Дисертації з теми "Perméabilisation de la membrane des lysosomes"

Les lysosomes jouent un rôle central dans la régulation des processus anaboliques et cataboliques, la signalisation cellulaire ainsi que dans la mise en œuvre des programmes transcriptionnels au sein des cellules. Ils favorisent l’adaptation des cellules cancéreuses lors des variations du microenvironnement en leur fournissant les métabolites essentiels et l’énergie nécessaire à leur survie et à leur prolifération. Un acteur majeur dans la réponse adaptative des lysosomes est le facteur de transcription EB (TFEB). TFEB coordonne l’expression de gènes associés à la fonction et à la biogenèse des lysosomes, y compris ceux impliqués dans l’autophagie, un processus catabolique majeur des cellules qui dépend des lysosomes. TFEB et l’autophagie fonctionnent comme des mécanismes adaptatifs visant à rétablir l’homéostasie cellulaire en réponse à un stress. Cependant, la biogenèse des lysosomes et l'augmentation de leur taille induite par TFEB peuvent rendre les cellules cancéreuses plus vulnérables aux composés ciblant les lysosomes. Cette vulnérabilité ouvre la porte au développement de nouvelles stratégies pour lutter contre le cancer en ciblant simultanément les lysosomes et en activant TFEB. L’objectif initial de cette étude a été de découvrir de nouveaux agents pharmacologiques agonistes de TFEB, manifestant une cytotoxicité significative contre les cellules cancéreuses. Par un criblage de la bibliothèque Prestwick comprenant 1200 composés approuvés par la « Food and Drug Administration » (FDA), nous avons identifié deux antidépresseurs, la sertraline et l’indatraline, qui agissent en tant que puissants activateurs de la translocation de TFEB vers le noyau. Les deux composés induisent une accumulation de cholestérol au sein des lysosomes, entraînant la perméabilisation de leurs membranes et une perturbation du flux autophagique. L’analyse de modélisation moléculaire a révélé que les deux composés pourraient inhiber le trafic du cholestérol en se liant au site de fixation du cholestérol des transporteurs, Niemann-Pick type C1 (NPC1) et NPC2. Dans les cellules cancéreuses, la sertraline et l’indatraline provoquent une mort cellulaire immunogénique, en transformant les cellules mourantes en vaccins prophylactiques capables de protéger contre la croissance tumorale chez la souris. Dans un contexte thérapeutique, une dose unique de ces composés était suffisante pour ralentir de façon significative la croissance tumorale de manière dépendante des lymphocytes T. Ces résultats caractérisent la sertraline et l’indatraline comme des agents immunostimulants qui agissent à travers un mécanisme novateur connectant l’accumulation du cholestérol lysosomal aux dommages lysosomaux, entraînant ainsi la mort immunogénique des cellules cancéreuses. Ces résultats soutiennent le repositionnement de ces deux molécules en tant qu’agents immunostimulants pour le traitement du cancer et encouragent l’extension de cette étude à d’autres inhibiteurs du transport lysosomal du cholestérol
Lysosomes serve as an intracellular platform that coordinates anabolic and catabolic processes, cell signaling, and transcriptional programs. These organelles allow the adaptation of cancer cells to a changing microenvironment by supplying them with essential metabolites and energy for their survival and proliferation. A major player in the lysosomal adaptive response is the transcription factor EB (TFEB), which is part of the microphthalmia/transcription factor E (MIT/TFE) family of transcription factors. TFEB plays a pivotal role in driving the expression of several genes associated with lysosome function and biogenesis, including those participating in autophagy. The latter is a critical lysosomal catabolic process in the cell. While TFEB and autophagy function as adaptive mechanisms to reestablish cellular homeostasis in response to stressors, TFEB-induced lysosomal biogenesis and enlargement can render cancer cells more vulnerable to compounds targeting lysosomes. This vulnerability opens the door for developing new strategies to combat cancers by simultaneously targeting the lysosome and activating TFEB. This study initially aimed to uncover novel pharmacological agents that function as agonists of TFEB and exhibit substantial cytotoxicity against cancer cells. By conducting cell-based drug screening of the Prestwick library, consisting of 1200 Food and Drug Administration (FDA)-approved compounds, we identified two antidepressants, sertraline and indatraline, as potent inducers of TFEB nuclear translocation. Both compounds promoted cholesterol accumulation within lysosomes, resulting in lysosomal membrane permeabilization, disruption of autophagy, and cell death. Molecular docking analysis unveiled that indatraline and sertraline may inhibit cholesterol traffic by binding to the same cavity where cholesterol typically binds to the lysosomal cholesterol transporters, Niemann-Pick type C1 (NPC1) and NPC2. In cancer cells, sertraline and indatraline elicited immunogenic cell death, converting dying cells into prophylactic vaccines that were able to protect against tumor growth in mice. In a therapeutic setting, a single dose of each compound was sufficient to significantly reduce the outgrowth of established tumors in a T cell-dependent manner. These results identify sertraline and indatraline as immunostimulatory agents that operate through a novel mechanism that connects lysosomal cholesterol accumulation to lysosomal membrane permeabilization, ultimately leading to immunogenic cell death. These results support the repositioning of sertraline and indatraline as immunostimulatory agents for cancer treatment and encourage the broadening of this study to other lysosomal cholesterol transport inhibitors

La perméabilisation de la membrane lipidique est actuellement un domaine de recherche important, puisque l'optimisation du transport des petites molécules (comme l'ADN ou les protéines) dans les cellules est nécessaire. Dans ce travail, nous tentons une contribution dans ce domaine en proposant une méthode de perméabilisation contrôlée à l'aide des Azobenzene Modified Polymers (AMP). Des copolymères avec un taux d'hydrophobicité modéré ont été montrés dans le passé comme perméabilisant la membrane. Les AMP nous permettraient alors de contrôler cette perméabilisation via le contrôle de leur taux d'hydrophobicité (selon la longueur d'onde de la lumière à laquelle ils sont illuminés). Cette hypothèse a été vérifiée à l'aide des vésicules géantes unilamellaires (GUV) encapsulant des sondes fluorescentes solubles. La cinétique de la fuite de ces sondes en combinaison avec des expériences d'électrophysiologie sur des films noirs (BLM) nous donne accès à une meilleure caractérisation des structures de perméation créées par l'interaction entre l'AMP et les lipides. En outre, des expériences ont été réalisées sur des cellules CHO (Chinese Hamster Overy). La possibilité de faire rentrer dans les cellules des molécules qui a priori n'y sont pas internalisées a été étudiée. Par ailleurs, la fuite de molécules encapsulées dans les cellules et sa cinétique ont été examinées

Ca2+ is a universal and versatile intracellular messenger, regulating a vast array of biological processes due to variations in the frequency, amplitude, spatial and temporal dynamics of Ca2+ signals. Increases in cytosolic free Ca2+ concentration ([Ca2+]c) are due to influx from either an infinite extracellular Ca2+ pool or from the more limited intracellular Ca2+ stores. Stimulation of the endogenous muscarinic (M3) receptors of human embryonic kidney (HEK) cells with carbachol results in the activation of phospholipase C (PLC) and formation of inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3), activation of IP3 receptors (IP3Rs), release of Ca2+ from the endoplasmic reticulum (ER), and activation of store-operated Ca2+ entry (SOCE). Lysosomes are the core digestive compartments of the cell, but their importance as signalling organelles is also now widely appreciated. Accumulating evidence indicates that lysosomal Ca2+ is important for their physiological functions. Lysosomal Ca2+ release triggers fusion during membrane trafficking and, through calmodulin, it regulates lysosome size. Luminal Ca2+ is critical for regulation of lysosomal biogenesis and autophagy during starvation through the transcription factor, TFEB. Furthermore, aberrant lysosomal Ca2+ is associated with some lysosomal storage diseases. Lysosomes in mammalian cells have long been suggested to accumulate Ca2+ via a low-affinity Ca2+-H+ exchanger (CAX). This is consistent with evidence that dissipating the lysosomal H+ gradient increased [Ca2+]c and decreased lysosomal free [Ca2+], and with the observation that lysosomal Ca2+ uptake was followed by an increase in pHly. Furthermore, heterologous expression of Xenopus CAX in mammalian cells attenuated carbachol-evoked Ca2+ signals. However, there is no known CAX in mammalian cells, and so the identity of the lysosomal Ca2+ uptake pathway in mammalian cells is unresolved. Using mammalian cells loaded with a fluorescent Ca2+ indicator, I show that dissipating the pHly gradient pharmacologically or by siRNA-mediated knockdown of an essential subunit of the H+ pump, increases the amplitude of IP3-evoked cytosolic Ca2+ signals without affecting those evoked by SOCE. A genetically encoded low-affinity Ca2+ sensor expressed on the lysosome surface reports larger increases in [Ca2+]c than the cytosolic sensor, but only when the Ca2+ signals are evoked by IP3R rather than SOCE. Using cells expressing single IP3R subtypes, I demonstrate that each of the three IP3R subtypes can deliver Ca2+ to lysosomes. I conclude that IP3Rs release Ca2+ within near-lysosome microdomains that fuel a low-affinity lysosomal Ca2+ uptake system. The temporal relationship between the increase in pHly and reduced Ca2+ sequestration suggests that pHly affects the organization of the microdomain rather than the Ca2+ uptake mechanism. I show that abrogation of the lysosome H+ gradient does not acutely prevent uptake of Ca2+ into lysosomes, but disrupts junctions with the ER where the exchange of Ca2+ occurs. The dipeptide, glycyl-L-phenylalanine 2-naphthylamide (L-GPN), is much used to disrupt lysosomes and release Ca2+ from them. The mechanism is widely assumed to require cleavage of GPN by cathepsin C, causing accumulation of amino acid residues, and osmotic lysis of lysosomal membranes. I show, using LysoTracker Red and Oregon Green-dextran to report pHly, that L-GPN is effective in HEK cells lacking functional cathepsin C, following CRISPR-Cas9-mediated gene disruption. Furthermore, D-GPN, which is resistant to cleavage by cathepsin C, is as effective as L-GPN at increasing pHly, and it is similarly effective in cells with and without cathepsin C. L-GPN and D-GPN increase cytosolic pH, and the effect is similar when the lysosomal V-ATPase is inhibited with bafilomycin A1. This is not consistent with GPN releasing the acidic contents of lysosomes. I conclude that the effects of GPN on lysosomes are not mediated by cathepsin C. Both L-GPN and D-GPN evoke Ca2+ release, the response is unaffected by inhibition or knock-out of cathepsin C, but it requires Ca2+ within the ER. GPN-evoked increases in [Ca2+]c require Ca2+ within the ER, but they are not mediated by ER Ca2+ channels amplifying Ca2+ release from lysosomes. GPN increases [Ca2+]c by increasing pHcyt, which then directly stimulates Ca2+ release from the ER. I conclude that physiologically relevant increases in pHcyt stimulate Ca2+ release from the ER independent of IP3 and ryanodine receptors, and that GPN does not selectively target lysosomes. I conclude that all three IP3R subtypes selectively deliver Ca2+ to lysosomes, and that the low pH within lysosomes is required to maintain the junctions between ER and lysosomes, but not for lysosomal Ca2+ uptake. I suggest that GPN lacks the specificity required to allow selective release of Ca2+ from lysosomes.

