Дисертації з теми "Phosphorelays"

L’objectiu d’aquesta tesi és trobar principis generals que permetin relacionar l’estructura i les propietats funcionals dels circuits moleculars de transducció de senyals two-component systems (TCS) i his-asp phosphorelays (PR). La tesi s’inicia revisant els mètodes usats per a l’estudi de principis de disseny en sistemes moleculars i alguns dels resultats obtinguts fins ara, i discutint la importància de l’estudi dels principis de disseny. A continuació, explorem els proteomes seqüenciats de més de 7000 organismes i fem un inventari dels diferents tipus d’organització en operons i proteïnes multidomini dels dominis proteics que intervenen en TCS i PR. A partir d’aquesta informació deduirem alternatives existents en la natura pel que fa al disseny d’aquests circuits moleculars. Per acabar, comparem mitjançant modelització matemàtica el comportament dinàmic de 3 circuits diferents de TCS, i trobem que un tercer component que modula l’activitat de la histidina quinasa o bé el response regulator pot modificar l’espai paramètric on el sistema es comporta de forma biestable.
El objectivo principal de esta tesis es la búsqueda de principios de diseño que relacionen la estructura y la función de redes bioquímicas de transducción de señales, concretamente en two-component systems (TCS) y phosphorelays (PR). La tesis se inicia con una revisión de los métodos usados para el estudio de principios de diseño en sistemas moleculares y algunos de los resultados obtenidos hasta ahora, seguida de una discusión sobre la importancia del estudio de dichos principios de diseño. A continuación, exploramos los proteomas secuenciados de más de 7000 organismos y hacemos un inventario de los distintos tipos de organización en operones o proteínas de los dominios proteicos implicados en TCS y PR, con el objetivo de deducir el repertorio de estructuras existentes en la naturaleza para estos circuitos moleculares. Para terminar, comparamos mediante modelización matemática las propiedades dinámicas de tres circuitos distintos de TCS, y observamos que una proteína adicional que interacciona con la histidina quinasa o con el response regulator modifica el espacio de valores de los parámetros del sistema en el cual existe biestabilidad.
The ultimate goal of this thesis is to set the stage for finding general design principles underlying the relationship between network design and network function in two-component (TCS) and His-Asp phosphorelay (PR) signal transduction systems. This thesis starts with a review of the methods for and results from the study of design principles in molecular systems, and a discussion about the importance of studying those design principles. Next, a survey of the fully sequenced and annotated genomes and proteomes of more than 7000 different organisms is performed in order to identify different types of organizations of the TCS/PR protein domains in operons and multidomain proteins. From this data, the existing diversity of TCS/PR circuit designs will be inferred. Finally, we compare through mathematical modeling the dynamic properties associated with three types of TCS circuit designs, and find that a third component that binds to and modulates the activity of either the sensor kinase or the response regulator can modify the parameter space in which bistability in the system’s response is possible.

Tout au long de sa vie, la bactérie doit faire face à de nombreuses variations de l'environnement. Elle doit s'y adapter rapidement et efficacement afin de survivre. Pour cela, elle dispose des phosphorelais, ou systèmes à deux composants qui sont les outils moléculaires majeurs permettant la perception et l'adaptation de l'environnement chez les bactéries. Ils sont composés d'un capteur et d'un régulateur associé. Suite à la perception d'un stimulus, le capteur s'autophosphoryle et transmet le groupement phosphate au régulateur qui va alors moduler l'expression de l'ensemble des gènes cibles, appelé régulon. Durant le processus d'infection, les bactéries pathogènes doivent faire face à de multiples stress. Ainsi est retrouvé un nombre important de ces systèmes chez de nombreuses bactéries pathogènes comme notre modèle d'étude Dickeya dadantii. Responsable de la maladie de la pourriture molle, D. dadantii est une entérobactérie phytopathogène à large spectre d'hôte. Elle dispose d'une batterie de 32 phosphorelais pour affronter les défenses de l'hôte et les stress généraux de carences nutritionnelles ou des variations physico-chimique de l'environnement.Dans un premier temps, cette étude se focalise sur l'un d'entre eux, le système EnvZ/OmpR. Mes travaux montrent dans un premier temps que le pH dans la plante reste acide durant l'infection. Cependant, malgré une activation du système par le pH acide, il n'est pas activé durant ce processus. Pour comprendre la raison de cette incohérence, le régulon du système a été étudié. Il a alors été découvert que durant l'émergence du genre Dickeya, le gène ompF, codant la porine du même nom, a été dupliqué. De façon intéressante, l'expression d'ompF est constitutive tandis que celle d'ompF2, le gène dupliqué, est soumise au niveau de phosphorylation d'OmpR. L'expression de cette seconde porine est également délétère à l'infection. Ainsi, durant l'infection, l'activation d'EnvZ/OmpR est contrecarrée par la perception de molécule de défense de l'hôte afin d'éviter l'expression d'ompF2 et permettre un bon déroulement de la virulence.Dans un second temps, a été réalisée lors de mes travaux une étude globale de l'importance de chaque phosphorelais sur la virulence de D. dadantii. Les premiers résultats montrent que seuls 6 systèmes sont impliqués dans la virulence. Le nombre et la complexité des stress rencontrés par les bactéries pathogènes ne semblent pas en accord avec ce faible nombre. La baisse de la quantité de bactéries inoculées a permis d'affiner la détection des systèmes participant à la virulence, qui se comptent désormais au nombre de 12. Enfin, l'ensemble de ces résultats indiquent l'importance d'une régulation fine de l'activation d'un phosphorelais car EnvZ/OmpR doit être activé pour l'infection mais que cette activation doit être fermement contrôlée au risque d'avoir des effets néfastes sur la virulence
Throughout their life, the bacteria must confront numerous environmental variations. They must adapt rapidly and effectively to ensure their survival. To accomplish this, they possess phosphorelays, or two-component systems, which are the major molecular tools enabling perception and adaptation to the environment in bacteria. These phosphorelays consist of a sensor and an associated regulator. Following the perception of a stimulus, the sensor autophosphorylates and transmits the phosphate group to the regulator, which then modulates the expression of the entire target gene set, known as a regulon. During the infection process, pathogenic bacteria must deal with multiple stresses. A significant number of these systems are found in various pathogenic bacteria, such as our study model Dickeya dadantii. Responsible for soft rot disease, D. dadantii is a wide-host-range phytopathogenic enterobacterium. It possesses a battery of 32 phosphorelays to deal with host defenses and the general stresses of nutritional deficiencies or physicochemical variations in the environment.First this study focuses on one of them, the EnvZ/OmpR system. My work initially shows that the pH in the plant remains acidic during infection. However, despite activation of the system by acidic pH, it is not activated during this process. To understand the reason for this inconsistency, the system's regulon was studied. It was then discovered that during the emergence of the Dickeya genus, the ompF gene, encoding the porin of the same name, was duplicated. Interestingly, the expression of ompF is constitutive, whereas that of ompF2, the duplicated gene, which is dependent on OmpR phosphorylation levels. The expression of this second porin is also detrimental to infection. Thus, during infection, the activation of EnvZ/OmpR is counteracted by the perception of host defense molecules to prevent the expression of ompF2 and enable proper virulence progression.In a second phase, a comprehensive study of the importance of each phosphorelay in D. dadantii's virulence was conducted in my work. The initial results show that only 6 systems are involved in virulence. The number and complexity of stresses encountered by pathogenic bacteria do not seem to align with this low number. Reducing the quantity of inoculated bacteria allowed for a more precise detection of the systems contributing to virulence, which now totals 12. Overall, these results indicate the significance of finely regulating the activity of a phosphorelay, as EnvZ/OmpR must be activated for infection, but this activation must be strongly controlled to avoid detrimental effects on virulence

