Дисертації з теми "MLPANN"

Introdução: A Holoprosencefalia (HPE) é uma malformação craniofacial decorrente de falhas no processo de formação do sistema nervoso durante o desenvolvimento embrionário. Sua etiologia é heterogênea e complexa, envolvendo fatores ambientais e genéticos. Estudos recentes sugerem que alterações subteloméricas possam ser um dos fatores etiológicos para o aparecimento da HPE. Objetivos: Investigar possíveis alterações (microdeleções/duplicações) nas regiões subteloméricas em indivíduos com diagnóstico de HPE. Metodologia: Avaliação genética de 25 amostras de DNA de indivíduos matriculados no HRAC-USP, com diagnóstico de HPE através da técnica de MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification), segundo protocolo proposto por Schouten et al. (2002). Estes indivíduos já foram previamente triados para mutações/deleções nos genes candidatos à HPE (SHH, ZIC2, TGIF, GLI2 e PTCH1) através do sequenciamento direto de Sanger e da técnica de MLPA, sem resultado positivo para qualquer alteração. Resultados: Dentre os 25 indivíduos analisados, o fenótipo predominante foi a microforma da doença. Os principais achados clínicos da amostra estudada foram: hipotelorismo, microcefalia e fissura de lábio e palato (100%), nariz achatado (84%), presença de um incisivo central único (24%) e ponte nasal baixa (64%). Quatro pacientes apresentaram comprometimento no SNC (16%). Nenhum indivíduo apresentou quaisquer alterações, como microdeleções e/ou duplicações nos genes contidos nas regiões subteloméricas, através da análise pela técnica de MLPA. Dessa forma, estes permanecem sem diagnóstico genético definido. Discussão: A não detecção de alterações subteloméricas sugere que o fenótipo predominante na amostra, microforma, possa não apresentar alterações subteloméricas relacionadas ao aparecimento da doença. Entretanto, deve-se salientar que o universo amostral é relativamente pequeno, de forma que este possa não ser um exemplo fiel dos casos de microforma da HPE. Reforça-se, ainda, a grande variedade de fatores envolvidos no surgimento desta patologia, bem como o envolvimento de outros genes ainda não estabelecidos, além das causas ambientais, ainda não completamente elucidadas. Conclusões: Não foram encontradas alterações subteloméricas nos pacientes com diagnóstico de HPE estudados. A técnica de MLPA consiste em uma metodologia rápida, sensível, eficaz e de baixo custo, quando comparada a outras técnicas, sendo indicada para o uso em laboratórios de diagnóstico genético, uma vez que diversos estudos já mostraram que consiste em um método confiável de diagnóstico. Devido ao tamanho relativamente pequeno da amostra utilizada neste estudo, e os dados ainda inconsistentes da literatura atual, estudos adicionais são necessários para que seja possível a realização de um diagnóstico diferencial, explicando o amplo espectro fenotípico observado nesta doença, conforme sugerido pela hipótese dos múltiplos fatores.
Introduction: Holoprosencephaly (HPE), a craniofacial malformation, results from flaws in formation process of the nervous system during embryonic development. The etiology is heterogeneous and complex, involving environmental and genetic factors. Recent studies suggest that subtelomeric aberrations could be an etiological factor to the onset of HPE. Objectives: Investigate possible changes (microdeletions/duplications) in subtelomeric regions in individuals diagnosed with HPE. Methodology: Genetic evaluation of 25 DNA samples from individuals enrolled at HRAC-USP, diagnosed with HPE (performed by Syndromology Division HRAC/USP) by MLPA technique, as proposed by Schouten et al (2002). Patients were previously screened for mutations/deletions in HPE candidate genes (SHH ZIC2, TGIF, GLI2 and PTCH1) by direct Sanger sequencing and MLPA technique, without any match. Analyses were performed at the Laboratory of Molecular Genetics, Hospital for Rehabilitation of Craniofacial Anomalies, HRAC-USP. Results: Among the 25 individuals analyzed, the predominant phenotype was HPE microform. The main clinical findings of the study sample were: hypotelorism, microcephaly, and cleft lip/palate (100%); flat nose (84%); presence of a single central incisor (24%) and low nasal bridge (64%). Four patients had CNS commitment (16%). No subtelomeric mutations were found in our sample, such as microdeletions/duplications of genes analyzed by MLPA technique. Thus, they remain without defined genetic diagnosis. Discussion: Subtelomeric changes were not found, suggesting that the predominant sample phenotype, microform HPE, could not be related with subtelomeric changes associated to the disease outbreak. However, it should be noted that the sample universe is relatively small, so this may not be a true example of HPE microform cases. It should also be reinforced the wide variety of factors involved in the onset of this pathology, as well as the involvement of other genes not yet established and environmental causes, not completely understood. Conclusions: No subtelomeric mutations were found in the HPE individuals studied. MLPA technique consists in a rapid, sensitive and cost effective methodology, when compared to other techniques being suitable for use in genetic diagnostic laboratories, since several studies have shown that consists of a reliable method of diagnosis. Due to the relatively small sample size used in this study, and even inconsistent data in literature, further studies are needed to make it possible to perform a differential diagnosis, explaining the wide phenotypic spectrum observed in this disease, as suggested by the multiple hit hypothesis.

The most common cancer form among men i prostate cancer and measurement of circulating tumor cells (CTCs) in the blood is a useful tool to evaluating the responset o treatment and progress of disease. CTC’s are cells that have detached from the original tumor and have spread in the blood sstem. In this master thesis a panel of 16 genes at single cell levels are analyzed using Reverse Transciptase Multiplexed Ligation-dependent Probe Amplification (RT-MLPA). The method uses gene specific reverse transcription primers to generate and amplify cDNA which MLPA probes are hybridized to. Correctly hybridized probes are ligated and amplified so that relative expression profiles can be calculated. One additional MLPA probe was designed to add to the existing panel. The results show that the MLPA reaction generates products from all genes in the panel when performed on synthetic MLPA prbe targets with equal concentrations. Results from totatl RNA on cell lines show that the reverse transcription and amplification of cDNA need further optimizations. When the whole assay is working it will be possible to evaluate gene expression from CTC’s that can help us understand the  progression and spread of prostate cancer in the body.
Prostatacancer är den vanligaste cancerformen hos män. Att räkna antal cirkulerade tumörceller (CTCer) i blodet är ett bra verktyg för att undersöka hur sjukdomen fortlöper och hur den svarar på behandling. CTCer är enskilda celler som brutit sig loss från originaltrumören och sprids i kroppen genom blodsystemet. I det här examensarbetet analyseras en panel bestående av 16 gener med hjälp av Reverse Transcriptase Multiplexed Ligation-dependent Probe Amplification (RT-MLPA).  Metoden bygger på att genspecifika primrar används för att syntetisera cDNA från mRNA. MLPA-prober hybridisear sedan till det amplifierade cDNAt. MLPA prober som hybridiserat korrekt ligeras och amplifieras och den relativa uttrycksnivåerna kan beräknas. Ytterligare en MLPA-probe designades för att passa in i den existerande blandningen av MLPA-prober. Resultaten viar att alla MLPA-prober ger produkter då en syntetisk DNA-templat blandning med lika koncentrationer används. Resultaten från total-RNA från cellinjer visar att omvandlingen och amplifieringen av mRNA till cDNA måste optimeras. När hela protokollet fungerar är det möjligt att undersöka genuttrycken i CTCer vilket kan underlätta förståelsen för utveckling och spridning av prostatacancer i kroppen.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2017.
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A Mielofibrose é a mais rara e severa das Neoplasias Mieloproliferativas Crônicas Philadelphia negativas. Caracteriza-se por fibrose medular, hematopoese extramedular e expressão anormal de citocinas inflamatórias, que resultam em citopenias, organomegalias, sintomas constitucionais, eventos trombohemorrágicos e evolução para Leucemia Aguda. Pode ocorrer de novo ou pós Policitemia Vera ou Trombocitemia Essencial, a partir da expansão clonal de uma célula tronco hematopoética desencadeada por uma mutação somática envolvendo os genes JAK2, CALR ou MPL, combinada a desregulação dos nichos hematopoéticos, a mutações e a anomalias citogenéticas adicionais. Este estudo visou caracterizar o perfil de mutações driver de portadores de Mielofibrose primária e secundária acompanhados em um serviço público terciário de Hematologia, e correlacionar este perfil aos desfechos clínicos dos doentes. A pesquisa das mutações JAK2 V617F (éxon 14) e éxon 12, CALR c.1092_1143del52 e c.1154_1155insTTGTC (éxon 9) e MPL W515K e W515L foi realizada em 31 indivíduos por meio da técnica de MLPA, método de análise de DNA que permite a pesquisa simultânea de diferentes mutações, em diferentes amostras. A mutação JAK2V617F foi encontrada em 48,4% dos pacientes, mutações indel do éxon 9 da CALR em 38,7% (em 66,7% destes a mutação del52, e em 33,3% a mutação insTTGTC), e a mutação MPL W515L em 3,2% dos pacientes. 9,7% dos pacientes eram triplo-negativos. Os pacientes com JAK2 mutada eram mais idosos, com menor grau de anemia e maior frequência de leucocitose, enquanto os portadores de mutações da CALR apresentavam menor frequência de leucocitose e plaquetopenia. Os indivíduos triplo-negativos apresentaram a menor mediana de idade ao diagnóstico (49,3 anos) e fenótipo de falência medular semelhante a Síndrome Mielodisplásica. A estratificação de risco por DIPSS foi semelhante à relatada em outros centros. O tempo mediano de acompanhamento foi de 32 meses (variando de 10 meses a 13 anos), sendo registrados fenômenos tromboembólicos em 19,3% e evolução para LMA em 6,4% dos pacientes. A taxa de mortalidade foi de 29%, e a sobrevida média após o diagnóstico foi de 68,3 meses. Os indivíduos com mutação da CALR apresentaram maior sobrevida média. A mediana de sobrevida de acordo com o DIPSS foi superior à prevista pelo modelo prognóstico, possivelmente pela maior frequência de mutações da CALR observada nesta população. Maior tempo de seguimento e inclusão de novos pacientes são necessários para melhor avaliação de desfechos e confirmação da maior prevalência de mutações da CALR. A pesquisa de mutações driver é essencial para sustentação diagnóstica, define subgrupos de doentes com características clínicas peculiares e, aliada a pesquisa de mutações colaborativas, tem impacto prognóstico. O complexo panorama genético envolvido na iniciação e progressão das NMP, especialmente a Mielofibrose, instiga a adoção de modelos integrativos de estratificação prognóstica. Neste cenário, o MLPA é uma potente ferramenta para estudo molecular, e um promissor aliado na caracterização das NMP.
Myelofibrosis is the rarest and most severe Philadelphia-negative myeloproliferative neoplasm and can present de novo or post Polycythemia Vera or Essential Thrombocythemia. It is characterized by bone marrow fibrosis, extramedullary hematopoiesis and abnormal expression of inflammatory cytokines, which result in cytopenias, organomegaly, constitutional symptoms, thrombohemorrhagic events and progression to Acute Leukemia. The disease arises from clonal expansion of a single hematopoietic stem cell (HSC), driven by a somatic mutation of JAK2, CALR or MPL genes combined with dysregulation of hematopoietic microenvironment, additional mutations and cytogenetic abnormalities. This study aimed to assess driver mutations status in patients with primary and secondary myelofibrosis accompanied at a tertiary Brazilian public hospital, and to correlate their mutational profile with clinical outcomes. The search for JAK2V617F, exon 12 JAK2, calreticulin exon 9 c.1092_1143del52 and c.1154_1155insTTGT, MPLW515K and MPLW515L mutations was performed in 31 subjects using MLPA technique, a method of DNA analysis that allows simultaneous appraisal of different mutations in multiple samples. JAK2V617F mutation was found in 48.4% of patients, indel CALR mutations in 38.7% of patients (of these, 66.7% harbored del52 bp, 33.3% harbored insTTGTC), MPL W515L in 3.2% of patients and 9.7% of patients were triple-negative. Patients with mutated JAK2 were older, with minor degree of anemia and more leukocytosis, whereas those with CALR mutations had less frequency of leukocytosis and thrombocytopenia. Triple-negative subjects displayed the lowest median age at diagnosis (49.3 years), and bone marrow failure phenotype, similar to Myelodysplastic Syndrome. Risk stratification provided by DIPSS was similar to other centers. Median follow-up time was 32 months (ranging from 10 months to 13 years). Thromboembolic phenomena were recorded in 19.3% of patients, and evolution to AML in 6.4% of patients. Mortality rate was 29%, and mean survival after diagnosis was 68.3 months. CALR mutated individuals presented higher average survival. Median survival according to DIPSS was higher than predicted by the prognostic model, possibly due to the higher frequency of CALR mutations reported. Longer follow-up and inclusion of new patients are necessary for better evaluation of outcomes and confirmation of the higher prevalence of CALR mutations. Driver mutations assessment is essential for diagnostic support, defines subgroups with peculiar clinical characteristics and, combined with collaborative mutations evaluation, has prognostic impact. The complex genetic landscape involved in initiation and progression of MPN, especially Myelofibrosis, instigates the adoption of integrative prognostic stratification models. In this scenario, MLPA is a powerful tool for molecular study, and a promising ally for MPN molecular characterization.

