Добірка наукової літератури з теми "Mutations de l'ADNmt"

Cet article est une revue des essais in vitro et in vivo utilisés pour évaluer le caractère génotoxique des micropolluants des milieux environnementaux relatifs aux eaux continentales et marines, rejets liquides d'origine domestique, industrielle ou agricole, sédiments de rivières et boues de stations de traitement d'épuration. Les essais in vitro réalisés sur cellules eucaryotes ou procaryotes sont fondés sur la détection des mutations géniques et chromosomiques, ou la mesure des adduits à l'ADN. Ils constituent des systèmes d'épreuve miniaturisés qui requièrent des volumes d'échantillons faibles; ils se prêtent ainsi au dépistage à grande échelle de la génotoxicité et à l'étude des concentrats et des extraits préparés à partir des milieux contaminés. Ils sont cependant moins bien adaptés à la prédiction de l'impact des micropolluants sur l'environnement. La recherche de conditions d'essai plus proches de la réalité environnementale a conduit au développement des essais in vivo réalisés sur organismes supérieurs, mollusques, poissons ou amphibiens, qui évaluent un potentiel génotoxique à partir d'études cytogénétiques ou d'études du caryotype des organismes exposés. Les critères de génotoxicité étudiés in vitro peuvent être utilisés dans le cadre d'études écoépidémiologiques, sur le terrain, afin d'évaluer l'impact réel des micropolluants présents dans les milieux environnementaux sujets à des contaminations d'origines diverses.

Les cellules humaines contiennent multiples copies d'ADNmt, qui code 37 gènes. L'ADNmt est sujet à des mutations qui peuvent conduire à des maladies affectant gravement les tissus ayant des besoins énergétiques élevés. Nous nous sommes concentrés sur deux mutations pathogènes du gène MT-ND5, 13513G>A et 13514A>G, qui altèrent Asp393, un résidu essentiel à la translocation des protons lors de la synthèse de l'ATP. Notre objectif était d'évaluer si la technologie CRISPR/Cas12a peut être appliquée à l'ADNmt humain. Nous avons démontré que les crRNA chimiquement modifiés améliorent la spécificité de Cas12a à des concentrations physiologiques de Mg²⁺. L'activité spécifique des éditeurs de bases mitochondriales fusionnés à AsCas12a ciblant les gènes ND4 et ND5 de l'ADNmt a été démontrée à la fois in vitro et, pour la première fois, dans les mitochondries de cellules HEK293 en culture. Nous avons également démontré que Cas12a et crRNA fusionnés étaient importés dans des mitochondries isolées, montrant le potentiel de la technologie crosslink pour améliorer l'adressage mitochondriale de crRNA
Human cells contain multiple copies of mtDNA, which encodes 37 genes. mtDNA is prone to mutations that can lead to diseases severely affecting tissues with high energy demands. We focused on two pathogenic mutations in the MT-ND5 gene,13513G>A and 13514A>G, that alter Asp393, a residue critical for proton translocation during ATP synthesis. Our aim was to evaluate whether CRISPR/Cas12a technology can be applied to human mtDNA. We demonstrated that chemically modified crRNAs improve the specificity of the Cas12a system under physiological levels of Mg²⁺. The specific activity of AsCas12a-fused mitochondrial base editors targeting the ND4 and ND5 genes of mtDNA was shown both in vitro and, for the first time, in the mitochondria of cultured HEK293 cells. We also demonstrated that crosslinked Cas12a and crRNA were imported into isolated mitochondria, showing the potential of crosslink technology in enhancing crRNA mitochondrial delivery

Les maladies héréditaires résultant de mutations de l’ADN mitochondrial (ADNmt) sont des affections graves à taux de récidive élevé en raison de leur mode d’hérédité maternel. La gravité variable et le caractère pluritissulaire des atteintes cliniques tient en partie à la coexistence de molécules d’ADNmt sain et mutant en proportion variable dans les différents tissus (hétéroplasmie). La crainte d’une possible variation des taux d’hétéroplasmie au cours du développement embryofoetal humain a freiné le développement des procédures de diagnostic prénatal et préimplantatoire de ces affections. De plus, le passage éventuel des molécules d’ADNmt au travers d’un goulot d’étranglement lors de l’ovocytogenèse (théorie du bottleneck)