In the last decade, a tremendous gain in knowledge concerning the molecular events of apoptosis signaling and execution has been achieved. The aim of this thesis was to clarify the role of lysosomal membrane permeabilization and lysosomal proteases, cathepsins, in signaling for apoptosis. We identified cathepsin D as an important factor in staurosporine-induced human fibroblast cell death. After release to the cytosol, cathepsin D promoted mitochondrial release of cytochrome c by proteolytic activation of Bid. Cathepsin D-mediated cleavage of Bid generated two fragments with the apparent molecular mass of 15 and 19 kDa. By sequence analysis, three cathepsin D-specific cleavage sites, Phe24, Trp48, and Phe183, were identified. Moreover, we investigated the mechanism by which cathepsins escape the lysosomal compartment, and found that Bax is translocated from the cytosol to lysosomes upon staurosporine treatment. In agreement with these data, recombinant Bax triggered release of cathepsins from isolated rat liver lysosomes. Conceivably, the Bcl-2 family of proteins may govern release of pro-apoptotic factors from both lysosomes and mitochondria. The importance of lysosomal cathepsins in apoptosis signaling was studied also in oral squamous cell carcinoma cells following exposure to the redox-cycling drug naphthazarin or agonistic anti-Fas antibodies. In this experimental system, cathepsins were released to the cytosol, however, inhibition of neither cathepsin D, nor cysteine cathepsin activity suppressed cell death. Interestingly, cysteine cathepsins still appeared to be involved in activation of the caspase cascade. Cathepsins are often overexpressed and secreted by cancer cells, and it has been reported that extracellular cathepsins promote tumor growth and metastasis. Here, we propose that cathepsin B secreted from cancer cells may suppress cancer cell death by shedding of the Fas death receptor. Defects in the regulation of apoptosis contribute to a wide variety of diseases, such as cancer, neurodegeneration and autoimmunity. Increased knowledge of the molecular details of apoptosis could lead to novel, more effective, treatments for these illnesses. This thesis emphasizes the importance of the lysosomal death pathway, which is a promising target for future therapeutic intervention.
In the last decade, a tremendous gain in knowledge concerning the molecular events of apoptosis signaling and execution has been achieved. The aim of this thesis was to clarify the role of lysosomal membrane permeabilization and lysosomal proteases, cathepsins, in signaling for apoptosis. We identified cathepsin D as an important factor in staurosporine-induced human fibroblast cell death. After release to the cytosol, cathepsin D promoted mitochondrial release of cytochrome c by proteolytic activation of Bid. Cathepsin D-mediated cleavage of Bid generated two fragments with the apparent molecular mass of 15 and 19 kDa. By sequence analysis, three cathepsin D-specific cleavage sites, Phe24, Trp48, and Phe183, were identified. Moreover, we investigated the mechanism by which cathepsins escape the lysosomal compartment, and found that Bax is translocated from the cytosol to lysosomes upon staurosporine treatment. In agreement with these data, recombinant Bax triggered release of cathepsins from isolated rat liver lysosomes. Conceivably, the Bcl-2 family of proteins may govern release of pro-apoptotic factors from both lysosomes and mitochondria. The importance of lysosomal cathepsins in apoptosis signaling was studied also in oral squamous cell carcinoma cells following exposure to the redox-cycling drug naphthazarin or agonistic anti-Fas antibodies. In this experimental system, cathepsins were released to the cytosol, however, inhibition of neither cathepsin D, nor cysteine cathepsin activity suppressed cell death. Interestingly, cysteine cathepsins still appeared to be involved in activation of the caspase cascade. Cathepsins are often overexpressed and secreted by cancer cells, and it has been reported that extracellular cathepsins promote tumor growth and metastasis. Here, we propose that cathepsin B secreted from cancer cells may suppress cancer cell death by shedding of the Fas death receptor. Defects in the regulation of apoptosis contribute to a wide variety of diseases, such as cancer, neurodegeneration and autoimmunity. Increased knowledge of the molecular details of apoptosis could lead to novel, more effective, treatments for these illnesses. This thesis emphasizes the importance of the lysosomal death pathway, which is a promising target for future therapeutic intervention.

Il est possible de perméabiliser la membrane plasmique des cellules par des agents chimiques (tels que les polyéthylènes glycols ou le diméthylsulfoxyde) ou par des agents physiques (tels que les ultrasons ou les impulsions électriques). Cette perméabilisation peut être réversible ou non, ce qui signifie qu’après la perméabilisation, la membrane retrouve son intégrité et ses propriétés d’hémi-perméabilité ou pas. Ces techniques peuvent être utilisées pour faire rentrer des médicaments ou des acides nucléiques dans les cellules ou pour générer des fusions cellulaires. Une approche récente, la dynamique moléculaire, utilise des simulations numériques pour prédire les effets des agents perméabilisants sur les membranes à l’échelle moléculaire, et permet d’apporter de nouvelles données pour comprendre les mécanismes moléculaires, encore peu connus à ce jour.Les impulsions dites « classiques » en électroperméabilisation, de l’ordre de la dizaine de millisecondes à la centaine de microsecondes et d’amplitude de champ de l’ordre de 100 kV/m, perméabilisent la membrane plasmique uniquement. Cependant, récemment, des impulsions plus courtes, dites impulsions nanoseconde (quelques nanosecondes) et de plus grande amplitude de champ (de l’ordre de 10 MV/m) ont été utilisées et permettent d’affecter également les membranes des organites cellulaires. Les travaux de cette thèse portent dans un premier temps sur les effets perméabilisants d’un agent chimique (le diméthylsulfoxyde, DMSO) en comparant les modèles prédictifs de la dynamique moléculaire avec des expériences in vitro sur des cellules. Le modèle numérique prédit trois régimes d’action en fonction de la concentration du DMSO. Utilisé à faible concentration, il y a déformation de la membrane plasmique. L’utilisation d’une concentration intermédiaire entraîne la formation de pores membranaires et les fortes concentrations de DMSO ont pour conséquence la destruction de la membrane. Les expériences in vitro faites sur des cellules ont confirmé ces résultats en suivant l’entrée de marqueurs de perméabilisation. Cette étude a été comparée avec la perméabilisation par un agent physique (les impulsions électriques). Dans un deuxième temps, ces travaux traitent du développement et de l’utilisation d’un nouveau dispositif d’exposition des cellules aux impulsions nanoseconde qui permet d’appliquer des champs électriques très élevés et d’observer par microscopie leurs au niveau cellulaire. Pour finir, ce dispositif a été utilisé avec des impulsions nanoseconde pour générer des pics calciques dans de cellules souches mésenchymateuses qui présentent des oscillations calciques spontanées liées à leur état de différenciation. Ces pics induits sont dus à la libération de calcium stocké dans les organites et/ou à la perméabilisation de la membrane plasmique permettant l’établissement d’un flux de calcium intramembranaire. Il est aussi possible d’utiliser des impulsions microseconde pour générer des pics calciques dans ces cellules. Dans ce cas, les pics calciques ne sont dus qu’à la perméabilisation de la membrane plasmique. En jouant sur l’amplitude des champs électriques appliqués et sur la présence ou l’absence de calcium externe, il est possible de manipuler les concentrations calciques cytosoliques en mobilisant le calcium interne ou externe. Une des particularités de ces nouveaux outils est de pouvoir être déclenchés et arrêtés instantanément, sans réminiscence, contrairement aux molécules chimiques permettant de produire des pics calciques. Ces outils pourraient donc permettre de mieux comprendre l’implication du calcium dans des mécanismes comme la différenciation, la migration ou la fécondation
It is possible to permeabilize the cellular plasma membrane by using chemical agents (as polyethylen glycols or diméthylsulfoxyde) or physical agents (as ulstrasounds or electric pulses). This permeabilization can be reversible or not, meaning that after the permeabilization, the membrane recovers its integrity and its hemi-permeable properties. These techniques can be used for the uptake of medicines or nucleic acids or to generate cellular fusions. A recent approach, the molecular dynamics, uses numerical simulations to predict the effects of permeabilizing agents at the molecular scale, allowed generating of new data to understand the molecular mechanisms that are not completely known yet.The pulses so called “classical” in electropermeabilization, from the range of the ten of milliseconds to the hundred of microseconds and with a field amplitude in the range of 100 kV/m, can only permeabilize the plasma membrane. However, more recently, shorter pulses, so called nanopulses (few nanosecondes) and with an higher field amplitude (in the range of 10 MV/m) have been used and allow to affect also cellular organelles membranes.This thesis is, in a first time, about the permeabilizing effects of a chemical gent (the diméthylsulfoxyde, DMSO) by comparing predictive models from molecular dynamics with experiments in vitro on cells. The numerical model predicts three regimes of action depending on the DMSO concentration. Used at low concentration, there is a plasma membrane deformation. The use of an intermediate concentration lead to membrane pores formation and higher DMSO concentrations resulted in membrane destruction. The experiments done in vitro on cells confirmed these results using the following of permeabilization markers. This study has been compared to permeabilization due to a physical agent (electric pulses).Secondly, it is about the development and the use of a new cell exposure device for nanopulses that permit to apply very high electric fields and to observe induced cellular effects simultaneously by microscopy.To finish, this device has been used with nanopulses to generate calcium peaks in mesenchymal stem cells that are presenting spontaneous calcium oscillations in correlation to their differentiation state.. These induced peaks are due to the release of the calcium stored in organelles and/or to plasma membrane permeabilization leading to a intramembrane calcium flux establishment. It is also possible to use microsecond pulses to generate calcium peaks in these cells. In this case, the calcium peaks are due to the plasma membrane permeabilization . By changing the amplitude of the applied electric fields and the presence or the absence of external calcium, it is possible to manipulate cytosolic calcium concentrations by mobilizing internal or external calcium. One feature of these new tools is to be triggered and stopped instantly without reminiscence, unlike chemical molecules permitting the production of calcium peaks. These tools could therefore lead to a better understanding of the involvement of calcium in mechanisms such as differentiation, migration or fertilization