Neoliberal governance strategies have been hegemonic in shaping global policy toward Marine Protected Areas (MPAs) over the past two decades. This impact has manifested itself in two key dimensions: the prominence given to public-private partnerships (PPPs) and the dependency upon civil society, particularly in the form of non-governmental organisations (NGOs). As a result, it is necessary to give primacy to the implication of PPPs and the role of NGOs in considering how best to govern MPAs. This is particularly the case in relation to efforts which seek the ‘right’ combination of ‘the market’, ‘the people’ and ‘the state’. This thesis investigates the California Marine Life Protection Act (MLPA) implementation process, and particularly the MLPA Initiative, which is widely publicised as a successful case of a science-based stakeholder-driven process through PPP. The thesis involves a thorough exploration of how an ideal combination could be achieved based on the Central Coast Study Region (CCSR) MLPA implementation process. Number of literary sources identified four key factors which have significantly contributed to the implementation of MLPA: 1) A strong legal mandate 2) Strong political will 3) A substantial level of stakeholder participation 4) Effective PPPs However, despite the widely publicised claims, research findings suggest that finding the ‘right’ combination for the MLPA implementation process remains a difficult task. The strong legal mandate, which has provided the foundation for the science used, constrained the stakeholder participation process. Indeed, it suggests that the terms ‘science-based’ and ‘stakeholder-driven’ could be to some extent, oxymorons, whilst strong political will could potentially compromise stakeholder participation. Effective PPPs for the MLPA Initiative represent a conundrum for PPP, since NGOs, including philanthropic foundations, increasingly exercise their influence on public policy to push through their agendas. Subsequently, PPP could potentially compromise the legitimacy of the process. Finally, the research findings suggest that the substantial level of stakeholder participation may not be a panacea for designating MPAs.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
A doença de Parkinson (DP) é uma das desordens neurodegenerativas mais comuns associada ao envelhecimento, alcançando 2% aos 70 anos. É uma doença caracterizada pela degeneração progressiva de neurônios dopaminérgicos nigrais nos gânglios basais e pela presença de inclusões protéicas citoplasmáticas denominadas corpúsculos e neuritos de Lewy nos neurônios sobreviventes. A etiologia da DP é pouco conhecida, sendo considerada, na maioria dos casos, idiopática. Conhecimentos alcançados nos últimos 15 anos sobre a base genética da DP demonstram, claramente, que os fatores genéticos desempenham um importante papel na etiologia desta desordem. Neste trabalho, rastreamos mutações nos genes que codificam proteínas participantes de vias metabólicas mitocondriais (Parkin, PINK1 e DJ-1) em 136 pacientes brasileiros com manifestação precoce da DP, através do sequenciamento automático e da técnica de MLPA. Avaliamos a presença de variantes de sequência por meio do sequenciamento dos exons 1 a 12 do gene Parkin e dos exons 1 a 8 do gene PINK1. Em Parkin foram identificadas três mutações patogênicas ou potencialmente patogênicas, ambas em heterozigose: p.T240M, p.437L e p.S145N. Em PINK1 não encontramos variantes de ponto patogênicas. Através da técnica de MLPA investigamos alterações de dosagem nos genes Parkin, PINK1 e DJ-1. Identificamos cinco alterações no gene Parkin em quatro pacientes: uma duplicação heterozigota do exon 4 no paciente PAR2256, uma deleção heterozigota do exon 4 no probando PAR2099, uma deleção homozigota do exon 4 na paciente PAR3380 e um probando heterozigoto composto (PAR2396) com duas alterações, uma duplicação do exon 3 e uma deleção dos exons 5 e 6. No gene PINK1 identificamos uma deleção heterozigota do exon 1, que nunca foi descrita na literatura, em um paciente (PAR2083). Não encontramos alteração quantitativa no gene DJ-1. Neste estudo obtivemos uma frequência total de mutações patogênicas (pontuais e de dosagem) nos genes estudados de 7,3%, sendo 6,6% no gene Parkin e 0,7% no gene PINK1.
Parkinson's disease (PD) is one of the most common neurodegenerative disorders associated with aging, reaching 2% at age 70. It is a disease characterized by progressive degeneration of nigra dopaminergic neurons in the basal ganglia and the presence of cytoplasmic protein inclusions known as Lewy bodies and neurites in surviving neurons. The etiology of PD is poorly understood, being considered, in most cases, idiopathic. Knowledge achieved in the last 15 years about the genetic basis of PD clearly shows that genetic factors play an important role in the etiology of this disorder. In this study, we screened mutations in genes that encode proteins participating in mitochondrial metabolic pathways (Parkin, PINK1 and DJ-1) in 136 Brazilian patients with early onset PD, through automatic sequencing and MLPA technique. We evaluated the presence of sequence variants by means of sequencing of exons 1 to 12 of Parkin gene and exons 1 to 8 of PINK1 gene. In Parkin gene were identified three pathogenic or potentially pathogenic mutations, both in heterozygous state: p.T240M, p.437L e p.S145N. In PINK1 gene we did not find pathogenic point mutations. Through the MLPA technique we investigated dosage changes in Parkin, PINK1 and DJ-1 genes. We identified five exon rearrangements in Parkin gene in four patients: a heterozygous duplication of exon 4 in patient PAR2256, a heterozygous deletion of exon 4 in proband PAR2099, a homozygous deletion of exon 4 in patient PAR3380 and a compound heterozygote (PAR2396) with two changes, a duplication of exon 3 and a deletion of exons 5 and 6. In PINK1 gene we identified a heterozygous deletion of exon 1, which has never been described in literature, in one patient (PAR2083). We found no quantitative change in DJ-1 gene. In this study, we obtained an overall frequency of pathogenic mutations (sequence and dosage) in the genes studied of 7.3%, being 6.6% in Parkin gene and 0.7% in PINK1 gene.

Orientador: Maria de Fátima Sonati
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas
Made available in DSpace on 2018-08-16T20:41:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Suemasu_CintiaNatsumi_M.pdf: 6481597 bytes, checksum: f9093ca98b4efb60bfe4f81a7e80efee (MD5) Previous issue date: 2010
Resumo: A talassemia alfa (a) constitui um grupo de doenças hereditárias causadas pela redução ou ausência da síntese das cadeias 'alfa' da hemoglobina. Os genes responsáveis pela codificação dessas cadeias são duplicados ('alfa' 2 e 'alfa'1) e estão localizados em um agrupamento gênico ou cluster, situado próximo ao telômero do cromossomo 16 (16p13.3). As deleções são as principais causas da doença, podendo afetar um ou ambos os genes 'alfa' do cromossomo (formas 'alfa' + e 'alfa' 0, respectivamente). Nos últimos anos, várias técnicas foram desenvolvidas para identificar as deleções envolvendo o cluster dos genes a no cromossomo 16. A gap- PCR, o Southern blot e o FISH são comumente aplicados com esta finalidade; entretanto, muitas deleções ainda não são detectadas utilizando-se essas estratégias metodológicas. Em 2005, uma técnica simples e adequada a análises quantitativas rápidas, o Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA), foi adaptada ao diagnóstico das hemoglobinopatias. Esta técnica é baseada na ligação e na amplificação, em reação de PCR, de dois oligonucleotídeos (sondas) que se hibridizam de forma adjacente ao DNA alvo. Cada oligonucleotídeo é projetado para gerar um produto de comprimento único e, por possuírem terminações comuns, todas as sondas podem ser amplificadas utilizando um único par de iniciadores. Por fim, o uso de fluorocromos permite a separação dos fragmentos, que foram gerados pela amplificação das sondas, em sistema de seqüenciamento por capilaridade. No presente estudo nós utilizamos o MLPA para investigar as bases moleculares da talassemia alfa em nove pacientes não relacionados, cinco deles com Doença da Hb H, cujos diagnósticos moleculares não puderam ser esclarecidos pelas técnicas usuais, incluindo o seqüenciamento de DNA. No total, foram utilizadas 44 sondas, distribuídas desde o telômero ao gene MSLN, cobrindo uma região de cerca de 800 kb, na região 16p13.3. Oito diferentes deleções foram detectadas. Enquanto quatro delas comprometem uma região de grande extensão que inclui todo o locus a e seu elemento regulatório, com tamanhos mínimos de 240 kb, 470 kb, 500 kb e 720 kb, respectivamente (posições 97000-334571, 97000-570532, 97000-602492 and 97000- 816477 do UCSC Genome Browser, Fevereiro, 2009, respectivamente), quatro outras encontram-se limitadas às regiões que contém o elemento regulatório, deixando os genes a intactos, porém sem expressão. Essas últimas apresentam tamanhos mínimos de 0.4 kb, em um dos casos, e de 95 kb a 100 kb nos demais (posições entre 163464-163904, 97000- 193847, 97000-202417 e 97000-202417 do UCSC Genome Browser, Fevereiro, 2009, respectivamente). Em um dos pacientes com fenótipo talassêmico heterozigótico foi demonstrada a presença de uma quadruplicação de cerca de 230 kb de DNA, incluindo todo o cluster a e seu elemento regulatório (97000 a 231370 do UCSC Genome Browser, Fevereiro, 2009). Este estudo representa o primeiro no Brasil a empregar o método de MLPA na caracterização das bases moleculares da talassemia a. A ampla diversidade de alterações identificadas enfatiza a necessidade de se investigar todos os casos cujos valores hematológicos revelem hipocromia e microcitose, na ausência de deficiência de ferro e níveis normais de HbA2
Abstract: Alpha (a) thalassemia is an inherited hemoglobin disorder characterized by reduction or absence of the a-globin chain synthesis. These chains are encoded by duplicated genes ('alpha' 2 and 'alpha' 1) that lie in a gene cluster near the telomeric end of the short arm of chromosome 16 (16p13.3). Deletions are the major molecular cause of the disease and may affect one or both 'alfa genes in the chromosome (the 'alpha' + and 'alpha' 0 forms, respectively). In recent years several techniques have been developed to identify deletions involving the 'alpha' -globin cluster in chromosome 16. The molecular tests commonly used to identify these deletions are gap- PCR, Southern Blot analysis and FISH. However, several thalassemia deletions remain uncharacterized by these methods. In 2005 a simple technique suitable for rapid quantitative analysis ¾ multiplex ligationdependent probe amplification (MLPA) ¾ was adapted for the diagnosis of thalassemias. The approach is based on the ligation and PCR amplification of two adjacently hybridizing oligonucleotides (probes). Each oligonucleotide pair is designed to give a product of unique length, and by using common ends all the probes can be amplified with one primer pair. Finally, the use of a fluorescent label allows the probe to be separated in a capillary sequencing system. In this study we used MLPA to investigate the molecular basis of thalassemia in nine unrelated patients (five with Hb H disease) in whom the molecular causes of the disease could not be detected by sequence analysis or other conventional techniques. In total, 44 probe pairs were used, covering approximately 800 kb from the telomere to the MSLN gene in the 16p13.3 region. Eight different deletions were detected. While four of them affect a large region including the entire ? -globin gene locus and its upstream regulatory element, spanning genomic regions of at least 240 kb, 470 kb, 500 kb and 720 kb (positions 97000-334571, 97000-570532, 97000-602492 and 97000-816477 of the UCSC Genome Browser, February, 2009, respectively). The other four deletions were limited to a region that contains the upstream regulatory element; the ? -globin genes, although intact, are therefore not expressed. These deletions span a region of at least 0.4 kb in one case and from 95 kb to 100 kb in the other cases (positions 163464-163904, 97000- 193847, 97000-202417 and 97000-202417 of the UCSC Genome Browser, February, 2009, respectively). One carrier who was suspected of having heterozygous ? -thalassemia showed a segmental quadruplication spanning about 230 kb and including the a cluster and upstream regulatory element (97000-231370 do UCSC Genome Browser, February, 2009). This study is the first in Brazil to use the MLPA method to characterize thalassemias. The variety of rearrangements identified highlights the need to investigate all cases presenting with microcytosis and hypochromia without iron deficiency or elevated Hb A2 levels
Mestrado
Ciencias Biomedicas
Mestre em Ciências Médicas

Els dos subtipus més freqüents de càncer d’endometri (CE) són el carcinoma endometrioide (CEE) i el carcinoma serós (CSE). El diagnòstic diferencial entre aquestes dues tipologies no sempre és fàcil, hi ha casos que presenten característiques histològiques molt dubtoses i ambigües que dificulten el correcte diagnòstic final. Aquests dos tipus tumorals presenten diferents perfils moleculars i un pronòstic diferencial, fent que el CSE sigui el subtipus més agressiu i amb el pronòstic més desfavorable. Actualment s’està posant en coneixement la importància que pot jugar l’heterogeneïtat intratumoral (HIT) en els comportaments més agressius dels tumors i en la resistència als tractaments, com és el cas del CSE. En els últims anys, la irrupció de les tecnologies d’alt rendiment com la NGS (Next Generation Sequencing) i la MLPA (Multiple Ligase-dependent Probe Amplification) han ofert l’opció d’ampliar el coneixement molecular del càncer d’una manera més precisa i resolutiva. Per aquests motius, els dos primers objectius d’aquesta tesi s’han centrat en analitzar, en els dos tipus més freqüents de càncer d’endometri, diverses alteracions moleculars que ens permetin obtenir uns perfils genètics específics, i classificar d’una manera més precisa i objectiva aquests dos tipus tumorals. Per realitzar les anàlisis de les alteracions genètiques s’han utilitzat, l’aplicació de targeted sequencing (NGS) amb un panell personalitzat de 40 gens per determinar els gens alterats respecte a variants somàtiques, i la tècnica MLPA per determinar les alteracions somàtiques en el número de còpies (ASNC) de 106 gens. Finalment, el tercer objectiu s’ha focalitzat en conèixer el paper que juga l’heterogeneïtat intratumoral en el CSE. L’efecte de l’HIT ha estat estudiat a dos nivells d’alteració molecular, a nivell de l’alteració dels gens determinant variants somàtiques i de l’alteració en el número de còpies dels gens, mitjançant les dues tècniques anteriors. Els resultats del primer objectiu d’aquesta tesi han demostrat la idoneïtat del nostre estudi personalitzat de NGS com a eina molecular addicional per confirmar la classificació histològica del CE. Aquesta estratègia sembla interessant com una eina per classificar tumors amb troballes microscòpiques inusuals i ambigües. Amb els resultats del segon objectiu s’ha descrit que de manera general el CSE presenta moltes més ASNC que el CEE. Tot i això, també s’ha mostrat que dins el CSE hi ha un percentatge de casos (42%) que presenten unes característiques genètiques que no es corresponen amb el fenotip, i que per tant, en aquests casos pot ser de gran ajuda l’ús del perfil genètic d’ASNC per realitzar una classificació més correcta. A més a més, s’ha suggerit l’ús de la combinació de la determinació de p53 per immunohistoquímica i del número de còpies de la CCNE1 per classificar els casos dins el grup serous-like. Per finalitzar, els resultats del tercer objectiu han mostrat que el CSE, per una banda, presenta unes alteracions moleculars clonals com les variants somàtiques al gen TP53 i guanys en els gens CCNE1 i PIK3CA, i per altra banda, que la seva heterogeneïtat intratumoral està caracteritzada principalment per les ASNC dels gens. A més a més, s’ha remarcat que un dels gens principalment afectats per aquesta heterogeneïtat és el gen ERBB2, que és una diana terapèutica àmpliament utilitzada.
Los dos subtipos más frecuentes de cáncer de endometrio (CE) son el carcinoma endometrioide (CEE) y el carcinoma seroso (CSE). El diagnóstico diferencial entre estas dos tipologías no siempre es fácil, hay casos que presentan características histológicas muy dudosas y ambiguas que dificultan su correcto diagnóstico final. Estos dos tipos tumorales presentan perfiles moleculares y pronósticos diferenciales, haciendo que el CSE sea el subtipo más agresivo y con el pronóstico más desfavorable. Actualmente se está poniendo en conocimiento la importancia que puede jugar la heterogeneidad intratumoral (HIT) en los comportamientos más agresivos de los tumores y en la resistencia a los tratamientos, como es el caso del CSE. En los últimos años, la irrupción de las tecnologías de alto rendimiento como la NGS (Next Generation Sequencing) y la MLPA (Multiple Ligase-dependiente Probe Amplification) han ofrecido la opción de ampliar el conocimiento molecular del cáncer de una manera más precisa y resolutiva. Por estos motivos, los dos primeros objetivos de esta tesis se han centrado en analizar en los dos tipos más frecuentes de cáncer de endometrio varias alteraciones moleculares que nos permitan obtener unos perfiles genéticos específicos, y clasificar de una manera más precisa y objetiva estos dos tipos tumorales. Para realizar los análisis de las alteraciones genéticas se han utilizado, la aplicación de targeted sequencing (NGS) con un panel personalizado de 40 genes para determinar los genes alterados respecto a variantes somáticas, y la técnica MLPA para determinar las alteraciones somáticas en el número de copias (ASNC) de 106 genes. Finalmente, el tercer objetivo se ha focalizado en conocer el papel que juega la heterogeneidad intratumoral en el CSE. El efecto de la HIT ha sido estudiado a dos niveles de alteración molecular, a nivel de la alteración de los genes analizando las variantes somáticas y la alteración en el número de copias de los genes, mediante las dos técnicas anteriores. Los resultados del primer objetivo de esta tesis han demostrado la idoneidad de nuestro estudio personalizado de NGS como herramienta molecular adicional para confirmar la clasificación histológica del CE. Esta estrategia parece interesante como una herramienta para clasificar tumores con hallazgos microscópicos inusuales y ambiguos. Con los resultados del segundo objetivo se ha descrito que de manera general el CSE presenta muchas más ASNC que el CEE. Sin embargo, también se ha mostrado que dentro el CSE hay un porcentaje de casos (42%) que presentan unas características genéticas que no corresponden con el fenotipo, por lo que en estos casos puede ser de gran ayuda el uso del perfil genético de ASNC para realizar una clasificación más correcta. Además, se ha sugerido el uso de la combinación de la determinación de p53 por inmunohistoquímica y del número de copias de la CCNE1 para clasificar los casos dentro del grupo serous-like. Para finalizar, los resultados del tercer objetivo han mostrado que el CSE, por una parte, presenta unas alteraciones moleculares clonales como las variantes somáticas en el gen TP53 y ganancias en los genes CCNE1 y PIK3CA, y por otra parte, que su heterogeneidad intratumoral está caracterizada principalmente por las ASNC de los genes. Además, se ha remarcado que uno de los genes principalmente afectados por esta heterogeneidad es el gen ERBB2, que es una diana terapéutica ampliamente utilizada.
The two most common subtypes of endometrial cancer (CE) are endometrioid carcinoma (CEE) and serous carcinoma (CSE). Differential diagnosis between these two types is not always easy, there are cases with very doubtful and ambiguous histological features that make it difficult their final diagnostic. These two tumor types have different molecular profiles and differential prognosis, making the CSE the most aggressive subtype and with the most unfavorable prognosis. At present, the importance of intratumoral heterogeneity (HIT) can be played out in the most aggressive behaviors of tumors and in resistance to treatment, as in the case of CSE. In recent years, the advent of high-performance technologies such as NGS (Next Generation Sequencing) and MLPA (Multiple Ligase-dependent Probe Amplification) have offered the option of extending molecular knowledge of cancer in a way more accurate and resolute. For these reasons, the first two objectives of this dissertation have been to analyze in the two most common types of endometrial cancer, various molecular alterations that allow us to obtain specific genetic profiles, and to classify more precisely and objective these tumor types. To preform genetic alteration analyzes have been used the application of targeted sequencing (NGS) with a personalized panel of 40 genes to determine the altered genes with respect to somatic variants, and the MLPA technique to determine somatic alterations in the number of copies (ASNC) of 106 genes. Finally, the third objective was focused on understanding the role that intratumoral heterogeneity plays in CSE. The effect of HIT has been studied at two levels of molecular alteration, at the level of the genes determining somatic variants and the number of copies of the genes, using the two previous techniques. The results of the first objective of this thesis have shown the suitability of our personalized NGS study as an additional molecular tool to confirm the histological classification of CE. This strategy seems interesting as a tool for classifying tumors with unusual and ambiguous microscopic findings. The results of the second objective have described that in general the CSE has many more ASNCs than the EEC. However, it has also been shown that in the CSE there is a percentage of cases (42%) that have genetic characteristics that do not correspond to the phenotype, and therefore in these cases the use may be very helpful of the ASNC gene profile for more accurate classification. In addition, the combination of p53 determination by immunohistochemistry and the number of CCNE1 copies has been suggested to classify cases within the group serous-like. Finally, the results of the third objective have shown that CSE, on the one hand, has clonal molecular alterations such as the somatic variants in the TP53 gene and gains in the CCNE1 and PIK3CA genes, and on the other hand, that its intratumoral heterogeneity is characterized mainly by the ASNC of the genes. It has also been emphasized that one of the genes that is most affected by this heterogeneity is the ERBB2 gene, which is a widely used therapeutic target.

