Дисертації: "Mutations de l'ADNmt"

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Shebanov, Nikita. "Pathogenic mutations of the mitochondrial protein ND5 : the development of novel gene therapy strategies." Electronic Thesis or Diss., Strasbourg, 2024. http://www.theses.fr/2024STRAJ095.

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Анотація:

Les cellules humaines contiennent multiples copies d'ADNmt, qui code 37 gènes. L'ADNmt est sujet à des mutations qui peuvent conduire à des maladies affectant gravement les tissus ayant des besoins énergétiques élevés. Nous nous sommes concentrés sur deux mutations pathogènes du gène MT-ND5, 13513G>A et 13514A>G, qui altèrent Asp393, un résidu essentiel à la translocation des protons lors de la synthèse de l'ATP. Notre objectif était d'évaluer si la technologie CRISPR/Cas12a peut être appliquée à l'ADNmt humain. Nous avons démontré que les crRNA chimiquement modifiés améliorent la spécificité de Cas12a à des concentrations physiologiques de Mg²⁺. L'activité spécifique des éditeurs de bases mitochondriales fusionnés à AsCas12a ciblant les gènes ND4 et ND5 de l'ADNmt a été démontrée à la fois in vitro et, pour la première fois, dans les mitochondries de cellules HEK293 en culture. Nous avons également démontré que Cas12a et crRNA fusionnés étaient importés dans des mitochondries isolées, montrant le potentiel de la technologie crosslink pour améliorer l'adressage mitochondriale de crRNA
Human cells contain multiple copies of mtDNA, which encodes 37 genes. mtDNA is prone to mutations that can lead to diseases severely affecting tissues with high energy demands. We focused on two pathogenic mutations in the MT-ND5 gene,13513G>A and 13514A>G, that alter Asp393, a residue critical for proton translocation during ATP synthesis. Our aim was to evaluate whether CRISPR/Cas12a technology can be applied to human mtDNA. We demonstrated that chemically modified crRNAs improve the specificity of the Cas12a system under physiological levels of Mg²⁺. The specific activity of AsCas12a-fused mitochondrial base editors targeting the ND4 and ND5 genes of mtDNA was shown both in vitro and, for the first time, in the mitochondria of cultured HEK293 cells. We also demonstrated that crosslinked Cas12a and crRNA were imported into isolated mitochondria, showing the potential of crosslink technology in enhancing crRNA mitochondrial delivery

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Steffann, Julie. "Etude de la ségrégation de l'ADN mitochondrial au cours du développement embryofoetal humain." Paris 5, 2006. http://www.theses.fr/2006PA05N17S.

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Анотація:

Les maladies héréditaires résultant de mutations de l’ADN mitochondrial (ADNmt) sont des affections graves à taux de récidive élevé en raison de leur mode d’hérédité maternel. La gravité variable et le caractère pluritissulaire des atteintes cliniques tient en partie à la coexistence de molécules d’ADNmt sain et mutant en proportion variable dans les différents tissus (hétéroplasmie). La crainte d’une possible variation des taux d’hétéroplasmie au cours du développement embryofoetal humain a freiné le développement des procédures de diagnostic prénatal et préimplantatoire de ces affections. De plus, le passage éventuel des molécules d’ADNmt au travers d’un goulot d’étranglement lors de l’ovocytogenèse (théorie du bottleneck)
Inherited disorders resulting from mutations of mitochondrial DNA (mtDNA) are serious diseases with a high recurrence risk due to their maternal mode of inheritance. Variability in clinical severity and various multi-tissual involvement result in a large extent from the coexistence of wild-type and mutant mtDNA molecules in various proportions in different tissues (heteroplasmy). Uncertainties regarding the potential variation of heteroplasmy load during human embryofetal development had hampered the development of prenatal (PND) and preimplantation (PGD) diagnostic procedures. Moreover, the restriction of the mtDNA molecule number, through a putative bottleneck at the time of

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DEGOUL, FRANCOISE. "Mutations de l'adn mitochondrial dans differentes myopathies humaines." Clermont-Ferrand 2, 1991. http://www.theses.fr/1991CLF21276.

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Анотація:

L'adn mitochondrial (adn mt) code pour des proteines de la chaine respiratoire et de l'atp synthetase. Nous avons retrouve des deletions heteroplasmiques de l'adn mt dans les tissus de patients atteints de myopathies oculaires et des mutations ponctuelles de l'adn mt dans les tissus de patients atteints de syndrome de merrf et de melas. Les deletions sont differentes d'un individu a l'autre (3 a 8,5 kb) et sont identiques dans les tissus d'un meme individu mais la quantite de molecules anormales est variable d'un tissu a l'autre. Elles amputent plusieurs genes codant pour les sous-unites des complexes i, iii, iv, et v et plusieurs genes d'arnt. Plus la quantite de genome mute est importante plus le deficit biochimique est detectable. Le mecanisme implique dans la formation des deletions demeure inconnu pourtant la presence de sequences repetees dans les 3/4 des cas suggere des mecanismes de recombinaison apres appariements de sequences homologues. Les mutations ponctuelles a la position 8344 et 3243 sont specifiques respectivement du syndrome de merrf et du syndrome de melas. Elles se situent dans les genes d'arn de transfert de la lysine au niveau de la boucle t pseudouridine c (8344) et de la leucine au niveau de la boucle dihydouracile (3243). Elles sont heteroplasmiques et se retrouvent a des taux variables suivants les tissus. Les mutations ponctuelles sont transmises selon les lois de l'heredite maternelle. Pour les deletions ce schema n'est pas retrouve: certains cas sont sporadiques, d'autres sont familiaux montrant une heredite autosomale dominante ce qui suggere l'intervention d'une proteine nucleaire dans le processus de formation des deletions

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Bousard, Aurélie. "Etude génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires." Thesis, Evry-Val d'Essonne, 2015. http://www.theses.fr/2015EVRY0004/document.

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Анотація:

Ce travail de thèse comporte trois projets visant à approfondir la caractérisation moléculaire des adénocarcinomes du rein à cellules claires (ccRCC) et à en améliorer le diagnostic.Le premier projet traite de l’identification de mutations oncogéniques présentes dans les éléments régulateurs actifs du génome des ccRCC. L’utilisation de données de séquençage pangénomique de patients atteints de ccRCC et de données épigénétiques (ChIP-seq et ATAC-seq) de lignées cellulaires de cancer du rein a permis l’identification d’îlots de mutations situés dans ces éléments régulateurs. De plus, l’utilisation de données de RNA-seq a permis d’identifier plusieurs îlots de mutation associés à un changement d’expression génique, dont un situé dans le premier intron du gène WWC1. Ce gène appartient à la voie Hippo, connue pour être impliquée dans l’oncogenèse. Ce travail constitue la première étude à permettre l’identification de mutations non-codantes localisées sur des éléments régulateurs actifs définis dans un type cellulaire pertinent.Le deuxième volet de ce travail consiste en une étude des altérations moléculaires de la voie FGF/FGFR qui est actuellement la cible d’essais cliniques dans le ccRCC. Il a permis de suggérer une implication de l’activation de la voie FGF/FGFR dans l’oncogenèse du ccRCC et dans le pronostic vital des patients, notamment par l’action de régulateurs négatifs de cette voie tel que SEF.Enfin, la troisième partie concerne la mise au point d’un test de diagnostic non-invasif du ccRCC à partir de l’ADN circulant. Il a abouti à l’identification de biomarqueurs hyperméthylés et au développement de tests sensibles basés sur des qPCR spécifiques de la méthylation
This thesis is composed of three projects looking to improve molecular characterization and diagnosis of clear cell renal cell carcinoma (ccRCC). The first project concern the identification of oncogenic mutations located on active regulatory elements of ccRCC. The use of whole-genome sequencing data of an hundred patients affected by ccRCC and epigenetic data (ChIP-seq and ATAC-seq) from renal cancer cell lines enabled the identification of mutation islands located in these active regulatory elements. Moreover, the use of RNA-seq data highlighted the association between some mutation islands and gene expression changes. One mutation island has been identified on a regulatory element located in the first intron of KIBRA. This gene is a member of the Hippo pathway known to be involved in ccRCC tumorigenesis. This pioneer work in integrating approach of genetic and epigenetic data consists in the first study that describes non-coding mutations located on active regulatory elements identified on a cell type relevant to the study. The second project consists of a study of the molecular alterations of the FGF/FGFR pathway, that is currently the target of clinical assays in ccRCC. It suggests an involvement of the FGF/FGFR pathway activation in ccRCC tumorigenesis and in patient prognosis, partly through the expression alterations of negative regulators of this pathway such as SEF.Finally, the set-up of a ccRCC non-invasive diagnostic test from circulating DNA has been initiated. Hypermethylated biomarkers have been identified and sensible tests based on methylation-specific qPCR have been set up in the third project

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Mayeur, Anne. "La prévention des maladies mitochondriales par mutation de l'ADNmt : de la clinique au transfert de pronoyaux." Electronic Thesis or Diss., université Paris-Saclay, 2024. http://www.theses.fr/2024UPASL084.

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Анотація:

Les mitochondries ont la particularité de posséder leur propre génome, l'ADN mitochondrial (ADNmt), transmis exclusivement par la mère via le cytoplasme de l'ovocyte. Les mutations pathogènes au sein de l'ADNmt sont à l'origine des maladies mitochondriales. Le transfert de pronoyaux (TPN), non autorisé en France, est une technique proposée depuis 2016 par le Royaume Uni afin de substituer le génome mitochondrial muté d'un zygote par un autre non muté. Cette méthode reste largement débattue sur le plan international en termes d'efficacité et de sécurité. L'objectif de nos travaux était d'évaluer la faisabilité clinique et technique du TPN. Nos recherches ont confirmé que les femmes porteuses d'un variant pathogène de l'ADNmt présentaient des critères de réponse ovarienne à la stimulation comparable à un groupe contrôle. Grâce à une étude sociologique nous avons également montré que cette technique recevait une adhésion par la grande majorité des femmes interrogées principalement car elle permet de maintenir un lien génétique entre une femme et son enfant. Puis nous avons mis au point la technique de TPN en utilisant des zygotes triploïdes (3PN) donnés à la recherche et après autorisation de l'Agence de Biomédecine. Enfin, nous avons évalué la pertinence de l'utilisation des 3PN et démontré leurs limites en termes de développement et de statut chromosomique, même lorsque la diploïdie était rétablie. Ces travaux ouvrent des perspectives sur la faisabilité et l'acceptation du TPN. De futures recherches sont nécessaires pour explorer la sécurité de cette technique
Mitochondria have the unique characteristic of possessing their own genome, mitochondrial DNA (mtDNA), which is exclusively transmitted by the mother through the cytoplasm of the oocyte. Pathogenic mutations in mtDNA are responsible for mitochondrial diseases. Pronuclear transfer (PNT), not authorized in France, is a technique proposed by the United Kingdom since 2016 to replace the mutated mitochondrial genome of a zygote with a non-mutated one. This method remains widely debated internationally regarding its efficacy and safety. The aim of our work was to evaluate the clinical and and technical feasibility of PNT. Our research confirmed that women carrying a pathogenic variant of mtDNA exhibited ovarian response criteria to stimulation comparable to a control group. Through a sociological study, we also showed that this technique received support from the majority of women surveyed, primarily because it maintains a genetic link between a woman and her child. Subsequently, we developed the PNT technique using triploid zygotes (3PN) donated for research, following authorization from the Biomedicine Agency. Finally, we assessed the relevance of using 3PN and demonstrated their limitations in terms of development and chromosomal status, even when diploidy was restored. This work opens up perspectives on the feasibility and acceptance of PNT. Future research is necessary to explore the safety of this technique

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Warcoin, Mathilde. "Etudes de pathologies humaines atypiques associées à des défauts de réparation de l'ADN." Paris 7, 2009. http://www.theses.fr/2009PA077123.

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Des mutations héréditaires de gènes intervenant dans la réparation de l'ADN sont à l'origine de deux types de pathologies. D'une part, on trouve des maladies pédiatriques sévères dites maladies cassantes, comme l'ataxie-télangiectasie, le syndrome de Nijmegen ou l'ATLD (Ataxia-Telangiectasia Like Disorder), dues respectivement à l'inactivation des gènes ATM, NBN/NBS1 et MRE1L Ces pathologies partagent certains symptômes, notamment une instabilité chromosomique, un déficit immunitaire, une radiosensibilité et une prédisposition au cancer. D'autre part, des anomalies de certains gènes de la réparation sont responsables d'une prédisposition héréditaire au cancer du sein. Nous avons criblé des patients ayant certaines caractéristiques communes avec les maladies cassantes. Dans une fratrie de deux adultes, dont le signe d'appel était une hypofertilité et une cytogénétique évocatrice, des mutations germinales non-sens des deux allèles du gène NBN ont été détectées. Une hypersensibilité aux radiations ionisantes similaire à celle observée dans le syndrome de Nijmegen, était retrouvée chez ces deux patients. Dans une deuxième famille, le premier cas de délétion mono-allélique germinale de RAD50 a été identifiée chez une jeune femme présentant une ataxie modérée isolée. Ces deux gènes codent des protéines appartenant au même complexe MRN (MRE11/RAD50/NBN) ayant un rôle dans la réponse précoce aux dommages de l'ADN. Ces observations originales démontrent l'existence d'une nouvelle catégorie de patients mutés dans des gènes de la réponse aux dommages de l'ADN. Ces sujets adultes sans anomalie du développement, présentent des variants hypomorphes de ces gènes qui se traduisent au niveau biologique par des défauts majeurs de la réparation de F ADN. Des anomalies de ces gènes pourraient être recherchées dans le cadre d'infertilité, de prédisposition au cancer ou d'hypersensibilité à la radio/chimiothérapie inexpliquées
Inherited mutations in genes involved in DNA repair result in two différent pathologies. First, some mutations lead to severe pediatric diseases called "chromosomes breakage syndromes" such as ataxia-telangiectasia, the Nijmegen breakage syndrome and the ataxia-telangiectasia like disorder due to inactivation of the ATM, NBN/NBS1 and MRE11 gene respectively. These syndromes share some symptoms, including chromosomal instability, immune defect, radiosensitivity and a predisposition to cancer. Second, other alterations of some genes of the DlsfA damage repair pathway are responsible for an inherited predisposition to breast cancer. We screened adult and pediatric patients presenting some clinical features of those chromosomes breakage syndromes. In a family of two adult siblings, whose call sign was a hypofertility and an evocative cytogenetic we detected germline biallelic nonsense-mutations of the NBN gene. Hypersensitivity to ionizing radiation similar to that observed in the Nijmegen syndrome was found in these two patients. In a second family, the first case of a mono-allelic deletion of the RAD50 gene was identified in a young woman with isolated mild ataxia. Both genes encode proteins belonging to the MRN complex (MRE11/RAD50/NBN). This complex plays a role in the early response to DNA damage. These original observations demonstrate the existence of a new class of patients mutated in genes involved in the response to DNA damage. These adult subjects without developmental abnormalities, have hypomorphic variants of these genes that result in major defect of the DNA repair. In the context of infertility, cancer predisposition and unexplained hypersensitivity to radio / chemotherapy, abnormalities of these genes must be investigated

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Jeanjean, Sophie. "Étude des mutations microsatellites par des approches basées sur l'utilisation de séquenceurs de première, deuxième et troisième génération." Electronic Thesis or Diss., université Paris-Saclay, 2025. https://www.biblio.univ-evry.fr/theses/2025/interne/2025UPASL010.pdf.

