Дисертації з теми "Plum pox virus (PPV)"

Le plum pox virus (ppv) est un organisme de quarantaine responsable de la sharka, maladie majeure des arbres fruitiers du genre prunus. Peu de sources de resistance sont disponibles actuellement. L'evaluation des ressources genetiques vis-a-vis du ppv doit prendre en compte la perennite de ces especes et etre realisee en conditions confinees. Une demarche experimentale a ete developpee in vitro pour l'etude des interactions prunus - ppv. La variabilite des prunus et de l'agent pathogene a ete prise en compte a travers 6 genotypes et 9 isolats viraux. Une methodologie d'etablissement, de maintien et de multiplication d'une collection de souches virales in vitro a ete developpee sur le genotype sensible, le clone gf 8-1 de prunier mariana. Differents facteurs intervenant dans l'inoculation par greffage in vitro ont ete etudies. Le suivi de la propagation systemique du virus a ete mene in vitro et in vivo, a l'aide de la demarche amap de modelisation de l'architecture des arbres. L'optimisation de la methode d'inoculation in vitro a ete realisee sur le prunier mariana gf 8-1 et le clone resistant p1908 de prunus davidiana. Un gradient de contamination decroissant vers l'apex a ete mis en evidence in vitro et in vivo chez le genotype sensible. Aucun genotype immum n'a ete detecte, mais des resistances partielles probablement liees au mouvement systemique ont ete mises en evidence in vitro comme in vivo. L'inoculation par greffage in vitro de prunus constitue maintenant un outil fiable permettant d'apprehender les relations plante - virus, d'evaluer le comportement de genotypes issus de l'amelioration conventionnelle ou obtenus par transgenese et d'etudier le determinisme genetique de la resistance.

La maladie de la Sharka est due à un virus de quarantaine, le Plum Pox Virus (PPV), infectant les arbres fruitiers du genre Prunus. Il est nécessaire de trouver des moyens de lutte, telle que la sélection de plantes résistantes. Or chez ces espèces, les sources de résistance sont à l’heure actuelle en nombre limité, voire inexistantes. Il a été montré, au laboratoire, que ce virus est capable d’infecter Arabidopsis thaliana et qu’il existe chez cette espèce une grande diversité de réponse à l’infection. En effet nous avons pu observer que les accessions St-0 et JEA avais un comportement résistant, alors que l'accession Cvi-1 été partiellement résistante. Deux méthodes d’inoculation ont été comparées: une inoculation mécanique à partir de feuilles de Nicotiana benthamiana inoculées avec pICPPVnkGFP et une inoculation par agro-infection à partir d’une souche Agrobacterium tumesfasciens contenant l’isolat viral pBINPPVnkGFP. L'emploi de ces deux méthodes d'inoculation nous a permis de mettre en évidence une variabilité de la réponse au PPV en fonction de la méthode utilisée. En conséquence, cette étude visait donc à identifier le ou les facteur(s) de la plante hôte impliqué(s) dans l'infection virale. L'agro-infection de populations recombinantes (F2 et RIL), de lignées multi-parentales ainsi que l'emploi de la génétique d'association a mis en évidence chez St-0 ainsi que dans plusieurs accession distinct (sept) un locus majeur sur le groupe de liaison 3, appelé sha3. Il apparait indispensable dans le mouvement longue distance du PPV. De plus l'utilisation de la génétique d'association a permis d'initier la cartographie fine de sha3 et de réduire considérablement le nombre de gènes candidats. Un criblage de mutants a été initié afin de déterminer le ou les gènes candidats contrôlant le phénotype Sha3. Après inoculation mécanique, l’analyse d'une population recombinante a mis en évidence la présence d’un locus majeur, distinct de sha3 et positionné au milieu du bras long du groupe de liaison 1. Ce locus co-localise avec rpv1, locus identifié précédemment dans la descendance Cvi x Ler (Sicard, Loudet et al. 2008). Ce même locus a été également confirmé à la fois dans une population multi-parentale et par une approche de génétique d'association. Un gène candidat est actuellement en cours de validation au laboratoire. Une étude visant à décomposer le mécanisme de résistance porté par l’accession JEA a été mise en place. Dans ce cas, il apparait que la propagation du virus est inhibée dans les feuilles de la rosette mais pas dans les tissus floraux. Ainsi, la résistance/sensibilité au PPV chez JEA est fortement conditionnée par les stades physiologiques de la plante hôte. Des travaux complémentaires seront indispensables afin de décrire plus finement ce mécanisme de résistance très particulier. Au terme de cette thèse, nous nous attendons à ce que l’identification de ces nouveaux gènes de résistance chez Arabidopsis permette, après transfert, d’accroître la diversité des sources de résistance à la Sharka chez les arbres fruitiers