A cDNA clone encoding a myosin-like protein has been detected by screening a ?gtll expression library with antibodies specific to a myosin-like protein extracted from Physarum amoebae. The clone, mlpA, encodes a polypeptide which is expressed in both cell stages in Physarum, and which shows significant homology to the myosin heavy chain rod domain of Dictyostelium discoideum. Genetic analysis has determined that there is a single gene that encodes mlpA in Physarum, and that this gene is not related to a mutation, hts-23, analysed in earlier work.

A complexidade da fisiologia da audição resulta da participação e interação de produtos de grande número de genes, razão pela qual a surdez hereditária exibe enorme heterogeneidade genética. Estudos moleculares nas duas últimas décadas permitiram a identificação de vários genes responsáveis por surdez; entretanto, muitos ainda restam ser identificados. A maioria dos estudos de mapeamento de genes de surdez até então conduzidos privilegiou estratégias que buscavam mutações de ponto. Outros mecanismos mutacionais, como deleções e duplicações, foram pouco investigados. Portanto, a contribuição das CNVs (Copy Number Variations) na surdez hereditária é pouco conhecida. O objetivo desse trabalho foi identificar novos genes que possam ter papel na etiologia da surdez sindrômica ou não-sindrômica por meio da investigação de microdeleções e microduplicações em pacientes com perda auditiva. Selecionamos 25 genes candidatos (CTTN, FGF3, FGF19, FOXC1, FOXF2, FOXQ1, IMMP2L, KIF5C, LRRN3, MAP1A, MYLK4, PPP3CA, SHANK2, SLC5A7, STRC, TMC1, TMC2, TMC3, TMC4, TMC5, TMC6, TMC7, TMC8, TPCN2 e TUBB2A) para a triagem de microrrearranjos por meio da técnica de MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification). Os genes candidatos foram selecionados a partir de rearranjos detectados em um estudo prévio realizado por meio de array-CGH (array-based Comparative Genomic Hybridization) em indivíduos com surdez sindrômica estudados em nosso laboratório, e também a partir de dados da literatura. Nossa casuística foi composta por 163 indivíduos, dos quais 74 são pacientes com surdez associada a outros sinais (sindrômicos), a maioria casos isolados, e 89 são pacientes com surdez não-sindrômica, propósitos de famílias em que segrega surdez de herança autossômica dominante ou recessiva. Desenhamos uma sonda sintética intragênica de MLPA para cada um dos genes candidatos. Foram detectadas seis deleções em TMC6 (3,7%), seis deleções e uma duplicação em STRC (4,3%) e uma duplicação em IMMP2L (0,6%). A triagem de alterações nesses três genes em 189 indivíduos fenotipicamente normais revelou quatro deleções em TMC6 (2,1%), oito deleções e três duplicações em STRC (5,8%) e três deleções em IMMP2L (1,6%). Todas as alterações em TMC6, tanto nos casos de surdez como nos controles, eram na realidade artefatos devidos a problemas de hibridação da sonda correspondente. No gene STRC, previamente já relacionado à surdez, os rearranjos nos indivíduos afetados devem se tratar de polimorfismos sem efeito fenotípico por serem muito frequentes na população. Contudo, é possível que haja nesses pacientes mutações adicionais que não puderam ser rastreadas e que poderiam contribuir ao fenótipo, em combinação com o rearranjo detectado, como já descrito em um caso da literatura. A duplicação em IMMP2L em uma paciente com surdez não-sindrômica, herdada da mãe igualmente afetada, mostrou-se a mais provavelmente relacionada ao fenótipo, pois o estudo complementar por meio de array-CGH revelou que o rearranjo inclui uma duplicação parcial da porção 3 de outro gene, DOCK4. O produto desse gene possui uma isoforma que se localiza nos estereocílios das células ciliadas e se liga a uma importante proteína relacionada à audição, a harmonina. Portanto, nossa hipótese é a de que a duplicação seja a causa da surdez na família e que DOCK4 seja um novo gene responsável por surdez. A associação de IMMP2L com surdez é menos provável devido ao grande número de CNVs não patogênicas já descritas que incluem partes desse gene. Estudos complementares são necessários para mapear a duplicação com mais precisão. Além disso, o rastreamento de mutações em DOCK4 em outras famílias com surdez pode vir a confirmar o possível papel desse gene na etiologia da surdez.
Several genes contribute to the complexity of physiology of hearing. Consequently, hereditary deafness is extremely heterogeneous from the genetic point of view. In the last two decades, several genes responsible for hereditary hearing loss have been identified, but a large number of genes remains to be found, as evidenced by the unexplained cases of inherited deafness. The search for point mutations in candidate genes after mapping based on linkage studies has been the main strategy in the identification of such genes. Other mutation mechanisms, such as deletions and duplications, have been rarely investigated, and the contribution of DNA copy number variants (CNVs) to hearing loss is not well known. This study aimed at identifying novel genes, which might play a role in the etiology of syndromic and non-syndromic deafness, through the search of gene microdeletions and microduplications. We selected 25 candidate genes (CTTN, FGF3, FGF19, FOXC1, FOXF2, FOXQ1, IMMP2L, KIF5C, LRRN3, MAP1A, MYLK4, PPP3CA, SHANK2, SLC5A7, STRC, TMC1, TMC2, TMC3, TMC4, TMC5, TMC6, TMC7, TMC8, TPCN2 and TUBB2A) based on their involvement in microimbalances detected by Array-based Comparative Genomic Hybridization (aCGH) in a previous study of a Brazilian sample of individuals with syndromic hearing loss from our laboratory and others reported in the literature. We studied 163 subjects, 74 of them presenting syndromic deafness, the majority were isolated cases, and 89 being probands of families in which nonsyndromic deafness had an autosomal dominant or recessive mode of inheritance. Gene deletions or duplications were screened by Multiplex Ligant-dependent Probe Amplification (MLPA) using one synthetic intragenic probe designed for each candidate gene. We detected six deletions in TMC6 (3,7%), six deletions and one duplication in STRC (4,3%), and one duplication in IMMP2L (0,6%). The screening of imbalances in these genes in a control sample of 189 hearing individuals revealed four deletions in TMC6 (2,1%), eight deletions and three duplications in STRC (5,8%) and three deletions in IMMP2L (1,6%). The imbalances found in TMC6, both in affected and control individuals, were in fact artifacts due to problems in the hybridization of the corresponding probe. As to the STRC gene, previously related to deafness, the imbalances are more likely to be 4 polymorphisms with no phenotypic effect. However, the possibility remains that additional undetected mutations in affected individuals contribute to their phenotype, in combination with the microrearrangement, as already reported in the literature. The duplication in IMMP2L in a non-syndromic patient, and also present in her affected mother, is most likely causative of deafness, since a complementary study performed with aCGH revealed that the rearrangement included a partial duplication of the 3 end of another gene, DOCK4. An isoform of the DOCK4 protein localizes to the stereocilia in the inner ear and interacts with harmonin, a protein already known to be involved in hearing. We hypothesize that this duplication may be the cause of deafness in the family and, this being the case, DOCK4 appears as a novel deafness gene. The causal association between IMMP2L and deafness is less plausible, because of the large number of reported non-pathogenic CNVs that include parts of this gene. Further studies are required to precisely map this duplication. In addition, the screening of mutations in DOCK4 in other families with hearing impairment is required to evaluate its possible role in the etiology of deafness.

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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES
Introduction: Breast cancer is the second most common cancer in the world, and the most common among women, only 5% to 10% are hereditary and half of them are caused by hereditary breast and ovarian cancer (HBOC) , caused by variations in the BRCA1 and BRCA2 genes. Objectives: The present study aimed to identify the prevalence of deletions and duplications in BRCA1 and BRCA2 genes in breast cancer patients in Goiás, Brazil. Materials and methods: We evaluated 46 breast cancer patients who met National Comprehensive Cancer Network (NCCN) criteria for HBOC syndrome screening. A 4 ml blood sample was collected for DNA extraction using commercial kit and the MLPA (Multiplex Ligation Dependent Probe Amplification) technique was performed using the SALSA MLPA P002 BRCA1 and SALSA MLPA P045 BRCA2 / CHECK2 kits. Results and discussion: The majority of the patients were female (97.83%) and the mean age of the patients was 37.52 years. In this group, 43.47% of the patients were younger than 35 years at the time of diagnosis and 35% of them were diagnosed with triple negative tumors. The most common molecular subtype was luminal A (46.2%) followed by triple negative tumors (28.20%). No patient was found with rearrangements in BRCA1. In the BRCA2 gene, one patient (2.12%) presented a false positive result for the heterozygous deletion of exon 27, which may have been caused by the presence of a small change in the probe binding region. Conclusion: This was the first study performed to analyze large deletions and duplications in patients from the central-western region of Brazil. We can conclude that the frequency of large deletions and duplications in the BRCA1 and BRCA2 genes in the Goian population is low.
Introdução: O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais freqüente no mundo, e o mais comum entre as mulheres, apenas 5% a 10% são hereditários e metade deles são causados ​​pela síndrome do câncer de mama e ovário hereditário (HBOC), causada por variações nos genes BRCA1 e BRCA2. Objetivos: O presente estudo teve como objetivo identificar a prevalência de deleções e duplicações nos genes BRCA1 e BRCA2 em pacientes com câncer de mama no estado de Goiás, Brasil. Materiais e métodos: Avaliamos 46 pacientes com câncer de mama que atenderam aos critérios do National Comprehensive Cancer Network (NCCN) para pesquisa da síndrome HBOC. Foi coletada uma amostra de sangue de 4 ml para extração de DNA usando kit comercial e a técnica MLPA (Multiplex Ligation Dependent Probe Amplification) foi realizada usando os kits SALSA MLPA P002 BRCA1 e SALSA MLPA P045 BRCA2 / CHECK2. Resultados e discussão: A maioria dos pacientes era do sexo feminino (97.83%) e a idade média dos pacientes era de 37,52 anos. Neste grupo 43.47% dos pacientes possuíam idade inferior a 35 anos no momento do diagnóstico sendo que 35% destes foram diagnosticados com tumores triplo negativo. O subtipo molecular mais comum foi o luminal A (46.2%) seguido de tumores triplo negativos (28.20%). Nenhum paciente foi encontrado com rearranjos no gene BRCA1. No gene BRCA2, um paciente (2,12%) apresentou um resultado falso positivo para a deleção em heterozigoze do éxon 27, fato que pode ter sido ocasionado pela presença de uma pequena alteração na região de ligação da sonda. Conclusão: Este foi o primeiro estudo realizado para análise de grandes deleções e duplicações em pacientes da região centro-oeste do Brasil. Podemos concluir que a frequência de grandes deleções e duplicações nos genes BRCA1 e BRCA2 na população goiana é baixa.