Inherited disorders resulting from mutations of mitochondrial DNA (mtDNA) are serious diseases with a high recurrence risk due to their maternal mode of inheritance. Variability in clinical severity and various multi-tissual involvement result in a large extent from the coexistence of wild-type and mutant mtDNA molecules in various proportions in different tissues (heteroplasmy). Uncertainties regarding the potential variation of heteroplasmy load during human embryofetal development had hampered the development of prenatal (PND) and preimplantation (PGD) diagnostic procedures. Moreover, the restriction of the mtDNA molecule number, through a putative bottleneck at the time of

L'adn mitochondrial (adn mt) code pour des proteines de la chaine respiratoire et de l'atp synthetase. Nous avons retrouve des deletions heteroplasmiques de l'adn mt dans les tissus de patients atteints de myopathies oculaires et des mutations ponctuelles de l'adn mt dans les tissus de patients atteints de syndrome de merrf et de melas. Les deletions sont differentes d'un individu a l'autre (3 a 8,5 kb) et sont identiques dans les tissus d'un meme individu mais la quantite de molecules anormales est variable d'un tissu a l'autre. Elles amputent plusieurs genes codant pour les sous-unites des complexes i, iii, iv, et v et plusieurs genes d'arnt. Plus la quantite de genome mute est importante plus le deficit biochimique est detectable. Le mecanisme implique dans la formation des deletions demeure inconnu pourtant la presence de sequences repetees dans les 3/4 des cas suggere des mecanismes de recombinaison apres appariements de sequences homologues. Les mutations ponctuelles a la position 8344 et 3243 sont specifiques respectivement du syndrome de merrf et du syndrome de melas. Elles se situent dans les genes d'arn de transfert de la lysine au niveau de la boucle t pseudouridine c (8344) et de la leucine au niveau de la boucle dihydouracile (3243). Elles sont heteroplasmiques et se retrouvent a des taux variables suivants les tissus. Les mutations ponctuelles sont transmises selon les lois de l'heredite maternelle. Pour les deletions ce schema n'est pas retrouve: certains cas sont sporadiques, d'autres sont familiaux montrant une heredite autosomale dominante ce qui suggere l'intervention d'une proteine nucleaire dans le processus de formation des deletions

Ce travail de thèse comporte trois projets visant à approfondir la caractérisation moléculaire des adénocarcinomes du rein à cellules claires (ccRCC) et à en améliorer le diagnostic.Le premier projet traite de l’identification de mutations oncogéniques présentes dans les éléments régulateurs actifs du génome des ccRCC. L’utilisation de données de séquençage pangénomique de patients atteints de ccRCC et de données épigénétiques (ChIP-seq et ATAC-seq) de lignées cellulaires de cancer du rein a permis l’identification d’îlots de mutations situés dans ces éléments régulateurs. De plus, l’utilisation de données de RNA-seq a permis d’identifier plusieurs îlots de mutation associés à un changement d’expression génique, dont un situé dans le premier intron du gène WWC1. Ce gène appartient à la voie Hippo, connue pour être impliquée dans l’oncogenèse. Ce travail constitue la première étude à permettre l’identification de mutations non-codantes localisées sur des éléments régulateurs actifs définis dans un type cellulaire pertinent.Le deuxième volet de ce travail consiste en une étude des altérations moléculaires de la voie FGF/FGFR qui est actuellement la cible d’essais cliniques dans le ccRCC. Il a permis de suggérer une implication de l’activation de la voie FGF/FGFR dans l’oncogenèse du ccRCC et dans le pronostic vital des patients, notamment par l’action de régulateurs négatifs de cette voie tel que SEF.Enfin, la troisième partie concerne la mise au point d’un test de diagnostic non-invasif du ccRCC à partir de l’ADN circulant. Il a abouti à l’identification de biomarqueurs hyperméthylés et au développement de tests sensibles basés sur des qPCR spécifiques de la méthylation
This thesis is composed of three projects looking to improve molecular characterization and diagnosis of clear cell renal cell carcinoma (ccRCC). The first project concern the identification of oncogenic mutations located on active regulatory elements of ccRCC. The use of whole-genome sequencing data of an hundred patients affected by ccRCC and epigenetic data (ChIP-seq and ATAC-seq) from renal cancer cell lines enabled the identification of mutation islands located in these active regulatory elements. Moreover, the use of RNA-seq data highlighted the association between some mutation islands and gene expression changes. One mutation island has been identified on a regulatory element located in the first intron of KIBRA. This gene is a member of the Hippo pathway known to be involved in ccRCC tumorigenesis. This pioneer work in integrating approach