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Анотація:

Les microsatellites sont des séquences d'ADN répétées en tandem avec un motif de 1 à 6 nucléotides, présents dans presque tous les génomes. Leur taux de mutation élevé, responsable d'une évolution rapide, leur confère un haut niveau de polymorphisme basé sur le nombre de répétitions. Ils sont donc utilisés comme marqueurs génétiques dans de nombreuses applications biomédicales. Le principal mécanisme de mutation est le glissement de la polymérase lors de la réplication, provoquant des contractions (délétions) ou des expansions (insertions) des microsatellites. Ce processus présente un biais directionnel, avec une préférence pour les délétions chez les procaryotes et les insertions chez les eucaryotes. Le système de réparation des mésappariements (MMR) corrige ces erreurs et réduit fortement le taux de mutation. Plusieurs facteurs influencent les mutations des microsatellites. Parmi les facteurs endogènes, on trouve la composition nucléotidique, la taille et le nombre de répétitions. Les facteurs exogènes incluent la taille du microsatellite et l'efficacité du système MMR. Mon projet de thèse visait à étudier et caractériser ces mutations à l'aide de séquenceurs de première, deuxième et troisième génération. Il se divisait en trois parties principales. Dans la première partie, j'ai contribué au développement d'une méthode d'inférence des taux de mutation, une mesure cruciale en génétique. Cette méthode permet d'identifier le modèle génétique à l'origine du glissement de la polymérase parmi 32 modèles considérés. Elle intègre des taux de délétion et d'insertion allant jusqu'à quatre sauts d'unités de répétition, avec une relation linéaire ou exponentielle entre le taux de mutation et le nombre d'unités. La méthode a été appliquée à des données expérimentales obtenues par amplification in vitro de microsatellites via PCR et méthode isotherme (RPA), combinées à l'analyse de fragments. Cela a révélé des différences mutationnelles significatives. Dans la deuxième partie, j'ai comparé différentes technologies de séquençage haut débit (NGS) pour déterminer la meilleure approche pour identifier la taille des allèles microsatellites. J'ai évalué diverses méthodes de préparation de librairies pour le séquençage à lecture courte avec la technologie Illumina, incluant des protocoles avec ou sans PCR (« PCR-free »), utilisant de 1 à 20 cycles PCR et incorporant ou non des codes-barres moléculaires. Un protocole sans PCR a été utilisé pour le séquençage à lecture longue avec la technologie PacBio. Mes résultats ont montré que le séquençage à lecture courte sans étape PCR est l'approche la plus fidèle. Enfin, dans la troisième partie, j'ai caractérisé les mutations des microsatellites en fonction de divers facteurs endogènes (unité́ répétée, nombre de répétitions) et exogènes (polymérase, température). J'ai développé un système rapporteur basé sur l'utilisation de plasmides contenant des microsatellites, combiné au séquençage capillaire et/ou NGS. Les études in vitro ont impliqué trois méthodes d'amplification ADN avec des températures allant de 15 à 65 °C. Les études in vivo ont été réalisées chez Escherichia coli et Saccharomyces cerevisiae, utilisant des souches sauvages et déficientes en MMR, cultivées à des températures de 20 à 45 °C. Ces travaux ont révélé un effet modulateur de la température sur les mutations des microsatellites. En conclusion, ce travail a permis d'améliorer la caractérisation des mutations microsatellites grâce à des approches innovantes, mathématiques et technologiques, et a mis en évidence un nouveau facteur exogène influençant leur formation in vitro et in vivo
Microsatellites are tandem repeat DNA sequences with motifs of 1 to 6 nucleotides, present in nearly all genomes. Their high mutation rate, driving rapid evolution, results in significant polymorphism based on the number of repeats. They are widely used as genetic markers in various biomedical applications. The primary mutation mechanism involves polymerase slippage during replication, leading to contractions (deletions) or expansions (insertions) of microsatellites. This process exhibits directional bias, favoring deletions in prokaryotes and insertions in eukaryotes. The mismatch repair system (MMR) corrects these errors, significantly reducing the mutation rate. Several factors influence microsatellite mutations. Endogenous factors include nucleotide composition, motif size, and repeat number. Exogenous factors include microsatellite size and MMR efficiency. My thesis project aimed to study and characterize these mutations using first-, second-, and third-generation sequencing technologies. It was divided into three main parts. In the first part, I contributed to the development of a method to infer mutation rates, a crucial measure in genetics. This method identifies the genetic model underlying polymerase slippage among 32 considered models. It accounts for deletion and insertion rates up to four repeat unit jumps, with linear or exponential relationships between mutation rates and repeat units. The method was applied to experimental data from in vitro microsatellite amplification via PCR and isothermal methods (RPA), combined with fragment analysis. This revealed significant mutational differences. In the second part, I compared various next-generation sequencing (NGS) technologies to identify the best approach for determining the length of microsatellite alleles. I evaluated library preparation methods for short-read sequencing with Illumina technology, including protocols with or without PCR (“PCR-free”), using 1 to 20 PCR cycles and incorporating molecular barcodes. A PCR-free protocol was used for long-read sequencing with PacBio technology. My results showed that short-read sequencing without PCR is the most reliable approach. Finally, in the third part, I characterized microsatellite mutations based on various endogenous (repeat unit, repeat number) and exogenous (polymerase, temperature) factors. I developed a reporter system using plasmids containing microsatellites combined with capillary and/or NGS sequencing. In vitro studies involved three DNA amplification methods across temperatures from 15 to 65 °C. In vivo studies were conducted in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae, using wild-type and MMR-deficient strains grown at temperatures from 20 to 45 °C. These studies revealed a modulatory effect of temperature on microsatellite mutations. In conclusion, this work improved microsatellite mutation characterization through innovative mathematical and technological approaches, highlighting a novel exogenous factor influencing their formation in vitro and in vivo

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Thèves, Catherine. "Recherche de mutations ponctuelles de l'ADN mitochondrial dans l'os pour une détermination de l'âge." Phd thesis, Ecole des Hautes Etudes en Sciences Sociales (EHESS), 2006. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00308590.

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Анотація:

Ces dernières années, de nombreux travaux ont démontré la présence de mutations mitochondriales en relation avec l'âge dans divers types tissulaires. Le sujet de notre travail consiste à démontrer de manière fiable et spécifique la détection de telles mutations, d'établir leurs relations avec l'âge, et de déterminer si elles peuvent présenter un intérêt en Médecine Légale ou en Anthropologie afin d'augmenter les indices de détermination de l'âge. Dans un premier temps, sur le tissu musculaire et les cellules buccales, nous avons mis au point une technique combinant la technologie PNA (Peptid Nucleic Acid) et la PCR en Temps Réel (qPCR), démontrant une détection sensible et une quantification des taux de mutation de l'hétéroplasmie A189G, et la relation avec l'âge dans le tissu musculaire. Ces résultats ont démontré la meilleure sensibilité de la technique PNA/qPCR par rapport à la technique de séquençage automatique pour la détection d'hétéroplasmie et ont pu être confirmés par la technique de Southern blot. Dans un deuxième temps, nous avons travaillé à partir de tissu osseux provenant d'une part d'individus d'âge connu dans le cadre d'identification en Médecine Légale et d'autre part de squelettes de Sibérie Orientale identifiés par l'analyse de marqueurs ostéologiques du vieillissement. Nous avons démontré l'accumulation de l'hétéroplasmie A189G dans les individus âgés de plus de 70 ans pour ceux dont l'âge est connu, et dans les individus âgés identifiés comme tel par les indicateurs ostéologiques. Le séquençage automatique nous a permis d'identifier deux autres hétéroplasmies (T72C et A73G) présentes dans des individus âgés de plus de 50 ans dans le tissu musculaire et osseux, hétéroplasmies déjà décrites dans la littérature. L'ensemble de ces résultats peut présenter un intérêt dans la détection et l'interprétation de l'hétéroplasmie de l'ADN mitochondrial dans les études médico-légale et anthropologique.

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Theves, Catherine. "Recherche de mutations ponctuelles de l'ADN mitochondrial dans l'os pour une détermination de l'âge." Paris, EHESS, 2006. https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00308590.

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Анотація:

Nous démontrons la détection de mutations de l’AND mitochondrial, leurs relations avec l’âge, et nous déterminons si elles peuvent présenter un intérêt en médecine l&gale ou en anthropologie afin d’augmenter les indices de détermination de l’âge. Dans un premier temps, sur le tissu musculaire et les cellules buccales, nous avons mis au point une technique combinant la technologie PNA (Peptid Nucleic Acid) et la PCR en temps réel (qPCR), démontrant une détection sensible et une quantification des taux de mutation de l’hétéroplasmie A189G, et la relation avec l’âge dans le tissu musculaire. Dans un deuxième temps, nous avons travaillé à partir de tissu osseux provenant d’une part d’individus d’âge connu dans le cadre d’identification en Médecine Légale et d’autre part de squelettes de Sibérie Orientale identifiés par l’analyse de marqueurs ostéologiques du vieillissement. Nous avons démontré l’accumulation de l’hétéroplasmie A189G dans les individus âgés de plus de 70 ans pour ceux dont l’âge est connu, et dans les individus âgés identifiés comme tel par les indicateurs ostéologiques. L’ensemble de ces résultats peut présenter un intérêt dans la détection et l’interprétation de l’hétéroplasmie de l’ADN mitochondrial dans les études médico-légale et anthropologique
In the present study, we searched to evaluate the most efficient method for detecting low levels of heteroplasmy, determine whether these mutations were really age-related and assess the possible implications of heteroplasmies in anthropological and forensic studies. In first time, in two tissue types, muscle samples and buccal cells, we carried out the sensitive detection and quantification of point mutation A189G with peptid nucleic acid (PNA) and Real Time PCR (qPCR) together. In second time, we worked on bone tissues, on the one hand, from individuals where age was known in forensic identification, on the other hand, from ancient skeletons of the eastern Siberia, where age determination was done using bone indicators. We showed the A189G heteroplasmy accumulation on individuals of 70 years old or more, when age is known, and on identified old individuals by bone indicators. These investigations could be of interest in the detection and interpretation of mtDNA heteroplasmy in anthropological and forensic studies

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Legros, Frédéric. "Étude de la dynamique du compartiment mitochondrial et des mutations hétéroplasmiques de l'ADN mitochondrial." Paris 7, 2002. http://www.theses.fr/2002PA077109.

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Lefebvre, Anne. "Le site CpG dans l'ADN : impact possible des variations conformationnelles sur le taux de mutations." Châtenay-Malabry, Ecole centrale de Paris, 1996. http://www.theses.fr/1996ECAP0485.

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Nous avons analysé la structure du dinucléotide CpG en fonction de la séquence d'ADN qui le contient, par résonance magnétique nucléaire et modélisation moléculaire, pour déterminer en quoi la structure de CpG influe sur les modifications structurales induites par la méthylation de la cytosine de ce dinucléotide, et mettre en relation la structure de CpG et le taux de mutations observé sur ces sites. La permutation de ses plus proches voisins modifie fortement la conformation de CpG. Au sein de la tétrade ACGT, comme dans d(GTACGTAC)2, il adopte un grand twist, associé à une phase élevée de la guanine. Au sein de d(CATCGATG)2, la structure de CpG est beaucoup plus malléable, et il adopte des valeurs moyennes de twist et de phase de la guanine plus faibles. Mais, la conformation de CpG est également influencée par des résidus plus éloignés dans la séquence, puisque la structure qu'il adopte dans d(CTTCGAAG)2 ressemble plus à celle calculée pour d(GTACGTAC)2 que pour d(CATCGATG)2. Nous avons également montré que les effets structuraux de la méthylation de CpG dépendent nettement de la conformation initiale de ce dinucléotide : la méthylation de la cytosine centrale modifie la structure moyenne de d(CATCGATG)2 mais pas de d(CTTCGAAG)2. Enfin, dans ces deux derniers oligonucléotides, un équilibre BI/BII a été mis en évidence au niveau du squelette de CpG, la proportion de conformères BII étant plus importante dans d(CTTCGAAG)2. Remarquablement, le double mésappariement d(TpG)2 dans d(CTTTGAAG)2 adopte un équilibre BI/BII très similaire à celui observé pour CpG dans d(CTTCGAAG)2. La structure particulière de CpG dans certains contextes d'ADN, en l'absence de méthylation, suffirait donc à expliquer sa reconnaissance par des enzymes de réparation, et donc sa mutation.

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Foray, Nicolas. "Cassures double brin de l'adn, cassures chromosomiques et radiosensibilite des cellules humaines." Paris 11, 1997. http://www.theses.fr/1997PA11T021.

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Merlevede, Jane. "Altérations génétiques et épigénétiques dans la leucémie myélomonocytaire chronique - Modulation par les agents déméthylants." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2015. http://www.theses.fr/2015SACLS007/document.