Les phosphorelais histidine-aspartate constituent la voie préférentielle de transduction des signaux environnementaux chez les bactéries et médient un grand nombre de réponses adaptatives différentes. Le système Rcs d'Escherichia coli est un phosphorelais complexe constitué de cinq protéines RcsCDBFA. Exclusif des Entérobactéries, il module la formation des biofilms et la virulence de différents pathogènes. Il est activé par des altérations de l'enveloppe et contrôle 2 à 3 % du génome bactérien. Cependant, le rôle du système Rcs dans l'adaptation des cellules à leur environnement reste peu documenté. Mon travail de thèse avait pour objectifs (i) de progresser dans la connaissance du rôle du système Rcs dans des conditions environnementales pertinentes (ii) de rationaliser la complexité du phosphorelais Rcs et notamment d'expliquer le rôle du co-facteur accessoire RcsA au sein de la réponse Rcs (iii) de tendre vers une vision intégrative du système par l'identification de ses partenaires protéiques. Dans le cadre de ces objectifs, mon travail de thèse a démontré le rôle essentiel du système Rcs pour la survie aux pHs acides, situation rencontrée par l'entérobactérie E. Coli dans l'estomac des mammifères. Mes travaux suggèrent également que le co-facteur accessoire RcsA affecte la cinétique d'expression de l'ensemble des gènes du régulon RcsB et qu'il permet notamment de prolonger la réponse Rcs après la disparition du signal activateur du phosphorelais. Pour finir, il apparaît que la régulation de rcsA est bien plus complexe qu'initialement supposée. En effet, mes résultats ont mis en évidence deux niveaux de régulation : transcriptionnel et post-transcriptionnel
Two-component systems, also called phosphorelays are the major signalling pathways in bacteria. They are widespread and mediate a large variety of adaptative cellular responses. The Rcs system of Escherichia coli is a complex phosphorelay composed of five proteins: RcsCDBFA. Exclusive to the Enterobacteriacae, the Rcs phosphorelay modulates biofilm formation and virulence in several pathogens. It is activated by membrane alterations and influences expression of 2 to 3% of the bacterial genome. However, the role of the Rcs system in adaptation to the environment remains elusive. The three objectives of my PhD were (i) to explore further the role of the Rcs system in adaptation to relevant environmental conditions (ii) to rationalize the complexity of the Rcs phosphorelay and, in particular, to explain the role of the accessory co-factor RcsA in the Rcs response (iii) to develop an integrated vision of the system through the identification of its protein partners. Within the framework of these objectives, my work proved that the Rcs system is essential for resistance to low pH, a situation encountered by E. Coli in mammals' stomach. My research also suggests that the accessory cofactor RcsA modulates the kinetics of expression of the whole RcsB regulon, in particular by prolonging the Rcs response after the phosphorelay's activating signal has stopped. To finish with, my work revealed a greater complexity in rcsA regulation than was previously thought to exist, by showing that it is twofold: transcriptional and post-transcriptional