of genetic and epigenetic data consists in the first study that describes non-coding mutations located on active regulatory elements identified on a cell type relevant to the study. The second project consists of a study of the molecular alterations of the FGF/FGFR pathway, that is currently the target of clinical assays in ccRCC. It suggests an involvement of the FGF/FGFR pathway activation in ccRCC tumorigenesis and in patient prognosis, partly through the expression alterations of negative regulators of this pathway such as SEF.Finally, the set-up of a ccRCC non-invasive diagnostic test from circulating DNA has been initiated. Hypermethylated biomarkers have been identified and sensible tests based on methylation-specific qPCR have been set up in the third project

Les mitochondries ont la particularité de posséder leur propre génome, l'ADN mitochondrial (ADNmt), transmis exclusivement par la mère via le cytoplasme de l'ovocyte. Les mutations pathogènes au sein de l'ADNmt sont à l'origine des maladies mitochondriales. Le transfert de pronoyaux (TPN), non autorisé en France, est une technique proposée depuis 2016 par le Royaume Uni afin de substituer le génome mitochondrial muté d'un zygote par un autre non muté. Cette méthode reste largement débattue sur le plan international en termes d'efficacité et de sécurité. L'objectif de nos travaux était d'évaluer la faisabilité clinique et technique du TPN. Nos recherches ont confirmé que les femmes porteuses d'un variant pathogène de l'ADNmt présentaient des critères de réponse ovarienne à la stimulation comparable à un groupe contrôle. Grâce à une étude sociologique nous avons également montré que cette technique recevait une adhésion par la grande majorité des femmes interrogées principalement car elle permet de maintenir un lien génétique entre une femme et son enfant. Puis nous avons mis au point la technique de TPN en utilisant des zygotes triploïdes (3PN) donnés à la recherche et après autorisation de l'Agence de Biomédecine. Enfin, nous avons évalué la pertinence de l'utilisation des 3PN et démontré leurs limites en termes de développement et de statut chromosomique, même lorsque la diploïdie était rétablie. Ces travaux ouvrent des perspectives sur la faisabilité et l'acceptation du TPN. De futures recherches sont nécessaires pour explorer la sécurité de cette technique
Mitochondria have the unique characteristic of possessing their own genome, mitochondrial DNA (mtDNA), which is exclusively transmitted by the mother through the cytoplasm of the oocyte. Pathogenic mutations in mtDNA are responsible for mitochondrial diseases. Pronuclear transfer (PNT), not authorized in France, is a technique proposed by the United Kingdom since 2016 to replace the mutated mitochondrial genome of a zygote with a non-mutated one. This method remains widely debated internationally regarding its efficacy and safety. The aim of our work was to evaluate the clinical and and technical feasibility of PNT. Our research confirmed that women carrying a pathogenic variant of mtDNA exhibited ovarian response criteria to stimulation comparable to a control group. Through a sociological study, we also showed that this technique received support from the majority of women surveyed, primarily because it maintains a genetic link between a woman and her child. Subsequently, we developed the PNT technique using triploid zygotes (3PN) donated for research, following authorization from the Biomedicine Agency. Finally, we assessed the relevance of using 3PN and demonstrated their limitations in terms of development and chromosomal status, even when diploidy was restored. This work opens up perspectives on the feasibility and acceptance of PNT. Future research is necessary to explore the safety of this technique

Des mutations héréditaires de gènes intervenant dans la réparation de l'ADN sont à l'origine de deux types de pathologies. D'une part, on trouve des maladies pédiatriques sévères dites maladies cassantes, comme l'ataxie-télangiectasie, le syndrome de Nijmegen ou l'ATLD (Ataxia-Telangiectasia Like Disorder), dues respectivement à l'inactivation des gènes ATM, NBN/NBS1 et MRE1L Ces pathologies partagent certains symptômes, notamment une instabilité chromosomique, un déficit immunitaire, une radiosensibilité et une prédisposition au cancer. D'autre part, des anomalies de certains gènes de la réparation sont responsables d'une prédisposition héréditaire au cancer du sein. Nous avons criblé des patients ayant certaines caractéristiques communes avec les maladies cassantes. Dans une fratrie de deux adultes, dont