Depuis plusieurs années, de nouvelles méthodologies basées sur l’utilisation du champ électrique pour agir ou caractériser les cellules ou les tissus cellulaires génèrent de nombreuses avancées et apportent des nouvelles promesses dans les laboratoires de recherche et dans l'industrie : diagnostic de cancer, ElectroChimioThérapie (insertion d’un médicament en perméabilisant les membranes des cellules), thérapie génique (insertion d’un gène thérapeutique), immunothérapie (vaccins anti-tumoraux obtenus par électrofusion de cellules dendritiques et cellules cancéreuses pour réactiver le système immunitaire).L’application d’ impulsions électriques à des cellules ou dans des tissus cellulaires induit un changement sur leurs propriétés, en particulier sur leurs membranes qui deviennent transitoirement perméables, laissant temporairement le passage aux ions et macro-molécules. Les phénomènes induits lors d’une perméabilisation par application de champ électrique ont été partiellement caractérisés en microscopie epi-fluorescence. Pour effectuer un suivi en temps réel de la dynamique du processus de l’électroperméabilisation, une voie prometteuse consiste à caractériser électriquement l’échantillon. Dans cet objectif, mon travail de thèse consiste à mettre en oeuvre le suivi en temps réel de l’évolution des caractéristiques électriques sur une large bande de fréquences d’un tissu cellulaire ou d’une cellule isolée, avant, pendant et après la sollicitation par un champ électrique pulsé.Dans le cadre de ma thèse un modèle du système biologique et de son environnement a été élaboré, afin de mieux décrire des phénomènes observés expérimentalement: effet des sollicitations électriques sur la viabilité cellulaire, sur la perméabilité de la membrane externe, effets induits sur les composés intracellulaires, dynamique de fusion membranaire. Le degré de perméabilisation de l’objet biologique (cellule ou tissu) dépend de manière fortement non-linéaire de nombreux paramètres, ce qui rend complexe l’élaboration de ce modèle et son interprétation. La détection de ce niveau de perméabilisation est effectuée en temps réel (mesure du niveau de perméabilisation avant, pendant et après l’application de l’impulsion électrique). In fine cette approche devrait permettre d’optimiser le taux de perméabilisation cellulaire en fonction de l’application considérée. Ce système de contrôle individuel du niveau de perméabilisation cellulaire pourrait à terme être parallélisé massivement sur une puce dédiée à l’électroporation d’un grand nombre de cellules. Afin d’avoir une vision multi-échelle des effets, l’étude a été menée sur plusieurs modèles expérimentaux: qui vont du tissu (échelle millimétrique) à la cellule unique, en passant par les échelles intermédiaires (caractérisation de spéroides cellulaires).Dans ces deux derniers cas (sphéroide, cellule unique) l’objet biologique est isolé dans une biopuce microfluidique équipée d’électrodes de mesure et d’application du champ (échelle micrométrique).Les micro-dispositifs que j’ai réalisé pour caractériser en temps réel la perméabilisation de cellules, intègrent une géométrie spécifique d’électrodes, ainsi que d'un réseau de canaux microfluidiques pour contrôler le débit de cellules Le degré de miniaturisation de ces puces permet de travailler au niveau de la cellule unique, et appliquer des champs électriques de forte amplitude, de forte fréquence, localisés spatialement
The increasing interest for new methodologies based on the use of the electric field to characterize the cells or tissue cells and generate brought promising development in research laboratories and industry: cancer diagnosis, electrochemotherapy (insertion of a drug after cell membranes permeabilization), gene therapy (insertion of a therapeutic gene), immunotherapy (anti-tumor vaccines obtained by electrofusion of dendritic cells and cancer cells to activate the immune system).The application of electrical pulses to cells or cell tissues induces a change in their properties, in particular on their membranes which become transiently permeable, and temporarily allow the passage of ions and macromolecules. Effect linked to the permeabilization phenomenon have been partially characterized by epi-fluorescence microscopy. Nevertheless, in order to perform the real-time monitoring of the electroporation process and know its dynamics, the electrical sample characterization is employed. Thus the aim of this work is to implement a real-time monitoring of dielectrical characteristics changes, on a wide frequency range, of a cellular tissue or a single cell, before, during and after the pulsed electric field application.As part of my thesis a model of the biological system has been developed to better describe the phenomena observed experimentally: effect of electrical stress on cell viability, on the permeability of the outer membrane, induced effects on the intracellular compounds, dynamics of membrane fusion.The degree of permeabilization of the biological sample (cells or tissues) is non linearly dependent of several parameters, which makes complicated the development of the model and its interpretation.The detection of a specific level of permeabilization is done in real time (measure of the level of permeabilization before, during and after the electric pulses application). This cell permeabilization level control could eventually be parallelized on a chip dedicated to the electroporation of a large number of cells. The latter can be used to optimize the electric pulses parameters in order to reach the desired permeabilization level. In order to have a multi-scale overview of the phenomenon, the study was performed on different size-level: from the tissue level (millimeter scale) to the single cell model through the intermediate scales (cell spéroides characterization).In the latter two cases (spheroid, single cell) the biological sample is isolated in a microfluidic biochip where the electric field solicitation are applied (micrometer scale).The microdevice designed and fabricated during this work, allows the real time characterization of the cell permeabilization. Furthermore the miniaturization of the system is crucial to work at the level of the single cell, and make possible the application of electrical fields of high amplitude, high frequency and spatially localized

L'électroperméabilisation est une méthode établie pour permettre l'internalisation des molécules exogènes dans les cellules en suspension et dans les tissus. Dans beaucoup d'applications, expérimentales et cliniques, il est très important que le pourcentage des cellules perméabilisées, le pourcentage des cellules survivantes, et souvent aussi la quantité de molécules internalisées, soient tous aussi élevés que possible. Pour améliorer l'efficacité des protocoles d'électroperméabilisation, le rôle de l'amplitude, de la durée et du nombre d'impulsions ont été étudiés en détail. Par contre, les études de l'influence de la forme de l'impulsion sur l'efficacité de l'électroperméabilisation ont été très rares, ce qui est en partie dû au manque de générateurs d'impulsions de haut voltage d'une forme autre qu'exponentielle ou rectangulaire. Le but principal de la recherche décrite dans cette thèse était d'étudier le rôle de la forme des impulsions dans l'efficacité de l'électroperméabilisation des cellules en suspension. Pour établir une base théorique pour les études expérimentales, nous avons développé une méthode d'analyse du voltage transmembranaire induit par des champs électriques qui varient au cours du temps. Nous avons également analysé le rôle des conductivités du milieu extracellulaire, de la membrane et du cytoplasme, et aussi du rayon et de la forme des cellules sur le voltage transmembranaire induit. Pour générer des impulsions ayant différentes formes, nous avons construit un système composé d'un générateur de fonctions programmable commercial et d'un amplificateur bipolaire à haute fréquence et à haut voltage. Concernant la détermination du pourcentage de cellules électroperméabilisées, nous avons développé une nouvelle méthode basée sur la bléomycine, un agent cytotoxique qui ne peut pas diffuser à travers une membrane plasmique intacte et qui mène ainsi à la mort sélective des cellules perméabilisées. Cette méthode élimine plusieurs des inconvénients de la méthode la plus communément utilisée, celle basée sur l'iodure de propidium. Nos expériences nous permettent de confirmer que pour des impulsions rectangulaires monophasiques, la perméabilisation augmente et la survie diminue avec l'augmentation de la durée et du nombre d'impulsions. Pour l'internalisation des petites molécules exogènes, nous montrons que le nombre d'impulsions joue un rôle plus important que la durée d'impulsion. Nous montrons aussi que la perméabilisation et l'internalisation des petites molécules exogènes provoquées par les impulsions biphasiques sont augmentées par rapport à des impulsions monophasiques de durée et d'amplitude identiques. Par contre, la survie obtenue avec des impulsions biphasiques est très similaire à celle réalisée par des impulsions monophasiques. Ces effets peuvent être expliqués sur la base de l'asymétrie du voltage transmembranaire total en raison du voltage transmembranaire de repos. Les impulsions biphasiques compensent cette asymétrie, et en plus elles permettent de délivrer une charge équilibrée au niveau des électrodes, réduisant la contamination électrolytique. Dans la gamme des temps de montée et de descente des impulsions rectangulaires de 2 µs à 100 µs, nous n'avons trouvé aucune influence de ces temps dans l'efficacité de l'électroperméabilisation. Nos résultats suggèrent aussi qu'un des paramètres très importants pour l'électroperméabilisation est la durée sans interruption pendant laquelle l'impulsion dépasse une certaine intensité critique.