Au cours de leur vie, les bactéries pathogènes sont confrontées à de nombreuses variations environnementales souvent appelées stress, notamment au cours du processus infectieux. Pour survivre et coloniser avec succès son hôte, la bactérie doit percevoir ce nouvel et hostile environnement pour s'y adapter rapidement. C'est le rôle principal assigné aux phosphorelais. Ces systèmes sont composés d'un couple capteur/régulateur. Sous l'action d'un stimulus, le capteur s'autophosphoryle et transmet son phosphate au régulateur, qui module l’activité d’un ensemble de gènes cibles permettant l'adaptation au nouvel environnement. Notre modèle expérimental Dickeya dadantii est une bactérie phytopathogène nécrotrophe responsable de la maladie de la pourriture molle chez un large spectre de plantes hôtes. Les variations du pH et d’osmolarité sont deux des stress souvent rencontrés et combattus par les bactéries pathogènes. Les phosphorelais EnvZ/OmpR et RcsCDB sont deux systèmes majeurs répondant à ces stress. Le laboratoire avait précédemment démontré que le niveau d'activation du système RcsCDB dépendait de la concentration en glucanes périplasmiques osmorégulés (OPG). Leur concentration est d’autant plus élevée dans le périplasme que l’osmolarité du milieu est basse ce qui fait des OPG un intermédiaire essentiel dans la perception de l'osmolarité. Cela nous a poussé à éclaircir la relation entre EnvZ/OmpR et les OPG. Dans ce travail, j’ai montré que, contrairement à l'activation du système RcsCDB, l'activation du système EnvZ/OmpR ne dépend pas de la concentration des OPG, tout en nécessitant leur présence pour l’activation correcte de ce phosphorelais. Pour mieux comprendre le rôle du système EnvZ/OmpR chez D. dadantii, l'activité de ce système a été étudiée in vivo et in planta. Alors que le système EnvZ/OmpR est activé dans un milieu à pH acide et à une osmolarité élevée chez E. coli, mes travaux montrent que seule la variation du pH active ce phosphorelais. De plus, contrairement à E. coli qui possède deux porines majeures, il ne semblait exister qu’une seule porine majeure chez D. dadantii. Mes études ont cependant révélé l’existence d’une seconde porine apparaissant à pH acide in vivo et in planta. Ces deux porines de type OmpF sont régulées par le pH via OmpR. Passée une adaptation de quelques heures dans l’hôte, le profil de ces porines dans l’enveloppe ne change plus durant l’infection. Pourtant, le niveau d’activation d’EnvZ/OmpR durant cette même période fluctue. Ainsi, au moins un autre paramètre environnemental module l’activation de EnvZ/OmpR in planta. Enfin, l’absence de variation des porines dans l’enveloppe durant cette même période suggère qu’un autre régulateur, peut-être RcsCDB, permettrait le maintien de leur niveau d’expression
During their lifetime, pathogenic bacteria are confronted with numerous environmental variations often referred to stress, particularly during infection. In order to survive and successfully colonize its host, the bacterium must perceive this new and dangerous environment to adapt quickly. This is the main role assigned to phosphorelays. These systems are composed of a sensor and a cognate regulator. Under the action of a stimulus, the sensor autophosphorylates and transmits the phosphate group to its regulator, which in turn modulates the activity of a set of target genes allowing adaptation to the new environment. Our experimental model Dickeya dadantii is a necrotrophic plant pathogen bacterium responsible for soft rot disease in a wide range of plant species. The variation of pH and osmolarity are two stresses often faced and fought by pathogenic bacteria. EnvZ/OmpR and RcsCDB phosphorelays are two major systems known to respond to these stresses. The laboratory had previously demonstrated that the level of activation of the RcsCDB system was dependent on the concentration of periplasmic osmoregulated glucans (OPG). Their concentration in the periplasm increases as the medium osmolarity decreases, making OPGs a major intermediate in the perception of osmolarity. This prompted us to decipher the relationship between EnvZ/OmpR and OPGs. I showed that, unlike for the activation of the RcsCDB system, the activation of EnvZ/OmpR doesn’t depend on the concentration of OPGs, but still requires its presence for proper activation of the phosphorelay. To go deeper into the EnvZ/OmpR system, activities of this system have been studied in vivo and in planta. While the EnvZ/OmpR system is activated in a medium with an acidic pH and a high osmolarity in E. coli, my work shows that only pH variation activates this phosphorelay in D. dadantii. In addition, only one major porin (versus two in E. coli) was previously detected in D. dadantii. My studies revealed the existence of a second porin expressed at acidic pH in vivo and in planta. These two OmpF-like porins are regulated by the pH via OmpR. After adaptation for a few hours in planta, the pattern of these two porines remains the same over the rest of the infection. However, the level of OmpR activation during the same period fluctuates indicating that at least one other environmental parameter modulates the activation of EnvZ/OmpR in planta. The steady state level of the porines in the envelope during this same period suggests that another regulatory system, perhaps RcsCDB may maintain their expression level

Les plantes sont de plus en plus confrontées à une diminution de la disponibilité en eau du sol, constituant une contrainte hydrique et osmotique impactant leur survie. La tolérance des plantes face à cette contrainte sera conditionnée par la perception de celle-ci. Un des mécanismes de signalisation de cette contrainte est appelé MultiStep Phosphorelay (MSP) et est composé de 3 partenaires : un récepteur Histidine-aspartate Kinase (HK), des protéines Histidine Phosphotransfert (HPt) et des Régulateurs de Réponse (RR), dont les facteurs de transcription RR-B. Chez Arabidopsis, un MSP constitué d’AHK1, AHP2 et ARR18 a été identifié dans le cadre de la contrainte osmotique. Pour le peuplier, HK1a et b, gènes paralogues et homologues à AHK1, ainsi que 10 et 9 gènes codant respectivement des HPt et des RR-B ont été isolés. La fonction d’osmosenseur d’HK1a a été avancée, et une voie de signalisation de la contrainte osmotique chez le peuplier constituée de ce récepteur, 3 HPt et 6 RR-B a été proposée. L’objectif de la thèse visait à déterminer et caractériser des facteurs de transcription RR-B liés à la contrainte osmotique de façon spécifique. Les résultats phares de cette thèse sont la mise en évidence de la fonction de facteur de transcription de deux RR-B, RR13 et RR19, via l’étude de leur capacité à dimériser et à transactiver ou non des gènes de réponses à la contrainte osmotique. Le RR13 semblerait spécifique de la voie cytokinines et le RR19 de la voie osmosensing. Ce travail étaye fortement l’implication du RR19 dans le MSP dédié à cette contrainte. De nombreuses études ont par ailleurs été initiées durant ce travail de thèse et pourront faciliter la caractérisation du MSP étudié
Plants are increasingly faced with a decrease in soil’s water availability, leading to a hydric and osmotic stress and impacting on their survival. Plant tolerance to this stress will be dependent on its perception. One of the signaling mechanisms related to this stress is called MultiStep Phosphorelay (MSP) and is composed by 3 partners: a histidine-aspartate receptor kinase (HK), histidine phosphotransfer proteins (HPt) and response regulators (RR), including the B-type RR transcription factors. In Arabidopsis, an MSP with AHK1, AHP2 and ARR18 has been identified for osmotic stress signaling. For poplar, HK1a and b, paralogous genes and homologous with AHK1, 10 HPt and 9 B-type RR genes have been isolated respectively. The osmosensor function of HK1a was proposed, and an osmosensing signaling pathway composed by HK1a, 3 HPt proteins, and 6 B-type RR has been suggested. The purpose of this work was focused on the identification and characterization of B-type RR transcription factors specifically linked to osmotic stress in poplar. The main results of this work are the highlight of the transcription factor function of two B-type RR, RR13 and RR19, through the study of their ability to dimerize and transactivate or not osmotic stress-responsive genes. The RR13 seems to be specific for cytokinins signaling pathway, whereas the RR19 seems to be specific for the osmosensing one. This work strongly supports the involvement of RR19 in the osmosensing MSP. Many studies have also been initiated during this work and will facilitate the characterization of the studied MSP