le signe d'appel était une hypofertilité et une cytogénétique évocatrice, des mutations germinales non-sens des deux allèles du gène NBN ont été détectées. Une hypersensibilité aux radiations ionisantes similaire à celle observée dans le syndrome de Nijmegen, était retrouvée chez ces deux patients. Dans une deuxième famille, le premier cas de délétion mono-allélique germinale de RAD50 a été identifiée chez une jeune femme présentant une ataxie modérée isolée. Ces deux gènes codent des protéines appartenant au même complexe MRN (MRE11/RAD50/NBN) ayant un rôle dans la réponse précoce aux dommages de l'ADN. Ces observations originales démontrent l'existence d'une nouvelle catégorie de patients mutés dans des gènes de la réponse aux dommages de l'ADN. Ces sujets adultes sans anomalie du développement, présentent des variants hypomorphes de ces gènes qui se traduisent au niveau biologique par des défauts majeurs de la réparation de F ADN. Des anomalies de ces gènes pourraient être recherchées dans le cadre d'infertilité, de prédisposition au cancer ou d'hypersensibilité à la radio/chimiothérapie inexpliquées
Inherited mutations in genes involved in DNA repair result in two différent pathologies. First, some mutations lead to severe pediatric diseases called "chromosomes breakage syndromes" such as ataxia-telangiectasia, the Nijmegen breakage syndrome and the ataxia-telangiectasia like disorder due to inactivation of the ATM, NBN/NBS1 and MRE11 gene respectively. These syndromes share some symptoms, including chromosomal instability, immune defect, radiosensitivity and a predisposition to cancer. Second, other alterations of some genes of the DlsfA damage repair pathway are responsible for an inherited predisposition to breast cancer. We screened adult and pediatric patients presenting some clinical features of those chromosomes breakage syndromes. In a family of two adult siblings, whose call sign was a hypofertility and an evocative cytogenetic we detected germline biallelic nonsense-mutations of the NBN gene. Hypersensitivity to ionizing radiation similar to that observed in the Nijmegen syndrome was found in these two patients. In a second family, the first case of a mono-allelic deletion of the RAD50 gene was identified in a young woman with isolated mild ataxia. Both genes encode proteins belonging to the MRN complex (MRE11/RAD50/NBN). This complex plays a role in the early response to DNA damage. These original observations demonstrate the existence of a new class of patients mutated in genes involved in the response to DNA damage. These adult subjects without developmental abnormalities, have hypomorphic variants of these genes that result in major defect of the DNA repair. In the context of infertility, cancer predisposition and unexplained hypersensitivity to radio / chemotherapy, abnormalities of these genes must be investigated

Les microsatellites sont des séquences d'ADN répétées en tandem avec un motif de 1 à 6 nucléotides, présents dans presque tous les génomes. Leur taux de mutation élevé, responsable d'une évolution rapide, leur confère un haut niveau de polymorphisme basé sur le nombre de répétitions. Ils sont donc utilisés comme marqueurs génétiques dans de nombreuses applications biomédicales. Le principal mécanisme de mutation est le glissement de la polymérase lors de la réplication, provoquant des contractions (délétions) ou des expansions (insertions) des microsatellites. Ce processus présente un biais directionnel, avec une préférence pour les délétions chez les procaryotes et les insertions chez les eucaryotes. Le système de réparation des mésappariements (MMR) corrige ces erreurs et réduit fortement le taux de mutation. Plusieurs facteurs influencent les mutations des microsatellites. Parmi les facteurs endogènes, on trouve la composition nucléotidique, la taille et le nombre de répétitions. Les facteurs exogènes incluent la taille du microsatellite et l'efficacité du système MMR. Mon projet de thèse visait à étudier et caractériser ces mutations à l'aide de séquenceurs de première, deuxième et troisième génération. Il se divisait en trois parties principales. Dans la première partie, j'ai contribué au développement d'une méthode d'inférence des taux de mutation, une mesure cruciale en génétique. Cette méthode permet d'identifier le modèle génétique à l'origine du glissement de la polymérase parmi 32 modèles considérés. Elle intègre des taux de délétion et d'insertion allant jusqu'à quatre sauts d'unités de répétition, avec une relation linéaire ou exponentielle entre le taux de mutation et le nombre