Le rayonnement térahertz se situe dans la gamme électromagnétique entre l'infrarouge lointain et les micro-ondes, correspondant à des fréquences comprises entre 0.1 et 10 THz. Cette zone spectrale est à l'heure actuelle très largement sous-exploitée, mais son application à l’étude d’objets biologiques a déjà montré un fort potentiel, dans la détection de cancers de la peau, le suivi de flux ioniques ou les biosenseurs. Dans le domaine de la biologie, qui nous intéresse particulièrement ici, la gamme des térahertz permet de quantifier et de discriminer des solutés d'intérêt biologique grâce à l'interaction avec les modes basse fréquence de l'eau liquide, et donc d'étudier les biomolécules, les microorganismes et les cellules dans leur environnement physiologique. La première partie de ce travail de thèse a consisté à étudier la dynamique de perméabilisation membranaire de cellules vivantes par réflexion totale atténuée (ATR) avec notre dispositif basé sur un laser femtoseconde et la génération d’impulsions térahertz ultracourtes. Des monocouches de cellules épithéliales MDCK ont été soumises à des concentrations variables de saponine, un détergent creusant des trous dans la membrane cellulaire. Les dynamiques obtenus ont ensuite été comparées à un modèle théorique décrivant le comportement physique de la couche cellulaire, et prenant en compte la diffusion des molécules de détergent ainsi que les caractéristiques physiques de la membrane. Le bon accord entre expérience et théorie nous indique que la perméabilisation membranaire est limitée principalement par la diffusion des molécules de détergent et leur fixation dur la membrane.Dans un second temps, nous avons développé un système totalement nouveau, basé sur une source QCL continue térahertz à 2,5 THz. Ce nouvel instrument est basé sur une conception très simplifiée, avec un seul prisme ATR et un seul détecteur, et sur une double modulation du faisceau térahertz à l'aide d'un hacheur mécanique. Ce hacheur synchronise la double modulation et définis les zones de mesure et de référence. La stabilité à long terme de cet appareil a été grandement améliorée grâce au contrôle précis de la température et de l'humidité à l'intérieur de l'appareil. Les performances sont excellentes tant à court terme qu'à long terme. Un rapport signal/bruit de 30 dB est obtenu sur 300ms, et il reste supérieur à 30 dB pendant plusieurs heures. En outre, une étude théorique et expérimentale a permis de calibrer l'instrument. Ainsi, les coefficients de réflexion ATR de plusieurs solutions d'intérêt biologique (ions, sucres et protéines) ont été obtenus sur une large gamme de concentrations. Une sensibilité au moins 20 fois supérieure à celle de la littérature existante a ainsi été obtenue. Grâce à ce nouveau système très performant, nous avons étudié la dynamique de la perméabilisation des membranes suite à l'action de la thérapie photodynamique (PDT). Les premiers résultats ont montré que l'encapsulation des photosensibilisateurs par des vecteurs micellaires améliore significativement l'efficacité de la PDT
Terahertz radiation is located in the electromagnetic range between far infrared and microwaves, corresponding to frequencies between 0.1 and 10 THz. This spectral range is currently largely under-exploited, but its application to the study of biological objects has already shown a strong potential, in the detection of skin cancer, ion flow monitoring or biosensors. In the field of biology, which is of particular interest to us here, the terahertz range makes it possible to quantify and discriminate solutes of biological interest thanks to the interaction with low-frequency modes of liquid water, and thus to study biomolecules, microorganisms and cells in their physiological environment. The first part of this thesis work consisted in studying the dynamics of membrane permeabilization of living cells by attenuated total reflection (ATR) with our device based on a femtosecond laser and the generation of ultrashort terahertz pulses. Monolayers of MDCK epithelial cells were exposed to varying concentrations of saponin, a detergent that digs holes in the cell membrane. The dynamics obtained were then compared to a theoretical model describing the physical behavior of the cell layer, taking into account the diffusion of detergent molecules and the physical characteristics of the membrane. The good agreement between experiment and theory indicates that membrane permeabilization is limited mainly by the diffusion of detergent molecules and their binding to the membrane.In a second part, we developed a completely new system based on a continuous terahertz QCL source at 2.5 THz. This new instrument is based on a very simplified design, with a single ATR prism and a single detector, and on the dual modulation of the terahertz beam using a mechanical chopper. This chopper synchronizes the dual modulation and defines the measurement and reference zones. The long-term stability of this device has been greatly enhanced by the precise control of temperature and humidity inside the device. Performance is excellent in both the short and long term. A signal-to-noise ratio of 30 dB is achieved over 300ms, and remains above 30 dB for several hours. In addition, a theoretical and experimental study has been carried out to calibrate the instrument. Thus, the ATR reflection coefficients of several solutions of biological interest (ions, sugars and proteins) were obtained over a wide range of concentrations. A sensitivity at least 20 times higher than that of the existing literature was thus obtained. Thanks to this new high-performance system, we studied the dynamics of membrane permeabilization following the action of photodynamic therapy (PDT). The first results showed that the encapsulation of photosensitizers by micellar vectors significantly improves the efficiency of PDT

La perméabilisation de la membrane mitochondriale externe (MOMP) est un évènement décisif lors de la balance entre la vie et la mort de la cellule. Les évènements biochimiques responsables de la MOMP ne sont pas encore complètement définis. Deux mécanismes majeurs et distincts ont été impliqués dans le contrôle de la MOMP: i) l'action des protéines de la famille de Bcl-2, qui peuvent directement s'insérer dans la membrane mitochondriale externe (OMM) et induire l'ouverture de pores; et ii) le pore de transition de perméabilité (PTP), un canal non sélectif de la membrane mitochondriale interne, qui induit un gonflement des mitochondries à la suite d'une ouverture prolongée, suivie d'une éventuelle rupture de la MOM. L'intérêt croissant pour la biologie de la mort cellulaire, entretenu par des contributions significatives d'études sur la levure dans la compréhension des mécanismes biologiques de base, ont amené l'eucaryote unicellulaire Saccharomyces cerevisiae sur le devant de la scène. La levure est dépourvue de certains régulateurs majeurs de l'apoptose, mais possède cependant des homologues des facteurs pro-apoptotiques mitochondriaux, ainsi que des orthologues des composantes moléculaires généralement attribuées au PTP, notamment le l'échangeur ADP/ATP (AAC) et la Porine (Por1). Ces caractéristiques de S. cerevisiae, ainsi que la disponibilité d'outils moléculaires et génétiques, ont fourni une excellente opportunité d'étudier les membres de la famille de Bcl-2 dans un environnement contrôlé, ainsi que la contribution du PTP et de ses composantes à la mort cellulaire. Dans ce travail, la contribution des groupes thiol de l'AAC, leur oxydation, Por1, et la possible interaction entre ces deux protéines, ont été explorées au cours de la mort cellulaire de la levure induite par l'acide acétique. Nous avons observé que l'oxydation de Aac2p, notamment la formation de ponts disulfures, ne contribuait pas au programme de mort induit par l'acide acétique. Cette conclusion est soutenue par l'absence d'un profil particulier d'oxydation d'Aac2p. Néanmoins, il avait été précédemment démontré que l'AAC était requis pour la relocalisation du cytochrome c induite par l'acide acétique, et que son absence promouvait la survie des cellules de levure. Par contre, la délétion de Por1 diminue la viabilité de levures traitées par l'acide acétique. Il a été émis l'hypothèse que les deux protéines participent à la même voie de régulation de la mort cellulaire. Pour la tester, la relocalisation du cytochrome c a été mesurée dans des mitochondries isolées de cellules Δaac1/2/3, Δpor1 et Δaac1/2/3Δpor1 suite à l'exposition à l'acide acétique. Les données obtenues suggèrent que l'absence de Por1 n'affecte pas la relocalisation du cytochrome c pendant la mort cellulaire induite par l'acide acétique, mais pourrait être importante pour sa régulation. Quand à la fois AAC et Por1 sont absentes, les mitochondries de levure peuvent toujours relarguer le cytochrome c, suggérant l'existence d'un mécanisme indépendant de l'AAC. De plus, nous avons montré que les deux protéines ont des effets distincts dans les réponses cellulaires à différents stress. En effet, l'absence des AACs contribue à l'augmentation de la résistance au stress osmotique et de l'intégrité de la paroi cellulaire. Enfin, S.cerevisiae a été utilisé comme modèle pour étudier les aspects mécanistiques relatifs à la fonction des protéines de la famille de Bcl-2. Notamment, nous avons évalué le rôle des sphingolipides sur l'action du régulateur pro-apoptotique humain Bax. Nous avons montré que l'absence de Isc1p, une inositol phospholipase C qui dégrade les sphingolipides complexes en céramides chez la levure, favorise la viabilité de cellules de levures exprimant une forme active de Bax. Nous avons ensuite révélé que cet effet n'est pas associé à des modifications de l'activité de Bax. Il semblerait plutôt que cet effet soit lié aux conséquences cellulaires de l'action de Bax
A decisive event in the cell’s life-or-death decision is the mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP). The biochemical events responsible for MOMP, are not entirely defined. Two major and distinct mechanisms have been implicated in the control of MOMP: i) the action of Bcl-2 family proteins, which can directly engage the outer mitochondria membrane (OMM) and induce the opening of pores; and ii) the mitochondrial permeability transition pore (PTP), an inner membrane unselective channel that induces mitochondria swelling upon long term openings, and eventual rupture of the OMM. The growing interest in cell death biology, fostered by the relevant contributions of yeast to the understanding of basic biological processes, brought the unicellular eukaryote Saccharomyces cerevisiae into the scene. Yeast cells lack some of the major regulators of apoptosis but still possess homologues of mitochondrially enclosed pro-apoptotic factors, as well as orthologues of the molecular components generally ascribed to PTP, including the ADP/ATP carrier (AAC) and Porin (Por1). These particular features of S. cerevisiae, along with the availability of genetic and molecular tools, provided an excellent opportunity to study Bcl-2 family members in a “controlled” environment, or the contribution of the PTP and its components to cell death. In this work, the particular contribution of AAC’s thiol goups, its oxidation, Por1, and of a possible interaction between both proteins to acetic acid-induced yeast cell death, was explored. We observed that oxidative modifications of Aac2p, namely the crosslinking of thiols, do not contribute to the acetic acid-induced cell death program. Such idea is supported by the apparent absence of a particular Aac2p oxidation pattern. Nevertheless, the AAC was previously found to be required for acetic acid-induced cytochrome c release, and its absence promoted the survival of yeast cells. Deletion of Por1, on the other hand, decreased the viability of yeast cells treated with acetic acid. It was hypothesized that the two proteins could share the same pathway in the regulation of cell death. To test it, cytochrome c release was evaluated in mitochondria isolated from Δaac1/2/3, Δpor1 and Δaac1/2/3Δpor1 cells following acetic acid exposure. The data obtained suggest that absence of Por1 does not affect cytochrome c releaseduring acetic acid induced-death, but it may be important for its regulation. When both the AAC and Por1 were absent, yeast mitochondria could still release cytochrome c, raising the possibility of an AAC-independent mechanism. Furthermore, we found both proteins have distinct effects that regulate the cellular response to different stresses. Indeed, absence of the AACs somehow contributed to increased osmotic stress and cell wall resistance. Finally, S. cerevisiae was used as a model to study mechanistic aspects relative to the function of Bcl-2 family proteins. Namely, we assessed the role of sphingolipids in the action of the human pro-apoptotic regulator Bax. We found that absence of Isc1p, an inositol phospholipase C that degrades complex sphingolipids into ceramides in yeast, favored the viability of yeast cells expressing an active form of Bax. It was further revealed that this effect is not associated with changes to the action of Bax; rather, it might be related with the cellular consequences of Bax-action. A parallel with the effect of Uth1p absence in yeast cells expressing Bax suggests that the absence of Isc1p could affect the selective degradation of mitochondria by mitophagy, and thus produce a different cell death response. This work provides new insights into the physiological events underlying the contribution of mitochondrial proteins, previously associated with cell death responses, and sphingolipid metabolism to cell death induced by acetic acid and Bax, respectively. Once again, the yeast S. cerevisiae proved to be an excellent model for the research of cell life and death