The Plum Pox Virus (PPV) infects Prunus species (stone fruit) and is the causal agent of the Sharka disease. This disease is vastly devastating for fruit and plant productivity and quality. Its cost reaches 10 billions of euros over the last 30 years. Breeding programs have been carried out with the aim to implement resistant cultivars but the number of sources of resistance in Prunus species is rather limited. It has been shown in the laboratory that this virus is able to infect Arabidopsis thaliana with a wide range of response to infection. Indeed, we observed that accessions St-0 and JEA had a resistant behavior, while accession Cvi-1 was partially resistant. Two inoculation methods were compared: mechanical inoculation from Nicotiana benthamiana leaves inoculated with pICPPVnkGFP and agro-inoculation infection from an Agrobacterium strain containing the viral isolate tumesfasciens pBINPPVnkGFP. The use of these two methods of inoculation allows us to highlight variability in the response to PPV depending on the method used. This study aims to identify the factor (s) of the host (s) involved in viral infection. Agro-infection of recombinant populations (F2 and RIL), multi-parental lines and the use of genetic association demonstrate in St-0 and several distinct accessions (seven) a major locus on linkage group 3, called sha3. It appears essential in the long-distance movement of PPV. Use of association genetics helped initiate the fine mapping of sha3 and significantly reduce the number of candidate genes. Screening of mutants was initiated to determine the gene controlling the phenotype Sha3. After mechanical inoculation, the analysis of a recombinant population revealed the presence of a major locus positioned in the middle of the long arm of linkage group 1. This locus co-localizes with rpv1, previously identified in Cvi x Ler offspring (Sicard, Loudet et al. 2008). The same locus was also confirmed with a multi-parental population and by a genetic association approach. A candidate gene is currently being validated in the laboratory. The study of the resistance mechanism carried by the accession JEA was initiated. In this case, it appears that the spread of the virus is inhibited in basal leaves but not in floral stem. The resistance / susceptibility to PPV in JEA appear to be strongly influenced by the physiological stages of the host plant. Further work will be necessary to describe more precisely this resistance mechanism very special. At the end of this thesis, we expect that the identification of these new resistance genes in Arabidopsis allows, after transfer, to increase the diversity of sources of resistance to plum pox virus in fruit trees

La maladie de la sharka, causée par le Plum pox virus (PPV), est responsable d’importantes pertes économiques chez les Prunus. Toutefois, aucun traitement préventif ou curatif n’est à ce jour disponible et peu de sources de résistance naturelle ont été retrouvées. En France, une approche prophylactique, qui repose essentiellement sur la détection et l’élimination rapide des arbres infectés, a été adoptée afin de réduire la propagation du virus. Néanmoins, certaines contraintes technico-économiques ne permettent pas la détection précoce et efficace du PPV à grande échelle par des méthodes conventionnelles. Le département des Pyrénées Orientales (France) est le plus touché par cette maladie (85% des contaminations). Ces enjeux ont motivé la création du projet Antishark, issu d'une collaboration entre AkiNaO, l'Université de Perpignan Via Domitia, la FDGDON66 et les producteurs locaux. L'objectif du projet consiste à développer une méthode innovante de détection précoce, en ciblant les réponses métaboliques de Prunus persica à un stade précoce de l'infection. Par conséquence, deux études en conditions contrôlées utilisant une approche métabolomique non-ciblée (UHPLC-HRMS) ont été réalisées. Cette approche constitue un outil prometteur pour mettre en évidence les interactions métaboliques entre le PPV et son hôte. Dans une première étude, la réponse métabolique globale à l'infection par le PPV (souches Dideron et Marcus), intégrant les feuilles symptomatiques et asymptomatiques, a permis de discriminer les