Breast cancer is the most frequent and deadly malignancy in women worldwide. Despite national screening prog rams combined with new treatments relapse rate remain high and new therapies are needed. Even in industrialized country like Canada, it is still the second most deadly cancer in women. From previous work, we identified PACE4, a member of the proprotein convertases (PCs) family of endoproteases, as a novel therapeutic target in prostate cancer. In the present study, we examined whether PACE4 could also be a potential target in breast cancer. In clinical samples of breast adenocarcinoma, we observed a specific overexpression of PACE4 in the estrogen-receptor-positive (ER+) subtype. We therefore looked for a breast cancer cell line model which would be representative and thus focused on ZR-75-1 since it both expresses PACE4 and is estrogen-receptor-positive. We compared stable knockdowns of furin, PACE4 and PC7 in the estrogen-receptor-positive cell line ZR-75-1 to evaluate their respective contribution to cell growth and tumor progression. PACE4 was found to be the only PC displaying a decrease in cell growth. The impact of PACE4 on tumor growth was also confirmed in vivo with xenograft of the ZR-75-1 cell line in athymic nude mice. PACE4 specific peptide-based inhibitors (C23 and Multi-Leu) were tested and shown to decrease prolife ration of ZR-75-1 cells in cell-based assays. We also confirmed that PACE4 expression was necessary for its specific peptide-based inhibitors to penetrates in the cell using a radiolabeled Multi-Leu peptide. Moreover, the systemic administration of C23 had a potent effect on tumor growth on xenografts of the ZR-75-1 cell line. Interestingly, PACE4-silencing and systemic administration of the PACE4 inhibitor C23 resulted in similar slowed tumor growth in vivo. Furthermore, these tumors demonstrated lower Ki67 proliferative indices with increased cell quiescence assessed with p27 KIP1 and p21 Waf1/Cip1 biomarkers. To conclude, PACE4-silencing and systemic administration of a PACE4 inhibitor result in hindered tumor progression and slower cellular proliferation. Our results suggest that PACE4 is a promising target for estrogen-receptor-positive breast cancer.

L'identification de nouveaux acteurs impliqués dans les maladies cardiovasculaires (MCV) permet une meilleure compréhension de leur physiopathologie. L'objectif de ces Études de thèse est de déterminer les causes génétiques des MCV et leurs facteurs de risque, en particulier de hypercholestérolémie familiale (FH) et des anévrismes de l'aorte thoracique (TAA).La première partie portait sur l’étude des causes génétiques de la FH chez des proposants français. Grâce à une approche de séquençage de l'exome, nous avons identifié les variations p.(Arg50Gln) et p.(Ala3396Thr) dans une région de líAPOB qui n'est pas généralement étudiée lors du diagnostic de la FH par le séquençage de Sanger. De plus, nous avons décrit un premier cas hétérozygote composite porteur des mutations p.(Ala3396Thr) de l'APOB et p.(Arg96Cys) de PCSK9. Des tests fonctionnels nous ont permis de montrer que la variation p.(Arg96Cys) de PCSK9 conduit à une augmentation de la dégradation du récepteur des LDL. La deuxième partie de ce travail consistait en l’étude du défaut génétique chez les patients souffrant de TAA d'origine familiale. Après exclusion des gènes connus pour être associés à la maladie, les résultats du séquençage de l'exome ont suggéré que le gène THSD4, connu aussi sous le nom d'ADAMTSL6, pourrait être un gène candidat potentiel dans les TAA. Nous avons démontré effectivement que THSD4 est un nouveau gène impliqué dans la maladie. En effet, les variations de ce gène retrouvées chez l'homme sont associées au TAA. Les études fonctionnelles que nous avons entreprises ont montré que les variations faux-sens au niveau de ce gène conduisent à une diminution des taux de THSD4 intracellulaire et affectent Également la fibrilline-1 du réseau microfibrille au niveau de la matrice extracellulaire. Les taux plasmatiques de THSD4 mesurés par ELISA suggèrent que THSD4 pourrait être un biomarqueur potentiel des anévrismes de l'aorte de différentes étiologies. Nous avons aussi étudié la FH au Liban et avons identifié des variations au niveau des gènes LDLR et LDLRAP1. Nous avons de même confirmé la forte incidence des formes hétérozygotes et homozygotes de la FH dans la population libanaise. En outre, nous avons initié les Études génétiques de la TAA afin de pouvoir Établir le spectre mutationnel de cette maladie au Liban. Ces résultats montrent l'importance des stratégies génétiques dans les Études familiales afin d'identifier de nouvelles mutations dans des gènes connus ou découvrir de nouveaux gènes responsables des maladies cardiovasculaires. Ceci permettrait l'amélioration de la compréhension de la physiopathologie des maladies complexes, un meilleur diagnostic et la mise en place de stratégies adaptées pour une prise en charge clinique optimale