Plus d’une soixantaine de protéines différentes sont insérées dans la membrane du lysosome et participent aux différentes fonctions de cet organite. Mais les voies de transport intracellulaire qui mènent les protéines membranaires lysosomales (LMP) jusqu’à cet organite ne sont pas bien comprises. De façon intéressante, certaines LMP présentent des localisations intracellulaires anormales dans certains cancers. C’est notamment le cas de la glycoprotéine LAMP1 qui s’avère surexposée à la surface cellulaire dans plusieurs cancers, où elle y joue plusieurs rôles dans l’agressivité tumorale. Grâce au système RUSH (pour Retention Using Selective Hooks), permettant la synchronisation du transport le long de la voie de sécrétion, nous avons montré que LAMP1, après néosynthèse, passe par la membrane plasmique avant d’accéder aux endosomes. La comparaison des voies empruntées par différentes LMP a aussi permis de révéler que LAMP1 et LIMP2 sont triées au niveau de l’appareil de Golgi, LIMP2 étant concentrée dans des structures vésiculaires caractéristiques et dépourvues de clathrine. Nous avons aussi montré que, de façon surprenante, ce tri au niveau de l’appareil de Golgi est indépendant des signaux de recrutement d’adaptateurs à la clathrine portés dans les queues C-terminales de ces deux LMP. Afin d’étudier quels mécanismes pourraient être impliqués dans la surexposition de LAMP1 à la surface cellulaire de certains cancers, nous avons aussi réalisé un criblage d’inactivation de gènes basé sur la technologie CRISPR-Cas9. Nous avons sélectionné les gènes dont l’inactivation affectait les niveaux de LAMP1 en surface et nous avons obtenu de nombreux gènes candidats qui sont à l’étude
More than sixty different proteins are inserted into the membrane of the lysosome, participating in the various functions of this organelle. But the intracellular trafficking pathways that lead lysosomal membrane proteins (LMPs) to this organelle are not well understood. Interestingly, some LMPs exhibit abnormal intracellular localisations in some cancers. This is the case of the glycoprotein LAMP1 which is overexpressed at the cell surface in several cancers, from where it plays several roles in tumour aggressiveness. Thanks to the Retention Using Selective Hooks (RUSH) system, allowing the synchronisation of the transport along the secretory pathway, we have shown that neosynthesized LAMP1 reaches the plasma membrane before entering endosomes. Comparing the routes followed by different LMPs also revealed that LAMP1 and LIMP2 are sorted at the Golgi apparatus, LIMP2 being concentrated in characteristic vesicular and clathrin-free structures. We have also shown that, surprisingly, this sorting at the level of the Golgi apparatus is independent of clathrin adapters recruitment signals carried in the C-terminal tails of these two LMPs. To investigate what mechanisms might be involved in the overexposure of LAMP1 at the cell surface of certain cancers, we also performed a gene knock-out screen based on CRISPR-Cas9 technology. We selected genes whose inactivation affected LAMP1 levels at the surface and obtained many candidate genes that are under study

L'électroporation est un procédé physique qui consiste à appliquer des impulsions de champ électrique pour perméabiliser de manière transitoire ou permanente la membrane plasmique. Ce phénomène est d'un grand intérêt dans le domaine clinique ainsi que dans l'industrie en raison de ses diverses applications, notamment l'électrochimiothérapie qui combine les impulsions électriques à l'administration d'une molécule cytotoxique, dans le cadre du traitement des tumeurs. L'analyse de ce phénomène est traditionnellement réalisée à l'aide des méthodes optique et biochimique (microscopie, cytométrie en flux, test biochimique). Elles sont très efficaces mais nécessitent l'utilisation d'une large gamme de fluorochromes et de marqueurs dont la mise en œuvre peut être laborieuse et coûteuse tout en ayant un caractère invasif aux cellules. Durant ces dernières années, le développement de nouveaux outils biophysiques pour l'étude de l'électroporation a pris place, tels que la diélectrophorèse et la spectroscopie d'impédance (basse fréquence). Outre une facilité de mise en œuvre, ces méthodes représentent un intérêt dans l'étude des modifications membranaires de la cellule. De là vient l'intérêt d'opérer au-delà du GHz, dans la gamme des micro-ondes, pour laquelle la membrane cytoplasmique devient transparente et le contenu intracellulaire est exposé. L'extraction de la permittivité relative suite à l'interaction champ électromagnétique/cellules biologiques reflète alors l'état cellulaire. Cette technique, la spectroscopie diélectrique hyperfréquence, se présente comme une méthode pertinente pour analyser les effets de l'électroporation sur la viabilité cellulaire. De plus, elle ne nécessite aucune utilisation des molécules exogènes (non-invasivité) et les mesures sont directement réalisées dans le milieu de culture des cellules. Deux objectifs ont été définis lors de cette thèse dont les travaux se situent à l'interface entre trois domaines scientifiques : la biologie cellulaire, l'électronique hyperfréquence et les micro-technologies. Le premier objectif concerne la transposition de l'électroporation conventionnelle à l'échelle micrométrique, qui a montré une efficacité aussi performante que la première. La deuxième partie du travail concerne l'étude par spectroscopie diélectrique HyperFréquence de cellules soumises à différents traitements électriques (combinés ou non à une molécule cytotoxique). Ces travaux présentent une puissance statistique et montrent une très bonne corrélation (R2 >0 .94) avec des techniques standards utilisées en biologie, ce qui valide 'biologiquement' la méthode d'analyse HF dans le contexte d'électroporation. Ces travaux montrent en outre que la spectroscopie diélectrique hyperfréquence s'avère être une technique puissante, capable de révéler la viabilité cellulaire suite à un traitement chimique et/ou électrique. Ils ouvrent la voie à l'analyse 'non-invasive' par spectroscopie diélectrique HyperFréquence de cellules électroporées in-situ
Electroporation is a physical process that consists in applying electric field pulses to transiently or permanently permeabilize the plasma membrane. This phenomenon is of great interest in the clinical field as well as in the industry because of its various applications, in particular electrochemotherapy which combines electrical pulses with the administration of a cytotoxic molecule in the treatment of tumors. The evaluation of this phenomenon is raditionally carried out using optical and biochemical methods (microscopy, flow cytometry, biochemical test). They are very effective but require the use of a wide range of fluorochromes and markers, which can be laborious and costly to implement, while being invasive to the cells. In recent years, the development of new biophysical tools for the study of electroporation has taken place, such as dielectrophoresis and impedance spectroscopy (low frequency). In addition to the ease of implementation, these methods are of interest in the study of membrane modifications of the cell. Hence the advantage of operating beyond the GHz, in the range of microwaves, for which the cytoplasmic membrane becomes transparent and the intracellular content is exposed. The extraction of the relative permittivity as a result of the electromagnetic field / biological cell interaction then reflects the cell state. This technique, microwave dielectric spectroscopy, is a relevant method for analyzing the effects of electroporation on cell viability. Moreover, it does not require any use of the exogenous molecules (non-invasive) and the measurements are directly carried out in the culture medium of the cells. Two objectives were defined during this thesis whose work is located at the interface between three scientific fields: cellular biology, microwave electronics and micro-technologies. The first objective concerns the transposition of conventional electroporation to the micrometric scale, which has shown an efficiency as efficient as the first. The second part of the work concerns the study by HighFrequency dielectric spectroscopy of cells subjected to different electrical treatments (combined or not with a cytotoxic molecule). This work presents a statistical power and shows a very good correlation (R2> 0.94) with standard techniques used in biology, which biologically validates the HF analysis method in the context of electroporation. This work also shows that microwave dielectric spectroscopy proves to be a powerful technique capable of revealing cell viability following chemical and / or electrical treatment. They open the way to 'non-invasive' analysis by hyper-frequency dielectric spectroscopy of electroporated cells in situ