profils métaboliques provenant de feuilles infectées par le PPV et de feuilles saines. Bien qu’il existe une réponse commune aux deux souches, des différences métaboliques ont également été révélées, mettant en évidence des altérations métaboliques souche-dépendante. De fait, cette observation pourrait amener à terme, la possibilité d’identifier la ou les souches virales responsables d’une infection. De plus, il est possible de discriminer les plants infectés par le PPV (feuilles symptomatiques et asymptomatiques) des plants sains et des plants infectés par un autre virus phytopathogène. Ces observations suggèrent l’existence d’une réponse spécifique potentielle à la maladie de la sharka. L’ensemble de nos résultats corroborent l'hypothèse selon laquelle les arbres asymptomatiques mais infectés par le PPV, pourraient être détectés via les altérations métaboliques provoquées le virus. Par ailleurs, les réponses métaboliques observées sur les feuilles asymptomatiques pourraient être considérées comme des réponses précoces, déclenchées avant l’apparition des symptômes. Dans un deuxième temps, des altérations métaboliques précoces, avant l’apparition des symptômes sharka, ont été confirmées par une étude cinétique et ce, malgré des tests moléculaires négatives (RT-qPCR). Nos résultats indiquent que la détection précoce des plantes infectées par le PPV, en ciblant les réponses métaboliques de Prunus persica, est de facto une stratégie prometteuse. Finalement, des corrélations statistiques entre les deux études ont été retrouvées. Bien que les cultivars présentent des profils métaboliques significativement différents, certaines variables discriminantes sont communes entre les différents cultivars testés (GF-305, nectarine jaune, pêche jaune) et également entre les différents stades d’infection du virus (symptomatique et asymptomatique). Cependant, une co-infection PPV et oïdium observée le long de l’étude cinétique en conditions contrôlées, serait susceptible d’altérer l'impact de l'infection par le PPV. Par conséquent, une nouvelle étude cinétique sans co-infection est en cours pour confirmer ou infirmer ces observations. De plus, l'identification de biomarqueurs liés à la maladie, également en cours, permettrait de mieux comprendre les interactions métaboliques entre la pêche et le PPV. Enfin, d'autres expérimentations en conditions naturelles sont en cours afin d'évaluer la robustesse de nos potentiels biomarqueurs
Sharka disease, caused by Plum pox virus (PPV), is responsible for significant economic losses in Prunus. However, no preventive or curative treatments are currently available and only a few sources of natural resistance have been found. In France, a prophylactic approach has been adopted in an attempt to limit the spread of the PPV, which is essentially based on the rapid detection and removal of infected trees. However, certain technical and economic limitations do not allow the early andeffective detection of PPV on a large scale by conventional methods. The department of Pyrénées Orientales (France) is the most affected by this disease (85% of infections). These issues motivated the creation of the Antishark project, which is the result of a collaboration between AkiNaO, the University of Perpignan Via Domitia, FDGDON66 and local producers. The objective of the project was to develop an innovative method of early detection, targeting the metabolic responses of Prunuspersica at an early stage of the infection. Consequently, two studies under monitored conditions using an untargeted metabolomics approach (UHPLC-HRMS) were carried out. This approach is a promising tool to reveal the metabolic interactions between PPV and its host. In a first study, the global metabolic response to PPV-infection (Dideron and Marcus strains), including symptomatic and asymptomatic leaves, allowed the discrimination of metabolic profiles from PPV-infected and healthy leaves. Although there was a common response between the two strains, metabolic differences were also revealed, notably highlighting strain-specific metabolic alterations. In fact, this novel result could eventually lead to the possibility of identifying the viral strain(s) responsible for the infection. Furthermore, it was possible to discriminate PPV-infected plants (symptomatic and asymptomatic leaves) from healthy plants and from plants infected by another plant pathogenic virus. These observations suggest the existence of a potential specific response to the sharka disease. Based on all these findings, the