Les systèmes à deux composants jouent un rôle prépondérant dans l'adaptation des bactéries à leur environnement. L'objectif de ce travail de thèse était d'identifier et de caractériser des systèmes à deux composants chez la bactérie phytostimulatrice Azospirillum nécessaires à l'adaptation à la rhizosphère de sa plante-hôte. L'analyse de la distribution génomique des gènes appartenant à la famille des systèmes à deux composants dans les génomes d'Azospirillum disponibles a révélé l'existence d'un grand nombre de gènes codant des hisitidine kinases hybrides, et une analyse plus approfondie a montré une organisation multidomaines complexe de cette famille de protéines. Afin de comprendre leur rôle chez Azospirillum, nous avons, dans un premier temps, sélectionné et inactivé quatre gènes codant des histidine kinases hybrides présentant une architecture multidomaines complexe. A l'aide d'une approche multidisciplinaire combinant génétique, biochimie et phylogénie, nous avons mis en évidence pour la première fois chez Azospirillum, un système atypique à trois-composants nommé PreSKR contrôlant un grand nombre de processus impliqués dans la survie et la colonisation de la rhizosphère, qui agirait en modulant le taux intracellulaire de c-di-GMP. Dans un second temps, nous nous sommes focalisés sur une histidine kinase hybride exprimée au contact de la plante hôte ; cette protéine, appelée RsiK, s'avère être impliquée dans la perception de surfaces et la régulation de la formation de biofilms. L'analyse du régulon par RNA-seq a révèlé que 78 gènes étaient contrôlés par ce système. La prévalence de la famille des histidine kinases hybrides chez Azospirillum couplée à l'approche fonctionnelle réalisée sur deux d'entre elle souligne l'importance des phosphorelais encore largement méconnus chez les bactéries rhizosphériques
Bacterial two-component systems play an important role in the ability of bacteria to adapt to various environments. The aim of this thesis was to identify and characterize two-component systems involved in the adaptation of the phytostimulatory bacteria Azospirillum to its host plant. Analysis of the genomic distribution of genes encoding two-component systems across Azospirillum available genomes revealed the existence of a high number of genes encoding hybrid histidine kinases, and further analyses highlighted a complex multi-domain organization of this family of proteins. In order to understand their role in Azospirillum, as a first step we selected and inactivated four genes encoding complex hybrid histidines kinases. Using a multidisciplinary approach which combines genetics, biochemistry and phylogeny, we brought to light for the first time in Azospirillum, an atypical three-component system named PreSKR which controls a wide variety of processes involved in survival and rhizosphere colonization likely by modulating c-di-GMP levels. As a second step, we focused on a gene encoding a hybrid histidine kinase named RsiK which is induced in contact with its host plant. RsiK is involved in surface sensing and biofilm formation regulation. Transcriptomic analysis of rsiK regulon by RNA-seq showed that 78 genes were under the control of this system. The prevalence of genes encoding hybrid histidine kinase family in Azospirillum, coupled with the functional characterization of two of them, highlight the importance of phosphorelays, still largely unrecognized in rhizospheric bacteria

Les systèmes à deux composants sont utilisés par les bactéries afin de percevoir un stimulus environnemental et de s’y adapter, via une modulation de l’expression génétique. Ils sont composés d’une histidine kinase, un capteur, qui transmet le signal perçu à un régulateur de réponse par un mécanisme de phosphotransfert. Y. pestis est un bacille à Gram négatif responsable de la peste, une zoonose, transmis par les puces. La formation d’un biofilm bactérien obstruant le proventricule de la puce infectée, qualifiée alors de bloquée, est un élément essentiel dans le processus de transmission de la bactérie par l’arthropode. Au cours de son cycle de vie, Y. pestis transite via différents environnements auxquels elle doit s’adapter afin de survivre et de disséminer. C’est pourquoi, l’étude des systèmes à deux composants a été pressentie par le laboratoire comme d’intérêt afin de mieux comprendre les mécanismes de pathogénicité de Y. pestis. Nos travaux ont mis au jour que le système OmpR/EnvZ est activé suite à l’entrée des bactéries dans le tractus digestif de la puce. Cette activation n’est pas engendrée par les changements d’osmolarité ni de pH rencontrés chez l’arthropode, mais pourrait être le fruit de la digestion du repas sanguin et du manque de nutriments en résultant. Par ailleurs, l’activation du système OmpR/EnvZ est requis pour le blocage optimal du tube digestif de la puce car il permet la mise en place d’un biofilm dense au niveau du proventricule de l’arthropode ; cet effet repose en partie sur l’activation de ompF. Les travaux de thèse associés aux précédents du laboratoire ont également permis de mettre en évidence qu’un autre système, GlrKR-YfhG et plus précisément la phosphorylation du régulateur de réponse GlrR, est important pour le blocage et la colonisation de la puce. De façon surprenante, le rôle de ce système dans l’insecte est multiple. Au niveau du proventricule, ce système est requis pour la formation d’un biofilm dense permettant le blocage du tube digestif de l’insecte. Il contrôlerait notamment la production de biofilm via la synthèse de c-di-GMP, selon un mécanisme encore inconnu. Dans l’intestin, ce système promeut la survie du pathogène en lui permettant de maintenir son intégrité membranaire via la régulation concomitante des gènes codant les ARN non codants, GlmY et GlmZ. Cependant, cette régulation n’explique que partiellement le rôle du système dans la colonisation de l’estomac. Finalement, le phénotype des mutant du système GlrKR-YfhG illustre que le tractus digestif de la puce est un environnement toxique pour Y. pestis et que le proventricule et l’intestin moyen de la puce sont deux environnements différents
Two-component systems are used by bacteria to sense and respond to environmental cues by modulating genetic expression. They are composed of an histidine kinase, a sensor which transmits the signal to a response regulator by a phosphotransfert mechanism. Yersinia pestis is the causative agent of plague, a zoonotic disease, and is transmitted by fleas. Biofilm formation in the flea proventriculus leads to flea blockage, which is an important step for Y. pestis transmission by its vector. During its life cycle, Y. pestis must sense and adapt to different environments. This is why two-component systems have been considered of interest for Y. pestis pathogenicity studies. Our work provided evidence that OmpR/EnvZ is activated in the flea’s digestive tract. Interestingly, neither osmolarity nor pH variation in the flea gut trigger OmpR-EnvZ. In contrast, nutrient depletion occurring after blood digestion could be responsible for the activation of the system. We further reported that OmpR/EnvZ is needed for flea blockage because it is needed for biofilm formation in the proventriculus, especially by activating ompF. In addition to OmpR-EnvZ, we also provided evidence that the activation of the GlrKR-YfhG regulatory system is also required for flea blockage. Strikingly, this system displays two distinct function. In the proventriculus, it promotes the production of c-di-GMP, a secondary messenger essential for biofilm formation, and thus flea blockage. In the midgut, it activates the transcription of small RNA glmY and glmZ genes to maintain the bacterial morphology. Overall, our data suggest that the flea’s digestive tract is a toxic environment for Y. pestis and that the proventriculus and the midgut are two distinct environments