La recherche de nouvelles molécules bioactives utilisables en thérapeutique est un enjeu majeur de santé publique en particulier dans le traitement de certaines maladies telle que les infections bactériennes.La résistance naturelle des bactéries et la surutilisation des antibiotiques ont entraîné la sélection de bactéries pathogènes résistantes à de multiples médicaments. Depuis les dernières décennies, la résistance aux antibiotiques conventionnels a limité les options thérapeutiques, entraînant une augmentation significative de la mortalité et de la morbidité dans les hôpitaux. En outre, depuis 1970, seules deux nouvelles classes d'antibiotiques ont été mises sur le marché. Les venins constituent une source riche de substances naturelles pharmacologiquement actives uniques et novatrices, tels que les peptides antimicrobiens (PAMs) qui représentent une alternative originale pour remédier à ce problème de santé publique.Dans notre étude, parmi les 200 venins d’animaux étudiés pour leurs propriétés antibactériennes, au moins six PAMs ont été isolés à partir d’un venin d’insecte. Le peptide 1 original inhibe la croissance des bactéries Gram positives et négatives mais présente une forte hémotoxicité (IT = 1,6-3,2). La synthèse en phase solide d’analogues structuraux a permis d’identifier R1W8 et I1N11, moins toxiques (IT = 18 et >800 respectivement). Les résultats préliminaires de l’étude du mécanisme d’action suggèrent que ces peptides agissent contre les bactéries par perméabilisation de leur membrane cytoplasmique. Ces peptides peuvent servir de modèles pour l’élaboration de nouveaux agents antimicrobiens
The research for new bioactive molecules which can be used in therapeutic is a major public health issue, particularly in the treatment of certain diseases such as bacterial infections.The natural resistance of bacteria consecutive to overuse of antibiotics have resulted in the selection of pathogenic multi-drug resistant bacteria. Over the last few decades, resistance to conventional antibiotics has limited treatment options, resulting in a significant increase in mortality and morbidity in hospitals. Moreover, since 1970, only two new classes of antibiotics have been placed on the market. Venoms are known to be a rich source of unique and innovative pharmacologically active substances, such as antimicrobial peptides (PAMs), which represent an original alternative to small molecules for the development of new active and non-resistance inducing antibiotics.In our study, among the 200 venoms of animals studied for their antibacterial properties, at least six PAMs were isolated from an insect venom. The original peptide 1 inhibits the growth of Gram positive and negative bacteria but shows a high hemotoxicity (TI = 1,6-3,2). The solid phase synthesis of structural analogs allowed to identify R1W8 and I1N11, less toxic (TI = 18 et >800 respectively). The preliminary results of the action mechanism study suggest that these peptides have a pore-forming action on bacteria cytoplasmic membrane. These peptides can be used as models for the development of new antimicrobial agents

Les Rotavirus appartiennent à la famille des Reoviridae, famille du groupe III des virus à ARN double brin. Identifiés en 1973 par Ruth Bishop, ces virus non enveloppés sont la première cause de diarrhée aiguë sévère du jeune enfant dans le monde. La capside virale icosaédrique est constituée de 3 couches protéiques de structure : la couche externe formée par la glycoprotéine VP7 d’où émergent les spicules de protéine VP4, la couche intermédiaire constituée par la protéine VP6 représentant près de 50 % du poids du virus et enfin, la couche interne appelée core, résultant de l’assemblage des protéines VP2, d’où émergent vers l’intérieur les protéines VP1 et VP3. Cette capside renferme un génome divisé en 11 segments d’ARN bicaténaires. A ces 6 protéines structurales s’ajoutent les protéines non structurales qui interviennent lors de la réplication du virus. Les deux protéines structurales, VP4 et VP7 sont essentielles pour la fixation de la particule triple couche (TLP) aux membranes des cellules hôtes, par interaction aux récepteurs intégrines, elle sont également impliqués dans la déstabilisation des membranes endosomales, indispensable à la libération de la particule double couche (DLP) infectieuse dans le cytoplasme. Actuellement, contrairement au mécanisme d’action de la protéine VP5*, celui de la glycoprotéine VP7 est inconnu. L’objectif de cette thèse, a été de comprendre le mécanisme moléculaire de déstabilisation des membranes par les peptides dérivés de VP7. Dans un premier temps nous avons montré, par des études in silico, l’existence d’un domaine prédit en hélice membranaire bordé de résidus arginine et lysine hautement conservés, situé à l’extrémité C-terminale de la glycoprotéine VP7. Ces résultats ont conduit à la synthèse de quatre peptides avec lesquels des tests de perméabilisation de membranes modèles de larges vésicules unilamellaires (LUVs) ont été menés. Ceux-ci ont permis d’identifier le domaine minimum le plus actif, VP723, parmi les peptides sélectionnés. Dans un second temps nous avons déterminé la structure de ces peptides par RMN, dans des conditions mimant l’environnement hydrophobe de la membrane. Le peptide minimal VP723 s’organise en hélice α-amphipathique, structure souvent impliquée dans la déstabilisation des membranes cellulaires. La comparaison de sa structure obtenue par RMN à celle du domaine correspondant dans la structure cristallographique de la protéine native montre le réarrangement conformationnel de ce segment après maturation par la trypsine. Ces résultats ont été confirmés par deux mutants de synthèse, dont l’un est inactif pour la perméabilisation des membranes modèles. Ces travaux ont été complétés par des expériences de Résonance Plasmonique aux Ondes guidée (PWR). Des études par RMN du solide sont en cours afin de déterminer l’orientation du peptide dans les membranes modèles. En conclusion, nos résultats mettent en évidence l’importance du domaine C-terminal VP723 de la protéine VP7 dans la déstabilisation des membranes, permettant d’assurer la translocation de la particule virale infectieuse (DLP) de l’endosome vers le cytoplasme. Un modèle du mécanisme d’entrée du virus, médié par les peptides dérivés de la maturation par la trypsine de la glycoprotéine VP7 est proposé
Rotaviruses belong to the Reoviridae family, belonging to the group III of dsRNA viruses. Identified in 1973 by Ruth Bishop, these non-enveloped viruses are the leading cause of severe diarrhea in young children worldwide. The icosahedral capsid is composed of three structural protein layers: the outer one, formed by the glycoprotein VP7, emerges spicules protein VP4, the intermediate one consists of VP6 protein representing nearly 50% of the weight of the virus and finally, the inner one called core, results from the assembly of proteins VP2, emerges towards the inside of proteins VP1 and VP3. The capsid contains a genome divided into 11 segments of dsRNA. To these six structural proteins are added nonstructural proteins involved in virus replication. The two structural proteins, VP4 and VP7, are involved in the interaction of the triple layer particle (TLP) to integrin receptors, necessary for the release of the infectious double layer particle (DLP) into the cytoplasm following the permeabilization of the membrane of the endosome compartments. Currently, unlike the mechanism of action of the protein VP5*, the glycoprotein VP7 remains unknown. The objective of this work was to understand the molecular mechanism involved in the destabilization of membranes by peptides derived from VP7. In a first step, we have shown, by in silico studies, the existence of a helical trans-membrane domain predicted containing a highly conserved arginine and lysine residues, located at the C-terminus of the VP7 glycoprotein. These results led to the synthesis of four peptides with which permeabilizing tests of model membranes were conducted. We have identified the minimum of the most active domain, named VP723, among the selected peptides. In a second step, we determined the structure of these peptides by NMR under conditions mimicking the hydrophobic environment of the membrane. The VP723 peptide is organized like an α-helical amphipathic structure often involved in the destabilization of cell membranes. The comparison of the structure obtained by NMR to that of the corresponding domain in the crystallographic structure of the native protein shows a conformational rearrangement of the segment after trypsin maturation. These results were confirmed by two synthetic mutants, one of which is inactive for the permeabilization of model membranes. These studies were complemented by experiments Plasmon Resonance guided the Waves (PWR). Studies by solid state NMR are in progress to determine the orientation of the peptide in model of membranes. In conclusion, our results highlight the importance of the C-terminal domain of the VP7 protein, named VP723, in the destabilization of membranes, to ensure the translocation of the infectious viral particle (DLP) from the endosome into the cytoplasm compartments. A mechanism of virus entry mediated by peptides derived from trypsin maturation of the VP7 glycoprotein is proposed in this study

Cytotoxic T lymphocytes (CTL) kill virally infected and tumourigenic cells via the regulated secretion of specialised secretory lysosomes. These secretory lysosomes contain cytolytic effector molecules, such as perforin and granzymes, which are able to induce apoptosis in target cells. Secretion occurs at the contact point between the CTL and its target, in a highly structured region termed the immunological synapse (IS). Upon formation of the IS, CTL undergo polarisation of their microtubule cytoskeleton and movement of the microtubule organising centre (MTOC) to the IS. Secretory lysosomes are then able to polarise along microtubules, fuse with the plasma membrane and deliver their effector molecules to the IS. The Adaptor Protein 3 complex (AP-3) sorts transmembrane proteins to lysosomes and deficiency in AP-3 results in missorting of proteins from the lysosomal to plasma membrane. CTL from AP-3 deficient patients, who suffer from Hermansky-Pudlak Syndrome Type 2 (HPS2), show reduced killing of target cells. This thesis describes two new patients with HPS2, both with homozygous mutations in the AP3B1 gene, which codes for the β3A subunit of the AP-3 complex. CTL from the new HPS2 patients show reduced cytotoxicity, which is shown here to be due to impaired secretory lysosome polarisation towards the IS. This impairment is common to HPS2 CTL, but varies between patients. In order to determine differences between HPS2 and wild type CTL, the localisation of a range of lysosomal, cytolytic, transmembrane, inhibitory and activation marker proteins is examined. This shows that in HPS2 CTL, LAMP1, CD63 and CD9 are potential AP-3 cargos. In addition, a possible effect on the key lytic effector perforin is identified. Preliminary experiments to allow proteomic comparison of HPS2 and wild type CTL are also presented. Further investigation of these results will help to shed light on the mechanisms involved in secretory lysosome polarisation in CTL.