hypothesis that asymptomatic PPVinfected trees could be detected through virus-induced metabolic alterations is supported.Furthermore, the metabolic responses collected from asymptomatic leaves could be considered as early responses to PPV-infection, i.e., before the appearance of symptoms. In a second step, early metabolic alterations, before the appearance of sharka symptoms, were confirmed by a kinetic study, despite negative molecular tests (RT-qPCR). Our results indicate that early detection of PPVinfected plants by targeting metabolic responses in Prunus persica was a promising strategy. Finally,statistical correlations between the two studies were found. Although the cultivars showed significantly different metabolic profiles, some discriminant features were common between the different cultivars tested (GF-305, yellow nectarine, yellow peach) and also between the different stages of the virus infection (symptomatic and asymptomatic). Nevertheless, a co-infection of PPV and powdery mildew observed during the kinetic experiment under monitored conditions could alter the impact of PPV-infection. Consequently, a new kinetic study without co-infection, is ongoing to confirm or refute these first observations. In addition, the identification of biomarkers related to the sharka disease, also in progress, would provide a betterunderstanding of the metabolic interactions between peach and PPV. Finally, other experiments under natural conditions are underway to evaluate the robustness of our potential biomarkers

Le plum pox virus (PPV), agent infectieux de la maladie de la sharka, affecte gravement les arbres fruitiers à noyaux du genre Prunus, rendant notamment les fruits impropres à la commercialisation. A ce jour, aucun cultivar de pêchers n'est résistant, mais des sources de résistance ont été identifiées et cartographiées chez P. Davidiana, espèce apparentée, et chez quelques cultivars d'abricotiers. Plusieurs des QTL cartographiés co-localisent avec des gènes candidats préalablement identifiés, parmi lesquels des facteurs d'initiation de la traduction. La résistance de P. Davidiana a été confirmée dans une population F2 et deux nouveaux QTL mineurs ont été détectés. L'étude des déterminants génétiques de la résistance portée par P. Armeniaca cv. 'Harlayne' a également été réalisée. La stratégie "gène candidat" a été poursuivie avec les facteurs d'initiation de la traduction elF4G et leurs isoformes. Nous l'avons associée au développement ciblé de marqueurs moléculaires pour la sélection assistée par marqueurs. Elle a révélé une fréquence inhabituelle de co-localisation de ces gènes avec les QTL de résistance identifiés chez P. Davidiana et P. Armeniaca cv. 'Harlayne'. Leur implication dans le contrôle de la résistance est discutée. Afin de valider ces résultats avec ceux préalablement publiés, l'ensemble des données a été intégré dans une méta-analyse QTL. Celle-ci a permis de préciser notamment les limites de la région du groupe de liaison 1 impliquée dans la résistance au PPV à la fois chez P. Davidiana et chez P. Armeniaca
The Plum pox virus (PPV), the causal agent of the sharka disease, is the most detrimental virus on stone-fruit trees, worldwide. Infected fruits are not marketable. To date, no peach cultivar is resistant. However sources of resistance have been identified and mapped in apricot and Prunus davidiana, a wild peach-related species. Several of the mapped QTL co-localize with candidate genes previously identified. Among them are the translation initiation factors. In this study, resistance in P. Davidiana was confirmed in an F2 population and two new QTL were identified. Quantitative analysis of the apricot cultivar 'Harlayne' resistance was also performed. A candidate gene strategy followed, including translation initiation factors elF4E, elF4G and their isoforms. Molecular markers targeting these genes were developped as a tool for marker-assisted selection. It revealed a striking co-localization with several resistance QTL identified in P. Davidiana and P. Armeniaca cv. 'Harlayne'. The implication od these genes in PPV resistance is discussed. In order to validate the consistency of these results with those previously published, data were merged in a QTL meta-analysis. It enabled to refine the boundaries of the genomic region controlling PPV resistance in both species, P. Davidiana and P. Armeniaca