A partir d’une banque d’ADNc de racines de peuplier ‘Dorskamp’, nous avons isolé un ADNc codant pour une histidine-aspartate kinase appelé HK1 et quatre ADNc codant pour trois protéines à domaine transmetteur de phosphate à histidine, HPt1, HPt2 et HPt3/4. Nous avons montré dans les racines de peuplier cultivé en hydroponie que le taux de transcrits HK1 augmente 5 min après l’application d’une contrainte hyper-osmotique et qu’il existe une interaction entre HK1 et HPt2 chez la levure. L’ensemble de ces résultats est un argument fort en faveur de l’implication d’un système de phosphorelais multiple dans la perception et la transduction du signal stress hydrique chez le peuplier.

Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) is a virulent pathotype of E. coli that is associated with major outbreaks of hemorrhagic colitis and the life-threatening kidney disease hemolytic uremic syndrome. For successful host colonization and attachment to the intestinal mucosa, EHEC requires the locus of enterocyte effacement (LEE) pathogenicity island, which encodes a type III secretion system (TTSS) responsible for secreting and translocating effector proteins into host colonocytes. Regulation of the LEE is primarily directed through the first operon, LEE1, encoding the locus encoded regulator (Ler), and occurs through the direct and indirect action of several regulators. The 2006 U.S. spinach outbreak of E. coli O157:H7, characterized by unusually severe disease, has been attributed to a strain (TW14359) with enhanced pathogenic potential including elevated virulence gene expression, robust adherence, and the presence of novel virulence factors. Aim 1 of this dissertation proposes a mechanism for the unique virulence expression and adherence phenotype of this strain, and further expands the role for regulator RcsB in control of the E. coli locus of enterocyte effacement (LEE) pathogenicity island. Proteomic analysis of TW14359 revealed a virulence proteome consistent with previous transcriptome studies that included elevated levels of the LEE regulatory protein Ler and type III secretion system (T3SS) proteins, secreted T3SS effectors, and Shiga toxin 2. Basal levels of the LEE activator and Rcs phosphorelay response regulator, RcsB, were increased in strain TW14359 relative to O157:H7 strain Sakai. Deletion of rcsB eliminated inherent differences between these strains in ler expression, and in T3SS-dependent adherence. A reciprocating regulatory pathway involving RcsB and LEE-encoded activator GrlA was identified and predicted to coordinate LEE activation with repression of the flhDC flagellar regulator and motility. Overexpression of grlA was shown to increase RcsB levels, but did not alter expression from promoters driving rcsB transcription. Expression of rcsDB and RcsB was determined to increase in response to physiologic levels of bicarbonate, and bicarbonate-dependent stimulation of the LEE was shown to be dependent on an intact Rcs system and ler activator grvA. The results of this aim significantly broaden the role for RcsB in EHEC virulence regulation. The bicarbonate ion (HCO3-) has been shown to stimulate LEE gene transcription through the LEE1 promoter, and is predicted to serve as a physiologic signal for EHEC colonization. Results from the previous aim demonstrated that bicarbonate induction of the LEE is mediated through the Rcs phosphorelay, and is dependent upon an intact global regulator of virulence grvA gene. However, the direct mechanism through which RcsB-GrvA regulates ler, and the contribution of GrvA to the virulence of EHEC is unknown. In Aim 2, the RcsB-GrvA regulon of EHEC was determined by RNA sequencing, and the contributions of each to virulence and stress fitness was explored. A significant increase in transcription of the gad genes for extreme acid resistance was observed for both EHEC strains TW14359grvA and TW14359rcsBgrvA compared to TW14359, and corresponded with a significant increase in acid survival for TW14359grvA during exponential growth. Therefore, a model by which RcsB-GrvA coordinate LEE expression with acid resistance through GadE was proposed. Finally, the temporal regulation of both rcsDB and grvAB operons in response to bicarbonate was defined using single copy luxE chromosomal reporter fusions. Taken together, these results demonstrate the role of RcsB and GrvA to EHEC virulence, and reveal a novel role for GrvA in of extreme acid resistance and LEE gene expression and in EHEC. Finally, production of the ECP pilus has been demonstrated in enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 (EHEC), and has been shown to be required for efficient adherence to epithelial cells during colonization. The first gene of the ecpRABCDE operon encodes a transcriptional regulator (EcpR) that positively regulates its own transcription, and promotes transcription and production of the downstream gene, ecpA, encoding the major ECP subunit EcpA. However, the distance between the ecpR and ecpA genes suggests the presence of regulatory elements that control ecpA directly. Therefore, it was hypothesized that an additional promoter was able to direct transcription of ecpA, independent of the promoter upstream of ecpR. To test this, promoter-lacZ transcriptional reporter fusions were created using the regions upstream of ecpR and ecpA to test for promoter activity, coupled with western blot analysis to detect EcpA in both wild-type and ecpR promoter mutant strains. In Aim 3, we showed that an additional promotable element, downstream of the EHEC O157:H7 strain TW14359 ecpR translational start site, is capable of driving transcription of ecpA, and that its activity is independent of an intact ecpR promoter. In addition, site-directed mutagenesis was used to characterize a TW14359 specific single nucleotide polymorphism within the predicted ecpA promoter region. Overproduction of EcpR was observed to increase cytosolic RcsB and Tir, indicating that ecp production is able to stimulate the LEE, and that the ecpA promoter polymorphism may contribute to intrinsically increased rcsB transcription in TW14359. Taken together, the results, and those obtained in Aims 1 and 2, expand the model for regulation of the ecp operon in EHEC O157:H7 strain TW14359, and broaden the model for EcpR and RcsB in the coordinate regulation of E. coli common pilus and type III secretion.