d'unités. La méthode a été appliquée à des données expérimentales obtenues par amplification in vitro de microsatellites via PCR et méthode isotherme (RPA), combinées à l'analyse de fragments. Cela a révélé des différences mutationnelles significatives. Dans la deuxième partie, j'ai comparé différentes technologies de séquençage haut débit (NGS) pour déterminer la meilleure approche pour identifier la taille des allèles microsatellites. J'ai évalué diverses méthodes de préparation de librairies pour le séquençage à lecture courte avec la technologie Illumina, incluant des protocoles avec ou sans PCR (« PCR-free »), utilisant de 1 à 20 cycles PCR et incorporant ou non des codes-barres moléculaires. Un protocole sans PCR a été utilisé pour le séquençage à lecture longue avec la technologie PacBio. Mes résultats ont montré que le séquençage à lecture courte sans étape PCR est l'approche la plus fidèle. Enfin, dans la troisième partie, j'ai caractérisé les mutations des microsatellites en fonction de divers facteurs endogènes (unité́ répétée, nombre de répétitions) et exogènes (polymérase, température). J'ai développé un système rapporteur basé sur l'utilisation de plasmides contenant des microsatellites, combiné au séquençage capillaire et/ou NGS. Les études in vitro ont impliqué trois méthodes d'amplification ADN avec des températures allant de 15 à 65 °C. Les études in vivo ont été réalisées chez Escherichia coli et Saccharomyces cerevisiae, utilisant des souches sauvages et déficientes en MMR, cultivées à des températures de 20 à 45 °C. Ces travaux ont révélé un effet modulateur de la température sur les mutations des microsatellites. En conclusion, ce travail a permis d'améliorer la caractérisation des mutations microsatellites grâce à des approches innovantes, mathématiques et technologiques, et a mis en évidence un nouveau facteur exogène influençant leur formation in vitro et in vivo
Microsatellites are tandem repeat DNA sequences with motifs of 1 to 6 nucleotides, present in nearly all genomes. Their high mutation rate, driving rapid evolution, results in significant polymorphism based on the number of repeats. They are widely used as genetic markers in various biomedical applications. The primary mutation mechanism involves polymerase slippage during replication, leading to contractions (deletions) or expansions (insertions) of microsatellites. This process exhibits directional bias, favoring deletions in prokaryotes and insertions in eukaryotes. The mismatch repair system (MMR) corrects these errors, significantly reducing the mutation rate. Several factors influence microsatellite mutations. Endogenous factors include nucleotide composition, motif size, and repeat number. Exogenous factors include microsatellite size and MMR efficiency. My thesis project aimed to study and characterize these mutations using first-, second-, and third-generation sequencing technologies. It was divided into three main parts. In the first part, I contributed to the development of a method to infer mutation rates, a crucial measure in genetics. This method identifies the genetic model underlying polymerase slippage among 32 considered models. It accounts for deletion and insertion rates up to four repeat unit jumps, with linear or exponential relationships between mutation rates and repeat units. The method was applied to experimental data from in vitro microsatellite amplification via PCR and isothermal methods (RPA), combined with fragment analysis. This revealed significant mutational differences. In the second part, I compared various next-generation sequencing (NGS) technologies to identify the best approach for determining the length of microsatellite alleles. I evaluated library preparation methods for short-read sequencing with Illumina technology, including protocols with or without PCR (“PCR-free”), using 1 to 20 PCR cycles and incorporating molecular barcodes. A PCR-free protocol was used for long-read sequencing with PacBio technology. My results showed that short-read sequencing without PCR is the most reliable approach. Finally, in the third part, I characterized microsatellite mutations based on various endogenous (repeat unit, repeat number) and exogenous (polymerase, temperature) factors. I developed a reporter system using plasmids containing microsatellites combined with capillary and/or NGS sequencing. In vitro studies involved three DNA amplification methods across temperatures from 15 to 65 °C. In vivo studies were conducted in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae, using wild-type and MMR-deficient strains grown at temperatures from 20 to 45 °C. These studies revealed a modulatory effect of temperature on microsatellite mutations. In conclusion, this work improved microsatellite mutation characterization through innovative mathematical and technological approaches, highlighting a novel exogenous factor influencing their formation in vitro and in vivo