España es el principal productor de frutales de hueso y cítricos de la Unión Europea. Las enfermedades virales más importantes asociadas a estos cultivos son la sharka en frutales de hueso, causada por Plum pox virus (PPV; Potyvirus), y la tristeza de los cítricos, causada por Citrus tristeza virus (CTV; Closterovirus), ambas transmitidas mediante pulgones de forma no persistente y de forma semipersistente, respectivamente. Actualmente existe un amplio conocimiento de la epidemiología de ambas virosis en árboles adultos, sin embargo no existen estudios sobre la epidemiología de ambas enfermedades en bloques viveros. Además, las características especiales de éstos como un marco de plantación más reducido hace que el control de la dispersión de la enfermedad sea más complicado. En este contexto se desarrolla esta Tesis Doctoral, cuyo objetivo principal es el estudio de los distintos factores que determinan la epidemiología de PPV en frutales de hueso y CTV en cítricos en condiciones de vivero con el fin de establecer posibles estrategias de control. Además, considerando que toda estrategia de control requiere en algún momento de la aplicación de métodos de detección específicos, sensibles y fiables, capaces de detectar bajas cantidades del patógeno, se ha realizado la validación de métodos serológicos y moleculares para una precoz y precisa detección viral de plantas infectadas en vivero antes de la comercialización del material vegetal. Para ello se establecieron tres parcelas experimentales de vivero durante el año 2006 en diferentes localidades de la provincia de Valencia. En las distintas parcelas experimentales se llevó a cabo el estudio de la susceptibilidad a la infección viral natural de los distintos patrones estudiados y la evaluación del efecto de los tratamientos con aceites minerales sobre la incidencia viral en el cultivo. Los patrones más susceptibles a la infección natural por PPV fueron Adesoto 101 y Mariana GF8-1. Los patrones Nemaguard y Mirobola 29C presentaron una susceptibilidad media, mientras los patrones Cadaman y Garnem resultaron resistentes a PPV-D detectándose únicamente el virus mediante RT-PCR a tiempo real. Sólo los patrones Adesoto 101, Mariana GF8-1 y Nemaguard, resultaron infectados en la parcela sometida a baja presión de inóculo. Además, se confirmó la alta susceptibilidad a la infección natural a CTV del patrón C. macrophylla.
Vidal Izquierdo, E. (2010). Epidemiología de Plum pox virus y Citrus tristeza virus en bloques de plantas de vivero. Métodos de control [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/9314
Palancia

La structure génétique d’une population virale au sein d’un hôte constitue un maillon essentiel pour la compréhension de l’évolution des virus et de leur épidémiologie, cependant cet aspect reste pourtant très peu étudié. Dans le cas des phytovirus, les plantes pérennes constituent un modèle de premier choix pour une étude intra-hôte détaillée. Le travail de thèse se positionne sur cette question et propose d’étudier la structure génétique des populations de Plum pox virus (PPV) --organisme de quarantaine responsable de la maladie de la Sharka chez les arbres fruitiers à noyau du genre Prunus-- au sein d’un hôte pérenne, et d’évaluer les effets de l’alternance des saisons et de la transmission par puceron sur leur évolution. Nous avons réalisé un échantillonnage exhaustif d’un pêcher chroniquement infecté par le PPV depuis 13 ans, suite à un événement d’inoculation unique. Notre échantillonnage a pris en compte l’architecture de l’arbre. L’analyse des échantillons démontre pour la première fois qu’à l’intérieur d’un arbre, il existe des populations virales totalement isolées qui évoluent indépendamment et qui sont en expansion contiguë dans des charpentières différentes. Nous avons aussi mis en évidence un phénomène de "clonage" biologique des variants de PPV à l’intérieur des feuilles. Ainsi, la somme des variants contenus individuellement dans l’ensemble des feuilles, représentent une sorte de collection de l’immense variabilité des génomes viraux que peut contenir la partie aérienne de l’arbre. Un suivi de la variabilité des populations de PPV, au sein de plantes ligneuses inoculées par une source virale homogène, au cours d’une succession de cycles saisonniers accélérés au laboratoire, a confirmé le mécanisme biologique permettant l’évolution de PPV dans son hôte par expansion contiguë : le PPV est transmis depuis les tissus néoformées d’une saison (jeunes branches) à ceux qui les prolongent l’année suivante (nouvelles branches et feuilles associées). Enfin, le suivi de nombreuses lignées de PPV au fil d’une série de cycles de transmission, de plantes à plantes par pucerons vecteurs, suggère la présence d’une dérive génétique plus importante que celle détectée dans les cycles de simulation de saisons