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La leucémie myélomonocytaire chronique (LMMC) est une pathologie clonale de la cellule souche hématopoïétique qui touche principalement les personnes âgées. Le seul traitement curatif de cette maladie est la greffe allogénique de cellules souches hématopoïétiques, souvent difficile à mettre en oeuvre. Les patients qui ne peuvent être greffés et dont la maladie présente des critères de gravité se voient proposer un agent déméthylant de l'ADN. Chez 30 à 40% d'entre eux, ce traitement induit une réponse objective dont le bénéfice en termes de survie n'est pas démontré. Le séquençage de gènes candidats a identifié une trentaine de gènes mutés de façon récurrente. Il s'agit de gènes codant des régulateurs épigénétiques, des facteurs d'épissage, des facteurs de transcription, et des protéines de la signalisation intracellulaire. Cette approche ne donnait qu'une vision partielle des événements génétiques associés à la maladie.Le premier objectif de cette thèse a été de recenser l'ensemble des mutations touchant les régions codantes et non codantes de l'ADN dans les cellules leucémiques des patients.Le séquençage de l'exome de cellules malades et de cellules contrôles a été réalisé chez 49 patients. Nos analyses ont montré qu'en moyenne, un patient porte 14 mutations somatiques dans les régions codantes. Nous avons confirmé que les mutations récurrentes les plus fréquentes affectaient les gènes TET2, SRSF2 et ASXL1. Nous avons aussi identifié 8 nouveaux gènes mutés de façon récurrente à une faible fréquence. En moyenne, 3 des 14 mutations affectent des gènes touchés de façon récurrente.Le séquençage du génome de cellules malades et de cellules contrôles a été réalisé chez 17 patients. L'analyse réalisée a détecté 475 mutations par patient dans les régions non répétées du génome. Dans l'exome, comme dans le reste du génome, les altérations principales sont des transitions. Deux signatures mutationnelles ont été identifiées et sont observées dans de nombreux cancers, traduisant probablement des altérations de la méthylation des cytosines au cours du vieillissement. Une troisième signature, jamais observée jusqu'alors et de signification indéterminée, a été détectée chez 2 patients.Nous avons alors répété l'analyse de l'exome dans les monocytes triés de 17 patients prélevés de façon séquentielle sur plus de 2 années : 6 n'ont pas été traités et 11 ont été traités par un agent déméthylant, parmi lesquels 6 sont restés stables et 5 ont montré une réponse clinique et biologique objective. L'analyse montre que 1) l'accumulation de mutations est un événement rare ; 2) l'hétérogénéité génétique du clone malade est limitée ; 3) la charge allélique des mutations reste inchangée, même chez les répondeurs ; 4) de nouvelles mutations peuvent apparaître alors que le patient est répondeur.Nous avons alors sélectionné 9 patients, 3 non traités, 3 stables sous traitement sans réponse objective, et 3 répondeurs. Nous avons collecté leurs monocytes avant tout traitement et quelques mois plus tard, alors que 6 d'entre eux étaient traités par un agent déméthylant. Nous avons analysé l'expression des gènes et la méthylation globale de l'ADN à ces deux temps. Chez les patients non traités, nous avons observé une remarquable stabilité de l'expression des gènes et de la méthylation de l'ADN. Chez les patients répondeurs, le traitement induit un changement significatif du niveau d'expression d'environ 500 gènes et la déméthylation d'environ 35,000 régions de l'ADN. Chez les patients stables sous traitement, le traitement induit un changement d'expression d'une soixantaine de gènes et du niveau de méthylation d'une centaine de régions seulement. Ces résultats suggèrent que les agents déméthylants n'affectent l'expression des gènes et la méthylation de l'ADN que chez les répondeurs, fournissant un argument important pour un effet essentiellement épigénétique et très peu cytotoxique de ces médicaments
Chronic myelomonocytic leukemia is a clonal disorder of the hematopoietic stem cell, affecting mainly the elderly. The only curative therapeutic is allogeneic stem cell transplantation, which is rarely feasible. When transplantation is not an option, patients with a severe disease can be treated with a demethylating agent. Thirty to 40% of these patients show hematological improvement, but it remains unknown if these drugs increase overall survival. Analysis of candidate genes by Sanger sequencing, then by New Generation Sequencing, identified about thirty genes that are frequently mutated. These genes encode epigenetic regulators, splicing factors, transcription factors and cell signalling regulators. However, this approach catched only part of the genetic events that characterize this disease.The first objective of this study was to determine the mutational landscape of CMML cells by analyzing the coding and non coding regions of leukemic cell genome.We first performed whole exome sequencing analysis of leukemic and control cells in 49 patients. These analyses showed that in average, a patient carries 14 somatic mutations in its coding regions. We confirmed that the most frequent mutations were in TET2, SRSF2 and ASXL1 genes. We identified also recurrent mutations in 8 new genes, these recurrent mutations occurring at a low frequency. In average, 3 out of the 14 mutations identified in each patient affected recurrently mutated genes.Secondly, we performed whole genome sequencing of leukemic and control cells in 17 patients. These analyses showed that in average, a patient carries 475 somatic mutations in the non repeated regions of the genome. In both the coding and non coding sequences, alterations were observed to be mainly transitions. As a signature of CMML, two mutational processes were identified in all 17 patients and are found in various other cancer types, most likely resulting from the cytosine methylation observed with ageing. A third process, never seen before and without known significance, was also detected in two patients.We collected several samples from 17 patients on a more than two year period: 6 of these patients remained untreated whereas 11 were treated with demethylating agent, among which 6 showed a stable disease and 5 fulfilled criteria of hematological improvement. These sequential analyses showed that 1) the occurence of new mutations is a relatively rare event ; 2) the genetic heterogeneity of the malignant clone is limited ; 3) the mutation allele burden remains unchanged under treatment, whatever the response ; 4) new mutations can appear, even in responding patients.We selected 9 patients, 3 untreated, 3 stable on therapy and 3 responders. We collected monocytes before treatment and a few months later and we analyzed gene expression and DNA methylation in sorted monocytes at these two time points. We did not detect any significant change in gene expression and DNA methylation pattern in untreated patients. In those who responded to treatment, we noticed significant changes in both gene expression, with about 500 deregulated genes, and the DNA methylation pattern, with about 35,000 demethylated regions. In stable patients, the treatment had a limited effect with changes in the expression of about 60 genes, and in the DNA methylation pattern of about 100 regions. These results show that demethylating agents affect gene expression and DNA methylation of responding patients only, suggesting they have mostly an epigenetic effect rather than a cytotoxic one

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Le, Roux Goglin Emilie. "Détection des mutations de /TP53/ et /CTNNB1/ dans l'ADN tumoral ou plasmatique : signification comme biomarqueurs de l'hépatocancérogenèse." Phd thesis, Université Claude Bernard - Lyon I, 2007. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00194209.

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Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est fréquent dans les régions tropicales, où son diagnostic est tardif et les traitements inefficaces. Pour permettre un diagnostic précoce, il faut identifier des marqueurs moléculaires spécifiques au CHC et détectables dans des prélèvements simples à obtenir tels que les échantillons de sang. Dans ce travail, nous avons étudié l'intérêt des mutations des gènes /TP53/ et /CTNNB1/ comme biomarqueurs pour la détection précoce et l'identification de l'étiologie des CHC. D'une part, nous avons analysé une mutation spécifique au codon 249 du gène /TP53/ (Ser249). Nous avons vu que les variations temporelles de la concentration en mutation Ser249 dans l'ADN circulant sont un marqueur d'exposition à l'aflatoxine B1 et au virus de l'hépatite B, et qu'elles pourraient être prédictives de l'hépatocancérogenèse. D'autre part, nous avons observé que les mutations dans les gènes /TP53/ et /CTNNB1/ peuvent co-exister dans les CHC, révélant des mécanismes complexes intégrant les deux voies, en fonction de l'étiologie. La compréhension de ces mécanismes permettra de déterminer la valeur des mutations comme marqueurs moléculaires du CHC.

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Le, Roux Émilie. "Détection des mutations de TP53 et CTNNB1 dans l'ADN tumoral ou plasmatique : signification comme biomarqueurs de l'hépathocancérogenèse." Lyon 1, 2007. http://www.theses.fr/2007LYO10103.

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Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est fréquent dans les régions tropicales, où son diagnostic est tardif et les traitements inefficaces. Pour permettre un diagnostic précoce, il faut identifier des marqueurs moléculaires spécifiques au CHC et détectables dans des prélèvements simples à obtenir tels que les échantillons de sang. Dans ce travail, nous avons étudié l'intérêt des mutations des gènes TP53 et CTNNB1 comme biomarqueurs pour la détection précoce et l'identification de l'étiologie des CHC. D'une part, nous avons analysé une mutation spécifique au codon 249 du gène TP53 (Ser249). Nous avons vu que les variations temporelles de la concentration en mutation Ser249 dans l'ADN circulant sont un marqueur d'exposition à l'aflatoxine B1 et au virus de l'hépatite B, et qu'elles pourraient être prédictives de l'hépatocancérogenèse. D'autre part, nous avons observé que les mutations dans les gènes TP53 et CTNNB1 peuvent co-exister dans les CHC, révélant des mécanismes complexes intégrant les deux voies, en fonction de l'étiologie. La compréhension de ces mécanismes permettra de déterminer la valeur des mutations comme marqueurs moléculaires du CHC
Hepatocellular carcinoma (HCC) is frequent in tropical regions where its diagnosis is late and its treatments are inefficient. Early diagnosis implies identification of HCC specific molecular markers which can be detectable in easily collected samples such as blood samples. In this work, we have studied the interest of mutations in TP53 and CTNNB1 genes as biomarkers for early detection and determination of HCC etiology. On one hand, we have analysed a specific mutation at codon 249 of TP53 gene (Ser249). We have shown that variations in concentration of Ser249 mutation in circulating DNA are a marker of exposure to aflatoxin B1 and hepatitis B virus, and that they may predict hepatocarcinogenesis. On the other hand, we have observed that mutations in TP53 and CTNNB1 genes can occur in the same HCC revealing complex mechanisms integrating the two pathways depending on etiology. Understanding these mechanisms will allow us to determine the value of mutations as molecular markers of HCC

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Dally, Andreas. "Analyse cladistique de mutations de l'ADN chloroplastique et phylogénie des riz : section EU-Oryza du genre Oryza /." Bondy : Éd. de l'ORSTOM, 1988. http://catalogue.bnf.fr/ark:/12148/cb34991064t.

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GARGOURI, ALI FAOUZI. "Recherches sur les introns de l'adn mitochondrial chez la levure saccharomyces cerevisae : mutations, suppressions et deletions genomiques d'introns." Paris 6, 1989. http://www.theses.fr/1989PA066195.

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L'etude de la suppression et de la reversion des mutations introniques de l'adn mitochondrial de saccharomyces cerevisiae a ete abordee. Trois voies de suppression reversion ont ete explorees: 1) la suppression informationnelle par deux suppresseurs extrageniques. L'un est mitochrondrial, il a ete sequence et localise dans l'arnr de la petite sous-unite ribosomale mitochondriale. Le second est nucleaire et a le meme spectre d'action que le premier. Les mutations suppressibles ont ete sequencees, elles sont de deux types: monoaddition de base ou monosubstitution de base creant un codon nonsens ochre. 2) la suppression phenotypique par un gene sauvage qui, a l'etat multicopie, devient suppresseur. La proteine codee par ce gene ressemble a une famille de proteines translocatrices de molecules energetiques a travers la membrane mitochondriale. 3) la reversion par deletion genomique d'introns. J'ai decouvert que les mutations introniques peuvent reverser par la perte totale de l'intron mute et souvent de certains introns avoisinants. Nous avons alors montre qu'in intron mitochondrial, presentant des homologies avec les transcriptases reverses virales, etait necessaire dans ce processus de deletion d'introns. Des phenomenes d'instabilite genetique sont aussi decrits dans la these

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Nabholz, Benoît. "Dynamique évolutive de l'ADN mitochondrial des oiseaux et des mammifères : Mutation, Sélection et Taille des populations." Montpellier 2, 2008. http://www.theses.fr/2008MON20115.

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L'origine et l'évolution du génome mitochondrial sont fascinantes par de nombreux aspects. Aujourd'hui, ce génome représente moins de 1% de l'ensemble de l'ADN de la majorité des animaux mais il héberge quelques uns des gènes les plus essentiels aux fonctions métaboliques. L'hypermutabilité mitochondriale est, chez les animaux, l'une de ses caractéristiques les plus singulières. L'étude du déterminisme du taux de mutation mitochondrial est le premier objectif de cette thèse. Par une approche phylogénétique précise, nous avons obtenu le taux de mutation de plus d'un millier d'esp`eces d'oiseaux et de mammifères. Nous avons révélé une gamme de variation très importante entre espèces, cette variation allant jusqu'à couvrir deux ordres de grandeur chez les mammifères. Grâce à une étude intra-classe et par la comparaison entre les oiseaux et les mammifères, nous avons montré que cette variation pouvait ˆetre en lien avec la longévité des organismes à travers une sélection pour une réduction du taux de mutation mitochondrial chez les espèces longévives. La deuxième partie de cette thèse concerne l'action de la sélection naturelle et de la dérive génétique sur l'évolution de l'ADN mitochondrial (ADNmt). Prenant comme point de départ les récentes preuves de sélection positive dans l'évolution de l'ADNmt (notamment chez les invertébrés), nous détectons, a contrario, essentiellement les traces de la sélection purificatrice chez les oiseaux et les mammifères. De manière plus surprenante, nous avons montré que la taille des populations n'est apparemment pas liée au niveau de polymorphisme mitochondrial des espèces, mais influencé, en revanche, l'efficacité de la sélection, mesurée au travers de la quantité de mutations faiblement délétères qui se fixent au cours de la divergence. Nous proposons qu'une forte stochasticité temporelle de la taille des populations pourrait expliquer ce résultat. L'ensemble de ces résultats participent à la compréhension de l'évolution d'un génome singulier, et a également des implications sur les utilisateurs, particulièrement nombreux, de l'ADN mitochondrial en temps que marqueur moléculaire
The origin and evolution of mitochondrial genome is fascinating. Currently, it makes up less than 1% of the whole organism genome, but contains some of the most important genes. A particularly intriguing feature of the animal mitochondrial genome is its hypermutability. The first goal of this work is to progress in our understanding of the determinism of mitochondrial DNA (mtDNA) substitution rate variations by distinguishing between two classical hypotheses of evolutionary biology –the generation time hypothesis and the metabolic rate hypothesis– and an other hypothesis that comes from biomedecine, namely the longevity hypothesis. Using a phylogenetic approach, we obtained lineage-specific mitochondrial mutation rates across more than one thousand bird and mammalian species. This analysis reveals an unexpectedly high level of mitochondrial mutation rate variation between lineages. The bird/mammal comparison and a within-class analysis suggest that this variation could be linked to species longevity through a (direct or indirect) selective pressure reducing the mitochondrial mutation rate in long-lived species. In the second part of this work, we address the impact of natural selection and genetic drift on mtDNA. Recent evidence of positive selection acting on mtDNA (mostly in invertebrates) was used as a starting point. We showed that, contrary to invertebrates species, bird and mammal mtDNA evolution is mainly under purifying selection. Surprisingly, even in the absence of positive selection, population size variations have no effect on mtDNA genetic diversity, but influence the rate of non-synonymous substitutions. This result could be explained by strong stochasticity of population sizes. All these results contribute to increase our understanding of an unusually evolving genome, and also have implications for the numerous users of mtDNA as a tool to reconstruct population and species history

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Casane, Didier. "L'adn mitochondrial des lapins. Role des mutations et de la selection dans l'evolution des sequences repetees apport de l'adn ancien a la connaissance de l'histoire des populations." Paris 11, 1994. http://www.theses.fr/1994PA112371.

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Des sequences non codantes repetees en tandem sont presentes dans la plupart des genomes. Elles sont qualifiees d'adn parasite et l'on suppose que leur presence ne depend que de la capacite des genomes a permettre leur maintien sans que cela affecte la valeur selective des organismes. Aucune fonction particuliere ne leur est generalement attribuee. L'evolution du nombre et de la sequence des unites repetees en tandem est due, dans ce modele, a l'accumulation de mutations ponctuelles aleatoires dans chaque unite et a des mecanismes de mutation qui font varier le nombre d'unites repetees, entrainant la rehomogeneisation de celles-ci. De plus, la duree de vie d'un bloc de sequences repetees en tandem est limitee, il finit par etre elimine du seul fait du hasard, meme s'il n'a pas d'effet sur la valeur selective. La selection n'est envisagee que lorsque le nombre d'unites repetees devient excessif. Nous avons teste ce modele dans le cas de deux blocs de sequences repetees en tandem presents dans la region non-codante de l'adn mitochondrial des lagomorphes. L'evolution d'un des deux blocs, constitue d'unites ayant une longueur comprise entre 140 et 178 pb chez les especes etudiees, subit des contraintes qui ne sont pas envisagees dans le modele presente ci-dessus. On constate effectivement une evolution rapide et concertee des unites presentes sur une molecule, mais une region de 20 pb est invariante. De plus, le nombre d'unites reste compris entre des bornes proches, entre 4 et 8 unites repetees, ce qui implique aussi un controle a ce niveau. L'evolution du polymorphisme de longueur dans les lignees somatiques, du a des variations du nombre d'unites, s'est revelee tissu-specifique. Le type moleculaire ayant 5 unites est toujours predominant dans les differents organes des animaux analyses. Toutefois, au cours du temps, il s'accumule des types moleculaires contenant moins de 5 unites repetee dans certains organes (reins, rate, foie, cerveau) alors que dans d'autres (ovai res et testicules), ce sont les molecules d'adnmt contenant plus de 5 unites repetees dont on voit les frequences augmenter. Il est possible que des mecanismes de mutation differents et dependant de la differenciation cellulaire expliquent ce fait, mais il est plus probable que selon la lignee cellulaire consideree, il y ait selection pour des formes optimales differentes. L'evolution de l'autre bloc, constitue d'unites d'une longueur comprise entre 6 et 20 pb, semble aussi etre sous contraintes selectives a differents niveaux. Si ces contraintes ne s'expriment pas au travers du maintien d'un motif nucleotidique precis, comme precedemment, elles sont cependant decelables de par la conservation d'un enchainement purine-pyrimidine dont la longueur reste incluse entre deux valeurs limites. Un polymorphisme de longueur, du a des variations du nombre d'unites est observe dans les differents organes analyses. La distribution de ce polymorphisme est stable, avec une forme de cloche aplatie, quand on compare les distributions observees dans differents organes d'un individu ou celles entre individus. Dans le cas du motif de 20 pb, les limites sont 4 et 18 unites. Ces resultats impliquent un taux de mutation de longueur eleve associe a une contre selection forte des molecules comprenant un nombre unites en deca et au-dela des valeurs limites observees. Les resultats montrent donc que l'evolution des deux ensembles de sequences repetees en tandem est soumise a des contraintes, ce qui impliquent qu'ils participent a des fonctions biologiques qui restent a decouvrir. Par ailleurs, nous avons commence une analyse diachronique du polymorphisme genetique dans les populations de lapins. A cette fin, nous avons extrait et sequence des fragments d'adn mitochondrial d'os d'animaux ayant vecu il y a quelques centaines a quelques milliers d'annees. Cela nous a permis de commencer a resoudre une hypothese d'introgression et d'evaluer les flux genetiques (cytoplasmiques) naturels entre populations, ainsi que les perturbations de l'organisation de la diversite genetique dues a l'action de l'homme. De facon inattendue, il n'a pas ete detecte d'echange genetique cytoplasmique entre deux populations geographiquement tres proches, observees sur une longue periode: elles presentent chacune un genotype mitochondrial specifique et constant au cours du temps. L'homme a probablement eu une influence tres importante sur l'organisation de la diversite genetique telle qu'elle nous apparait aujourd'hui

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El, Khoury Riyad. "Effets de mutations de la translocase ATP/ADP mitochondriale sur la stabilité de l'ADN mitochondrial et la longévité chez le champignon filamenteux Podospora anserina." Paris 11, 2009. http://www.theses.fr/2009PA112093.