Seto Tai Chi.
Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2005.
Includes bibliographical references (leaves 122-138).
Abstracts in English and Chinese.
Thesis Committee --- p.ii
Statement --- p.iii
Acknowledgements --- p.iv
Abstract (in English) --- p.v
Abstract (in Chinese) --- p.vii
Table of Contents --- p.ix
List of Tables --- p.xvi
List of Figures --- p.xv
Chapter Chapter 1 --- General Introduction and Literature Review --- p.1
Chapter 1.1 --- Introduction --- p.2
Chapter 1.2 --- Tobacco seed as bioreactor --- p.4
Chapter 1.2.1 --- Advantages of using tobacco seed to produce bioactive human lysosomal enzyme --- p.4
Chapter 1.2.2 --- Disadvantages and potential problems of using tobacco seed to produce bioactive human lysosomal enzyme --- p.5
Chapter 1.2.2.1 --- Difference of asparagine-linked N-glycosylation between plant and human protein --- p.8
Chapter 1.2.2.2 --- Immunogenicity of recombinant protein with plant-derived N-glycan to human --- p.10
Chapter 1.2.2.3 --- "Strategy to ""humanize"" plant-derived recombinant human lysosomal enzyme" --- p.10
Chapter 1.2.2.4 --- Lack of specific glycan structure一mannose-6-phosphate (M6P) tag addition --- p.11
Chapter 1.2.2.5 --- Strategy for M6P tag addition on plant-derived human lysosomal enzyme --- p.12
Chapter 1.3 --- The plant secretory pathway --- p.13
Chapter 1.3.1 --- Plant vacuole in tobacco seed --- p.16
Chapter 1.3.2 --- Soluble protein trafficking in plant cell --- p.17
Chapter 1.3.3 --- Integral membrane protein trafficking in plant cell --- p.17
Chapter 1.3.4 --- Components involved in integral membrane protein trafficking to PSV crystalloid --- p.19
Chapter 1.3.4.1 --- BP-80 (80-kDa binding protein) --- p.19
Chapter 1.3.4.2 --- α-TIP (α-tonoplast intrinsic protein) --- p.20
Chapter 1.3.5 --- Using specific integral membrane protein trafficking system to target recombinant human lysosomal enzyme to tobacco seed PSV --- p.21
Chapter 1.4 --- Homo sapiens α-L-iduronidase (hIDUA) --- p.21
Chapter 1.4.1 --- Global situation of lysosomal storage disease一hIDUA deficiency --- p.21
Chapter 1.4.2 --- Physiological role --- p.22
Chapter 1.4.3 --- Molecular property --- p.24
Chapter 1.4.3.1 --- Mutation and polymorphism --- p.24
Chapter 1.4.4 --- Lysosomal secretory pathway --- p.24
Chapter 1.4.5 --- Biochemical property --- p.25
Chapter 1.4.6 --- Clinical application --- p.27
Chapter 1.4.6.1 --- Enzyme replacement therapy (ERT) --- p.27
Chapter 1.4.6.2 --- Clinical trial --- p.28
Chapter 1.4.6.3 --- Economic value --- p.29
Chapter 1.4.7 --- Expression system --- p.29
Chapter 1.4.7.1 --- Production (overexpression) of rhIDUA in CHO cell system --- p.30
Chapter 1.4.7.2 --- Production of rhIDUA in tobacco plant leaf --- p.30
Chapter 1.5 --- Project objective and long-term significance --- p.30
Chapter 1.5.1 --- Project objective --- p.30
Chapter 1.5.2 --- Long-term significance --- p.31
Chapter Chapter 2 --- Generation and Characterization of Anti-IDUA Antibodies --- p.32
Chapter 2.1 --- Introduction --- p.33
Chapter 2.2 --- Materials --- p.33
Chapter 2.2.1 --- Chemical --- p.33
Chapter 2.3 --- Methods --- p.35
Chapter 2.3.1 --- Generation of polyclonal anti-IDUA antibody --- p.35
Chapter 2.3.1.1 --- Design of synthetic peptide --- p.35
Chapter 2.3.1.2 --- Conjugation of synthetic peptide to carrier protein --- p.39
Chapter 2.3.1.3 --- Immunization of rabbit --- p.39
Chapter 2.3.2 --- Characterization of polyclonal anti-IDUA antibody in rabbit serum --- p.40
Chapter 2.3.2.1 --- Dot-blot analysis --- p.40
Chapter 2.3.3 --- Purification of polyclonal anti-IDUA antibody --- p.42
Chapter 2.3.3.1 --- Construction of anti-IDUA antibody affinity column --- p.42
Chapter 2.3.3.2 --- Affinity-purification of anti-IDUA antibody --- p.42
Chapter 2.3.4 --- Western blot detection of denatured rhIDUA --- p.42
Chapter 2.4 --- Results --- p.43
Chapter 2.4.1 --- Characterization of polyclonal anti-IDUA antibody --- p.43
Chapter 2.5 --- Discussion --- p.51
Chapter 2.6 --- Conclusion --- p.51
Chapter Chapter 3 --- Generation and Characterization of Transgenic Tobacco Plants Expressing rhIDUA Fusions --- p.52
Chapter 3.1 --- Introduction --- p.53
Chapter 3.1.1 --- Signal peptide of hIDUA (hIDUA SP) --- p.54
Chapter 3.1.2 --- Signal peptide of proaleurain (Pro. SP) --- p.54
Chapter 3.1.3 --- Hypothesis to be tested in this study --- p.54
Chapter 3.2 --- Materials --- p.55
Chapter 3.2.1 --- Chemical --- p.55
Chapter 3.2.2 --- Primers --- p.55
Chapter 3.2.3 --- Bacterial strain --- p.58
Chapter 3.2.4 --- The insert-Homo sapiens α-L-iduronidase (hIDUA) cDNA used in this study --- p.58
Chapter 3.2.5 --- The vector-pLJ526 used in this study --- p.59
Chapter 3.3 --- Methods --- p.61
Chapter 3.3.1 --- Construction of chimeric gene construct --- p.61
Chapter 3.3.1.1 --- Restriction endonuclease´ؤPfIMIl --- p.61
Chapter 3.3.1.2 --- Recombinant DNA and molecular cloning techniques used in this study --- p.61
Chapter 3.3.1.3 --- Cloning of pSPIDUA-FLAG --- p.62
Chapter 3.3.1.4 --- Cloning of pSPIDUA-control --- p.62
Chapter 3.3.1.5 --- Cloning of a universal construct (pUniversal) --- p.62
Chapter 3.3.1.6 --- Cloning of pSP-IDUA-T7 --- p.66
Chapter 3.3.1.7 --- Cloning of pSP-IDUA-control --- p.66
Chapter 3.3.1.8 --- Cloning of chimeric gene construct into Agrobacterium binary vector --- p.66
Chapter 3.3.2 --- Expression of chimeric gene construct in tobacco plant --- p.73
Chapter 3.3.2.1 --- Tobacco plant --- p.73
Chapter 3.3.2.2 --- Electroporation of Agrobacterium --- p.73
Chapter 3.3.2.3 --- Agrobacterium-mediated transformation of tobacco plant --- p.74
Chapter 3.3.2.4 --- Selection and regeneration of tobacco transformant --- p.75
Chapter 3.3.3 --- Characterization of transgenic tobacco plant expressing rhIDUA fusion --- p.75
Chapter 3.3.3.1 --- Genomic DNA polymerase chain reaction (PCR) --- p.75
Chapter 3.3.3.2 --- Southern blot analysis --- p.76
Chapter 3.3.3.3 --- Total RNA reverse transcription-PCR (RT-PCR) --- p.77
Chapter 3.3.3.4 --- Northern blot analysis of tobacco leaf --- p.78
Chapter 3.3.3.5 --- Western blot analysis --- p.79
Chapter 3.3.4 --- Purification of plant-derived rhIDUA fusion --- p.81
Chapter 3.3.4.1 --- Construction of affinity column with anti-IDUA antibody --- p.81
Chapter 3.3.4.2 --- Affinity-purification of rhIDUA fusion from tobacco mature seed --- p.81
Chapter 3.3.5 --- Confocal immunoflorescence study --- p.82
Chapter 3.3.5.1 --- Preparation of paraffin section --- p.82
Chapter 3.3.5.2 --- Single immunocytochemical labeling --- p.82
Chapter 3.3.5.3 --- Double labeling with one monoclonal and one polyclonal antibodies --- p.83
Chapter 3.3.5.4 --- Double labeling with two polyclonal antibodies --- p.83
Chapter 3.3.5.5 --- Image collection --- p.84
Chapter 3.4 --- Results --- p.85
Chapter 3.4.1 --- Chimeric gene construction and confirmation --- p.85
Chapter 3.4.2 --- Selection and regeneration of tobacco transformant with kanamycin- resistance --- p.86
Chapter 3.4.3 --- Genomic DNA PCR screening of tobacco transformant --- p.88
Chapter 3.4.4 --- Southern blot analysis of tobacco transformant --- p.91
Chapter 3.4.5 --- Total RNA RT-PCR screening of tobacco transformant --- p.93
Chapter 3.4.6 --- Northern blot analysis of tobacco transformant --- p.93
Chapter 3.4.7 --- Western blot analysis --- p.96
Chapter 3.4.7.1 --- Western blot analysis of pSP-IDUA-T7-121 transformant leaf --- p.96
Chapter 3.4.7.2 --- Western blot analysis of pSP-IDUA-T7-121 transformant mature seed --- p.98
Chapter 3.4.8 --- Affinity-purification of rhIDUA fusion --- p.98
Chapter 3.4.9 --- Expression level of rhIDUA fusion --- p.102
Chapter 3.4.10 --- Subcellular localization of rhIDUA fusion --- p.102
Chapter 3.5 --- Discussion --- p.111
Chapter Chapter 4 --- Summary and Future Perspectives --- p.117
References --- p.122
Appendix 1 --- p.139
Appendix II (List of Abbreviations) --- p.141