The intra-host genetic structure of a viral population constitutes an essential link for the understanding the virus evolution and epidemiology. In the case of plant viruses, perennial host plants are perfectly suited models for a detailed study of the genetic structure of viral populations. This work proposes to study the genetic structure of Plum pox virus (PPV) populations --a quarantine pest which causes Sharka, the major disease of stone fruits-- in perennial hosts and to assess the effect of both the season cycles and the aphid transmission on their evolution. We completed an exhaustive sampling of a peach tree, chronically infected by PPV for over 13 years. The sampling was carefully designed to reflect the architecture of the tree. Analysis of the samples demonstrates that a long virus/host association results in the differentiation of several distinct virus populations, geographically isolated in different limbs, where they evolve independently through contiguous range expansion. We also present evidence that the tree harbours a huge “bank” of viral clones, each isolated in one of the myriad leaves. A monitoring of the evolution of PPV populations, within woody plants inoculated by an homogeneous viral source, during accelerated season cycles, confirm the biological process involved in PPV evolution by contiguous range expansion within host: the PPV is transmitted from newly formed tissues of one season (young branches) to those expanding them in the following season (newly formed branches and associated leaves). Finally, the monitoring of numerous PPV lineages, through several plant to plant aphid transmission cycles, suggests the presence of higher genetic drift than that operating upon a series of season cycles

Plum pox virus (PPV) es miembro del género Potyvirus, causa la enfermedad de la sharka que tiene un serio impacto agrícola y económico sobre el cultivo de frutales de hueso. Puesto que la utilización de variedades resistentes es la estrategia más duradera y definitiva en la lucha contra virosis de plantas. El objetivo general de esta tesis doctoral sería evaluar la expresión de anticuerpos recombinantes específicos de proteínas de PPV para interferir o inmunomodular la infección viral y servir así como estrategia para obtener resistencia. Para ello se ha utilizado el fragmento de anticuerpo recombinante scFv2A (del inglés "single chain Fv variable fragment) que reconoce específicamente a la proteína NIb replicasa de PPV. Esta proteína se localiza principalmente en el núcleo de células de plantas infectadas, aunque su función de replicación, presumiblemente, tiene lugar en estructuras membranosas derivadas del retículo endoplásmico (RE) en el citoplasma. Se transformaron plantas de Nicotiana benthamiana con tres versiones del fragmento recombinante scFv2A dirigidas a diferentes compartimentos celulares. Una versión citosólica (scFv2A), una versión nuclear (NLS-scFv2A) y otra dirigida a membranas del RE (6K2-scFv2A) por la cara citosólica. Se obtuvieron diversas líneas transgénicas: líneas A, líneas N y líneas K transformadas respectivamente con las construcciones scFv2A, NLS-scFv2A y 6K2-scFv2A. Se realizaron ensayos independientes de desafío, mediante inoculación mecánica con extractos de plantas infectadas con virus o bien inoculando con un clon recombinante de PPV fusionado a GFP (PPV-GFP). Tras los ensayos, se comprobó que las plantas de las diversas líneas transgénicas de N. benthamiana que expresaban los fragmentos scFv2A, 6K2scFv2A o NLSscFv2A presentaban diferentes grados de protección frente a la infección por PPV. Además, se determinó que varias de las líneas transgénicas, tanto líneas A como K y N, presentaban porcentajes de infección significativamente m
Gil Capitán, MT. (2010). Inmunomodulación de la infección de Plum pox virus mediante la expresión estable y transitoria de anticuerpos recombinantes contra la NIb replicasa viral en plantas de Nicotiana benthamiana [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/34204
Palancia

The main aim of this master thesis was the simultaneous detection of four selected plant viruses ? Apple mosaic virus, Plum pox virus, Prunus necrotic ringspot virus and Prune harf virus, by microarrays. The intermediate step in the process of the detection was optimizing of multiplex polymerase chain reaction (PCR).