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Chez l’homme, plusieurs mutations dans le gène hANTI codant le transporteur ATP/ADP mitochondrial sont associées à des cas d’ophtalmoplégie progressive autosomale dominante (adPEO) caractérisés par l’accumulation de délétions de l’ADN mitochondrial (ADNmt). Le mécanisme responsable de cette instabilité est encore obscur. Deux hypothèses sont proposées, l’une stipule que l’effet primaire des mutations est de découpler le membrane interne mitochondriale, ce qui secondairement entraîne une déstabilisation de l’ANDmt, l’autre propose que l’effet primaire des mutations est perturber le pool de nucléotides adényliniques , ce qui entraine la déstabilisation de l’ ADNmt. En utilisant le modèle Podospora anserina, j’ai montré que les mutations humaines A114P, L98P et V289M introduites dans le gène homologue PaAnt sont responsables de défauts de croissance, d’une diminutions de la production de radicaux libres (ROS), d’une chute du potentiel du membrane (∆ψ) et de l’accumulation de larges délétions de l’ADNmt entraînant une mort prématurée. J’ai également montré que l’instabilité de l’ADNmt des mutations M106P et A121P ne peut s’expliquer uniquement par une chute du ∆ψ ni par une augmentation du ROS comme il est généralement proposé puisque cette instabilité est supprimée sans restauration du ∆ψ et des ROS en présence d’un allèle du gène rmp1 impliqué dans le cross-talk mitochondrie-noyau et d’un allèle du gène AS1 codant une sous unité du ribosome cytosolique. L’instabilité de l’ADNmt associée à la mutation S296M n’est supprimée par aucun des 2 allèles. Ces résultats illustrent le rôle central du fond génétique dans le développement des ces pathologies
In humans, several mutations in the adenine nucleotide translocase gene ANT1 are associated mtDNA deletions and autosomal dominant forms of progressive external ophthalmoplegia (adPEO). The mechanisms underlying mtDNA instability are still obscure. Two hypotheses are currently proposed. One suggests that pathogenic mutations primary uncouple the mitochondrial inner membrane,which secondary cause mtDNA instability and the second suggest that the primary effect of the pathogenic mutations is the perturbation of the mitochondrial adenine nucleotide pool, which causes increase in mtDNA instability. Using the model system Podospora anserina, I showed that the three adPEO-associated mutations equivalent to A114P, L98P and V289M introduced into the P. Anserina ANT1 ortholog dominantly cause severe growth defects, decreased reactive oxygen species production (ROS), decreased mitochondrial inner membrane potential (∆ψ) and accumulation of large-scale mtDNA deletions leading to premature death. Interestingly, I showed that for the M106P and A121P mutant alleles, the associated mtDNA instability cannot be attributed only to a reduced membrane potential or increased ROS level as it is generally proposed since in can be suppressed without restoration of th ∆ψ or the ROS level. This suppression was obtained by an allele of the rmp1 gene involved in nucleo-mitochondrial cross talk and also by an allele of the AS1 gene encoding a cytosolic ribosomal protein. In contrast, mtDNA instability caused by the S296M mutation was not suppressed by these alleles. These results put also in forward the central role of the genetic background in developing a disease

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Colas, Chrystelle. "Conséquences cliniques et biologiques des déficiences constitutionnelles du système de réparation des mésappariements de l'ADN chez l'homme." Paris 6, 2011. http://www.theses.fr/2011PA066470.

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L’inactivation du système MMR (Mismatch Repair) favorise un processus d’instabilité des séquences répétées microsatellites du génome (MSI Microsatellite Instability). Le processus MSI est mutagène mais son rôle dans le processus de transformation cellulaire n’est pas encore précisément établi. Les individus porteurs de mutations constitutionnelles hétérozygotes des gènes MMR sont prédisposés aux cancers du côlon et de l’endomètre MSI (syndrome de Lynch). Les patients porteurs de mutations constitutionnelles bi-alléliques des gènes MMR sont plus rares (syndrome CMMRD, "Constitutionnal MMR Deficiency") et présentent une prédisposition sévère à la survenue de tumeurs MSI de localisations très diverses dès l’enfance. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode de détection de ces patients avant la survenue d’une tumeur chez eux ou leurs apparentés. Mon travail s’est focalisé sur ce syndrome avec l’objectif de décrire de manière inédite les modifications du génome survenant dans des tissus MMR déficients de ces patients, avant leur transformation. Mes résultats permettent d’établir que : (i) l’instabilité de microsatellites codants n’est pas observée dans l’ADN de lymphocytes immortalisés de ces patients (LBLs, Lignées Lymphoblastoïdes), suggérant que ce processus est contemporain de la transformation de ces cellules ; (ii) l’instabilité de microsatellites non codants est fréquente, conduisant à l’apparition de mutations en culture dans les LBLs de ces patients. Ce trait phénotypique peut être d’intérêt pour aider au dépistage des patients CMMRD. Enfin, je présente une revue exhaustive de la littérature concernant ces patients et l’analyse des corrélations génotype-phénotype

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Rieunier, Guillaume. "ATM et régulation du stress oxydatif." Paris 7, 2014. http://www.theses.fr/2014PA077107.

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L'Ataxie Télangiectasie (A-T) est une maladie autosomale récessive rare caractérisée par une ataxie cérébelleuse, des télangiectasies, un déficit immunitaire, une instabilité chromosomique, une radiosensibilité et une prédisposition aux cancers. L'A-T est causée par une inactivation biallélique du gène ATM qui code pour la protéine kinase ATM. ATM peut être activé par des dommages à l'ADN et par un stress oxydatif et coordonne ainsi la réponse cellulaire à différents stress en participant à plusieurs voies métaboliques. Nous avons analysé 3 séries de patients A-T porteurs de mutations faux-sens pour ATM. La caractérisation de l'expression, de la localisation et de l'activité kinase d'ATM dans ces patients a permis de confirmer le diagnostic d'A-T et de poser de nouvelles questions sur l'importance de la fraction cytoplasmique d'ATM. L'étude de la régulation du stress oxydatif chez des patients A-T atypiques nous a permis i) de décrire de nouveaux foyers cytoplasmiques d'ATM actif, ii) de montrer l'interaction d'ATM avec un modulateur du stress oxydatif, OXR1, dans ces foyers et iii) de montrer l'importance de cette interaction pour le maintien de l'homéostasie des ROS et la survie cellulaire
Ataxia Telangiectasia (A-T) is a rare disorder inherited in an autosomal recessive manner, characterized by cerebellar ataxia, telangiectasia, immune defect, chromosomal instability, radiosensitivity and cancers predisposition. A-T is caused by biallelic inactivation in ATM gene which encodes the ATM kinase. ATM can be activated by DNA damage and by oxidative stress and coordinates the cellular response to different stress through its roles in several metabolic pathways. We analyzed 3 series of A-T patients bearing ATM missense mutations. Analyses of ATM expression, localization and kinase activity in these patients allowed A-T diagnosis confirmation and raised new questions on the importance of ATM cytoplasmic fraction. Oxidative stress regulation analysis in atypical A-T patients led us to i) describe new active ATM cytoplasmic foci, ii) show ATM interaction with OXR1, an oxidative stress modulator, in these foci and iii) show the importance of this interaction for ROS homeostasis maintenance and for cell survival

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Frigola, Rissech Joan 1991. "Determinants of the local mutation rate variability along the genome." Doctoral thesis, Universitat Pompeu Fabra, 2020. http://hdl.handle.net/10803/669530.

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The rate at which mutations accumulate along the genome is not uniform but influenced by factors such as chromatin compactness, replication time or transcription. Most of these factors create mutational biases that encompass large areas of the genomes, including several megabases. In recent years, though, local mutational asymmetries spanning just a few base pairs have also been identified. This thesis focuses on the study of two of these local mutational asymmetries. First, we describe a reduction in the number of exonic somatic mutations caused by DNA polymerase mismatches, which we attribute to a higher efficacy of the mismatch repair mechanism in these locations. Second we study the UV induced DNA damage formation and repair at transcription factor binding sites and assess the relative contribution of these two factors to the unexpected number of mutations of these areas across transcription factors families. The presence of these local mutation rate variations illustrates the difficulty of properly modeling the mutation rate, an important procedure in many cancer genomics and evolutionary studies.
La velocitat a la que les mutacions s’acumulen al llarg del genoma no és uniforme sinó que depèn de diversos factors. Alguns dels més coneguts són l’empaquetament de la cromatina, el moment de replicació o la transcripció. La majoria d’aquests factors creen variacions mutacionals que abarquen grans àrees del genoma, incloent varies megabases. En els últims anys, però, també s’ha identificat variabilitat en el ritme en que s’acumulen les mutacions a escala molt més petita, en regions de poques bases. Aquesta tesi es centra en l’estudi de dos d’aquestes variacions locals en el ritme en que les mutacions tenen lloc. Primer, hem descrit una reducció en el número de mutacions somàtiques en els exons causades per errors de la AND polimerasa, que hem atribuït a una major eficàcia del mecanisme encarregat aquest tipus d’errors en els exons. En segon lloc, hem estudiat com les lesions en el DNA causades per la llum ultraviolada es generen i són reparades als llocs d’unió dels factors de transcripció i hem determinat fins a quin punt cada un d’aquests processos permeten explicar l’inesperat número de mutacions en aquestes regions. La presència d’aquestes variacions locals la velocitat a la que les mutacions s’acumulen al llarg del genoma posen de manifest la dificultat de modelar correctament aquest procés, un procediment central en molts estudis evolutius i de genòmica del càncer.

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Aissi-Ben, Moussa Sana. "Caractérisation moléculaire des mutations germinales et somatiques associées au syndrome de Lynch en Tunisie." Lille 2, 2009. http://www.theses.fr/2009LIL2S001.

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Bien que le cancer colorectal (CCR) soit relativement peu fréquent en Tunisie, la proportion de cancers colorectaux développés à un âge précoce est particulièrement élevée, suggérant une susceptibilité génétique. Néanmoins, jusqu'à présent, aucune étude génétique n'a été réalisée dans la population tunisienne. Le syndrome de Lynch ou syndrome HNPCC (cancer colo-rectal héréditaire sans polypose) constitue la cause la plus fréquente de CCR héréditaire. Il est dû à des mutations germinales affectant les gènes MMR de réparation des mésappariements de l'ADN. Notre travail de Thèse a eu pour objectif principal d'étudier les caractéristiques cliniques et génétiques du syndrome de Lynch en Tunisie. L'étude a porté sur 31 familles tunisiennes suspectées de syndrome de Lynch, dont 13 (42%) répondants aux critères d'Amsterdam. Dix mutations différentes, dont 8 nouvelles, ont été identifiées dans 11 familles (35,5%) : 5 dans MSH2 et 5 dans MLH1, dont un réarrangement de grande taille. Ainsi, dans la population tunisienne, au moins 35,5% des cancers développés dans le cadre d'une suspicion de syndrome de Lynch sont liés à des mutations germinales des gènes MMR. Ceci constitue une donnée particulièrement importante à prendre en considération pour la prise en charge des patients et de leur famille. L'identification des patients présentant avec un risque élevé de développer un CCR reste problématique. Celle-ci repose essentiellement sur l'histoire familiale des patients. Néanmoins, la recherche d'instabilité microsatellitaire et l'étude de l'expression des protéines MMR sont d'un intérêt majeur pour le dépistage du syndrome de Lynch. Une partie de notre travail a eu pour objectif de tenter d'identifier de nouveaux marqueurs d'aide au diagnostic de susceptibilité au cancer colorectal. Nous avons étudié le phénotype et les caractéristiques génétiques des tumeurs de 51 patients sélectionnés selon les critères de Bethesda. Comme attendu, la présence d'instabilité microsatellitaire et la perte d'expression des protéines MMR était significativement associées à l'existence chez les patients d'antécédents familiaux de cancers colorectaux (P < 0,001). De plus, la mucine sécrétée MUC5AC qui n'est pas exprimée dans le côlon adulte normal était plus fréquemment exprimée dans les tumeurs des patients présentant une histoire familiale de cancer colorectal (P = 0,039). Bien que préliminaire, ce résultat suggère que l'étude de l'expression de MUC5AC pourrait avoir un intérêt pour l'aide au dépistage des patients à haut risque de développer un cancer colorectal

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Gouge, Jérôme. "Etudes biophysique et structurale d'ADN polymérases." Paris 7, 2011. http://www.theses.fr/2011PA077087.