O gene SHOX (short stature homeobox containing gene), expresso em altos níveis nas células osteogênicas, é fundamental para o desenvolvimento ósseo e para a determinação da altura. Haploinsuficiência do SHOX é responsável por vários fenótipos que envolvem a baixa estatura, como a síndrome de Turner, a discondrosteose de Léri-Weill e a baixa estatura idiopática. Cerca de dois terços das haploinsuficiências são causados por deleções. Neste trabalho, foi realizada uma comparação entre três técnicas para detecção de deleções do SHOX: a hibridação in situ com fluorescência (FISH), o estudo de microssatélites e o multiplex ligationdependent probe amplification (MLPA). Nos pacientes sem deleção do SHOX, foi realizado um rastreamento para identificação de mutações de ponto no gene que levassem à sua haploinsuficiência. Foram analisados seis pacientes com discondrosteose de Léri-Weill (DLW) e 20 com baixa estatura desproporcionada (BED). Na técnica de FISH, os cromossomos metafásicos obtidos a partir de cultura de linfócitos foram hibridados com o cosmídio LLNOYCO3M34F5. DNA genômico extraído a partir de leucócitos de sangue periférico foi submetido à análise de microssatélites e MLPA. Foram amplificados seis marcadores de microssatélites (repetições CA, DYS290, DXYS10093, DXYS10096, DXYS233 e DXYS234) e o MLPA foi realizado de acordo com as instruções dos kits SALSA MLPA P018-C1 e P018-D1 SHOX. Estes kits contêm oito sondas específicas para o gene SHOX e 13 para a área do SHOX, localizada a jusante do gene. O seqüenciamento direto da região codificadora do gene foi realizado nos pacientes sem deleção. Todos os pacientes com DLW apresentaram deleções envolvendo todo o gene. Entre os pacientes com BED, apenas um (5,0%) apresentou uma deleção intragênica envolvendo os exons 4, 5 e 6a. Os resultados das três metodologias foram concordantes na maioria dos casos, exceto em dois casos. No primeiro caso, inicialmente o FISH não identificou uma deleção envolvendo todos os éxons em um paciente com DLW. No segundo, uma deleção envolvendo os exons 4, 5 e 6a, identificada em uma paciente com BED, foi detectada apenas pelo MLPA. Ainda entre os pacientes com BED, três (15%) apresentaram deleção da região do marcador DXYS10096, a 3 do gene. Outros três (15%) pacientes apresentaram mutações de ponto identificadas pelo seqüenciamento direto: a mutação p.Tyr35X, que resulta na substituição de uma tirosina por um códon de parada prematuro; a p.Arg147His localizada na região do homeodomínio e a NM_000451:c.1236 -10T>C que se encontra a 10 nucleotídeos antes do início do éxon 5. Em uma comparação das três metodologias, o FISH foi considerado a técnica mais trabalhosa e com menor sensibilidade, levando até oito dias para sua realização. A análise por microssatélites requer o estudo dos progenitores, além de um grande número de marcadores para a análise de regiões extensas. O MLPA detectou todas as deleções, sendo considerada a metodologia mais sensível. Ele apresentou também menor custo e tempo de execução, além de possibilitar a estimativa do tamanho da deleção. Desta forma, o MLPA foi considerado a melhor metodologia para investigação inicial dos pacientes com DLW e BED.
The SHOX gene (short stature homeobox containing gene), expressed at high levels in osteogenic cells, is essential for bone development and growth process. SHOX haploinsufficiency is responsible for several phenotypes involving short stature, such as Turner syndrome, Léri-Weill dyschondrosteosis (LWD) and idiopathic short stature. Deletions are responsible for 2/3 of SHOX haploinsufficiency. In this study, a comparison among three techniques for detection of SHOX deletions: fluorescence in situ hybridization (FISH), microsatellites analysis and multiplex ligationdependent probe amplification (MLPA) was performed. A screening for point mutations that could lead to haploinsufficiency was performed in patients without SHOX deletion. Six patients with Léri-Weill dyschondrosteosis (LWD) and 20 with disproportionate short stature (DSS) were analyzed. FISH analysis was performed using the cosmid LLNOYCO3\"M\"34F5 and metaphase spreads obtained from lymphocytes culture. Genomic DNA extracted from peripheral blood leukocytes was used to microsatellite and MLPA analysis. Six microsatellite markers (CA repeats, DYS290, DXYS10093, DXYS10096, DXYS233 and DXYS234) were amplified by PCR and MLPA was performed according to the manufacturers instructions for SALSA MLPA P018 and P018-C1-D1 SHOX kits. These kits contain 8 specific probes for SHOX gene and 13 for \"SHOX area, which is located downstream of the gene. The direct sequencing of entire encoding region was performed in patients with no SHOX deletions. All patients with LWD presented deletions involving the entire gene. One (5.0%) patient with DSS, presented an intragenic deletion involving exons 4, 5 and 6a. The results of the three methods were concordant in most cases, except in two cases. In the first case, a patient with DLW, the FISH did not identify a deletion involving all SHOX exons. In the second case, a deletion of exons 4, 5 and 6a in a patient with BED was identified only by MLPA. Other 3 (15%) DSS patients had deletion in SHOX area, in the DXYS10096 marker. Other three (15%) patients presented a point mutation identified by direct sequencing: p.Tyr35X, which replaces a tyrosine for a premature stop codon, p.Arg147His located in the homeodomain region and NM_000451: c.1236-10T> C which is 10 nucleotides before the exon 5. In a comparison of three methods, the FISH technique was considered the more laborious and less sensitive, taking until eight days to obtain the results. The microsatellite analysis requires the parents DNA study. In addition, several markers are essential for the analysis of extensive regions. The MLPA was considered the most sensitive methodology since it detected all deletions. It also presented lower cost and execution time, and allowed the estimation of the size of the deletion. Thus, the MLPA was considered the best approach for initial investigation of LWD and DSS patients.

Detecta las mutaciones de tipo deleción y/o duplicación causantes de RM idiopático síndrómico o no síndrómico en diferentes genes y regiones, por medio de la técnica MLPA, siguiendo los pasos propuestos por GIRMOGEN 2012. El lugar de ejecución fue el Centro de Genética y Biología Molecular (CGBM) del Instituto de Investigación de la Facultad de Medicina Humana de la Universidad San Martín de Porres. El material biológico consistió en una muestra de 3 a 4 mL sangre periférica, en tubos vacutainer con EDTA, de 50 pacientes diagnosticados clínicamente con retraso mental provenientes del Servicio de Genética - Departamento de Especialidades Médicas del Hospital Edgardo Rebagliati Martins – EsSalud.
Tesis

INTRODUÇÃO: A síndrome de Williams-Beuren (SWB) é uma doença genética causada por uma microdeleção na região 7q11.23 e caracterizada por dismorfismos faciais típicos, deficiência intelectual, comportamento hipersociável, cardiopatia congênita, principalmente a estenose aórtica supravalvar (EASV), e outras malformações variáveis. MÉTODOS: Foram avaliados 65 pacientes (40 do sexo masculino, 25 do sexo feminino), com idades entre 2 e 59 anos (mediana = 14 anos), com características clínicas sugestivas de SWB. Todos os pacientes eram filhos de pais normais. A técnica de Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification® (MLPA®) foi usada com kit específico com sondas da região da SWB (MRC Holland). As sondas foram hibridadas ao DNA e os fragmentos ligados foram amplificados por PCR e analisados com software específico. RESULTADOS: A deleção de todas as sondas da região 7q11.23 testadas foi detectada por MLPA® em 55/65 pacientes. Um caso de deleção atípica, ou seja, menor que 1,5 Mb, foi observada em um paciente com quadro clínico parcial da síndrome. Os nove pacientes sem deleção tinham um diagnóstico clínico duvidoso da SWB. Dois pacientes tiveram MLPA® positivo para SWB embora apresentassem resultados de FISH negativos. Os achados clínicos dos pacientes com deleção típica foram: fácies típica (98,2%), atraso do desenvolvimento neuropsicomotor (98,2%), comportamento hipersociável (94,5%), hiperacusia (94,5%) e cardiopatia (81,8%). Dentre os pacientes com cardiopatia, 42,2% apresentavam EASV (isolada ou associada a outras anomalias cardíacas), 26,7% apresentavam estenose pulmonar e 31,1% apresentavam outras cardiopatias isoladas ou em associação. Outros achados dos pacientes com deleção foram: anormalidades geniturinárias (85,4%), escoliose (56,4%), baixa estatura (43,6%), hérnias inguinais e/ou umbilicais (36,4%), hipertensão arterial (36,4%, com 20% destes apresentando estenose de artérias renais), estrabismo (34,5%), microcefalia (30,9%), sinostose radioulnar (10,9%), hipotireoidismo (14,5%) e hipotireoidismo subclínico (7,3%). Hipercalcemia foi detectada em um paciente apenas. Outros dois pacientes apresentaram nefrocalcinose e um paciente apresentou hipercalciúria, com níveis de cálcio sérico normais. Três pacientes adolescentes foram a óbito por causas cardiovasculares, incluindo um caso de óbito após transplante cardíaco. CONCLUSÕES: A técnica de MLPA® foi eficaz na detecção da microdeleção na região 7q11.23 possibilitando a confirmação diagnóstica da SWB em 84,6% dos pacientes estudados. Além disso, foi possível detectar uma deleção menor atípica em um paciente com fenótipo parcial e confirmar o diagnóstico em dois pacientes com quadro clínico típico de SWB e resultados de FISH negativos. Portanto, o MLPA® constitui-se um método promissor na investigação diagnóstica da SWB. Por ser uma doença multissistêmica, a SWB exige cuidados multidisciplinares e acompanhamento específico a fim de se prevenir complicações
INTRODUCTION: Williams-Beuren syndrome (WBS) is a genetic disorder caused by a microdeletion in 7q11.23 region. It is characterized by typical facial dysmorphisms, mental retardation, hipersociable behavior, congenital heart disease, mainly supravalvular aortic stenosis (SVAS), and other variable congenital malformations. METHODS: 65 patients (40 males, 25 females), aged 2-59 years old (median = 14 years old), with clinical characteristics suggesting WBS, were evaluated. All patients had normal parents. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification® (MLPA®) was performed with a kit with probes in WBS region (MRC Holland). The probes were hybridized to the DNA and the ligated fragments were amplified by PCR and analyzed with specific software. RESULTS: The deletion for all tested probes in the 7q11.23 region was detected by MLPA® in 55/65 patients. One case of atypical deletion, smaller than 1.5 Mb, was observed in one patient with partial clinical picture of the syndrome. The nine patients without the deletion did not have a definitive clinical diagnosis of WBS. Two patients had positive MLPA® results even though they had negative FISH for WBS. The clinical characteristics of the patients with the typical deletion were: typical facies (98.2%), neuropsicomotor delay (98.2%), hypersociable behavior (94.5%), hyperacusis (94.5%) and congenital heart disease (81.8%). Among the patients with cardiac abnormalities, 42.2% had SVAS (isolated or not), 26.7% had pulmonary valve stenosis and 31.1% had other cardiac anomalies (isolated or grouped). Other findings in patients with deletion comprised: genitourinary abnormalities (85.4%), scoliosis (56.4%), short stature (43.6%), inguinal and/or umbilical hernias (36.4%), arterial hypertension (36.4%, with 20% of these presenting renal arteries stenosis), strabismus (34.5%), microcephaly (30.9%), radioulnar synostosis (10.9%), hypothyroidism (14.5%), and subclinical hypothyroidism (7.3%). Hypercalcaemia was detected in only one patient. Two other patients had nephrocalcinosis and one patient had hypercalciuria, with normal serum calcium levels. Three adolescents died due to cardiovascular problems, including one case that died after a cardiac transplantation. CONCLUSIONS: MLPA® was effective to detect the microdeletion in 7q11.23 region confirming the diagnosis of WBS in 84.6% of the patients. It was also possible to detect a small atypical deletion in one patient with partial phenotype and confirm the diagnosis in two patients with typical clinical characteristics of WBS and negative FISH results. Thus, MLPA® is a promising method in the diagnostic investigation of WBS. WBS is a multisystemic disorder and therefore requires multidisciplinary care and specific follow-up in order to prevent complications

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:38:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernanda Carla Stegani.pdf: 10431040 bytes, checksum: 2702ca1faeabb2d893b8f2971288b01e (MD5) Previous issue date: 2011-12-08
The Intellectual Disability (ID) is defined as a disability characterized by significant limitations both in intellectual functioning and in the adaptive behavior and it is expressed in practical, social and conceptual skills, originating before the age of 18. It is one of the most common neuropsychiatric disorders in children and adolescents, with a 5% prevalence in our population. The Fragile X Syndrome (FXS) is the most frequent and best documented DI heritable in humans. The phenotype of FXS is associated with mutations in the gene FMR1 (Fragile X Mental Retardation-linked type 1) and it covers a broad spectrum of behavioral and physical involvement. It is caused by a CGG trinucleotide expansion in the first exon of the FMR1 gene located in the region Xq27.3 on the X chromosome Because of its phenotypic diversity, this disease has been under diagnosed in the pediatric population. Among the techniques used for molecular diagnosis of FXS, the MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) has been considered promising. In this context, this study aimed to validate the molecular diagnosis of patients suspected of FXS in the Laboratory of Cytogenetics and Molecular Genetics (Lagene) by the MLPA technique. We selected 33 patients referred by medical from public health to Lagene with clinical of FXS. To perform the analysis by MLPA the Salsa MLPA P106-B1 MRX kit was used. The amplificons were obtained only for 15% of the patients. The MLPA kit used did not detect changes in the copy number of the FMR1 gene in any examined patient, being useful the need of other molecular methods to confirm the diagnosis of FXS. Thus, we concluded that such MLPA kit was not useful to detect specific changes in the copy numbers of the FMR1 gene. So the Salsa MLPA Kit P106-B1 MRX should not be used to the trial of patients with FXS.
A Deficiência Intelectual (DI) é definida como uma incapacidade caracterizada por limitações significativas, tanto no funcionamento intelectual quanto no comportamento adaptativo e está expressa nas habilidades práticas, sociais e conceituais, originando-se antes dos 18 anos de idade. É um dos transtornos neuropsiquiátricos mais comuns em crianças e adolescentes, com taxa de prevalência de 5% na população brasileira. A Síndrome do X-Frágil (SXF) é a forma mais frequente, mais pesquisada e melhor documentada de DI herdável em seres humanos. O fenótipo da SXF está associado a mutações no gene FMR1 (Fragile Xlinked Mental Retardation type 1) e abrange um amplo espectro de envolvimento físico e comportamental. É causada por uma expansão de trinucleotídeos CGG no primeiro éxon do gene FMR1 localizado na região Xq27.3 no cromossomo X. Em função de sua diversidade fenotípica, esta doença tem sido subdiagnosticada na população pediátrica. A importância do reconhecimento clínico e diagnóstico específico da SXF vem do fato de que teoricamente todos os casos são hereditários e familiais. Entre as técnicas moleculares utilizadas para o diagnóstico da SXF, a MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) tem sido considerada promissora. Nesse contexto, este estudo teve como objetivo validar o diagnóstico genético-molecular de pacientes com suspeita da SXF no Laboratório de Citogenética e Genética Molecular (LaGene) da Secretaria Estadual de Saúde do Estado de Goiás, na cidade de Goiânia, pela técnica de MLPA. Foram selecionados 33 pacientes encaminhados pelo serviço médico da rede pública de saúde ao LaGene com indicação clínica de diagnóstico da SXF. Para realização da análise por MLPA foi utilizado o Kit: Salsa MLPA P106-B1 MRX. Foram obtidas amplificações de apenas 15% dos pacientes. O Kit utilizado não detectou alterações no número de cópias do gene FMR1 em nenhum paciente analisado, sendo necessário a utilização de outros métodos moleculares para confirmação do diagnóstico da SXF. Dessa forma, concluímos que o Kit utilizado não foi específico para detectar alterações no número de cópias do gene FMR1, não se mostrou sensível e específico na detecção de portadores da SXF, sendo considerado oneroso. Assim a técnica de MLPA, com o uso do Kit Salsa MLPA P106-B1 MRX , não deverá ser utilizada para se triar pacientes com suspeita da SXF.