Pour se protéger des stress environnementaux, les bactéries possèdent des systèmes de transduction du signal appelés phosphorelais His-Asp. Chez Escherichia coli, le phosphorelais RcsCDB est essentiel dans certaines conditions de stress et est impliqué dans la formation de biofilm. Ce système contrôle la synthèse de la capsule, la division cellulaire et la production du facteur sS en réponse à un stress de l'enveloppe. L'objectif de cette thèse était de mieux comprendre le rôle du système RcsCDB ainsi que les déterminants nécessaires à la régulation par RcsB et son cofacteur RcsA. L'identification des cibles du système RcsCDB/A par une approche globale suggère qu'une de ses fonctions consiste en un remodelage de l'enveloppe. Une étude plus approfondie de la régulation de deux cibles du système, flhDC et bdm, montre le premier exemple de régulation négative par RcsB et RcsA et renforce l'hypothèse selon laquelle le système Rcs contribue à l'efficacité de formation d'un biofilm
To protect themselves against environmental stresses, bacteria use signal transduction systems, the so-called His-Asp phosphorelays. In Escherichia coli, the RcsCDB phosphorelay is essential under certain conditions of stress and is involved in biofilm development. This system controls capsule synthesis, cell division and sS production in response to envelope stresses. The objective of my thesis was to understand the biological role of the RcsCDB/A system and to identify the determinants of the regulation by the response regulator RcsB and its cofactor RcsA. Using a global approach, we characterized RcsB and RcsA regulons. This study suggests that one function of the Rcs system consists in envelope remodelling. A thorough study of the regulation of two targets of the Rcs system, flhDC and bdm, shows the first example of a negative regulation by RcsB and RcsA and strengthens the assumption that the Rcs system contributes to the effectiveness of biofilm formation

Les relais de phosphorylation de type histidine/aspartate constituent des voies de signalisation impliquées dans la perception et la transduction des signaux jusqu’à la mise en place de réponses spécifiques. Ils mettent en jeu un récepteur ou Histidine aspartate Kinase (HK), des protéines navettes en charge de la transmission du phosphate (HPt) et des Régulateurs de Réponse (RR). L’implication d’un tel système dans la transduction du signal de la contrainte osmotique est avérée chez la levure et fortement suspectée chez Arabidopsis. Ce travail de thèse visait d’une part à caractériser l’implication de cette voie de transduction de la contrainte osmotique chez le peuplier, avec l’identification de partenaires HPt et RR en aval du récepteur HK1 et d’autre part à caractériser le mode de fonctionnement d’un RR de type-B. HK1, un osmosenseur membranaire détecterait le signal et le transmettrait à trois HPt préférentielles. De plus, un partenariat d’interaction se dégagerait entre ces trois HPt et certains RR-B. La régulation transcriptionnelle observée lors d’une contrainte osmotique pour deux des représentants des RR-B témoigne d’une possible implication de ces RR dans cette voie. Ces protéines sont des facteurs de transcription dont la fonction a été confirmée in planta pour l’un d’entre eux. La dimérisation du domaine receveur du RR et son interaction avec le domaine de fixation à l’ADN ou domaine GARP apparaissent comme des points de contrôle clés dans la régulation de l’activité effectrice des RR-B. De plus, la capacité d’un RR-B à se fixer sur ses motifs de reconnaissance (boîtes AGAT) a pu être vérifiée in vitro et la présence de ces séquences a d’ailleurs été retrouvée dans des gènes régulés par la contrainte osmotique. Ce travail prospectif ouvre des perspectives concernant l’implication des RR-B dans la voie de transduction du signal de la contrainte osmotique, et propose notamment des mécanismes fins pour l’élaboration d’une réponse hautement spécifique
Multistep His-to-Asp phosphorelay systems are signaling pathways devoted to signal perception and transduction for establishment of specific responses. These systems are composed of three successive partners: Histidine-aspartate Kinases (HKs), Histidine-containing Phosphotransfer proteins (HPts), and Response Regulators (RRs). One of the best characterized corresponding systems is the osmo-responsive pathway in yeast. Such systems are also suspected in Arabidopsis. This work aimed to characterize the involvement of an osmosensing pathway in Populus by identifying HPt and RR elements downstream of HK1 and to reveal the underlying mechanisms for the activity of a RR-B. HK1, membrane osmosensor, is expected to be responsible for signal detection and propagation by triggering the activation of three preferential HPt. Furthermore, an interacting partnership between those HPts and particular B-type RRs was observed. Two of them appear to be regulated by an osmotic stress, suggesting their possible involvement in this pathway. The B-type RR members, the final output elements of the pathway, act as transcription factors, as shown for at least for one of them in planta. Taken together, the dimerization of the RR receiver domain and its interaction with its DNA binding domain (GARP), are likely key checkpoints in the regulation of RR-B activity. Besides, the ability of one RR-B to bind its cognate specific DNA sequences (AGAT boxes) was confirmed in vitro and those were found in promoters of osmotic response genes. This work opens up prospects for the involvement of RR-B in the osmotic stress signaling pathway and suggests mechanisms tuning induction of specific responses

L'enveloppe bactérienne est une cible majeure d'un grand nombre d'antibiotiques naturels. Certains provoquent d'importantes perturbations de la membrane cytoplasmique, d'autres ciblent spécifiquement les différentes étapes enzymatiques de la voie de biosynthèse du peptidoglycane, constituant majeur de la paroi. Pour contrer l'action de ces antibiotiques, les bactéries ont développé divers systèmes de résistance leur conférant un avantage sélectif dans leur niche écologique. Le rejet de l'antibiotique est un des principaux mécanismes de résistance rencontré chez les bactéries. Il implique parfois des transporteurs membranaires de type ABC (pour ATP Binding Cassette) pouvant hydrolyser l'ATP pour exporter ou importer un allocrite. Les bactéries possèdent également divers systèmes leur permettant, d'une part, de détecter un signal environnemental (antibiotique ou stress de la paroi qu'il engendre), et, d'autre part, d'assurer la transduction du signal qui aboutit à une réponse adaptée. Deux types de systèmes sont impliqués dans les réponses aux stress de la paroi : les phosphorelais et les facteurs sigma à fonction extracytoplasmique.