Ces dernières années, de nombreux travaux ont démontré la présence de mutations mitochondriales en relation avec l'âge dans divers types tissulaires. Le sujet de notre travail consiste à démontrer de manière fiable et spécifique la détection de telles mutations, d'établir leurs relations avec l'âge, et de déterminer si elles peuvent présenter un intérêt en Médecine Légale ou en Anthropologie afin d'augmenter les indices de détermination de l'âge. Dans un premier temps, sur le tissu musculaire et les cellules buccales, nous avons mis au point une technique combinant la technologie PNA (Peptid Nucleic Acid) et la PCR en Temps Réel (qPCR), démontrant une détection sensible et une quantification des taux de mutation de l'hétéroplasmie A189G, et la relation avec l'âge dans le tissu musculaire. Ces résultats ont démontré la meilleure sensibilité de la technique PNA/qPCR par rapport à la technique de séquençage automatique pour la détection d'hétéroplasmie et ont pu être confirmés par la technique de Southern blot. Dans un deuxième temps, nous avons travaillé à partir de tissu osseux provenant d'une part d'individus d'âge connu dans le cadre d'identification en Médecine Légale et d'autre part de squelettes de Sibérie Orientale identifiés par l'analyse de marqueurs ostéologiques du vieillissement. Nous avons démontré l'accumulation de l'hétéroplasmie A189G dans les individus âgés de plus de 70 ans pour ceux dont l'âge est connu, et dans les individus âgés identifiés comme tel par les indicateurs ostéologiques. Le séquençage automatique nous a permis d'identifier deux autres hétéroplasmies (T72C et A73G) présentes dans des individus âgés de plus de 50 ans dans le tissu musculaire et osseux, hétéroplasmies déjà décrites dans la littérature. L'ensemble de ces résultats peut présenter un intérêt dans la détection et l'interprétation de l'hétéroplasmie de l'ADN mitochondrial dans les études médico-légale et anthropologique.

Nous démontrons la détection de mutations de l’AND mitochondrial, leurs relations avec l’âge, et nous déterminons si elles peuvent présenter un intérêt en médecine l&gale ou en anthropologie afin d’augmenter les indices de détermination de l’âge. Dans un premier temps, sur le tissu musculaire et les cellules buccales, nous avons mis au point une technique combinant la technologie PNA (Peptid Nucleic Acid) et la PCR en temps réel (qPCR), démontrant une détection sensible et une quantification des taux de mutation de l’hétéroplasmie A189G, et la relation avec l’âge dans le tissu musculaire. Dans un deuxième temps, nous avons travaillé à partir de tissu osseux provenant d’une part d’individus d’âge connu dans le cadre d’identification en Médecine Légale et d’autre part de squelettes de Sibérie Orientale identifiés par l’analyse de marqueurs ostéologiques du vieillissement. Nous avons démontré l’accumulation de l’hétéroplasmie A189G dans les individus âgés de plus de 70 ans pour ceux dont l’âge est connu, et dans les individus âgés identifiés comme tel par les indicateurs ostéologiques. L’ensemble de ces résultats peut présenter un intérêt dans la détection et l’interprétation de l’hétéroplasmie de l’ADN mitochondrial dans les études médico-légale et anthropologique
In the present study, we searched to evaluate the most efficient method for detecting low levels of heteroplasmy, determine whether these mutations were really age-related and assess the possible implications of heteroplasmies in anthropological and forensic studies. In first time, in two tissue types, muscle samples and buccal cells, we carried out the sensitive detection and quantification of point mutation A189G with peptid nucleic acid (PNA) and Real Time PCR (qPCR) together. In second time, we worked on bone tissues, on the one hand, from individuals where age was known in forensic identification, on the other hand, from ancient skeletons of the eastern Siberia, where age determination was done using bone indicators. We showed the A189G heteroplasmy accumulation on individuals of 70 years old or more, when age is known, and on identified old individuals by bone indicators. These investigations could be of interest in the detection and interpretation of mtDNA heteroplasmy in anthropological and forensic studies