A síndrome de Waardenburg é uma síndrome geneticamente heterogênea, com uma taxa de penetrância muito alta e expressividade extremamente variável. O objetivo desse estudo foi a caracterização molecular de uma amostra brasileira de pacientes com SW, dando continuidade ao estudo clínico feito em Pardono (2005), por meio do estudo de 48 probandos classificados com a síndrome de Waardenburg tipo 1 ou 2. Foram estudados os genes PAX3, MITF, SOX10, SNAI2, EDN3 e EDNRB, por meio do sequenciamento pelo método de Sanger, e investigadas as microdeleções e microduplicações dos genes PAX3, MITF e SOX10 pela técnica de MLPA (Multiplex Ligationdependent Probe Amplification). Dentre os resultados obtidos, identificou-se 17 mutações potencialmente patogênicas (35,4% dos probandos). Dessas, seis são variações de número de cópias (12,5% dos probandos). Além disso, foi realizado um levantamento na base de dados LOVD (Leiden Open Variation Database), no qual constam 105 mutações não sinônimas exônicas consideradas causativas da SW. Diversos algoritmos foram utilizados para avaliar a possível patogenicidade dessas mutações, os quais levam em conta as frequências das mutações na base de dados do projeto 1000 genomas e 6500 exomas, anotam as previsões dadas pelos programas Polyphen2, MutationTaster, LRT e SIFT e verificam a conservação em mamíferos e primatas. Por meio dessa análise, verificou-se que em 19 mutações desse tipo (18%) faltam evidências de sua patogenicidade, colocando-se em dúvida a sua relação com a síndrome de Waardenburg
Waardenburg syndrome (WS) is a genetically heterogeneous syndrome, with a very high penetrance rate and highly variable expressivity. The focus of this study was the molecular characterization of a Brazilian sample of patients with WS (48 probands classified with Waardenburg syndrome type 1 or 2). The analysis of genes PAX3, MITF, SOX10, SNAI2, EDN3 and EDNRB were performed by the Sanger sequencing method. Microduplications and microdeletions in genes PAX3, MITF and SOX10 were investigated by MLPA technique (Multiplex Ligationdependent Probe Amplification). We detected 17 mutations considered as potentially pathogenic in 17 probands of the sample (35,4 % of probands). Among these, six are copy number variations (12,5% of probands). In addition, we performed a survey using the database of LOVD (Leiden Open Variation Database), which contains 105 non-synonymous exonic mutations considered causative of WS. Several algorithms were used to evaluate the possible pathogenicity of these mutations, taking into account the frequency of mutations in the database project in 1000 genomes and 6500 exomes, and using programs : Polyphen2, MutationTaster, LRT and SIFT. These algorithms also verify the conservation of the variations in mammals and primates. Through this analysis, lack of evidence was found for the pathogenicity of 19 non-synonymous mutations (18%) and association of these with Waardenburg syndrome is questioned

INTRODUÇÃO: O cromossomo Y contém genes primordiais para o desenvolvimento testicular e a espermatogênese. Sua conformação repetitiva predispõe à ocorrência de deleções e duplicações, que tem impacto clínico. As microdeleções nas regiões AZF afetam loci responsáveis pela espermatogênese e são uma das causas mais frequentes de azoospermia e oligozoospermia. Seu diagnóstico tem valor preditivo para o sucesso na recuperação cirúrgica de espermatozoides testiculares em homens azoospérmicos. A técnica utilizada para detectá-las é a reação de polimerização em cadeia (PCR), porém os protocolos divergem entre si, havendo muita variabilidade na incidência destas deleções. À vista disso, sugerimos utilizar a técnica de Amplificação de Múltiplas Sondas dependente de Ligação (MLPA). OBJETIVO: Comparar os resultados obtidos com as técnicas de PCR e MLPA na detecção de microdeleções do cromossomo Y em homens inférteis. RESULTADOS: Analisamos 43 pacientes inférteis (azoospérmicos e oligozoospérmicos) e 40 homens férteis (controle) pelas técnicas de PCR e MLPA. Encontramos 7 deleções por PCR (16,2%) e 9 por MLPA (21%), além de 5 duplicações e um mosaico. DISCUSSÂO: Além das deleções, as duplicações também podem gerar instabilidades nos genes do cromossomo, podendo levar a infertilidade. CONCLUSÕES: Os resultados obtidos por ambas as técnicas revela que a MLPA é uma técnica mais sensível que a técnica de PCR para detectar microdeleções do cromossomo Y
INTRODUCTION: The Y chromosome contains several genes responsible for testicular development and spermatogenesis. Its repetitive conformation predisposes this chromosome to deletions and duplications that have clinical impact. Microdeletions in the AZF regions affect loci responsible for spermatogenesis and are one of the most frequent causes of azoospermia and oligozoospermia. This diagnosis may have a predictive value for success in the surgical recovery of testicular spermatozoa in azoospermic men. The gold standard method for this detection is polymerase chain reaction (PCR), but protocols diverge among them, generating a great variability in the incidence of these deletions. PURPOSE: We evaluated another molecular diagnostic method, Multiplex Ligand Probe Dependent Amplification (MLPA), which generates more genomic data (such as duplications and rearrangements) in a single reaction, leading to a better understanding of these patients phenotype. OBJECTIVE: To compare the results obtained with PCR and MLPA techniques in the detection of Y chromosome microdeletions in infertile men. RESULTS: We analyzed 43 infertile patients (azoospermic and oligozoospermic) and 40 fertile men (control) by PCR and MLPA techniques. We found 7 deletions by PCR (16.2%) and 9 by MLPA (21%), in addition to 5 duplications and one mosaic. DISCUSSION: Besides deletions, duplications can also generate instability in the chromosome genes, which may lead to infertility, and it is important being capable to diagnose these alterations with a faster and more effectively method. CONCLUSIONS: The results obtained by both techniques reveal that MLPA is more sensitive than PCR to detect microdeletions of the Y chromosome

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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES
Cleft lip and / or palate are birth defects easily recognizable and widely incidents in the human population. The clefts have a complex etiology involving genetic and environmental factors. They are found in approximately 1 in 700 births and have substantial impact on people's lives. Require always, surgery, dental, speech therapy, psychological and cosmetic. Clefts are recognized as a result of a wide rate of developmental disorders. Approximately 2/3 of the cases are not associated with any other abnormality and are called "non syndromic." The etiology of non syndromic oral clefts remains unknown. Preliminary studies suggest the involvement of a variety of genes and / or loci and environmental factors seem to play an important role in the genesis of such cases. Advances in molecular and quantitative analysis provide new opportunities to identify genes and gene-environment interactions relevant to the etiology of this common defect and representative birth. In this study, we analyzed a set of 80 cases of cleft lip and / or palate of non syndromic cases of patients of Associação de Combate as Deformidades Faciais (REFACE), collecting epidemiological and clinical data and biological sample for DNA extraction. The analysis was performed by Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) of IRF6 and GRHL3 genes. This study finds only one individual with a duplication of a genomic region of the gene GRHL3, emphasizing the necessity of a larger sample and different geographical regions.
Fissuras de lábio e/ou palato (FL/P) são defeitos de nascimento facilmente reconhecíveis e amplamente incidentes na população humana. As fissuras têm uma etiologia complexa, envolvendo fatores genéticos e ambientais. São encontradas em aproximadamente 1 em 700 nascimentos e têm substancial impacto na vida das pessoas. As fissuras, de modo geral, acontecem com maior frequência nos homens do que nas mulheres, numa taxa de 2:1. Requerem, sempre, intervenções cirúrgicas, dentárias, fonoaudiológicas, psicológicas e cosméticas. Aproximadamente 2/3 dos casos não estão associadas a qualquer outra anomalia e são chamadas nãosindrômicas (FL/PNS). A etiologia da FL/PNS permanece desconhecida. Estudos preliminares sugerem a participação de uma variedade de genes e/ou loci, bem como fatores ambientais na etiologia desses defeitos congênitos. O gene IRF6 (interferon regulador factor 6) é consistente na sua contribuição como causa das fissuras orais dentre um grande numero de genes candidatos. Mutações nesse gene causam uma forma dominante da síndrome de van der Woude, a qual inclui FL/P, e marcadores polimorficos nesse gene estão fortemente associados a FL/P. Recentemente, o gene GRHL3 foi identificado como um outro gene associado à causa da síndrome de van der Woude. Dessa forma, passou a ser um novo gene candidato as FL/PNS. No presente trabalho, coletamos dados epidemiológicos, ambientais e amostra biológica (sangue periférico) de 80 casos de FL/PNS atendidos na Associação de Combate às Deformidades Faciais (REFACE) da cidade de Goiânia, GO. Investigamos variações nos genes IRF6 e GRHL3, mediante a técnica de Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA). Os resultados mostraram uma duplicação no exon 4 do gene GRHL3 em quatro indivíduos portadores de fissura de lábio e palato não aparentados. Nenhuma variação foi detectada no gene IRF6. Esse é o primeiro relato de uma microduplicação no gene GRHL3 em indivíduos com FL/PNS. Esses resultados são preliminares e enfatizam a necessidade de aplicação de outros métodos que comprovem esse achado, além de uma maior amostragem e de investigações adicionais no estudo da etiologia das fissuras orais não sindrômicas.

Mestrado em Biomedicina Molecular
Laryngeal carcinomas belong to a bigger family of tumours known as Head and Neck Cancer (HNC). HNC is the sixth most malignant type of cancer in the world and it can arise from several anatomical sites. Among them, the larynx is the second most common affect organ. The incidence of laryngeal carcinoma is 1,9% worldwide and it presents a high mortality rate (1,6%). Despite technological advances in diagnosis and treatment fields, the 5 year-survival rate did not improved significantly. The low survival rates are mainly explained by a late diagnosis, tumour aggressiveness and the fact that laryngeal carcinoma metastasize easily. Taking this into consideration, it is essential to identify biomarkers with significant diagnostic and prognostic value in order to anticipate the detection of laryngeal carcinoma in an early stage. This study arises mainly for characterize the genetic and epigenetic profile of laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC). Eight LSCC samples and seven non-tumour samples contralateral to the primary tumour were collected upon resection surgery and characterized by MLPA, MS-MLPA and array CGH. The results showed that gain of genetic material was mainly present in chromosomes 3q, 8q, 11q, 14q13.1, Xp22.31 and Xq21.1 while genetic loss occurred mainly in chromosomes 3p, 9p23.1 and Y. Gain of MYC and TNFRSF1A was the most common event among the tumour samples included in this study. Regarding the methylation profile, the genes CDKN2A, CHFR, RARβ e RASSF1 were the only ones which were methylated in this samples. In conclusion, this study allowed to identify genetic alterations associated with LSCC that have already been reported in scientific papers as well as alterations that have been associated with tumour development and progression. In addition, a few genetic alterations which have never been reported as being associated with human cancer before were identified. Nevertheless, new studies must be carried out, with a higher number of samples. Ultimately, the main goal would be to identify genetic alterations significantly associated with LSCC progression and establish a correlation with clinicopathological data.
O carcinoma da laringe pertence a uma grande família de tumores conhecida como Cancro da Cabeça e do Pescoço que é considerado o sexto tipo de tumor mais maligno em todo o mundo. Dentro desta família, os tumores podem ter origem em diversos locais anatómicos, sendo a laringe o segundo órgão mais comummente afetado. O cancro da laringe apresenta uma incidência mundial de 1,9% e uma taxa de mortalidade elevada de 1,6%. Apesar dos avanços tecnológicos na área do diagnóstico e da terapêutica, a taxa de sobrevivência ao fim de 5 anos não apresentou melhorias significativas. As baixas taxas de sobrevivências são explicadas essencialmente pelo diagnóstico tardio, pela agressividade do tumor e pela sua propensão a desenvolver metástases. Desta forma, torna-se essencial a identificação de biomarcadores com valor de diagnóstico e prognóstico a fim de detetar a presença do tumor numa fase mais precoce. Este estudo surge com o objetivo principal de caracterizar o perfil genético e epigenéticos do carcinoma das células escamosas da laringe com recurso às técnicas de MLPA, MS-MLPA e array CGH, usando oito amostras tumorais e sete amostras não-tumorais contra laterais ao tumor, ambas coletadas após cirurgia A análise genética revelou uma maior taxa de ganho de material genético nos cromossomas 3q, 8q, 11q, 14q13.1, Xp22.31, Xq21.1 e perda de material genético nos cromossomas 3p, 9p23.1 e Y. O ganho dos genes MYC e TNFRSF1A revelou ser o evento mais comum entre as amostras analisadas. Relativamente ao perfil epigenético, observou-se que os genes CDKN2A, CHFR, RARβ e RASSF1 se encontravam metilados nas amostras em estudo. Em suma, este trabalho permitiu identificar algumas alterações genéticas e epigenéticas descritas na literatura como estando associadas ao CCEL, assim como alterações associadas ao desenvolvimento tumoral. Foram ainda identificadas alterações que ainda não foram reportadas como estando associadas ao cancro. Desta forma, este estudo piloto permitiu dar início ao estudo de potenciais biomarcadores associados ao CCEL. Porém, novos estudos devem ser realizados, com um número de amostras superior, de forma a identificar alterações genéticas significativas no desenvolvimento e progressão do CCEL e associa-las às características clinico patológicas dos doentes.

Rearranjos subteloméricos submicroscópicos são uma causa importante de malformações congênitas múltiplas e retardo mental. Recentemente, os mecanismos de origem de rearranjos subteloméricos começaram a ser investigados. O seqüenciamento dos pontos de quebra de rearranjos cromossômicos em 1p36 revelou predomínio por mecanismos de reparo não exclusivos. Rearranjos constitucionais em 1p36 são as alterações subteloméricas mais comuns e incluem deleções terminais simples, cromossomos derivados, deleções intersticiais e rearranjos complexos. Estes rearranjos resultam em um padrão específico de malformações e distúrbios do desenvolvimento neuropsicomotor que caracterizam a síndrome de monossomia 1p36. Os genes causativos ainda não foram identificados e a expressão fenotípica pode ser em função da haploinsuficiência de genes contíguos ou pelo mecanismo de efeito de posição. Obesidade e hiperfagia são características descritas em ~15% dos casos. Investigamos por MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification) a presença de rearranjos no segmento cromossômico 1p36 em um grupo de 154 pacientes com obesidade e hiperfagia e testes genéticos negativos para a síndrome de Prader-Willi (PWS), e outro grupo de 83 pacientes encaminhados para estudos cromossômicos por diversos motivos. A estratégia de MLPA utilizada permitiu identificar em nove pacientes diferentes tipos de rearranjos na região subtelomérica 1p36. Para investigar os mecanismos de quebra, reparo e estabilização cromossômica envolvidos em rearranjos subteloméricos, linhagens celulares de seis pacientes contendo rearranjos constitucionais em 1p36 foram desenvolvidas. A clonagem e seqüenciamento das junções dos pontos de quebra de um rearranjo complexo e três translocações não recíprocas identificaram similaridades nas junções que sugerem o reparo por NHEJ (Nonhomologous end-joining) como o mais provável mecanismo de origem destes rearranjos. Duas deleções terminais aparentemente simples também foram investigadas e o refinamento dos pontos de quebra identificou dois intervalos genômicos distintos contendo duplicações segmentares específicas de 1p36 com 90-98% de homologia. Estas duplicações segmentares podem ter estimulado ou sido usadas como substratos no mecanismo de reparo do DNA. Nossos achados reforçam a associação da monossomia 1p36 com obesidade e hiperfagia e sugerem que estas características estejam freqüentemente associadas com fenótipos atípicos/leves e deleções submicroscópicas com 2-3 Mb de extensão. Sugerimos o uso de MLPA como um método alternativo rápido de diagnóstico para detectar e caracterizar rearranjos em 1p36.
Subtelomeric abnormalities are an important cause of mental retardation and birth defects. The mechanisms involved in the formation of subtelomeric rearrangements are now beginning to be elucidated. Breakpoint sequencing analysis of 1p36 rearrangements has revealed prevalence of different nonexclusive recombination-repair mechanisms. Rearrangements of 1p36 are the most frequently detected subtelomeric abnormalities and include different-sized simple terminal deletions, derivative chromosomes, interstitial deletions and complex rearrangements. These rearrangements have been reported to result in the specific pattern of malformation and neurodevelopmental disabilities that characterizes monosomy 1p36 syndrome. Thus far, no genes have been conclusively determined to be causative. Besides, it is still not known if a mechanism of haploinsufficiency or position effect that influences phenotype expression in this commonest terminal deletion syndrome. Obesity and hyperphagia have been reported to occur in ~15% of cases. We have used multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) to screen for monosomy 1p36 in a group of 154 hyperphagic and obese, PWS negative patients and in a separate group of 83 patients sent to investigate a variety of other conditions. The MLPA strategy used allowed the identification of a diversity of rearrangements in nine subjects. In order to gain further insights into the mechanisms of chromosome breakage, repair, and stabilization mediating subtelomeric rearrangements in humans, we have used cell lines containing constitutional rearrangements of 1p36 of six patients. Cloning of the breakpoint junctions in a complex rearrangement and three non-reciprocal translocations revealed similarities at the junctions that suggest NHEJ as the most likely mechanism of DNA repair that generated these rearrangements. Additionally, two apparently pure terminal deletions were also investigated and the refinement of the breakpoint regions identified two distinct genomic intervals ~25-kb apart, each containing a series of 1p36 specific segmental duplications with 90-98% identity. These segmental duplications might have been stimulated or used as substrate for a recombination-repair mechanism. Our work reinforces the association between monosomy 1p36 and obesity and hyperphagia, and further suggests that these features might be usually associated with an atypical/mild phenotype in addition to a submicroscopic deletion of ~2 to 3 Mb in size. We suggest the use of MLPA as an alternative method for high-throughput detection and delineation of rearrangements at 1p36.