Le groupe des Firmicutes, dont la bactérie modèle est Bacillus subtilis, est un groupe ubiquitaire producteur d'antibiotiques et contenant de nombreux organismes pathogènes. Les analyses effectuées au laboratoire ont permis d'identifier chez les Firmicutes des systèmes associant un phosphorelais et un transporteur ABC. Dans chacun des cas, les gènes codant les différents partenaires du système sont à proximité sur le chromosome et le phosphorelais régule l'expression des gènes codant le transporteur ABC. On trouve trois de ces systèmes chez B. subtilis nommés BceRSAB (anciennement YtsABCD), YvcPQRS et YxdJKLM. L'objectif de notre étude était de tester l'hypothèse selon laquelle ces systèmes pouvaient être impliqués dans la résistance aux antibiotiques ciblant l'enveloppe bactérienne.

La bacitracine est un antibiotique qui se complexe à l'undécaprényl pyrophosphate (UPP) et inhibe la dernière étape de la biosynthèse du peptidoglycane : la régénération de l'undécaprényl phosphate (UP). Nos résultats indiquent que le système BceRSAB est le composant majeur de la résistance à la bacitracine chez B. subtilis. L'expression de l'opéron bceAB est activée, en présence de bacitracine, par le phosphorelais BceRS. Nous avons également identifié une protéine, nommée BcrC, qui participe à la résistance à la bacitracine chez B. subtilis. Nous avons démontré que cette dernière est une UPP phosphatase impliquée dans la régénération de l'UP et s'oppose ainsi à l'action de la bacitracine. L'expression du gène bcrC ne dépend pas du phosphorelais BceRS mais de trois facteurs sigma à fonction extracytoplasmique. En conclusion, B. subtilis possède deux types de systèmes de résistance à la bacitracine indépendants et complémentaires.
Nous avons par la suite analysé le mécanisme de régulation de l'induction du système BceRSAB par la bacitracine. Nos résultats sont surprenants et montrent clairement que le transporteur ABC BceAB participe à l'activation de l'expression de ses propres gènes de structure avec le phosphorelais BceRS. De plus, lorsque le pool cellulaire d'UPP diminue (lorsque la phosphatase BcrC est surproduite), et en présence de bacitracine, l'expression du gène bceA diminue également. Ceci montre que l'UPP participe, avec la bacitracine, au stimulus du système BceRSAB. Notre hypothèse de travail est que le transporteur ABC, prédit comme étant un exporteur, prend en charge le complexe UPP/bacitracine et agit comme une flippase pour créer une dissymétrie membranaire ressentie par le senseur BceS. Il n'est pas exclu, qu'en présence de bacitracine, le transporteur BceAB puisse interagir avec le senseur BceS pour permettre l'activation du système.

La majeure partie des bactéries du groupe des Firmicutes possède, d'une part, des protéines similaires à BcrC, et, d'autre part, des systèmes similaires au système BceRSAB. Toutes les protéines « BcrC-like » ont un motif caractéristique permettant de les classer dans la famille des phosphatases de type PAP2. Il est tentant de penser qu'elles sont toutes des UPP phosphatases assurant une des étapes clés de la synthèse du peptidoglycane.
Par ailleurs, les deux autres systèmes « Bce-like » de B. subtilis, YvcPQRS et YxdJKLM, sont également activés en présence d'antibiotiques ciblant l'enveloppe bactérienne et nous savons que le transporteur ABC YvcRS est aussi impliqué dans le mécanisme de régulation. Nous proposons donc que les systèmes « Bce-like » des Firmicutes sont tous des systèmes de détoxification dirigés contre des antibiotiques ciblant l'enveloppe bactérienne.

Erwinia chrysanthemi est une entérobactérie phytopathogène responsable de la formation d'une pourriture molle sur un large spectre de plantes hôtes. Sa virulence dépend principalement de la sécrétion d'exoenzymes (dont les pectinases et cellulases) qui vont dégrader la paroi des cellules végétales. L'objectif de cette thèse est de participer à la compréhension du rôle du périplasme dans la perception de l'environnement par la bactérie. Nous avons caractérisé génétiquement et biochimiquement le locus gan codant 9 protéines impliquées dans le transport et la dégradation des ß-galactanes (un des composants de la pectine). Les OPG (glucanes périplasmiques osmorégulés) sont essentiels pour la virulence d'E. chrysanthemi puisqu'un mutant opgG incapable de les synthétiser présente un phénotype pléïotrope dont la perte de virulence. Une mutation suppressive de la mutation opgG localisée dans le gène rcsC a été obtenue au laboratoire. Nous avons voulu préciser le rôle du système à deux composants RcsCDB dans le pouvoir pathogène de la bactérie. La mutation rcsC2 conduit à une diminution de la phosphorylation du régulateur RcsB due à une augmentation de l'activité phosphatase de RcsC. Pourtant RcsB n'est pas essentielle pour la virulence. Nous avons également montré que l'expression des gènes régulés par le système RcsCDB est influencée par la quantité des OPG. Une faible surexpression d'une version soluble de RcsF engendre une activation du système Rcs et que la faible surexpression de DjlA et IgaA n'a pas d'effet significatif. Enfin, nous avons entrepris de caractériser la structure de RcsF par mutagenèse dirigée
Erwinia chrysanthemi is a phytopathogenic enterobacterium causing soft rot disease in a wide range of plant species. The maceration of plant tissues is essentially caused by the secretion of a set of plant cell wall degrading enzymes (including pectinases and cellulases). The aim is to participate to the understanding of the role of the periplasm in environment perception by bacteria. We characterised genetically and biochemically the gan locus encoding 9 proteins involved in galactan transport and catabolism (galactan is a pectic component). Osmoregulated periplasmic glucans (OPGs) are essential for E. chrysanthemi pathogenicity. An opgG mutant lacks OPGs and shows a pleiotropic phenotype including nonvirulence. A rcsC point mutation (rcsC2) suppresses the phenotype induced by OPGs defect. We wanted to clarify the role of the Rcs system in pathogenicity. The rcsC2 mutation leads to the reduction of transcriptional activity of RcsB caused by an increase of phosphatase activity of RcsC. Mutations in RcsCDB proteins show that RcsB is not essential to virulence. We have shown that genes expression regulated by RcsCBD phosphorelay is influenced by the quantity of OPGs in the periplasm. An ectopic overexpression of a soluble version of RcsF leads to a RcsCDB phosphorelay activation, while an ectopic overexpression of DjlA and IgaA has no significatives effects. Finally, we have characterized RcsF structures by site-directed mutagenesis and deletion mutagenesis