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La réplication du génome est réalisée par des ADN polymérases qui vont dupliquer l'information génétique en insérant un nucléotide dans le brin amorce de façon complémentaire au brin matrice. La sélection du nucléotide est réalisée lors de sa liaison dans le site catalytique. Le taux d'erreur des polymérases est d'environ 10⁻⁶ erreurs/base répliquée. Cette fidélité est assurée parce que les réplicases peuvent dégrader l'amorce en cas de mésappariement. Cependant, l'ADN est soumis à des agressions constantes de l'environnement si bien que Les réplicases doivent parfois faire face à des bases lésées ou des cassures double brin. Dans certains cas, elles peuvent insérer un nucléotide dans le brin amorce alors que l'instruction n'est pas canonique. Dans d'autres cas, elles s'arrêtent pour faire intervenir la machinerie de réparation, où d'autres ADN polymérases sont impliquées. Nous avons entrepris des études structurales d'une réplicase d'archée, P. Abyssi, pour comprendre son interaction avec un ADN canonique mais aussi avec des bases désaminées. A l'aide d'une dizaine de structures à résolution atomique, nous avons pu proposer un modèle rendant compte de l'arrêt de la polymérase lorsqu'elle reconnaît une base désaminée en amont du site catalytique. Un second volet porte sur des polymérases impliquées dans la réparation de l'ADN au travers de l'étude de polymérases X eucaryotes et bactériennes. Nous avons en effet résolu à 2,5 À la structure du complexe ternaire d'une polymérase X eucaryote. L'étude cristallographique des polymérases X bactériennes a conduit à enregistrer des données à 3,4 À. Les données SAXS suggèrent un arrangement des domaines inédits et très ouvert
In all cells, the replication step is achieved by DNA polymerases that duplicate genetic information by adding nucleotides at the 3' end of a primer using complementarity to a template strand. The correct nucleotide is chosen after binding in the catalytic site. To get an error rate as low as 10"6 errors/replicated base, polymerases have the ability to degrade the primer strand if a mismatch is incorporated. However DNA is subjected to various exogenous and endogenous attacks so that polymerases are often facing damaged bases or double strand breaks. Depending on the organism they are able to replicate genetic information even if it has been corrupted. In some other cases they stop until DNA reparation pathways come into play. We have conducted structural studies on an archaeal (P. Abyssi) DNA polymerase to order to better understand the discrimination between canonical and deaminated bases. Using a dozen crystallographic structures we have proposed a model that describes how the protein recognizes damaged bases before they enter in the catalytic site. A second part of the work deals with studies of eukaryotic and bacterial polymerases involved in DNA repair. We solved at 2,5 À the structure of a eukaryotic ternary complex that shows new interactions between the protein and DNA. Crystallographic studies two bacterial polymerases recently led to a 3,4 À data set that allowed molecular replacement solution to be found. The SAXS data indicate a new arrangement of the different domains in an open and extended way

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Le, Guyader Gwenaël. "Analyse du rôle joué par les protéines de la voie de réparation par jonction des extrémités non-homologues de l'ADN au cours du processus de commutation de classe des immunoglobulines." Paris 7, 2007. http://www.theses.fr/2007PA077122.

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La réparation des cassures double brin de l'ADN (CDB) est majoritairement prise en charge chez les mammifères par la machinerie de réparation des extrémités non-homologues (NHEJ). Un défaul d'expression d'une des protéines connues du NHEJ (tel qu'Artémis ou XRCC4) aboutit chez l'Homme ou la souris à un défaut de la recombinaison V(D)J associé à une sensibilité accrue aux agents induisant des CDB, entraînant un arrêt précoce du développement des cellules B et T. La voie NHEJ est supposée intervenir spécifiquement dans le mécanisme de commutation isotypique de la chaîne lourde des immunoglobulines (CSR), sans toutefois n'avoir jamais été indubitablement mise en cause. Afin de dépasser le défaut de recombinaison V(D)J, et ainsi d'évaluer finement le rôle des facteurs Artémis et XRCC4 dans la réaction de CSR, nous avons essayé de développer quatre différentes stratégies. Une des stratégies a servi à initier l'invalidation conditionnelle du gène murin Artémis dans les cellules B matures des centres germinatifs. Ces données n'ont pas permis d'impliquer Artémis dans le processus de réparation des extrémités non-homologues de l'ADN au cours du CSR. Pour définitivement statuer sur l'implication de la voie NHEJ durant le CSR, nous nous sommes efforcés de développer une stratégie d'invalidation conditionnelle du gène XRCC4 dans ces mêmes cellules B, en mettant en place un système de transgenèse lentivirale. Les résultats de ce modèle nous ont permis de définitivement impliquer XRCC4 et la voie NHEJ dans le processus de commutation isotypique. Son rôle n'est toutefois que partiel, suggérant que d'autres voies alternatives de réparation des CDB peuvent prendre le pas au cours du CSR
The immune System is the site of intense DNA damage. Indeed, DNA double-strand breaks (DSBs) are a constant threat to ail living cells. Mammalian cells tend to utilize mainly the non-homologous end-joining pathway (NHEJ) to repair DSBs. Lack of one of the NHEJ proteins (Artemis or XRCC4) leads to a severe combined immune deficiency with radiosensitivity in mammals. Mature B cells migrate to secondary lymphoid organs, where they undergo antigen-driven immunoglobulin-gene diversification through somatic hypermutation and class-switch recombination (CSR). So far, XRCC and DNA Ligase IV are the only proteins required for ail types of NHEJ reactions that have no reported roles outside NHEJ. Therefore, although most available evidence points to a role for NHEJ factors in CSR, elucidation of the role of XRCC4 would provide the most unequivocal proof. To bypass the embryonic lethality and the V(D)J recombination defect of knockout models, we tried to develop four differents strategies to identify the role of Artemis and XRCC4 in CSR. The purpose of one of these strategies was to bring about conditional inactivation of Artemis murine gene in mature germinal center B cells. We found that Artemis-deficient B cells undergo robust CSR, indicating that NHEJ pathway functions mostly in CSR via an Artemis-independent mechanism. To formally implicate NHEJ process in CSR, we built up a strategy of conditional invalidation of XRCC4 gene in mature B cells. Our results connect XRCC4 and NHEJ pathway to CSR while reflecting the use of an alternative pathway using microhomologies in the repair of CSR DSB in the absence of XRCC4

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Labalette, Pierre. "La neuropathie optique hereditaire de leber : etude de la mutation en position 11778nt de l'adn mitochondrial et de la liaison au locus chromosomique dxs 7." Lille 2, 1991. http://www.theses.fr/1991LIL2M229.

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Sternberg, Damien. "Contribution à trois aspects de la génétique mitochondriale humaine : étude de transmission de l'ADN mitochondrial lors de fécondations in vitro - caractérisation de mutations de l'ADN mitochondrial dans les maladies mitochondriales et le vieillissement musculaire." Paris 12, 2002. http://www.theses.fr/2002PA120010.

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L'ensemble de notre travail concerne trois aspects de la recherche en génétique mitochondriale humaine. Notre premier axe d'étude a été la transmission de l'ADN mitochondrial des parents aux enfants conçus par injection intracytoplasmique de spermatozoi͏̈de (ICSI). Si les risques de transmission de défauts de l'ADN nucléaire paternel sont reconnus depuis les débuts de cette technique de procréation médicalement assistée, aucune étude n'avait recherché à l'aide de techniques hautement sensibles chez les enfants conçus par ICSI la présence de molécules d'ADN mitochondrial d'origine paternelle. Nous avons montré qu'il n'existait pas, dans le sang circulant des enfants étudiés, d'ADN mitochondrial paternel détectable par les techniques utilisées. Notre deuxième axe d'étude avisé à préciser la responsabilité d'une classe de gènes de l'ADN mitochondrial, les gènes d'ARN de transfert, dans certaines maladies mitochondriales. Nous avons mis au point un outil d'analyse de l'ADN mitochondrial permettant d'analyser rapidement la séquence des 22 gènes d'ARN de transfert à la recherche de mutations de ces gènes. Appliqué à l'investigation d'une vaste cohorte de patients, cet outil a permis de détecter de très nombreuses variations de séquence, certaines déjà connues pour être pathogènes ou au contraire anodines, d'autres nouvelles et suspectes d'être pathogènes. Un travail complémentaire d'analyse des données et de validation des mutations a été nécessaire à l'interprétation des résultats. Il a également permis de mieux définir les indications d'une telle recherche. En troisième lieu, nous nous sommes intéressés à la part que pouvaient avoir les lésions de l'ADN mitochondrial dans la physiopathologie du vieillissement musculaire, et plus particulièrement dans la genèse des fibres négatives pour l'activité cytochrome oxidase. Nous avons recherché des mutations de l'ADN mitochondrial dans ces fibres, et avons pu montrer que, dans un certains nombre d'entre elles, une expansion clonale de molécules d'ADN mitochondrial porteuses de mutations ponctuelles des gènes d'ARN de transfert était responsable du déficit enzymatique
Mitochondrial genetics is important to consider when dealing with infertility, mitochondrial diseases or ageing. Our work contributes to the clarification of the role and behaviour of mitochondrial DNA (mtDNA) in those three circumstances. First, we studied mtDNA inheritance in children born after a particular in vitro fertilisation technique, i. E. Intracytoplasmic injection of spermatozoon (ICSI). Although the risk of transmission of a paternal infertility-linked nuclear defect by this technique is well known, the possible transmission of the patemal mtDNA had never been addressed by means of highly sensitive detection assays. By using different sensitive techniques, we showed that there was no detectable paternally inherited mtDNA in the peripheral blood of the 27 children who were studied. Second, we aimed at determining the contribution of mtDNA tranfer RNA (tRNA) gene defects to the pathogenesis ofmitochondrial disorders. We set up an exhaustive scanning method to screen ah tRNA genes for mutations, and applied it to a large number of selected patients with mitochondrial disorders. We found numerous sequence variations of those genes, some of them already known to be pathogenic or polymorphie, others being questionable from a functional point of view. We performed an evaluation of each questionable sequence variation by all possible means, and were able to assign a precise significance to most of them. In retrospect, we tried to delineate the best indications for the screening ofmtDNA tRNA genes. Third, we wanted to determine the contribution of mtDNA mutations to the ageing process of human muscle, at a single fibre level. We looked for large-scale rearrangements and tRNA gene point mutations in a large number of fibres defective in cytochrome c oxidase (COX- fibres) activity and an equal number of normal fibres (COX+ fibres) from normal biopsy samples taken from ageing subjects. We detected large scale rearrangements in several fibres. Most interestingly, we detected, characterised and quantified tRNA gene point mutations in several COX- fibres, such mutations being absent from COX+ fibres. We showed that clonally expanded point mutations contribute toageing process in muscle, by a segmental alteration of the respiratory chain activity

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Garlan, Fanny. "Nouvelles méthodes de détection de l'ADN tumoral circulant par PCR digitale en gouttelettes : application au suivi des patients." Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2016. http://www.theses.fr/2016USPCB108/document.

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L’ADN tumoral circulant (ADNtc) porte des altérations spécifiques de la tumeur des patients, qui sont détectables par un acte minimalement invasif. L’ADNtc représente donc un biomarqueur d’intérêt pour le suivi de l’évolution du cancer. Sa détection requière une technique hautement sensible et quantitative. Dans ce contexte, ce travail de thèse a porté sur la quantification et le suivi de l’ADNtc par PCR digitale en gouttelettes (PCRdg). Cet outil permet la détection d’altérations à l’échelle d’un ADN unique, offrant ainsi une sensibilité allant jusqu’à 0.001%. La détection de cet ADNtc a été réalisée par l’évaluation des biomarqueurs tels qu’une mutation spécifique de la tumeur, la fragmentation de l’ADNtc et l’hyperméthylation de séquences cibles. D’une part, nous avons observé que chez les patients atteints de cancer, l’ADN muté circulant est plus fragmenté que l’ADN non muté, et que cet ADN circulant de patients est globalement plus fragmenté que chez les sujets sains. D’autre part, une corrélation entre les pourcentages d’ADN muté et d’ADN hyperméthylé circulants a été observée au cours du suivi de patients. Ceci suggère la possibilité d’un suivi précis et quantitatif de l’ADNtc par l’évaluation de l’hyperméthylation en alternative à la détermination du statut mutationnel. Nous avons ensuite appliqué nos tests de détection de l’ADNtc dans le cadre de deux études cliniques. L’étude PLACOL, incluant 82 patients atteints de cancer colorectal métastatique, a permis de mettre en évidence deux facteurs pronostiques : un seuil de 0.1 ng/mL et la mesure de la pente de décroissance de la concentration en ADN muté ou hyperméthylé circulant. Dans la seconde étude, portant sur le mélanome métastatique dans le contexte d’une thérapie ciblée (vémurafenib), une corrélation inverse entre les concentrations d’ADNtc et de vémurafenib a été observée. Ces résultats suggèrent le potentiel clinique de l’ADNtc pour l’orientation thérapeutique des patients atteints de cancer avancé
Circulating tumor DNA (ctDNA) carries tumor-specific alterations that are detectable by minimally invasive sampling. It represents a highly pertinent marker for cancer monitoring during patients’ follow-up. CtDNA detection requires a highly sensitive and quantitative technique. In this context, this project focused on ctDNA quantification and monitoring by picoliter-droplet digital PCR. Thanks to the compartmentalization in millions of picoliter droplets, this tool allowed the detection of single DNA molecule with a sensitivity reaching 0.001%. Testing of ctDNA was performed through the evaluation of different potential biomarkers: specific mutations, ctDNA fragmentation, and hypermethylation of target sequences. On one hand, we observed in cancer patients that ctDNA is more fragmented than wild-type DNA, and, globally more fragmented than circulating DNA in healthy individuals. On the other hand, a strong correlation between percentages of hypermethylated and mutated DNA was observed during the follow-up of patients. Such results suggest the feasibility to precisely and quantitatively monitor ctDNA by the evaluation of hypermethylation as an alternative to the determination of mutational status. We have applied such ctDNA detection strategies in the context of two clinical studies. The PLACOL study, enrolling 82 metastatic colorectal cancer patients, allowed to highlight two prognostic factors: a ctDNA concentration threshold of 0.1 ng / mL, and the evaluation of ctDNA decreasing slope. In the second study, ctDNA was monitored in 11 melanoma patients in the context of a targeted therapy (vemurafenib). An inverse correlation between the concentrations of vemurafenib and ctDNA was demonstrated. These results suggest the clinical relevancy of ctDNA in advanced cancer patients, for the optimization of therapeutic management

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Jagla, Monika. "Etude de l'impact de mutations du domaine de liaison à l'ADN sur les fonctions du récepteur des androgènes dans le cancer de la prostate." Strasbourg 1, 2007. https://publication-theses.unistra.fr/public/theses_doctorat/2007/JAGLA_Monika_2007.pdf.

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Les objectifs de ma thèse ont été d’étudier deux mutations du domaine de liaison à l’ADN (DBD) du récepteur des androgènes (RA) détectées dans le cancer de la prostate (CaP). La mutation T575A affecte la liaison à l’ADN du RA muté et le recrutement de co-régulateurs, conduisant probablement à la formation d’un complexe d’activation transcriptionnelle distinct de celui formé par le RA sauvage. D’autre part, une insertion de 23 acides aminés entre les deux doigts de zinc du DBD, provoque un défaut de localisation nucléaire du récepteur muté (AR23) et lui confère de nouvelles propriétés cytoplasmiques. Sa localisation atypique sous forme d’agrégats au niveau des membranaire le placerait au cœur de la signalisation cellulaire à l’interface entre l’apoptose et la prolifération cellulaire. L’ensemble des ces résultats montre les différentes fonctions qui peuvent être affectées par une mutation au niveau du DBD du RA et l’impact potentiel de telles mutations sur l’évolution de CaP.

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Jagla, Monika Bergerat Jean-Pierre. "Étude de l'impact de mutations du domaine de liaison à l'ADN sur les fonctions du récepteur des androgènes dans le cancer de la prostate." Strasbourg : Université Louis Pasteur, 2007. http://eprints-scd-ulp.u-strasbg.fr:8080/799/01/jagla2007.pdf.

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Szalat, Raphaël. "Rôle des voies de réparation des dommages de l'ADN dans l'instabilité génomique observée au cours du myélome multiple." Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2019. http://www.theses.fr/2019USPCC094.