Orientadores: Antonia Paula Marques de Faria, Maricilda Palandi de Mello
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas
Made available in DSpace on 2018-08-30T05:34:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Henrique_PamelaPontes_M.pdf: 8320960 bytes, checksum: 1d8ff3e1253bf81cc18b4afd51572860 (MD5) Previous issue date: 2015
Resumo: A deficiência intelectual ligada ao X (DILX) é uma das causas genéticas mais frequentes de deficiência intelectual (DI), ocorrendo em 10 a 12% de todos os homens afetados, provavelmente pelo maior número de genes identificados no cromossomo X em comparação a qualquer segmento autossômico. Cerca de 100 genes seriam determinantes de DILX, porém mesmo com o conhecimento do papel de vários deles, há aspectos a serem elucidados, como a contribuição de cada um na determinação da DI ou ainda as correlações genótipo-fenótipo, cuja análise depende da investigação genética em indivíduos com DI idiopática. Entre os métodos que permitem a investigação molecular dessa condição destaca-se a Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) por sua rapidez, sensibilidade e baixo custo. O objetivo do presente estudo foi investigar alterações em genes do cromossomo X pela técnica de MLPA em pacientes do sexo masculino com atraso global do desenvolvimento ou DI de origem indeterminada. Foram investigados 107 indivíduos com o kit SALSA MLPA P106 MRX probemix (MRC-Holland), 104 deles apresentaram resultado na faixa de normalidade e em três foram identificadas alterações do número de cópias interpretadas como duplicações. O paciente P13 apresentou alteração no gene HUWE1, que atua no controle da diferenciação neural e tem mutações descritas em algumas famílias com DI de moderada a grave; no paciente P139 foram identificadas alterações nos genes SCL6A8 e GDI, ambas confirmadas pela análise por Real Time Polymerase Chain Reaction (qPCR); mutações no primeiro são incluídas entre as síndromes de deficiência de creatina, com fenótipos variando de DI leve e atraso de fala até DI grave, convulsões e alterações de comportamento no sexo masculino, enquanto no segundo se associam à DILX inespecífica; já no paciente P39 foi detectada alteração no gene ARX, relacionado a mais de uma condição classificada como DILX sindrômica, que não foi confirmada. Como apenas alguns éxons relacionados à DILX foram investigados, não se afasta a eventual ocorrência de rearranjos localizados em regiões não abordadas pelo kit utilizado. Contudo, a técnica utilizada se mostrou uma opção de custo relativamente baixo e fácil reprodutibilidade, sendo viável para aplicação em algoritmos de investigação da DI. Os resultados reforçam a relevância da DILX entre as causas de DI, justificando a inclusão de testes moleculares específicos para a elucidação diagnóstica dessa condição
Abstract: X-linked intellectual disability (XLID) is one of the most frequent genetic causes of intellectual disability (ID), occurring in 10-12% of all affected men, probably because the larger number of identified genes on the X chromosome related to this condition than in any other autosomal segment. Although about 100 genes have been considered as determinant of XLID, the the role of several of these genes remains yet be elucidated despite the knowledge on the function of several of them. For instance, the contribution of each gene in determining the ID and the genotype-phenotype correlation depend on the genetic investigation of affected individuals. The Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) is among the methods that allow molecular investigation of this condition because it is rapid and low cost and presents high sensitivity. The aim of this study was to investigate copy number variations in X-linked genes by MLPA technique in males with global developmental delay or ID of undetermined origin. A hundred and seven individuals were investigated using SALSA MLPA P106 MRX kit (MRC-Holland) and alterations were confirmed by Real Time Polymerase Chain Reaction (qPCR). A normal invariant pattern was observed in 104 out of 107 individuals, and three showed variations that have been interpreted as duplications. Patient P13 showed increased signal for HUWE1 gene, which plays a role in the control of neural differentiation. HUWE1 mutations have been described in families with moderate or severe ID. Patient P139 showed increased signals corresponding to regions of SCL6A8 and GDI1 genes. The former is included among genes involved in the creatine deficiency syndrome whose phenotype can range from mild ID and speech delay to severe ID, convulsions and behavior changes in males, and the latter is involved with non-syndromic XLID. Conversely, the variation in ARX gene, which is associated to more than one condition classified as syndromic XLID, observed in MLPA analysis for patient P39 was not confirmed in the qPCR assay. As only a few exons related to XLID were investigated, it does not rule out the possible occurrence of rearrangements located in regions not covered by the kit used. However, the technique employed was an easily reproducible, relatively low cost option, manageable for application in ID research algorithms. The results reinforce the importance of XLID among the causes of ID, justifying the inclusion of specific molecular tests for the laboratory diagnosis of this condition
Mestrado
Ciencias Biomedicas
Mestra em Ciências Médicas

Haemophilia A and von Willebrand Disease (VWD) are disorders which can cause mild to severe bleeding in an individual. In many cases, knowledge of the molecular basis of these disorders is required to enable appropriate genetic counselling within families, carrier diagnosis and, in some cases, prenatal diagnosis. The current ‘gold standard’ for diagnosing patients with Haemophilia A and VWD disorders is by direct sequencing of genomic DNA to identify mutations. However this method may not reveal the presence of larger heterozygous deletions or duplications of F8 and VWF due to masking by an unaffected allele. Therefore the genetic basis of disease in a proportion of cases may remain unresolved. Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) is a method based on gene dosage that can be applied to the detection of large gene deletions or duplications in Haemophilia and VWD, aiding effective genetic diagnosis. This project developed and applied MLPA to investigate the molecular basis of disease in a selected cohort of patients diagnosed with Haemophilia A, type 1 and type 3 VWD, where standard direct sequencing protocols of F8 and VWF had failed to reveal causative mutations, and to assess its application in the genetic diagnosis of these disorders. This extended previous work on the molecular basis of Haemophilia A and VWD carried out in the Molecular Diagnostics Centre (MDC) at Central Manchester NHS Foundation Trust. MLPA confirmed the presence of large deletions in seven Haemophilia A index patients, two type 1 VWD patients, seven type 3 VWD patients and one possible duplication in a female haemophiliac. The presence of a masked gene abnormality was also confirmed in two carrier females. This demonstrates that MLPA is a useful diagnostic tool for detecting or confirming larger scale mutations not suited to DNA sequence analysis. MLPA is an important addition to the range of molecular diagnostic tools for the investigation of these haemostatic disorders and may be utilised when conventional mutation screening has failed to identify a causative mutation.

Leishmania tropica ist der Auslöser von kutaner Leishmaniose beim Menschen und kommt in Afrika über den Mittleren Osten bis nach Nordindien vor. Mittels Mikrosatellitentypisierung (MLMT) wurde die weltweite Populationsstruktur dieser Spezies und der nahe verwandten Spezies L. aethiopica aufgedeckt, indem sowohl Methoden angewandt wurden, die auf genetischen Distanzen beruhen als auch solche, die auf der Analyse von Allelfrequenzen basieren. Die 195 Stämme von L. tropica sowie die acht Stämme von L. aethiopica gruppierten hauptsächlich gemäß ihrer geographischen Herkunft. Die Stämme von L. aethiopica stellten eine eigene Gruppe dar, die allerdings innerhalb der afrikanischen Stämme von L. tropica gruppierte. Vorläufige Ergebnisse einer genomweiten SNP-Analyse haben die Ergebnisse der Mikrosatellitenanalyse weitgehend bestätigt. Um die Gründe für die hohe genetische Variabilität innerhalb der Spezies L. tropica herauszufinden, wurde eine Funktionelle Klonierung durchgeführt, in der N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) als Indikator für ein funktionierendes oder eingeschränktes Mismatch Repair (MMR)-System eingesetzt wurde. Dafür wurde ein Akzeptorstamm (hohe MNNG-Toleranz) mit einer Cosmidbibliothek, die genomische DNA eines Donorstammes (niedrige MNNG-Toleranz) enthielt, transfiziert. Die erhaltenen Transfektanten wurden dann auf ihre MNNG-Toleranz getestet. Die zeit- und kosteneffiziente Identifizierung von großen Mengen an Sandmücken ist wichtig für Feldstudien, in denen mehrere Tausend Mücken gefangen werden. Hier wird eine multiplexe Technik zur ligationsabhängigen Sondenamplifizierung vorgestellt, die die Identifizierung von Sandmücken-Spezies im Mittleren Osten ermöglicht. Die Spezies Phlebotomus syriacus, P. arabicus und P. papatasi können durch diese Methode mit spezies-spezifischen Sonden eindeutig identifiziert werden. Außerdem kann diese Methode dazu genutzt werden, weitere Spezies zu diskriminieren und auf gepoolte Sandmücken angewandt werden.
Leishmania tropica is the causative agent of human cutaneous leishmaniasis in foci ranging from Africa through the Middle East to northern India. By multilocus microsatellite typing (MLMT), the world-wide population structure of this species and its closely related species L. aethiopica has been revealed applying methods based on both genetic distances and allele frequencies. The 195 strains of L. tropica and eight strains of L. aethiopica largely clustered according to their geographical origins. The strains of L. aethiopica formed a distinct group, although clustering among other African strains of L. tropica. Preliminary data obtained through a whole genome sequencing approach including strains of L. tropica, L. aethiopica and L. major have largely corroborated the results of the MLMT approach. To reveal the reasons for the high genetic variability among strains of L. tropica, a Functional Cloning approach was conducted using N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) as an indicator for a functioning or impaired mismatch repair (MMR) system. The transfectants retrieved from the transfection of an acceptor strain exhibiting high MNNG tolerance with a cosmid library bearing the genomic DNA of a donor strain with a reduced MNNG tolerance were screened for the restored phenotype of the donor strain. The time- and cost-efficient identification of a large amount of sand flies is important since several thousands are caught during field studies. Here, a multiplex ligation-dependent probe amplification approach (MLPA) for the identification of sand flies endemic to the Middle East is introduced. The unambiguous identification of Phlebotomus syriacus, P. arabicus and P. papatasi was possible with this approach using species-specific probes. Furthermore, this technique has the potential to discriminate more species and to be applied to pooled sand fly specimens.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4725.pdf: 4003213 bytes, checksum: c40eb861711bbe31a91e5b1600b14b63 (MD5) Previous issue date: 2012-09-21
Universidade Federal de Sao Carlos
Intellectual disability (ID) is manifest sign of more than 2,000 different clinical conditions and is present in 5% of the population. Because it is a heterogeneous group of clinical conditions, with different causal factors and simultaneously involved, about 50% of patients with ID have no defined etiology. Chromosomal microdeletions, situations in which there is loss of a fragment of up to 5Mb of the genome resulting in haploinsufficiency of one or multiple genes, are one of the possible causes of ID. The aim of this study was to standardize genetic testing with the technique of MLPA (Multiplex Ligation Probe Amplification) to investigate the presence of microdeletion syndromes in a sample of patients with idiopathic DI or with diagnosis not yet confirmed by molecular genetic testing. The MLPA kit used (SALSA® MLPA® P064-B2 MR1) detected, at the same time, 11 microdeletion syndromes: 1p36 deletion, Sotos, Miller-Dieker, 22q11.2 deletion, Saethre-Chotzen, Prader-Willi, Angelman, Williams, Alagille, Smith-Magenis and Canavan. We selected 57 patients with idiopathic ID and facial dysmorphias, with normal conventional karyotyping and normal brain imaging studies. The presence of microdeletion was identified in 4 patients (7%), 3 patients had Williams syndrome and 1 had 22q11.2 deletion. The results reinforce the usefulness of MLPA in the etiologic research of ID, helping in the clinical management and familial genetic counseling.
Deficiência intelectual (DI) é sinal manifesto de mais de 2.000 condições clínicas diferentes e está presente em 5% da população. Por se tratar de um grupo heterogêneo de condições clínicas, com fatores causais distintos e simultaneamente envolvidos, cerca de 50% dos pacientes com DI não têm sua etiologia definida. Entre as possíveis causas de DI estão as microdeleções cromossômicas, situações nas quais há perda de um fragmento de até 5Mb do genoma, implicando na haploinsuficiência de um ou múltiplos genes. O objetivo desse trabalho foi padronizar testes genéticos fundamentados na técnica de MLPA (Amplificação de Múltiplas Sondas dependentes de Ligação) para investigar a presença de síndromes de microdeleção em uma amostra de pacientes com DI idiopática ou com hipótese diagnóstica ainda não confirmada por teste genético molecular. O kit de MLPA utilizado (SALSA® MLPA® P064-B2 MR1) detectava, simultaneamente, 11 síndromes de microdeleção: deleção 1p36, Sotos, Miller-Dieker, deleção 22q11.2, Saethre- Chotzen, Prader-Willi, Angelman, Williams, Alagille, Smith-Magenis e Canavan. Foram selecionados clinicamente 57 pacientes com DI e dismorfias faciais, com cariótipo convencional e exame de imagem de encéfalo normais. A presença de microdeleção foi identificada em 4 pacientes (7%), tendo sido detectados 3 pacientes com síndrome de Williams e 1 com deleção 22q11.2. Os resultados reforçam a utilidade da técnica de MLPA na investigação etiológica da DI, ajudando no manejo clínico dos pacientes e no aconselhamento genético familiar.

L’avortement spontané (AS) désigne la perte du produit de conception avant sa viabilité, c'est-à-dire avant la 22e semaine d’aménorrhée, ou un poids fœtal inférieur à 500 g. La cause génétique est à l’origine de plus des deux tiers des AS, les aneuploïdies autosomiques, représentant à elles seules jusqu’à 70% des pertes fœtales du 1er trimestre. Le caryotype présente une très bonne sensibilité en ce qui concerne le dépistage des trisomies autosomiques (13, 18 et 21) et des aneuploïdies affectant les chromosomes sexuels, mais il montre d’importantes limites, d’une part en raison des échecs de culture cellulaire et d’autre part en raison de l’existence de remaniements non détectables au caryotype standard. Actuellement plusieurs techniques moléculaires de dépistage rapides des aneuploïdies liées aux échecs de grossesses ont été vérifiées : 1°) la fluorescence in situ par hybridation (FISH) 2°) l’amplification multiplex de sondes nucléiques dépendant des ligatures (MLPA). Ces deux méthodes présentent l’avantage d’être réalisables, sans culture préalable, sur noyaux en interphase ou sur ADN extrait et de permettre la détection d’anomalies cryptiques. Notre étude repose sur l’étude cytogénétique des produits d’AS pour mettre en évidence les anomalies chromosomiques les plus fréquentes à l’origine de ces pertes fœtales et d’en mieux appréhender les mécanismes de survenue. Elle a été réalisée sur 220 patientes âgées de 19 à 45 ans, et était fondée sur l’analyse directe par FISH sur noyaux interphasiques (AneuVysionTM) de prélèvements de villosités choriales et sur l’analyse de l’ADN extrait de tissus fœtaux par MLPA afin de révéler d’éventuelles aneuploïdies et micro-remaniements. L’âge gestationnel au moment des prélèvements était compris entre 7 et 38 semaines d’aménorrhée. Sur un total de 151 échantillons analysés par AneuVysionTM, 10 anomalies chromosomiques ont été observées: 3 trisomies 21, 1 trisomie 18, 1 trisomie 13, 1 mosaïque 46,XX/47,XX+21, 3 triploïdies et 1 monosomie X (Turner). Par ailleurs, sur les 69 autres échantillons analysés par MLPA, 6 étaient ininterprétables. Les anomalies trouvées par cette technique étaient: 2 monosomies X. Pour les échantillons restants, la MLPA a été négative. Nous avons en parallèle réalisé une étude rétrospective fondée sur l’analyse comparative d’un échantillon recruté à Sidi Bel Abbès, de femmes ayant subi un AS et admises à la maternité del’hôpital Hassani Abdelkader de Sidi Bel Abbès et d’un échantillon recruté à Clermont-Ferrand de femmes ayant subi un AS et pour lesquelles un prélèvement pour établir le caryotype du produit de fausse-couche avait été adressé dans le service de cytogénétique du CHU Estaing de Clermont-Ferrand. Cette étude a couvert une période de six années, allant de janvier 2005 à décembre 2010. Les techniques de FISH et de MLPA représentent des outils simples, rapides et sensibles pour la détection des remaniements chromosomiques. Elles représentent une alternative très intéressante à la culture cellulaire, et permettent le diagnostic de désordres génomiques indécelables par les techniques conventionnelles
Spontaneous abortion (SA) is the loss of the product of fertilization before its viability, that is, before22 weeks of gestation or fetal weight less than 500 g. Genetic causes account for more than two thirds of SA, autosomal aneuploidies alone accounting for up to 70% fetal loss. Chromosomal cytogenetic techniques show significant limitations on the one hand because of the failures of cell culture, and secondly because of the existence of undetectable alterations to the standard karyotype. It was therefore planned to use molecular techniques :- Fluorescent in situ hybridization (FISH)- Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA). Both techniques have the advantage of being achievable without prior culture of cores interphase or DNA extracted and to enable detection of cryptic abnormalities. The project is based on cytogenetic study of AS products to highlight the most frequent chromosomal abnormalities causing fetal losses, and to better understand their occurrence. Our study was performed on 220 patients from 19 to 45 years, and was based on the direct analysis by FISH on interphase nuclei (AneuVysionTM) of chorionic villus sampling and analysis of DNA extracted fetal tissue by MLPA to reveal any aneuploidy and rearrangements. The gestational age of the samples ranged from the 7th to the 38th week of gestation. In a total of 151 samples analyzed by AneuVysionTM, 10 chromosomal abnormalities were observed: three trisomies 21, one trisomy 18, one trisomy 13, one mosaic 46,XX/47,XX+21, 3 triploidies and one monosomy X (Turner). In addition, among the other 69 samples analyzed by MLPA, 6 were uninterpretable. The abnormalities found by this technique were 2 monosomies X. For the remaining samples, the MLPA was negative. We conducted a retrospective parallel study based on the analysis of a sample recruited in Sidi Bel Abbes, women who have had an AS and were admitted to the maternity hospital Abdelkader Hassani, Sidi Bel Abbes ; and a sample recruited in Clermont-Ferrand : women who underwent AS for which a levy to establish the karyotype product miscarriage had been addressed in the Department of Cytogenetics of CHU Estaing, Clermont-Ferrand. This study covered a period of six years, from January 2005 to December 2010. The techniques of FISH and MLPA are simple, rapid and sensitive tools for the detection of chromosomal rearrangements. They represent a very interesting alternative to cell culture and allow diagnosis for genomic disorders undetectable by conventional techniques