Under conditions of nutrient limitation, Bacillus subtilis cells terminally differentiate into a dormant spore state. Progression to sporulation is controlled by a genetic circuit structured as a phosphorelay embedded in multiple transcriptional feedback loops, and which is used to activate the master regulator Spo0A by phosphorylation. These transcriptional regulatory interactions are 'bandpass'-like, in the sense that activation occurs within a limited band of Spo0A~P concentrations, and have recently been shown to pulse in a cell-cycle-dependent fashion. Additionally, the core phosphorelay is an architectural variant of the canonical two-component signaling system, which allows signal integration from a larger number of inputs, including two types of phosphatases that act on different protein components. However, the impact of these pulsed bandpass interactions on the circuit dynamics preceding sporulation and the utility of two types of phosphatases remains unclear. In order to address these questions, we measured key features of the bandpass interactions at the single-cell level and analyzed them in the context of a simple mathematical model. The model predicted the emergence of a delayed phase shift between the pulsing activity of the different sporulation genes, as well as the existence of a stable state, with elevated Spo0A activity but no sporulation, embedded within the dynamical structure of the system. To test the model, we used time-lapse fluorescence microscopy to measure dynamics of single cells initiating sporulation. We observed the delayed phase shift emerging during the progression to sporulation, while a re-engineering of the sporulation circuit revealed behavior resembling the predicted additional state. The core phosphorelay model also showed a post-translational bandpass response, and we find that the two types of phosphatases can independently tune the two bandpass thresholds. These results show that periodically-driven bandpass feedback loops can give rise to complex dynamics in the progression towards sporulation, and that similar inputs can tune different response features.

碩士
國立交通大學
生物科技系所
92
Pseudomonas aeruginosa PAO1 is an opportunistic pathogen, and owns great capability to adapt versatile environment. There are 123 genes encoding two-component system components in the bacteria, which serve as a stimulus-response coupling machinery allowing the organism sense and respond to the changes in environment. The system has been classified into three types: the classical system, the unorthodox system, and the hybrid system. We focus on the hybrid system which consists of a histidine kinase (HK) without output domain, a separated Histidine-containing phosphotransfer (Hpt) molecule, and a response regulator (RR). In order to demonstrate the role of Hpt modules in signaling phosphorelay, the gene fragments corresponding to each of the Hpt domain and one hybrid sensor (PA1611) and two RRs (PA3346 and PA0034) were amplified by PCR and subcloned respectively into pET30 expression vector. The recombinant proteins were expressed in E. coli and the proteins purified by His-Bind nickel column for the phosphorylation assays. The assay demonstrated a specific phosphoryl transfer from sensor kinase PA1611 to HptB and then to PA3346. However, using yeast two-hybrid screening failed to identify the protein interactions. Sequence comparisons of several Pseudomonas species revealed that the genome DNA contains the HptB homolog flanking by a flagella biosynthesis gene cluster. To identify the functional role of HptB, hptB mutant was constructed by homologous recombination. The hptB mutant showed a decrease of growth rate decreased in a nutrient limiting condition. The hptB mutation also affected the biofilm formation with a 2-fold higher activity than that of the wild type strain in a minimal medium supplemented with carbon and nitrogen source. A reducing swimming capability and an increase of twitching motility were also found in hptB mutant. Taken together, the HptB is likely mediated the signaling involved in flagella biosynthesis and regulation.

博士
國立清華大學
分子醫學研究所
97
This thesis contains two major topics. The first one is “Characterization of the histidine-containing phosphotransfer (Hpt) protein B�{mediated multi-step phosphorelay system in Pseudomonas aeruginosa PAO1” and the second one is “The ATP-binding motif in AcoK is required for regulation of acetoin catabolism in Klebsiella pneumoniae CG43”. Pseudomonas aeruginosa is a gram-negative pathogen causing many acute and chronic infections, particularly in hospitalized individuals. It contains three genes that encode proteins with an Hpt domain but lack a kinase domain. Hpt proteins are signal mediators between hybrid sensors and response regulators. The proteins play a crucial role in directing signal transduction in bacteria, yeasts and plants. The study in first topic demonstrates that the Pseudomonas aeruginosa HptB-mediated signaling system consists of four orphan sensor kinases, HptB, and a specific response regulator, PA3346. We also present evidence of phosphatase activity of PA3346 on its neighboring gene product, PA3347. Finally, the swarming and biofilm forming activites of hptB, PA3346, and PA3347 knockout mutants are described. The second part of this thesis is to characterize a transcriptional factor AcoK in the regulation of acetoin catabolism. Many bacterial species utilize acetoin as a carbon source. The compound is oxidized by acetoin dehydrogenase encoded by acoABCD operon in Klebsiella pneumoniae. Previously, we have shown the expression of this operon is induced by acetoin through AcoK, the product of a gene located immediately upstream of acoABCD. AcoK contains a helix-turn-helix DNA binding domain of the LuxR transcription activator family at the C-terminal region and putative Walker A and B nucleotide binding motifs at N-terminal portion. The goal of the second study is to understand the contribution of different domains, in particular the nucleotide binding motif, in AcoK on its transcriptional activity. A number of truncations and site-directed mutations were constructed on AcoK and the biochemical and trans-activation activities of the resulting proteins were determined and reported herein. A mutation in the putative Walker A motif resulted in a significant reduction of ATP hydrolysis and trans-activation activity of AcoK on acoABCD expression, presumably was due to the loss of ATP-binding ability. The transcription factor bound specifically to a region comprising nucleotide -66 to -36 of the acoABCD promoter, although the DNA binding ability was not affected by the Walker A motif mutation. Together, this study provides an additional example in how a member of the Signal Transduction ATPases with Numerous Domains family activates its target gene expression.