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Le myélome multiple (MM) est une hémopathie maligne caractérisée par la prolifération clonale de plasmocytes. Le MM est cliniquement et moléculairement hétérogène et comprend différents sous-groupes avec des pronostics différents. Divers événements génomiques, notamment des translocations récurrentes impliquant le gène des immunoglobulines (Ig) avec différents partenaires, des anomalies chromosomiques et de nombreuses mutations contribuent à l'hétérogénéité de la maladie. Si les translocations impliquant le Ig gene sont supposées survenir durant la maturation des lymphocytes B, les mécanismes conduisant au large spectre des lésions de l'ADN observées au cours du MM restent largement méconnus. Les processus de réparation des dommages de l’ADN sont largement impliqués dans l’instabilité génomique et la résistance aux chimiothérapies endommageant l’ADN comme les agents alkylants. Ces derniers, demeurent l’un des traitements de référence du MM malgré l’arrivée de nouveaux traitements efficaces qui ont amélioré de façon significative la survie globale des patients, à l’exception des patients à haut risque qui ont encore une survie courte avec une médiane de survie inférieure à 3 ans. Dans ce travail, nous avons étudié les mécanismes impliqués dans l’hétérogénéité génomique observée au cours du MM. En particulier, nous avons utilisé des méthodes de séquençage de nouvelle génération pour caractériser les processus mutationnels et l’existence de gènes de fusion dans une grande cohorte de patients. De plus, nous avons concentré notre analyse génomique sur le sous-groupe de myélome avec translocation t(4; 14) en étudiant un groupe de 58 patients avec cette translocation. Nous avons ainsi identifié de nouvelles mutations «driver» de ce sous-groupe de MM associé à un mauvais pronostic, affectant ATM, ATR, FGFR3 et PRKD2. Enfin, nous avons combiné les données de séquençage de nouvelle génération et un nouveau test fonctionnel pour évaluer le rôle de la réparation des lésions de l’ADN parexcision de nucléotides (NER) dans la résistance aux agents alkylants et avons pu cibler thérapeutiquement ce mécanisme à l’aide de petites molécules. Au total, nos données révèlent un rôle majeur des processus de réparation des dommages de l'ADN dans lagénération de mutations exprimées et dans la résistance aux agents alkylants. Par ailleurs, nous avons identifié de nouveaux marqueurs d'instabilité génomique spécifiques aux MM avec t(4; 14) et de nouveaux gène de fusion impliqués dans la progression de la maladie. Nos résultats suggèrent qu'une stratégie thérapeutique ciblant le NER et en particulier l’hélicase XPB peut être efficace pour traiter le MM et sensibiliser les cellules aux agents alkylants. Nos résultats ont identifié le rôle et l’impact de certains mécanismes de réparation des dommages de l’ADN dans la biologie du MM ainsi que de nouvelles cibles thérapeutiques
Multiple myeloma (MM) is a malignant hemopathy characterized by clonal proliferation of plasma cells. MM is clinically and molecularly hetereogenous and featured by different subgroups of MM with different prognosis. Various recurrent genomic events including reccurent translocations involving the immunoglobulin (Ig) gene, chromosomal abnormalities and various mutations contribute to MM heterogeneity. While the recurrent translocations the Ig gene gene are considered to occur during the Ig gene rearrangement, the maturation affinity or the isotype switch that are part of the B cell maturation process, the mechanisms leading to the observed wide spectrum of DNA lesions in MM remain largely unknown. DNA damage and repair pathways play an important role in DNA damage response, genome instability and resistance to DNA damage chemotherapies such as alylating agents that remain the gold standard of therapy despite the advent of new and effective treatments that have markedly improved patient’ survival with the exception of high-risk patients that still have short overall survival with a median inferior to 3 years. In this work, we have investigated the mechanisms involved in the complex genomic heterogeneity observed in MM. In particular we used next generation sequencing methods to characterize the mutational processes and the fusion genes landscape in a large cohort of MM patients. In addition, we have focused our genomic analysis on the myeloma subgroup harboring t(4; 14) translocation by studying a group of 58 t(4;14) MM. We identified new potential driver of this poor prognosis MM subgroup including mutations in ATM/ATR, FGFR3 and PRKD2. Finally, we combined next generation sequencing data and a novel functionnal assay to assess the role of nucleotide excision repair (NER) in resistance to alkylating agents. Altogether our data reveal a major role of DNA damage repair processes in the generation of expressed mis-sense mutations, and in resistance to alkylating agents, new markers of genomic instability specific to t(4; 14)MM and new fusion gene. Finally, our results suggest that a therapeutic strategy targeting the NER, and especially the helicase XPB, is potentially efficient to treat MM, and to sensitize cells to alkylating agents. Altogether, our data highlighted the impact of distinct DNA damage and repair mechanisms in MM biology and identified new potential therapeutic targets

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Fiche, Jean-Bernard. "Etudes thermiques des puces à ADN par imagerie de résonance des plasmons de surface (SPRi) : vers la détection de mutations ponctuelles." Université Joseph Fourier (Grenoble), 2006. http://www.theses.fr/2006GRE10201.

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Les puces à ADN sont devenues en l'espace d'une décennie des outils incontournables du paysage scientifique actuel. Situées à l'interface des disciplines traditionnelles, elles ont trouvé. Des applications dans des domaines aussi variées que l'expression des gènes, la détection des SNP ou l'évolution de l'espèce humaine au cours du temps. Le travail présenté ici utilise pour la première fois la technique d'imagerie de résonance des plasmons de surface (SPRi) alliée à un contrôle de la température - allant de 20°C à 80°C - pour l'étude des puces à ADN. Dans une première partie, le processus d'hybridation sur support solide est étudié en détail à l'aide du modèle de Langmuir, tant des points de vue cinétique que thermodynamique. Les paramètres ΔH et ΔS, caractéristiques des séquences utilisées, sont estimés et présentent une évolution inhabituelle en fonction de la longueur des sondes, probablement due à des problèmes d'accessibilité sur la puce. Dans une seconde partie, une technique de détection de mutations ponctuelles basée sur l'utilisation de rampes de température a été développée. Les résultats obtenus sur deux cas modèles (K-ras et Cycline D1) présentent un excellent accord avec les prédictions théoriques en solution et permettent d'envisager l'application de cette méthode pour la détection des SNP (Single Nucleotide Polymorphism) sur des échantillons biologiques. Une dernière application à l'étude des interactions entre l'ADN-glycosylase Fpg et l'ADN lésé est finalement présentée. Deux lésions de l'ADN, la 8-oxo-guanine et la 5',8-Cyclo-2'desoxyadénosine, ont été étudiées. Une activité catalytique a été détectée par une méthode thermique originale uniquement pour la lésion 8-oxoG
Ln the space of one decade, DNA-chips became tools which cannot be ignored in the present scientific context. Placed at the interface between traditional disciplines, th. Ey are currently used for gene expression studies, SNP detection or who le genome analysis. This work uses for the first time surface plasmon resonance imaging coupled with tempe rature control - from 20°C to 80°C - applied to DNA-chip studies. Ln the first part, we study the DNA hybridization process on a solid support from a both kinetic and thermodynamic point of view, assuming the theoretical Langmuir model, ΔH and ΔS parameters are estimated as a function of probes length and show a non-conventional behaviour compared to the theoretical prediction. We assume that it could be due to a lack of accessibility on the DNA-chip surface. The second part is dedicated to point mutation detection using tempe rature scan technique. Our results, obtained with two models (K-ras and Cycline D1), are in good agreement with theoretical predictions in solution and let assume that this method could be applied for SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) detection on biological samples. A last application concerns the DNAglycosylase Fpg interactions with damaged DNA duplexes. Two lesions, 8-oxo-guanine and 5',8Cyclo-2'-desoxyadenosine, are used and Fpg enzymatic activity is only detected for the first one using an original thermal method

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Solé, Ferré Anna. "Correction of point mutations at the endogenous locus of the mammalian dihydrofolate reductase gene using polypurine reverse hoogsteen hairpins." Doctoral thesis, Universitat de Barcelona, 2016. http://hdl.handle.net/10803/379822.

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This work is focused on the study of Polypurine Reverse Hoogsteen (PPRH) hairpins and their ability as gene correction tools. The repair of a point mutation at its endogenous gene locus has been the focus of many researchers during the past decades by using various approaches such as gene replacement, gene augmentation therapy (GAT) and different repair oligonucleotides. Cystic fibrosis, sickle-cell anemia and Tay-Sachs disease are some examples of the high number of disorders caused by a single-point mutation. In this work we present an alternative repair methodology using PPRH molecules, that although first developed in our laboratory as a gene-silencing tool, we hypothesized that they could also be applied as a gene correction tool. PPRHs are double-stranded DNA molecules formed by two antiparallel homopurine domains linked by a 5-thymidine loop, which form intramolecular reverse Hoogsteen bonds. PPRHs have been described to effectively bind to the dsDNA forming a triplex structure (Coma et al., 2005), and have been designed against either the template or the coding strand of the dsDNA (de Almagro et al., 2009, de Almagro et al., 2011a). Taking advantage of the ability of PPRHs to form a triplex structure with the pyrimidine strand of the dsDNA, in the present work we wanted to explore the ability of PPRHs to correct point mutations. First of all, we studied the in vitro conditions for PPRHs to bind to dsDNA and to maintain it in an open conformation by binding assays. Then, we designed different repair-PPRHs by adding to the PPRH core a repair tail complementary to the mutated region of the DNA except for the nucleotide to be corrected. These repair-PPRHs were used in mammalian cells to repair a point mutation in a dihydrofolate reductase (dhfr) plasmid. Finally, those results led us to further demonstrate the correction capability of repair-PPRHs in different mutant cell lines containing single point mutations in the endogenous dhfr gene. In addition, we developed improved Long-distance-repair¬PPRHs (LDR-PPRHs) to correct mutations that are very distant with respect to the DNA target where the PPRH core binds. Considering the possible high proportion of guanines in a PPRH sequence, an in vitro characterization of these molecules was carried out to study the effect of these guanines in the formation of secondary structures, such as G-quadruplex. The triplex conformation formed by repair-PPRHs with their pyrimidine target sequences was also studied even when repair-PPRHs folded in a G-quadruplex structure instead of a hairpin. As a second part of this thesis, we developed a new application of the electrophoretic mobility shift assay (EMSA) technique, to demonstrate the binding between miRNAs and their target sequences. For over two decades, research in our laboratory has been focused on the pharmacogenomic study of methotrexate (MTX) resistance in cancer chemotherapy upon inhibition of DHFR. Beside gene amplification, our research group has shown that many genes are involved in this mechanism. In this direction, cellular genes and micro-RNAs such as miR-224 and its target genes SLC4A4, CDS2 and HSPC159 were identified to play an important role in the resistance to MTX in colon cancer cells (Mencia et al., 2011). For this reason, miR-224 was chosen to show in a direct and specific manner, its ability to bind to the SLC4A4 target gene, thus setting up the EMSA as a simple and useful method to validate the interaction between a miRNA and a specific mRNA target.
Aquest treball es centra en l'estudi de pinces de polipurines "polypurine reverse Hoogsteen (PPRH)", i la seva capacitat com eina en la correcció de gens. La reparació d'una mutació puntual en el seu locus endogen ha sigut el principal tema de molts investigadors en les últimes dècades, utilitzant diverses estratègies com per exemple la teràpia de substitució de gens (GAT) i diferents oligonucleòtids de reparació. La fibrosi quística, anèmia de cèl.lules falciformes i la malaltia de Tay-Sachs son alguns exemples de la gran quantitat de trastorns causats per una mutació puntual. En aquest treball, presentem una metodologia de reparació alternativa que utilitza molècules PPRH, desenvolupades en el nostre laboratori inicialment com a eina de silenciament gènic, amb la hipòtesi que també es podrien aplicar com a eina de correcció de gens. Els PPRH son unes molècules d'ADN de doble cadena, formades per dos dominis de homopurines antiparal•eles, connectades per un bucle de 5 timidines, que formen enllaços de Hoogsteen reversos i intramoleculars. Els PPRHs s'han descrit per unir-se eficaçment a la doble cadena d'ADN formant una estructura de tríplex, i han sigut dissenyats tant contra la cadena motlle com contra la cadena codificant de l'ADN. Tenint en compte la capacitat dels PPRHs per formar una estructura de tríplex amb la cadena de pirimidines de l'ADN, en l'estudi presentat aquí volíem explorar la capacitat dels PPRHs per corregir mutacions puntuals. En primer lloc, es van estudiar les condicions in vitro en les que els PPRHs s'unien a la doble cadena de l'ADN i la mantenien oberta, mitjançant assajos d'unió. Tot seguit, hem dissenyat diferents PPRHs reparadors, tot afegint, al nucli del PPRH, una cua reparadora, complementaria a la regió mutada de l'ADN excepte pel nucleòtid que ha de ser corregit. Aquests PPRHs reparadors s'han utilitzat en cèl.lules de mamífer per reparar una mutació puntual en un plàsmid de la dihydrofolate reductasa (dhfr). Per últim, els resultats positius ens van portar a estudiar la capacitat dels PPRHs reparadors per reparar diferents línies cel.lulars que contenien diferents tipus de mutacions puntuals en el gen endogen de la dhfr. A més, també hem desenvolupat un PPRH millorat, anomenat LDR-PPRH, per "Long-Distance-Repair-PPRH", per reparar mutacions puntuals molt distants respecte la seqüència diana del nucli del PPRH. Tenint en compte la possible alta proporció de guanines en una seqüència de PPRH, es va dur a terme una caracterització in vitro d'aquestes molècules per estudiar l'efecte de les guanines en la formació d'estructures secundàries, com per exemple els G-quàdruplex. També es va estudiar la conformació de triple hèlix formada pels PPRH reparadors amb les seves seqüències diana de pirimidines, fins i tot quan el PPRH reparador es plega en una estructura de G-quàdruplex enlloc de en forma de pinça. Com a segona part de la tesi, hem desenvolupat una nova aplicació de la tècnica d'assaig de canvi de mobilitat electroforètica (EMSA), per demostrar la unció entre els miRNAs i les seves seqüències diana. Durant més de dues dècades, la investigació en el nostre laboratori s'ha centrat en l'estudi farmacogenòmic de la resistència al metotrexat (MTX) en la quimioteràpia contra el càncer, per la inhibició del gen de la dhfr. A més de l'amplificació gènica, el nostre grup ha demostrat que molts gens estan involucrats en el mecanisme, així com també hi estan involucrats els micro-RNAs. El miR-224 i els seus gens diana, SLC4A4, CDS2 i HSPC159 van ser identificats per jugar un paper important en la resistència al MTX en cèl.lules de càncer de colon. Per aquesta raó, el miR-224 va ser l'escollit per mostrar d'una manera directa i específica, la seva habilitat per unir-se al gen diana SLC4A4, establint així la tècnica d'EMSA com un mètode senzill i útil per validar la interacció entre un miRNA i la seva diana específica de mRNA.

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Baillet, Victoire. "Étude de l’impact mutationnel d’une perte de méthylation de l’ADN chez Arabidopsis thaliana." Thesis, Paris Sciences et Lettres (ComUE), 2018. http://www.theses.fr/2018PSLEE041.