Steroid sulfatase (STS) is a membrane-bound microsomal enzyme that hydrolyzes various alkyl (e.g., dehydroepiandrosterone sulfate) and aryl steroid sulfates (e.g., estrone sulfate, E1-S), leading to the in situ formation of biologically active hormones. In the human, STS is maximally expressed in the placenta, where it is required for estriol formation by the feto-placental unit. At lower levels, it normally occurs in several other human and primate tissues and seems to be involved in the growth of steroid dependent cancers in breast, endometrium and prostate. Actually, in estrogen receptor (ER)-positive tumors, STS mRNA level has been proposed as a significant and independent prognostic factor, since high levels of this messenger are associated with shorter disease-free survival of patients. The human STS gene contains 10 exons, spread over 146 kbp in the short arm of the X chromosome, and maps in the Xp22.3-Xpter position. The deduced amino acid sequence consists of 583 amino acids, including a 21-residue signal peptide. The STS cDNA has been cloned and sequenced from human placenta cDNA libraries. In placental transcripts, the first exon is partially translated and presents 5’-untranslated regions (5’-UTRs) of different lengths, owing to multiple transcription start sites (TSSs) scattered over a 50-bp region. The STS promoter associated with this exon is TATA-less, lowin GC content, and lacks binding sites for known transcription factors, though binding of putative factors was detected with the gel mobility shift assay In this work, we show that the regulation of STS gene expression is even more complex, since at least eight alternatively spliced transcripts are involved in human STS gene expression in different tissues.
L’enzima steroide solfatasi (STS) promuove la reazione di idrolisi degli ormoni steroidei coniugati al solfato come il deidroepiandrosterone solfato (DHEA-S) e l’estrone solfato (E1-S) permettendo la formazione di composti ormonalmente attivi. L’attività di questo enzima, oltre a rivestire una funzione fondamentale nei meccanismi di comunicazione cellulare, assume una grande importanza nell’ambito dei tumori ormono-dipendenti nei quali è stato rilevato un incremento dei suoi livelli di espressione rispetto alla controparte sana; inoltre, in questi, rappresenta la via maggiormente utilizzata per la sintesi degli estrogeni promuoventi la proliferazione di tumori estrogeno-dipendenti. E’ stato anche dimostrato come agli alti livelli di espressione del messaggero dell’STS in tessuti tumorali sia associata una cattiva prognosi per il tumore alla mammella in donne sia in pre- che in post-menopausa. Il gene della steroide solfatasi umana è localizzato nel braccio corto del cromosoma X e mappa precisamente nella regione Xp22.3-Xpter assieme al cluster di altre tre solfatasi: ARSD, ARSE, ARSF che sono comprese in un totale di 200 kb di DNA. La struttura del gene umano, come riportato da studi eseguiti sul trascritto isolato dalla placenta, consiste di 10 esoni, intervallati da introni di diversa lunghezza, che variano da 102 pb a 35 kb, per un totale di 146 kb. La regione promotrice risulta essere inusuale in quanto manca del TATA box, non possiede isole ricche in GC e risulta difettiva anche di regioni di ancoraggio per il fattore Sp1 e per altri fattori di trascrizione noti. Non possiede cioè strutture o elementi associati a molti promotori eucaristici. Come spesso succede per geni privi di TATA box, l’enzima possiede più siti di inizio della trascrizione. Il cDNA per l’enzima STS codifica per una proteina di 583 amminoacidi del peso di 63 kDa, dotata di un peptide segnale di 21-23 amminoacidi che viene tagliato dopo la traduzione per produrre una proteina matura costituita da 560 amminoacidi. Recenti evidenze hanno messo in luce come l’espressione di tale gene sia probabilmente regolata in modo tessuto-specifico, mediante l’utilizzo di primi esoni non tradotti alternativi, associati a promotori diversi e presumibilmente controllati da fattori trascrizionali differenti. Mediante la tecnica di RLM-RACE abbiamo voluto studiare la regione 5’-terminale dei messaggeri codificanti l'enzima STS in diversi tessuti umani, sia sani che tumorali, allo scopo di verificare questo tipo di controllo della trascrizione e di descriverne i componenti.

Obesidade sindrômica é definida como a obesidade ocorrendo em conjunto com várias características clínicas distintas, associadas a retardo mental. A forma sindrômica mais freqüente é a síndrome de Prader-Willi (PWS) caracterizada por hipotonia, dificuldade de sucção no período neonatal, atraso do desenvolvimento neuropsicomotor (DNPM), hiperfagia, obesidade, baixa estatura na adolescência, mãos e pés pequenos, hipogonadismo, dificuldade de aprendizado e distúrbios de comportamento. Estudamos 141 pacientes com obesidade e/ou hiperfagia, atraso no desenvolvimento neuropsicomotor e/ou dificuldades de aprendizado e distúrbios de comportamento, pela técnica de MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) assim como 19 pacientes que apresentavam além de atraso do DNPM e/ou dificuldade de aprendizado, distúrbios de comportamento, obesidade e/ou hiperfagia, outro sinal ao exame físico que sugerisse alteração cromossômica, pela técnica de SNP-array (The GeneChip 174; Mapping 100K Set, Affymetrix), com o objetivo de identificar genes e/ou segmentos cromossômicos envolvidos com obesidade sindrômica. Essas técnicas detectam deleções e/ ou duplicações do genoma, seja analisando regiões específicas, como a de MLPA, seja cobrindo praticamente o genoma inteiro (SNP-array). Dez pacientes apresentaram alterações cromossômicas: duas deleções 1p36, uma deleção 2p25.3, uma deleção 3p26.3 e duplicação 11q22.3, uma deleção 6(q16.1-q21), duas deleções 12(q15q21.1) (irmãs gêmeas), uma deleção X(p22.13p22.12), uma duplicação 14q11.2 e uma duplicação X(q26.3). Dentre as alterações encontradas estão duas síndromes relacionadas com obesidade já descritas, a monossomia 1p36 e a monossomia 6q16, que são diagnósticos diferencias da PWS. Nos segmentos alterados foram localizados vários genes relacionados a obesidade: DRD2, MCHR2, PLCH2, PRKCZ, RAB21, RAB2B, RAB39, TPO e SIM1. Onze genitores foram analisados por MLPA, SNP-Array e/ou cariótipo e rearranjos cromossômicos não foram identificados. Na presença dos cromossomos parentais normais o risco de recorrência é considerado desprezível. O diagnóstico de pacientes com obesidade sindrômica é um desafio, pois há sobreposição de fenótipos impossibilitando até agora o diagnóstico diferencial, a não ser o da síndrome de Prader-Willi clinicamente reconhecível, pelo menos, em sua segunda fase. O emprego de técnicas que detectam variações no número de cópias do genoma humano amplia a possibilidade de reconhecimento de novas síndromes e a descrição do espectro da variabilidade fenotípica de síndromes conhecidas. Estas síndromes são uma potencial fonte de esclarecimento das causas das formas comuns de obesidade.
Syndromic obesity is defined as obesity occurring in association with several distinct clinical features and mental retardation (MR). Prader-Willi syndrome (PWS) is the most frequent syndromic form of obesity and is characterized by hypotonia, poor sucking in the neonatal period, developmental delay, hyperphagia, obesity, short stature in adolescence, small hands and feet, hypogonadism, learning disabilities and behavior disturbances. Herein, we studied 141 patients with obesity and/or hyperphagia, psychomotor developmental delay and/or learning disabilities and behavior disturbances with the technique of MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification), and 19 patients by SNP-array technique (\"The GeneChip 174; Mapping 100K Set, Affymetrix) to identify copy number variations. By using both techniques we detected deletions or duplications of the genome in ten patients: two deletions at 1p36, two deletions at 12q15q21.1 (twins), a deletion of chromosomes 2p25.3, 6q16.1-q21, and Xp22.13p22.12, a duplication of chromosomes 14q11.2 and Xq26.3, and an unbalanced translocation between chromosomes 3p26.3 and 11q22.3. Monosomy 1p36 and monosomy 6q16 are well-known syndromes and had already been related with obesity. Both syndromes are considered as differential diagnosis of PWS. Several genes related to obesity are mapped in the altered chromosome segments: DRD2, MCHR2, PLCH2, PRKCZ, RAB21, RAB2B, RAB39, TPO and SIM1. Eleven parents were studied by MLPA, SNP array, and / or karyotype analyses, and chromosomal rearrangements were not identified. Therefore, we consider these rearrangements to be causative of the patients´ phenotype. The diagnosis of patients with syndromic obesity is a challenge due to the overlapping of the phenotypes, except for Prader-Willi syndrome that is a clinically recognizable syndrome, mainly in its second phase. The use of techniques that detect copy number variations of the human genome will increase the recognition of new syndromes and also the description of the spectrum of phenotypic variability of known syndromes. These syndromes are a potential source for the understanding of the etiology of the common forms of obesity.