The identification of new actors involved in cardiovascular diseases (CVD) allows a better understanding of their pathophysiology. The objective of our studies was to investigate the genetic causes of CVD and their risk factors with a special focus on Familial Hypercholesterolemia (FH) and Thoracic Aortic Aneurysm and Dissection (TAAD).The first part of this work consisted on studying the genetic causes of ADH in French probands. Through an exome sequencing approach, we identified the p.(Arg50Gln) and the p.(Ala3396Thr) variations in the APOB gene, which occur in a region not routinely sequenced when diagnosing FH by Sanger sequencing. In addition, we reported the first compound heterozygote with the p.(Ala3396Thr) mutation of APOB and the p.(Arg96Cys) mutation of PCSK9 and we proved by functional assays that the p.(Arg96Cys) variation of PCSK9 leads to increased LDL receptor degradation. A second part of this work consisted on studying the genetic defect in patients who suffer from familial TAAD. After exclusion of the known genes associated to the disease, exome sequencing results suggested that THSD4, also known as ADAMTSL6, might be a potential candidate gene of TAAD. We demonstrated that THSD4 is a new gene involved in the pathogenesis of the disease. Human variations in this gene are associated with TAAD. Functional studies showed that missense variants of this gene lead to a decrease in levels of intracellular THSD4 and also affect the fibrillin-1 microfibril assembly in the extracellular matrix. THSD4 levels in plasma measured by an ELISA assay suggested that THSD4 might be a potential biomarker for aortic aneurysm of different etiologies.We conducted studies on FH in Lebanon and we identified variations in the LDLR and the LDLRAP1 genes, highlighting the high incidence of heterozygous and homozygous FH in the Lebanese population. In addition, we initiated genetic studies on TAAD in order to establish the mutational spectrum of this disease in Lebanon. These results demonstrate the importance of genetic strategies applied on familial studies to discover new genes responsible of CVD, or new mutations in already known genes. This can lead to a better understanding of the pathophysiology of complex diseases, a better diagnosis, and the implementation of better strategies for adequate clinical management

Familial hypercholesterolaemia (OMIM 143890) is characterized by hypercholesterolaemia from birth, with the subsequent development of cutaneous and tendon xanthomas and premature onset of atherosclerosis, as first described by Müller over 70 years ago (1). Myant (2) noted that the monogenically determined increase in plasma cholesterol was largely confined to low-density lipoprotein (LDL) cholesterol and Goldstein and Brown (3) showed that the increase in LDL was due to mutations of the gene encoding the formation of LDL receptors, leading to defective catabolism of LDL. Over 1000 variations in the LDL receptor gene have now been described, most of which can cause familial hypercholesterolaemia (4). Usually only one mutant gene is inherited, which gives rise to the heterozygous form of the disease. Rarely, inheritance of two identical mutant alleles occurs, giving rise to homozygous familial hypercholesterolaemia. Inheritance of two mutations results in compound heterozygosity, which is clinically indistinguishable from genetically homozygous familial hypercholesterolaemia. The frequency of familial hypercholesterolaemia in the populations of Europe and North America averages 0.2%, but in some parts of the world it is much higher. Regions with an increased prevalence of familial hypercholesterolaemia include Lebanon, South Africa, and the Canadian province of Quebec. In each instance this is attributable to an unusually high frequency of one or two mutations within the population, such as the Lebanese allele, the Afrikaner 1 and 2 mutations, and the French Canadian allele. In South Africa and Canada the increased prevalence of familial hypercholesterolaemia represents a founder gene effect traceable to immigrant settlers from Europe, whereas in Muslim communities it reflects the frequency of first-cousin marriages. In notable contrast is the multiplicity of mutations found among familial hypercholesterolaemia patients in the UK, as shown in Fig. 12.2.2.1. An identical clinical syndrome to familial hypercholesterolaemia can occur as a result of inheritance of a mutation at the apoB locus, which results in a functionally defective form of LDL (5). This disorder, familial defective apoB-100 or FDB (OMIM 144010), has a frequency of 0.1% in people of European descent but has never been described in Japan. Rarely, familial hypercholesterolaemia is caused by dominantly inherited gain of function mutations of a gene encoding proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) (OMIM 603776), which results in increased degradation of LDL receptors and an unusually severe clinical phenotype (6). It can also be caused by recessively inherited loss of function mutations of a gene encoding a protein involved in the clathrin-mediated internalization of the LDL receptor (6), which results in a milder phenotype than dominantly inherited forms of the condition and is known as autosomal recessive hypercholesterolaemia (OMIM 603813). A recent survey detected mutations of the LDL receptor, apoB, and PCSK9 genes in only 62% of patients with clinically definite familial hypercholesterolaemia (7), raising the likelihood that mutations of genes encoding other proteins involved in LDL metabolism remain to be discovered.