The Chediak-Higashi Syndrome is a disorder affecting lysosome biogenesis. At the cellular level, the Chediak-Higashi syndrome is characterized by the presence of grossly enlarged lysosomes in every tissue. Impaired lysosomal function in CHS patients results in many physiological problems, including immunodeficiency, albinism and neurological problems. The Chediak-Higashi syndrome is caused by the loss of a BEACH protein of unknown function named Lyst. In this work, I have studied the function of the Dictyostelium LvsB protein, the ortholog of mammalian Lyst and a protein that is also important for lysosomal function. Using a knock-in approach we tagged LvsB with GFP and expressed it from its single chromosomal locus. GFP-LvsB was observed on endocytic and phagocytic compartments. Specific analysis of the endocytic compartments labeled by LvsB showed that they represented late lysosomes and postlysosomes. The analysis of LvsB-null cells revealed that loss of LvsB resulted in enlarged postlysosomes, in the abnormal localization of proton pumps on postlysosomes and their abnormal acidification. This work demonstrated that the abnormal postlysosomes in LvsB-null cells were produced by the inappropriate fusion of lysosomes with postlysosomal compartments. Furthermore, this work provided the first evidence that LvsB is a functional antagonist of the GTPase Rab14 in vesicle fusion events. In particular, we demonstrated that reduction of Rab14 activity suppressed the LvsB-null phenotype by reducing the enlarged post-lysosomes and the enhanced rate of heterotypic fusion. In contrast, expression of an active form of Rab14 enhanced the LvsB-null phenotype by causing an even more severe enlargement of endosome size. The results provided by this work support the model that LvsB and Lyst proteins act as negative regulators of fusion by limiting the heterotypic fusion of early with late compartments and antagonize Rab GTPases in membrane fusion. The LvsB localization studies and the functional assessment of the LvsB-null phenotype helped make unique contributions to the understanding of the molecular function of Lyst proteins.

Dissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de Medicina
A insuficiência cardíaca (IC) é uma condição frequente em países desenvolvidos, sendo a insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada (ICFEP) responsável por mais de 50% dos casos de IC. A ICFEP é caracterizada por uma reduzida capacidade do ventrículo esquerdo em encher-se de sangue devido a uma disfunção diastólica. Apesar da alta incidência desta doença, os mecanismos subjacentes não estão ainda bem caracterizados. Sabe-se que a patogénese da ICFEP está dependente de um estado pró-inflamatório induzido por comorbilidades associadas à doença, como a hipertensão, a diabetes e a obesidade. Uma das citocinas pró-inflamatórias mais importantes na ICFEP é o TNF-α. Esta citocina aumenta a produção de espécies reativas de oxigénio nas células endoteliais (CEs), o que leva à sua disfunção, interferindo com a comunicação intercelular entre CEs e os cardiomiócitos (CMs). Em última análise, esta disfunção na comunicação pode levar à hipertrofia dos CMs. Estudos anteriores mostraram que, em hepatócitos, o TNF-α afeta a atividade dos lisossomas através da permeabilização da membrana lisossomal. Considerando a relação entre o TNF-α em circulação e a disfunção endotelial, assim como a falta de conhecimento sobre o mecanismo de ação subjacente, o nosso estudo teve como objetivo investigar o efeito do TNF-α na função lisossomal, uma das vias mais afetadas em pacientes com ICFEP, usando células endoteliais de veia umbilical humana (CEVUH). Os nossos resultados mostraram que, após a incubação com TNF-α, houve um aumento no tamanho e número de lisossomas, não se tendo observado diferenças na expressão de LAMP1. Demonstrámos também que os níveis de expressão de catepsinas aumentaram, no entanto, a taxa de conversão em catepsinas maturas diminuiu. Contrariamente ao esperado, o TNF-α alterou o pH lisossomal, modificando deste modo a heterogeneidade da população lisossomal. Além disso, observámos que os lisossomas aumentados, resultante da exposição a TNF-α, apresentavam marcadores de dano na membrana lisossomal. Esta citocina pró-inflamatória comprometeu os mecanismos de reparação da membrana lisossomal ao diminuir a expressão de proteínas relevantes como o Tsg101 e a Alix. É importante referir que um aumento no recrutamento de galectina 3 e LC3-II para a membrana do lisossoma também foi observado, sugerindo um aumento na lisofagia. Adicionalmente, a presença do TNF-α também pareceu desencadear a eliminação de lisossomas danificados, através de processos como a autofagia e a exocitose. Com a inibição da autofagia, foi encontrado um aumento na exocitose dos lisossomas danificados, sugerindo que esse mecanismo pode ser um processo alternativo à lisofagia. Por último, os nossos resultados revelaram ainda um novo papel não canónico para a Cx43 na homeostase lisossomal. Apresentámos também que a Cx43 é recrutada para membranas endolisossomais positivas para LAMP1, bem como para vesículas danificadas, galectina 3 positivas. Os nossos resultados demonstraram que a Cx43 pode modular a exocitose lisossomal induzida pelo TNF-α em CEs. No geral, o nosso trabalho revela novos dados sobre a disfunção endotelial mediada por inflamação, associando um papel fundamental aos lisossomas danificados e à sua secreção. Concluindo, revelámos um novo papel não canónico da Cx43 na manutenção da homeostase lisossomal.
Heart failure (HF) is a highly prevalent condition in developed countries with heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF), accounting for more than 50% of all cases of HF cases. HFpEF is characterized by a reduced ability of the left ventricle to fill with blood due to a diastolic dysfunction. Although the high incidence of this disease, the underlying mechanisms are not well established. It is known that HFpEF pathogenesis is dependent on a systemic and proinflammatory state, induced by HFpEF-associated comorbidities, such as hypertension, diabetes, and obesity. One of most important proinflammatory cytokines increased in HFpEF is TNF-α. This cytokine increases the production of reactive oxygen species (ROS) in endothelial cells (ECs), leading to their dysfunction and culminating with the disruption of EC-cardiomyocyte intercellular communication. This event ultimately leads to cardiomyocyte hypertrophy. Furthermore, previous studies have shown that in hepatocytes, TNF-α affects lysosomal activity by inducing lysosomal membrane permeability. Considering the connection between circulating TNF-α and endothelial dysfunction and the lack of knowledge on the underlying mechanism of action, we aimed to investigate the effect of TNF-α on the lysosomal function, one of the most affected pathways in HFpEF patients, by using human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Our results showed that upon TNF-α stimulation, there was an increase of lysosome size and number, with no observed differences on LAMP1 expression. Additionally, we demonstrated that cathepsins expression levels were increased, however the maturation rate was decreased. Unexpectedly, TNF-α altered the lysosomal pH affecting the heterogeneity of lysosomal population. Moreover, we observed that TNF-α-induced enlarged lysosomes show membrane damage markers. This proinflammatory cytokine compromised membrane repair mechanisms by decreasing the expression of important proteins, Tsg101 and Alix. Importantly, an increase in galectin 3 and LC3-II recruitment to lysosome membrane was found, suggesting an increase in lysophagy. Additionally, TNF-α incubation also seemed to trigger the clearance of damaged lysosomes, by autophagy and exocytosis. Upon autophagy inhibition, an increase in exocytosis of damaged lysosomes was found, suggesting that this mechanism might be an alternative process to lysophagy. Lastly, our findings disclosed a new non-canonical role for Cx43 on lysosomal homeostasis. We found that Cx43 is recruited to LAMP1 positive endolysosomal membranes as well as to galectin-3 positive damaged vesicles. Our results also demonstrated that Cx43 can modulate lysosomal exocytosis induced by TNF-α in ECs. Overall, our data unveil new insights on inflammation-mediated endothelial dysfunction, by giving a pivotal role to damaged lysosomes and their secretion. In addition, a new non-canonical role of Cx43 in the alleviation of the lysosomal burden was unveiled.
Outro - This work was financed by the European Regional Development Fund (ERDF), through the Operational Program for Competitiveness Factors (COMPETE; under the projects PAC “NETDIAMOND” POCI-01-0145-FEDER-016385; HealthyAging2020 CENTRO-01-0145-FEDER-000012-N2323; POCI-01-0145-FEDER-007440, CENTRO-01-0145-FEDER-032179, CENTRO-01-0145-FEDER-032414, POCI-01-0145-FEDER-022122; FCTUID/NEU/04539/2013, UID/NEU/04539/2019, UIDP/04539/2020; and FCT/PT2020-02/SAICT/2017_424 Repair).