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Chez les plantes et les mammifères, la méthylation de l’ADN est une modification chromatinienne qui joue un rôle pivot dans le maintien de l’intégrité des génomes, notamment au travers de l’extinction épigénétique des éléments transposables (ET). Cependant, dans la mesure où la désamination spontanée des cytosines méthylées, qui peut conduire à des transitions C>T, est plus fréquente que celle des cytosines non méthylées, la méthylation est également intrinsèquement mutagène. Cette mutabilité accrue est de fait très certainement à l’origine de la déplétion en dinucléotides CpG observée dans les génomes de mammifères, naturellement méthylés à ces sites sauf au sein des «îlots CpG». A l’exception de cet effet bien connu, aucune étude à ce jour n’a exploré directement et de façon exhaustive l’impact de la méthylation sur le spectre des mutations spontanées. Dans ce travail, je tire profit d’une population de lignées epiRIL (epigenetic recombinant inbred lines) établie chez la plante Arabidopsis pour évaluer à l’échelle du génome l’impact de la méthylation de l’ADN sur le paysage mutationnel. Les epiRILs dérivent du croisement entre deux parents quasi- isogéniques, l’un sauvage et l’autre porteur d’une mutation conduisant à une réduction de 70% de la méthylation du génome, et il a pu être mis en évidence que des différences parentales de méthylation pouvaient être héritées de façon stable pour >1000 régions le long du génome. Au moyen de données de séquençage disponibles pour >100 epiRIL, j’ai effectué la caractérisation exhaustive des variants ADN (autres qu’ET) uniques à chaque lignée mais également en ségrégation parmi les epiRIL, ce qui constitue à terme une ressource pour les différentes équipes qui utilisent cette population. En analysant le patron de variants uniques, j’ai mis en évidence une réduction spécifique du taux de transitions C>T en lien avec l’hypométhylation stable dans les epiRIL. J’ai aussi pu décrire que si la remobilisation extensive des ET dans cette population a modelé le spectre des insertions et délétions ponctuelles, elle ne se traduit pas pour autant par des réarrangements récurrents. Je présente également les développements méthodologiques mis en place afin d’effectuer la caractérisation de QTL (quantitative trait loci) “épigénétiques” préalablement identifiés dans la population
In both plants and mammals, DNA methylation plays a pivotal role in ensuring proper genome function and integrity, notably through the epigenetic silencing of transposable elements (TEs). However, as spontaneous deamination of 5- methylcytosine (5mC), which can lead to C>T transitions, is more frequent than that of unmethylated C, DNA methylation is also inherently mutagenic. This higher mutability of 5mC has indeed been proposed to explain the depletion in CpG dinucleotides in mammalian genomes, which are typically methylated at these sites except in socalled CpG islands. Despite this well-characterized effect of DNA methylation, we still lack a comprehensive view of its impact on the whole mutation spectrum in any given organism. Here, I take advantage of a population of so-called epigenetic Recombinant Inbred Lines (epiRILs) established in the flowering plant Arabidopsis thaliana to investigate the impact of DNA methylation on the spectrum of spontaneous mutations genome wide. The epiRIL population derives from a cross between a wild-type individual and a near-isogenic mutation deficient in DNA methylation, and it could be shown that parental differences in DNA methylation are stably inherited for at least 8 generations over >1000 regions across the genome. Building on whole-genome sequencing data available for >100 epiRILs, I performed a thorough characterization of non- TE DNA sequence variants that are either private to one line or segregating in the population, therefore establishing a resource for research groups that make use of the epiRIL population. Based on the pattern of private variants, I show a specific reduction in the rate of C>T transitions in the epiRILs, in line with the heritable hypomethylation in this population. I also describe that the extensive TE remobilisation at play among the epiRILs shapes the spectrum of short insertions and deletions yet does not translate into recurrent large-scale mutation events. On another note, I also present methodological developments aimed towards the identification of causal (epi)variants underlying so-called “epigenetic QTL” (quantitative trait loci) previously described in the epiRIL population

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Azaiez, Aida. "Implication des gènes de réparation de l'ADN dans la stabilité du génome d'Arabidopsis thaliana - Étude de l'instabilité des microsatellites." Doctoral thesis, Université Laval, 2005. http://hdl.handle.net/20.500.11794/18033.

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La présente étude nous a permis de développer un système rapporteur, basé sur le gène bactérien codant pour la β-glucuronidase (GUS), afin de mesurer l’instabilité des microsatellites chez Arabidopsis thaliana. Les microsatellites sont des séquences particulières du génome susceptibles à des mutations fréquentes qui se produisent au cours de la réplication. On a démontré dans ce projet une corrélation entre la longueur du microsatellite et son taux de mutation. De même, l’orientation du microsatellite influence son instabilité. Dans deux études ultérieures, nous avons également étudié l’implication des gènes de correction des mésappariements (système MMR, « Mismatch repair ») dans l’instabilité des microsatellites. Le système MMR corrige les erreurs survenues au cours de la réplication des microsatellites. Nous avons montré que l’inactivation des gènes AtPMS1 et AtMSH2 entraîne l’augmentation de l’instabilité des séquences répétées, d’où l’importance de ces gènes dans le maintien de la stabilité des microsatellites en particulier et du génome en général.
The present study allowed us to develop a reporter system based on a bacterial gene encoding for β-glucuronidase (GUS), in order to measure microsatellite instability in Arabidopsis thaliana. Microsatellites are particular regions of the genome undergoing frequent mutations during replication. A correlation between length of the repetitive tracts and microsatellite instability was demonstrated. Besides, the orientation of the microsatellite influenced its instability. In two later studies, we have also studied the effect of mismatch repair genes (MMR) on microsatellite instability. Mismatch repair system corrects errors that occur during the replication of microsatellites. We showed that inactivation of AtPMS1 and AtMSH2 genes increased tracts instability, hence the importance of these genes in the maintenance of microsatellite stability and genome stability in general.

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Domingue, Olivier. "Induction de répression génétique post-transcriptionnelle de ATMLH1, un des principaux gènes de correction des mésappariements de l'ADN chez Arabidopsis thaliana." Thesis, Université Laval, 2005. http://www.theses.ulaval.ca/2005/22556/22556.pdf.

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Afin de caractériser sa fonction, des lignées transgéniques de type ihpRNA ont été produites pour induire une inactivation spécifique du gène AtMLH1 chez Arabidopsis thaliana. Elles ont été générées en transformant la plante avec un vecteur comportant un même fragment du gène AtMLH1 inséré en directions sens et anti-sens. Cinq lignées montrant un éventail d'intensités de répression ont été rigoureusement analysées. Trois lignées, ihpMLH1-63, -70 et 73, présentaient une forte réduction de l’abondance du transcrit (~10 % du sauvage), une (ihpMLH1-51) montrait un abaissement intermédiaire (~30 % du sauvage) et une dernière (ihpMLH1-54) n’avait qu’une inactivation mineure (~60 %), tel que mesuré par RT-PCR semi-quantitatif. Une étude northern a permis de détecter des siRNA dont l’abondance était corrélée avec l’intensité de la répression. L’étude des conséquences phénotypiques de l’inactivation du gène AtMLH1 a été amorcée en examinant son impact sur l’instabilité des microsatellites via un gène rapporteur. Dû à un phénomène de co-suppression, cette analyse n'a pas été informative. Les conséquences de l’inactivation du gène AtMLH1 feront donc l'objet de futurs travaux.

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Barbier, Valessa. "Développement, étude et applications de nouvelles matrices "intelligentes" pour l'analyse automatisée d'ADN par électrophorèse : séquençage, cartographie et diagnostic." Paris 6, 2002. http://www.theses.fr/2002PA066388.

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Gopalan, Nair Rekha. "Déterminants moléculaires de l'adaptation à l'hôte chez la bactérie phytopathogène Ralstonia solanacearum." Thesis, Toulouse 3, 2020. http://www.theses.fr/2020TOU30207.

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Le complexe d'espèces Ralstonia solanacearum (RSSC) est un pathogène de plantes très agressif qui affecte plus de 250 espèces végétales dont la tomate, la pomme de terre, le Pelargonium, le gingembre et le bananier. De plus, ce pathogène multi-hôtes est connu pour sa capacité d'adaptation rapide à de nouvelles plantes hôtes et à de nouveaux environnements. Afin de combattre ce pathogène, il est nécessaire de mieux connaitre les mécanismes moléculaires qui gouvernent ces capacités adaptatives. Les objectifs de cette thèse ont été (1) d'identifier les bases génétiques de l'adaptation d'une souche RSSC à un cultivar résistant, (2) d'analyser le rôle potentiel des modifications épigénétiques dans l'adaptation à l'hôte et (3) d'analyser l'impact de l'espèce végétale sur les modifications génétiques, transcriptomiques et épigénétiques dans les clones bactériens adaptés. Cette étude a été menée sur des clones générés par évolution expérimentale de la souche GMI1000 de RSSC après 300 générations de passages en série sur la tomate résistante 'Hawaii 7996', l'aubergine sensible 'Zebrina' et le haricot tolérant 'Blanc précoce'. Des tests de compétition avec le clone ancestral GMI1000 ont démontré que 95% des clones évolués sur Hawaii 7996 étaient mieux adaptés à la croissance dans cette espèce de tomate que le clone ancestral. L'analyse des séquences génomiques de ces clones adaptés a révélé entre 0 et 2 mutations par clone et nous avons démontré que ces mutations étaient des mutations adaptatives. L'analyse des transcriptomes des clones évolués sur Hawaii 7996, Zebrina et Haricot a révélé un chevauchement parmi les listes des gènes différentiellement exprimés, suggérant une convergence vers un recâblage global du réseau de régulation de la virulence. Deux régulateurs de transcription, HrpG, l'activateur du régulon du système de sécrétion de type III et EfpR, un régulateur global de la virulence et des fonctions métaboliques, sont apparus comme des nœuds clés du réseau de régulation qui sont fréquemment ciblés par des modifications génétiques ou potentiellement épigénétiques affectant leur expression. Des variations transcriptomiques significatives ont également été détectées dans des clones évolués n'ayant aucune mutation, suggérant ainsi un rôle probable des modifications épigénétiques dans l'adaptation. La comparaison des profils de méthylation de l'ADN entre les clones évolués et le clone ancestral a révélé entre 13 et 35 régions différentiellement méthylées (DMRs). Aucun impact de la plante hôte sur la liste des DMRs n'est apparu. Certaines de ces DMRs ciblaient des gènes qui ont été identifiés comme étant différentiellement exprimés entre les clones évolués et le clone ancestral. Ce résultat supporte l'hypothèse que les modifications épigénétiques régulent l'expression des gènes et pourraient jouer un rôle majeur dans l'adaptation de RSSC à de nouvelles plantes hôtes
The Ralstonia solanacearum species complex (RSSC) is a destructive plant pathogen that infects more than 250-plant species including tomato, potato, pelargonium, ginger and banana. In addition, this multihost pathogen is known for rapid adaptation to new plant species and new environments. In order to overcome this pathogen, it is important to understand the molecular mechanisms that govern host adaptation. The objectives of this thesis were (1) to decipher the genetic bases of adaptation of a RSSC strain to a resistant cultivar, (2) to investigate the potential role of epigenetic modifications in host adaptation and (3) to analyze to impact of the plant species on genetic, transcriptomic and epigenetic modifications in RSSC adapted clones. This study was conducted on clones generated by experimental evolution of GMI1000 RSSC strain after 300 generation of serial passages on the resistant tomato ‘Hawaii 7996’ plant, the susceptible eggplant ‘Zebrina’ and the tolerant plant Bean ‘Blanc precoce’. Competitive experiments with the GMI1000 ancestral clone demonstrated that 95% of the clones evolved on Hawaii 7996 were better adapted to the growth into this tomato plant than the ancestral clone. Genomic sequence analysis of these adapted clones found between 0 and 2 mutations per clone and we demonstrated that they were adaptive mutations. Transcriptome analysis of the Hawaii, Zebrina and Bean evolved clones revealed a convergence towards a global rewiring of the virulence regulatory network as evidenced by largely overlapping gene expression profiles. Two transcription regulators, HrpB, the activator of the type 3 secretion system regulon and EfpR, a global regulator of virulence and metabolic functions, emerged as key nodes of this regulatory network that were frequently targeted by either genetic or potential epigenetic modification affecting their expression. Significant transcriptomic variations were also detected in evolved clones showing no mutation, suggesting a potential role of epigenetic modifications in adaptation. Comparison of the DNA methylation profiles between the evolved clones and the ancestral clone revealed between 13 and 35 differentially methylated regions (DMRs). No impact of the host plant on the list of DMRs appeared. Some of these DMRs targeted genes that were identified to be differentially expressed between the evolved clones and the ancestral clone. This result supported the hypothesis that epigenetic modifications regulate gene expression and could play a major role in RSSC adaptation to new host plants

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Raffour-Millet, Armêl. "Identification du mécanisme impliqué dans la formation de délétions de l'ADN mitochondrial : cas de la "Common Deletion"." Thesis, Paris, Muséum national d'histoire naturelle, 2017. http://www.theses.fr/2017MNHN0017/document.

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La mitochondrie est une organelle essentielle possédant son propre ADN circulaire. Cet ADN peut présenter des mutations et/ou des délétions, consécutives à l’exposition à différents types de dommages ou en raison de protéines mutées. Ces mutations ou délétions sont impliquées dans de nombreuses pathologies, dont les cancers, et le vieillissement. Leur apparition peut survenir notamment lors de la réplication ou de la réparation. A ce jour, la réplication et la réparation mitochondriales ne sont pas encore bien élucidées. L’objectif de ce projet est donc de mieux en appréhender les mécanismes et de mieux comprendre l’émergence d’anomalies en nous intéressant plus particulièrement à une délétion appelée « Common Deletion ». Ce travail reposait sur l’hypothèse que cette délétion put résulter d’une mauvaise réparation de cassure(s) double-brin et/ou d’une erreur durant la réplication de l’ADN mitochondrial. L’analyse de ces résultats révèle que la formation de la « Common Deletion » ne nécessite qu’une seule cassure double-brin proche des séquences répétées entourant cette dernière et implique les protéines de la réplication de l’ADN mitochondrial. Ainsi, ce travail permet de mieux saisir les mécanismes de réplication et de réparation assurant la stabilité de l’ADN mitochondrial. Un second projet a été de proposer un modèle d’étude in vitro des topoisomérases en utilisant des minicercles d’ADN permettant la visualisation du complexe covalent, étape clef de la réaction de relaxation de ces enzymes
Mitochondria is an essential organelle with its own circular DNA. This DNA may exhibit mutations and/or deletions, as a result of exposure to different types of damage or due to mutated proteins. These mutations or deletions are involved in many pathologies, including cancers, and aging. They may occur during replication or repair. For now, mitochondrial replication and repair have not yet been fully elucidated. The objective of this project is therefore to better understand the mechanisms and the emergence of anomalies by focusing on a deletion called "Common Deletion". This work was based on the assumption that this deletion could result from poor repair of double-strand break(s) and/or error during mitochondrial DNA replication. Analysis of these results reveals that the formation of the "Common Deletion" requires only a single double-strand break close to the repeated sequences surrounding the latter and involves the proteins of mitochondrial DNA replication. Thus, this work makes it possible to better understand the mechanisms of replication and repair ensuring the stability of mitochondrial DNA. A second project was to propose an in vitro model for topoisomerases using DNA minicircles allowing visualization of the covalent complex, a key step in the relaxation reaction of these enzymes

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Koch, Nathalie. "Séquençage des gènes pol et env du VIH-1 pour le suivi virologique des patients infectés : optimisation et validation des techniques de séquençage de l'ARN viral et de l'ADN proviral." Aix-Marseille 2, 2000. http://theses.univ-amu.fr.lama.univ-amu.fr/2000AIX20666.pdf.

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Le suivi thérapeutique des patients infectés par le VIH nécessite la détection des virus résistants aux antirétroviraux. Les tests de génotypage basés sur le séquençage nécessitant une certaine expertise, des techniques plus simples, basées sur le principe d'hybridation à des sondes oligonucléotidiques, ont été développées (LiPA, Puces à ADN, PCR différentielle. . . ). Nous avons montré, que pour le LiPA, le polymorphisme important du VIH au voisinage des codons d'intérêt entraîne un pourcentage conséquent de non hybridation. De plus, le LiPA appartient à une catégorie de tests permettant seulement l'analyse de quelques codons. Or, le nombre de drogues utilisées a considérablement augmenté ces dernières années avec, pour conséquence, une multiplication des mutations et des mécanismes de résistance (insertions, délétions, réactions croisées. . . ). Il est donc actuellement nécessaire de séquencer la totalité du gène de la protéase et une partie du gène de la RT. Deux types de tests permettent l'analyse d'une séquence entière : le séquençage par la méthode classique de Sanger et les puces à ADN. Des kits de diagnostic utilisant des méthodes de séquençages sont aujourd'hui disponibles. Nous avons montré que les kits basés sur l'utilisation du séquençage classique (Trugene, Viroseq) permettent la détection des insertions alors que plusieurs études ont montré que les puces à ADN (PRT 440) ne pouvaient pas détecter ce type de mutations. Toutefois, ces kits de séquençage classique nécessitent quelques améliorations au niveau de leur logiciel d'analyse pour une meilleure signalisation des insertions. Actuellement, le séquençage par la méthode de Sanger reste la technique de référence pour la détection des mutations de résistance. Nous avons montré que l'analyse du virus plasmatique permettait de détecter plus de mutations que l'analyse du virus proviral. Cependant, chez les patients ayant un passé thérapeutique long et chaotique, le séquençage de l' ADN proviral pourrait être envisagé afin de déterminer toutes les mutations de résistance archivées dans les lymphocytes mais pas forcement présentes dans le virus plasmatique. Enfin, l'utilisation d'une technique« maison » de séquençage nous a permis: - de séquencer les sites de clivage et de mettre en évidence une forte association entre la mutation A431V du site P7 / P1 et la mutation M46I de la protéase, - de réaliser une étude épidémiologique au Burundi, montrant que le sous-type C est majoritairement présent dans ce pays.

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PAUMARD, RIGAL SOLANGE. "Etude genetique et biochimique des variations de l'adn ribosomal du chromosome x chez la souche oregon r de drosophila melanogaster." Paris 7, 1988. http://www.theses.fr/1988PA077135.

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Bellocq-Goncalves, Delphine. "Etude sur modèle murin de la bioactivation métabolique des amines aromatiques hétérocycliques par les cellules épithéliales coliques mutées ou non sur le gène Adenomatous polyposis coli (Apc)." Toulouse 3, 2008. http://www.theses.fr/2008TOU30049.

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Les amines aromatiques hétérocycliques (AAHs) sont formées après cuisson des aliments : viandes rouges et poissons. Ces composés mutagènes et cancérigènes sont impliqués dans la carcinogenèse colorectale mais le rôle des cellules intestinales dans la bioactivation des AAHs n'est pas clairement établi. Une mutation du gène Adenomatous polyposis coli (Apc) apparaît précocement dans les cancers coliques. Les cellules coliques Apc+/+ et ApcMultiple intestinal neoplasia (Min)/+ constituent un modèle pertinent pour l'étude de la promotion tumorale. Les études qui sont présentées ont permis d'étudier les capacités de bioactivation métabolique de ces cellules vis-à-vis de 3 AAHs, PhIP, MeIQx et IQ. En condition d'induction par le 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-p-dioxine (TCDD), les cellules ApcMin/+ produisent des taux plus élevés de métabolites réactifs. Eu égard à la cancérogénicité des AHHs en lien avec la formation d'adduits à l'ADN, ces cellules mutées sont rendues " métaboliquement compétentes ". Par RT-qPCR, nous avons montré qu'après induction par le TCDD les cellules ApcMin/+ présentent des niveaux d'expression des gènes CYP1A1, CYP1A2 et CYP1B1 plus élevés que les cellules Apc+/+. Ainsi, in situ, la bioactivation des AAHs peut être à l'origine de nouvelles mutations. Après transfection des cellules Apc par la forme humaine du CYP1A2, les niveaux d'ARNm, de protéines et les activités enzymatiques mesurées sont plus importants dans les cellules ApcMin/+. Ces résultats indiquent que le gène Apc est impliqué dans la régulation de l'expression des cytochromes P450 (CYPs). Un lien existerait entre le récepteur Ah, principal acteur de la régulation des CYPs de la famille 1, et Apc, acteur de la voie de signalisation Wnt/ß-caténine. Les CYPs impliqués dans la bioactivation des AAHs pourraient, en lien avec une perturbation de l'homéostasie cellulaire liée à une mutation du gène Apc, être un facteur majeur de la promotion des cancers colorectaux, voire de leur initiation
Heterocyclic aromatic amines (HAA) are formed in cooked red meat and fish and are considered as potent promoting dietary factors of colon carcinogenesis. Role of intestine cells in HAA bioactivation is not yet fully explained. Loss of function of the Adenomatous polyposis coli (APC) gene product is an early and frequent event in human colorectal carcinogenesis. Normal (Apc+/+) and premalignant (ApcMultiple intestinal neoplasia (Min)/+) mouse colonic epithelial cells allow to study carcinogenesis promotion, but were not characterized for bioactivation of HAA. The overall goal of this work was to characterize the metabolic bioactivation potential towards three HAA, i. E. PhIP, MeIQx and IQ in these colonic cell lines. ApcMin/+ cells when induced by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) produce significantly higher amount of HAA reactive metabolites than Apc+/+ cells. Parallel RT-qPCR experiments demonstrate that induction by TCDD has prevailing effects in gene expression of CYP1A1, CYP1A2 and CYP1B1 in ApcMin/+ cells. So, a more important metabolic HAA bioactivation potential measured in ApcMin/+ cells can be linked to a higher probability to generate in situ new mutations. After transfection of Apc+/+ and ApcMin/+ cells with human CYP1A2 gene, we have shown that mRNA and protein levels, and also a CYP1A2-related activity were increased in mutated cells. These results indicate that mutation of Apc gene leads to a co-ordinated dysregulation of CYPs expression in mouse colon epithelial cells. A possible link between the aryl hydrocarbon receptor, a main actor in the regulation of CYP1 family expression, with the Apc gene, a main actor of the Wnt/ß-catenin pathway may exist. This disrupted expression of CYP1 members in connection with the mutation of Apc may be of great importance in colorectal carcinogenesis

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Touat, Mahdi. "Mécanismes et implications thérapeutiques de l'hypermutation dans les gliomes Mechanisms and Therapeutic Implications of Hypermutation in Gliomas Mismatch Repair Deficiency in High-Grade Meningioma: A Rare but Recurrent Event Associated With Dramatic Immune Activation and Clinical Response to PD-1 Blockade Buparlisib in Patients With Recurrent Glioblastoma Harboring Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathway Activation: An Open-Label, Multicenter, Multi-Arm, Phase II Trial Hyman DM. BRAF Inhibition in BRAFV600-Mutant Gliomas: Results From the VE-BASKET Study Glioblastoma Targeted Therapy: Updated Approaches From Recent Biology Successful Targeting of an ATG7-RAF1 Gene Fusion in Anaplastic Pleomorphic Xanthoastrocytoma With Leptomeningeal Dissemination Ivosidenib in IDH1-Mutated Advanced Glioma." Thesis, université Paris-Saclay, 2020. http://www.theses.fr/2020UPASL071.

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Une élévation majeure de la charge mutationnelle (hypermutation) est observée dans certains gliomes. Néanmoins, les mécanismes de ce phénomène et ses implications thérapeutiques notamment concernant la réponse à la chimiothérapie ou à l'immunothérapie sont encore mal connus. Sur le plan du mécanisme, une association entre hypermutation et mutations des gènes de la voie de réparation des mésappariements de l'ADN (MMR) a été rapportée dans les gliomes, cependant la plupart des mutations MMR observées dans ce contexte n'étaient pas fonctionnellement caractérisées, et leur rôle dans le développement d’hypermutation restait de ce fait incertain. De plus, l'impact de l'hypermutation sur l'immunogénicité des cellules gliales et sur leur sensibilité au blocage des points de contrôles immunitaires (par exemple par traitement anti-PD-1) n’est pas connu. Dans cette étude, nous analysons de manière exhaustive les déterminants cliniques et moléculaires de la charge et des signatures mutationnelle dans 10 294 gliomes, dont 558 (5,4%) tumeurs hypermutées. Nous identifions deux principales voies responsables d'hypermutation dans les gliomes : une voie "de novo" associée à des déficits constitutionnels du système MMR et de la polymérase epsilon (POLE), ainsi qu'une voie "post-traitement", plus fréquente, associée à l'acquisition de déficits MMR et de résistance secondaire dans les gliomes récidivant après chimiothérapie par temozolomide. Expérimentalement, la signature mutationnelle des gliomes hypermutés post-traitement (signature COSMIC 11) était reproduite par les dommages induits par le témozolomide dans les cellules MMR déficientes. Alors que le déficit MMR s'associe à l'acquisition de résistance au témozolomide, des données cliniques et expérimentales suggèrent que les cellules MMR déficientes conservent une sensibilité à la nitrosourée lomustine. De façon inattendue, les gliomes MMR déficients présentaient des caractéristiques uniques, notamment l'absence d'infiltrats lymphocytaires T marqués, une hétérogénéité intratumorale importante, une survie diminuée ainsi qu’un faible taux de réponse aux traitements anti-PD-1. De plus, alors que l'instabilité des microsatellites n'etait pas détectée par des analyses en bulk dans les gliomes MMR déficients, le séquençage du génome entier à l'échelle de la cellule unique de gliome hypermuté post-traitement permettait de démontrer la presence de mutations des microsatellites. Collectivement, ces résultats supportent un modèle dans lequel des spécificités dans le profil mutationnel des gliomes hypermutés pourraient expliquer l’absence de reconnaissance par le système immunitaire ainsi que l’absence de réponse aux traitements par anti-PD-1 dans les gliomes MMR déficients. Nos données suggèrent un changement de pratique selon lequel la recherche d’hypermutation par séquençage tumoral lors de la récidive après traitement pourrait informer le pronostic et guider la prise en charge thérapeutique des patients
High tumor mutational burden (hypermutation) is observed in some gliomas; however, the mechanisms by which hypermutation develops and whether it predicts chemotherapy or immunotherapy response are poorly understood. Mechanistically, an association between hypermutation and mutations in the DNA mismatch-repair (MMR) genes has been reported in gliomas, but most MMR mutations observed in this context were not functionally characterized, and their role in causing hypermutation remains unclear. Furthermore, whether hypermutation enhances tumor immunogenicity and renders gliomas responsive to immune checkpoint blockade (e.g. PD-1 blockade) is not known. Here, we comprehensively analyze the clinical and molecular determinants of mutational burden and signatures in 10,294 gliomas, including 558 (5.4%) hypermutated tumors. We delineate two main pathways to hypermutation: a de novo pathway associated with constitutional defects in DNA polymerase and MMR genes, and a more common, post-treatment pathway, associated with acquired resistance driven by MMR defects in chemotherapy-sensitive gliomas recurring after temozolomide. Experimentally, the mutational signature of post-treatment hypermutated gliomas (COSMIC signature 11) was recapitulated by temozolomide-induced damage in MMR-deficient cells. While MMR deficiency was associated with acquired temozolomide resistance in glioma models, clinical and experimental evidence suggest that MMR-deficient cells retain sensitivity to the chloroethylating nitrosourea lomustine. MMR-deficient gliomas exhibited unique features including the lack of prominent T-cell infiltrates, extensive intratumoral heterogeneity, poor survival and low response rate to PD-1 blockade. Moreover, while microsatellite instability in MMR-deficient gliomas was not detected by bulk analyses, single-cell whole-genome sequencing of post-treatment hypermutated glioma cells demonstrated microsatellite mutations. Collectively, these results support a model where differences in the mutation landscape and antigen clonality of MMR-deficient gliomas relative to other MMR-deficient cancers may explain the lack of both immune recognition and response to PD-1 blockade in gliomas. Our data suggest a change in practice whereby tumor re-sequencing at relapse to identify progression and hypermutation could inform prognosis and guide therapeutic management

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Grandval, Philippe. "Caractérisation des variations génétiques constitutionnelles de signification inconnue dans le syndrome de Lynch." Thesis, Aix-Marseille, 2014. http://www.theses.fr/2014AIXM5004/document.

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Анотація:

Le syndrome de Lynch est une affection héréditaire autosomique dominante due à des mutations constitutionnelles des gènes du système de réparation de l'ADN (MLH1, MSH2 et MSH6). Depuis 20 ans le réseau français des laboratoires impliqués dans le syndrome de Lynch a identifié un total de 6687 variants. Sept cent sept d'entre eux, essentiellement des variants faux sens, restent encore des variants de signification inconnue (VSI), sans utilité pour le conseil génétique. Le but de notre étude était de développer un algorithme permettant de classer les variants de signification inconnue. Les critères utilisés étaient les données des analyses in silico, phénotypiques (ségrégation, critères d'Amsterdam), l'état de la fonction MMR (MisMatch Repair) dans les cellules tumorales, les tests fonctionnels et d'épissage, ainsi que les données publiées. Cet algorithme a été appliqué à l'ensemble des VSI de la base de données française et nous a permis de caractériser 370 variants . Les données ont été intégrées dans la base de données française UMD des gènes MMR afin d'être disponibles pour la communauté scientifique. Grace aux données collectées par le réseau, nous avons également pu caractériser le phénotype du syndrome de Lynch. Nous avons ainsi confirmé que le cancer du sein ne fait pas partie du spectre du syndrome de Lynch et que les formes de ce syndrome associées à une mutation du gène EPCAM n'entrainent qu'un risque très faible de cancers de l'endomètre, permettant ainsi d'adapter les recommandations de suivi dans cette situation.de l'endomètre, permettant ainsi d'adapter les recommandations de suivi dans cette situation
Lynch syndrome is a frequent cancer predisposition with an autosomal dominant mode of inheritance and caused by heterozygous germ line mutations in one of the major DNA mismatch repair (MMR) genes (MLH1, MSH2 and MSH6). For 20 years, the French laboratories network involved in Lynch syndrome identified a total of 6687 variations. Among them, 707, mainly missense variations, remained variants of uncertain significance (VUS), thus could not be used for reliable genetic counseling. The aim of our study was to develop an algorithm able to classify VUS, according to the international consensus (IARC). This algorithm was constructed based on criteria usually required for genetic characterization such as in silico analysis, phenotypical data (segregation, Amsterdam criteria's), MMR status in tumor cells, functional assays, splicing analyses and published data. Data were registered in the French database. As a result of this work, we were able to classify 370 variants of the 707 (52,3%). As part of this work, we also analyzed phenotypical data of patients with Lynch syndrome and showed that breast cancer can definitively be excluded from the spectrum of Lynch-related cancers, and that EPCAM mutations, which may lead to Lynch syndrome, are associated with a very low incidence of endometrial cancer and have probably to be considered as an allelic disease with specific clinical recommendations

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Fleury, Hubert. "Implication des inhibiteurs de PARP dans le cancer de l’ovaire." Thèse, 2017. http://hdl.handle.net/1866/20221.

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