Emerging evidence indicated that oxidative stress has been implicated in mechanisms leading to neuronal cell injury in various pathological states of the brain, including neurodegenerative disorders such as Alzheimer's disease (AD) and aging (1, 3, 8, 12, 36, 48, 66). Increasing evidence supports the notion that reduction of cellular expression and activity of antioxidant proteins and the resulting increase of oxidative stress are fundamental causes in the aging processes and neurodegenerative diseases (1, 9, 12, 34, 96, 249). As one of the main intracellular redox systems involved in neuroprotection, the vitagene system is emerging as a neurohormetic potential target for novel cytoprotective interventions (15, 17-18). In this study the importance of vitagenes in the cellular stress response and the potential use of dietary antioxidants in the prevention and treatment of neurodegenerative disorders, aging and systemic pathologies is discussed (12, 17, 251). The strong evidence that the vitagene network operates as a defense system in the brain during oxidative and nitrosative stress open new perspectives in the treatment of neurodegenerative disorders and other age-related diseases (2, 12, 14, 31, 249, 251). Taken together, these results suggest that the expression of Hsps increases with age and occurs as a consequence of redox state perturbation and this may have a role to limit the deleterious consequences associated with protein denaturation (1, 3, 5, 8, 12). Relevant to this, we devoted our recent interest to the development of nutritional interventions, including carnosine, able to target redox-sensitive cytoprotective genes, called vitagenes, involved in the homeostatic control of so-called longevity-assurance processes (2, 123, 251). In this study we tested the hypothesis that neurotoxicity is an important primary mediator of injury in Meniere's disease and may be reflected in measurable increases in markers of cellular stress response and oxidative stress in the peripheral blood of patients with Meniere's disease. The search for novel and more potent inducers of vitagenes will facilitate the development of pharmacological strategies to increase the intrinsic capacity of vulnerable ganglion cells to maximize antidegenerative mechanisms, such as stress response and thus cytoprotection (16, 18, 249, 251). Neurofibromatosis type 1 (NF1) is one of the most common autosomal dominant neurogenetic disorder. The mechanisms underlying NF1 clinical variability remain poorly understood, probably because of the involvement of complex pathophysiology and multiple factors. Neurofibromatosis type 1 (NF1) is a common monogenic tumor-predisposition disorder with an autosomal dominant pattern of inheritance that arises secondary to haploinsufficiency of the tumor suppressor gene NF1 (149, 284). The allelic heterogeneity of the constitutional NF1 mutation may be one of the factors explaining the disease phenotypic variability (285). Studies provided evidence for a strong genetic component and suggested the involvement of unlinked modifying genes and perhaps also of the normal NF1 allele, in the variable expression of the disease (285). The NF1 gene product, neurofibromin, is a cytoplasmic ubiquitously expressed protein of 2818 amino acids long, with structural and functional similarities to the mammalian GTPase-activating protein (GAP)-related protein family, a group of evolutionarily conserved proteins. Analysis of the predicted sequence of neurofibromin revealed that it likely functions as a negative regulator of Ras, a key intracellular signaling protein that is important for regulating cell growth and survival. Significant advances in the understanding of the pathophysiology of NF1 have been made in the last decade. Molecular testing is not indicated for the routine clinical care of patients with NF1, but can be helpful in individuals suspected of having NF1 (e.g. a young child with multiple cafà à à à à à à à à ©-au-lait spots and unaffected parents or a patient with a single criterion) or when prenatal or preimplantation genetic diagnosis is desired. Recently molecular testing for NF1 has become clinically available (188, 190). Because of the large size of the NF1 gene and the lack of mutation hotspots, a multi-step detection protocol is preferred. Efforts to identify and characterise all NF1 gene mutations continue to present a considerable research and diagnostic challenge due to a combination of the large gene size, the absence of any localised mutation clustering, little evidence of repeat mutation and the wide diversity of mutation types observed. Furthermore, the presence of a number of highly homologous partial NF1 pseudogene-like sequences located throughout the human genome has increased the complexity of PCR-based mutation analysis (150). According to this evidence, data illustrated in the present study clearly reported a wide spectrum of different types of mutations, including pathogenetic missense, nonsense, small deletions/insertions, which lead to the synthesis of an aberrant protein product. The data presented in this study indicate that splicing in NF1 gene is extremely complex (242-243). In fact, we identified heterozygous missense mutations in acceptor site or intraexonic causing codons in frame microdeletion or activating a criptic exon splicing site or causing exon skipping. All these mutations altered canonic mechanism of normal splicing causing aberrant transcripts formation (242-243). To better investigate smaller NF1 rearrangements, we performed multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) to screen of a number patients affected by NF1 for whom the presence of point mutations, small deletions and insertions had been previously excluded by sequencing analysis. Single and multi-exon NF1 copy-number changes, exclusively represented by NF1 gene entire deletion in our genetic test, were found in two different clinic case of patients with NF1. Our study enlarge knowledge and spectrum of NF1 gene mutations and underlie the importance of molecular-genetic tests on the basis also of the Neurofibromatoses clinic field characterization.
Emergenti evidenze sperimentali indicano il coinvolgimento dello stress ossidativo alla base dei meccanismi patogenetici che portano al danno neuronale in diverse condizioni patologiche, inclusi i disordini neurodegenerativi, quali la malattia di Alzheimer e l'invecchiamento fisiologico (1, 3, 8, 12, 36, 48, 66). Le attuali evidenze suggeriscono che, in generale, la riduzione dell'espressione cellulare e dell'attivita' di proteine antiossidanti associata ad una diminuzione nell'efficienza dei meccanismi cellulari di riparazione e di degradazione ed il conseguente incremento dei livelli di stress ossidativo e/o nitrosativo rappresentano una delle cause fondamentali sia dei normali processi d'invecchiamento che delle principali malattie neurodegenerative (1, 9, 12, 34, 96, 249). Uno dei principali sistemi redox intracellulari coinvolti nella neuroprotezione, il sistema dei vitageni, dato principalmente dal sistema delle proteine Hsps, e' emerso quale potenziale neurormetico target di innovative strategie terapeutiche citoprotettive (15, 17-18). I dati del presente studio sperimentale indicano l'importanza del sistema dei vitageni alla base della risposta cellulare allo stress e il potenziale impiego di antiossidanti nutrizionali, nella prevenzione e nel trattamento dei disordini neurodegenerativi, dell'invecchiamento e delle patologie sistemiche (12, 17, 251). L'emergente evidenza sperimentale in base alla quale il network dei vitageni opera quale sistema di difesa nel cervello in seguito ad aumentati livelli di stress ossidativo e/o nitrosativo apre nuove prospettive nel campo della medicina per il trattamento dei disordini neurodegenerativi e di altre patologie eta'à à à à à à  -dipendenti (2, 12, 14, 31, 249, 251). Considerate in una visione d'insieme, i dati sperimentali del presente studio indicano che l'espressione delle Hsps aumenta durante l'invecchiamento ed in presenza di alterazioni dello stato redox, al fine di limitare le conseguenze deleterie date dall'eccessiva produzione di proteine alterate ossidativamente (1, 3, 5, 8, 12). Riguardo cioe', abbiamo rivolto il nostro interesse verso lo sviluppo di innovativi interventi nutrizionali, dati da antiossidanti presenti nella dieta, quali la carnosina, aventi come target tali geni citoprotettivi redox-sensitivi, definiti vitageni, coinvolti nella neuroprotezione e nel mantenimento dell'omeostasi e dei processi che assicurano la longevita' (2, 123, 251). Nel presente studio abbiamo testato, inoltre, l'ipotesi sperimentale in base alla quale la neurotossicita' rappresenta un importante mediatore primario di danno nella sindrome di Menierà à à à à à à © cio' puo' essere spiegato da aumentati livelli di biomarkers di risposta cellulare allo stress quantificabili in campioni di sangue periferico di pazienti affetti. Di conseguenza, la ricerca di innovativi e potenti induttori del sistema dei vitageni apre nuove prospettive per lo sviluppo di originali strategie farmacologiche in grado di dare citoprotezione e di massimizzare i meccanismi antidegenerativi, inclusa la risposta cellulare allo stress, anche nei neuroni gangliari a spirale dell'apparato cocleovestibolare, riducendo i principali segni clinici associati alla sindrome di Menierà à à à à à à © (16, 18, 249, 251). La Neurofibromatosi di tipo 1 (NF1), o neurofibromatosi classica o periferica, e' uno dei piu' comuni disordini neurogenetici ereditari a carattere autosomico dominante. Il meccanismo molecolare che sta alla base della variabilita' clinica di tale sindrome multisistemica rimane ancora non del tutto conosciuto, probabilmente per la complessita' dei molteplici fattori coinvolti nella sua patofisiologia. La Neurofibromatosi di tipo 1 (NF1) e' una condizione genetica multisistemica la quale origina da mutazioni allo stato eterozigote, inattivanti il gene tumor suppressor NF1, localizzato nella regione pericentromerica del cromosoma umano 17 (17q11.2). L' eterogeneita' allelica delle mutazioni che interessano il gene NF1 rappresenta uno dei fattori che spiega l'eterogeneita' fenotipica (285). Studi clinici e sperimentali dimostrano l'esistenza di una forte componente genetica e suggeriscono il coinvolgimento di geni modificatori alla base della variabilita' di espressione di tale disordine neurogenetico (285). Il prodotto del gene NF1, la neurofibromina, e' una proteina ubiquitaria citoplasmatica di 2818 residui aminoacidici, con una struttura e funzione simili a quelle delle proteine GAP (GTPasi-activating protein), un gruppo di proteine conservate evolutivamente. L'analisi della struttura della neurofibromina ha permesso di identificarla quale regolatore negativo della proteina Ras, una proteina chiave intracellulare coinvolta nel signaling pathway che regola i processi di crescita e di sopravvivenza cellulare. Significativi progressi scientifici sono stati raggiunti nell'ultima decade per quanto riguarda la comprensione dei principali meccanismi molecolari alla base della patofisiologia di tale sindrome genetica multisistemica. L'analisi mutazionale del gene NF1 ed i test genetici vengono utilizzati quale supporto e conferma della diagnosi clinica, soprattutto in quei casi clinici che non soddisfano pienamente i criteri diagnostici o quando la diagnosi prenatale e' richiesta. Recentemente, test molecolari sono stati resi disponibili clinicamente per la diagnosi genetica di Neurofibromatosi di tipo 1 (188, 190). A causa dell'enorme grandezza e complessita' del gene NF1, della mancanza di siti hotspots mutazionali noti, dell'estrema variabilita' fenotipica e della presenza di pseudogeni, in genere e' richiesto un protocollo multi-step per la diagnosi molecolare di NF1 (150). In accordo ad evidenze cliniche e sperimentali, i dati riportati nel presente studio mostrano chiaramente la presenza di un ampio spettro di differenti tipi di mutazioni riscontrate in diversi casi clinici, incluse mutazioni patogenetiche missense, nonsense, piccole delezioni/inserzioni, le quali portano alla sintesi di un prodotto proteico aberrante. I dati sperimentali e clinici del presente studio indicano che il meccanismo di splicing nel gene NF1 e' estremamente complesso (242-243). Infatti, nel nostro laboratorio abbiamo identificato in diversi casi clinici delle mutazioni missense nel sito accettore di splicing o intraesoniche, nel gene NF1 allo stato eterozigote, le quali possono causare o la microdelezione in frame di codoni, o attivare siti criptici di splicing intraesonici o addirittura promuovere lo skipping dell'esone di interesse. In tutti questi casi si ha una profonda alterazione dei meccanismi canonici di splicing, la quale determina la formazione di trascritti aberranti e patogenetici (242-243). Per di piu', al fine di identificare ridotti riarrangiamenti del gene NF1, incluse piccole delezioni/duplicazioni, abbiamo adottato recentemente nel nostro laboratorio un nuovo protocollo diagnostico basato sull'impiego della tecnica MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification), per testare tutti i casi clinici NF1 risultati negativi al sequenziamento diretto per la ricerca di mutazioni puntiformi (180, 207). Il nostro studio, pertanto, amplia le conoscenze e lo spettro delle mutazioni relative al gene NF1 e sottolinea l'importanza dell'analisi genetico-molecolare alla base di una caratterizzazione diagnostica anche nel campo clinico delle Neurofibromatosi.

The thesis reports a contribution to the development of neural-like network- based element-free methods for the numerical simulation of some non-Newtonian fluid flow problems. The numerical approximation of functions and solution of the governing partial differential equations are mainly based on radial basis function networks. The resultant micro-macroscopic approaches do not require any element-based discretisation and only rely on a set of unstructured collocation points and hence are truly meshless or element-free. The development of the present methods begins with the use of the multi-layer perceptron networks (MLPNs) and radial basis function networks (RBFNs) to effectively eliminate the volume integrals in the integral formulation of fluid flow problems. An adaptive velocity gradient domain decomposition (AVGDD) scheme is incorporated into the computational algorithm. As a result, an improved feed forward neural network boundary-element-only method (FFNN- BEM) is created and verified. The present FFNN-BEM successfully simulates the flow of several Generalised Newtonian Fluids (GNFs), including the Carreau, Power-law and Cross models. To the best of the author's knowledge, the present FFNN-BEM is the first to achieve convergence for difficult flow situations when the power-law indices are very small (as small as 0.2). Although some elements are still used to discretise the governing equations, but only on the boundary of the analysis domain, the experience gained in the development of element-free approximation in the domain provides valuable skills for the progress towards an element-free approach. A least squares collocation RBFN-based mesh-free method is then developed for solving the governing PDEs. This method is coupled with the stochastic simulation technique (SST), forming the mesoscopic approach for analyzing viscoelastic flid flows. The velocity field is computed from the RBFN-based mesh-free method (macroscopic component) and the stress is determined by the SST (microscopic component). Thus the SST removes a limitation in traditional macroscopic approaches since closed form constitutive equations are not necessary in the SST. In this mesh-free method, each of the unknowns in the conservation equations is represented by a linear combination of weighted radial basis functions and hence the unknowns are converted from physical variables (e.g. velocity, stresses, etc) into network weights through the application of the general linear least squares principle and point collocation procedure. Depending on the type of RBFs used, a number of parameters will influence the performance of the method. These parameters include the centres in the case of thin plate spline RBFNs (TPS-RBFNs), and the centres and the widths in the case of multi-quadric RBFNs (MQ-RBFNs). A further improvement of the approach is achieved when the Eulerian SST is formulated via Brownian configuration fields (BCF) in place of the Lagrangian SST. The SST is made more efficient with the inclusion of the control variate variance reduction scheme, which allows for a reduction of the number of dumbbells used to model the fluid. A highly parallelised algorithm, at both macro and micro levels, incorporating a domain decomposition technique, is implemented to handle larger problems. The approach is verified and used to simulate the flow of several model dilute polymeric fluids (the Hookean, FENE and FENE-P models) in simple as well as non-trivial geometries, including shear flows (transient Couette, Poiseuille flows)), elongational flows (4:1 and 10:1 abrupt contraction flows) and lid-driven cavity flows.

INTRODUÇÃO: Os desequilíbrios genômicos constituem causa frequente de abortamento, anomalias congênitas (AC) e atraso de desenvolvimento neuropsicomotor (ADNPM). O aprimoramento de novas técnicas de diagnóstico citogenômico, como por exemplo, a MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) e a triagem ampla do DNA utilizando arrays, mostraram que a alteração no número normal de cópias genômicas (CNVs) influencia na patogenicidade dos fenótipos em diversas síndromes. OBJETIVOS: Com isso, os objetivos do presente estudo foram identificar CNVs em pacientes com MC e ADNPM utilizando a técnica de MLPA e, a partir dos resultados alterados, aplicar da técnica de array para a identificação de possíveis rearranjos complexos, além de associar as alterações moleculares encontradas com o fenótipo dos pacientes. MÉTODOS: Participaram do estudo 416 pacientes com MC e ADNPM. As amostras de DNA foram analisadas utilizando a técnica de MLPA com kits comerciais para as principais síndromes de microdeleções (P064) e regiões subteloméricas (P036 e P070). Dois kits de MLPA específicos para as regiões 7q11.23 (P029) e 22q11.2 (P250) também foram utilizados para complementar a identificação de CNVs atípicas. Entre os casos que apresentavam alterações pela técnica de MLPA, 15 pacientes foram submetidos à técnica de array, utilizando três diferentes plataformas: Agilent SurePrint G3 Genoma Humano microarray 180 K, HumanCytoSNP-12 BeadChip, CytoScan(TM) HD array 6.0 Affymetrix®. RESULTADOS: A análise molecular pela técnica de MLPA possibilitou a detecção de microdeleções e/ou microduplicações em 97 pacientes sendo que: em 46 pacientes foi possível encontrar alterações utilizando apenas o kit P064 (microdeleções), em 34 pacientes utilizando apenas os kits P036 e P070 (regiões subteloméricas) e em quatro pacientes só foi possível identificar a alteração utilizando outro kit de MLPA (P250), específico para alterações genômicas em 22q11.2. Rearranjos complexos, envolvendo mais de três cromossomos, foram observados em 10 pacientes. DISCUSSÃO: A MLPA permitiu detectar CNVs em 97/416 pacientes (23,3%), sendo uma técnica ideal para ser aplicada em pacientes com sinais fenotípicos inespecíficos. Algumas alterações genômicas encontradas estão relacionadas também com alterações específicas, como a presença de malformação cardíaca ou convulsões. E em outros casos a alta variabilidade fenotípica pode ser associada a um conjunto de CNVs consideradas patogênicas. Além disso, a inclusão de outra técnica de triagem, com maior cobertura do genoma permitiu detectar rearranjos complexos antes não observados mesmo em síndromes bem descritas como as síndromes de midrodeleções 7q11.23 e 22q11.2. CONCLUSÃO: A MLPA com kits combinados, por possuir maior abrangência de regiões detectadas e menor custo, é uma ferramenta valiosa para ser utilizada como um teste de triagem diagnóstica
INTRODUCTION: Genomic imbalances are the most common cause of miscarriage, congenital anomalies (CA) and mental retardation (MR). With the improvement of new cytogenomics diagnostic techniques, such as the MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) and the array techniques, it have been shown that changes in the normal gene copy number influence the pathogenic variability of phenotypes in different syndromes. AIMS: The aims of the present study were to identify CNVs in patients with CM and RM using the MLPA technique and, from the abnormalities results, to apply the array methodology for the identification of complex rearrangements. Furthermore, the study aimed to associate the alterations found by molecular techniques with the phenotype of patients. METHODS: 416 patients with CM and RM participated in the study. The samples were analysed by MLPA technique with commercial kits for the main microdeletion syndromes (P064) and subtelomeric regions (P036 and P070). Two more MLPA kits for specific regions 7q11.23 (P029) and 22q11.2 (P250) were used to confirm the altered results and to complement some results with the identification of atypical abnormalities. From the patients who presented abnormalities by MLPA technique, 15 underwent by microarray-based comparative genomic hybridization (CGH-array) technique, using three different platform: Agilent SurePrint G3 Human Genome microarray 180 kb, HumanCytoSNP -12 BeadChip, CytoScan(TM) HD ® and Affymetrix 6.0. RESULTS: The molecular analysis by MLPA technique allowed the detection of microdeletions and/or microduplications in 97 patients. In 46 patients it was possible to find genomic alteration using only MLPA kit P064 and in 34 patients using only the subtelomeric kits P036 and P070. For four patients it was only possible to identify the genomic abnormalities using another specific MLPA kit (P250), involving the 22q11.2 region. Complex rearrangements involving more than three chromosomes were detected in 10 patients. DISCUSSION: The MLPA technique was capable of detecting CNVs in 97/416 (23,3%) of patients, being an ideal technique to be applied in patients with non-specific signs phenotypic. Some genomic alterations found are, also related to specific changes, such as the presence of cardiac malformation or convulsions. In other cases, the high phenotypic variability may be associated to certain group of pathogenic CNVs. Moreover, the inclusion of additional screening method, with greater coverage, allowed the detection of complex rearrangements not seen before even in syndromes as well described microdeletions syndromes on 7q11.23 and 22q11.2 regions. CONCLUSION: The MLPA technique can be a valuable tool used as a molecular screening test, because it has greater coverage and lower cost of detected regions

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro
O retardo mental (RM) é caracterizado por um funcionamento intelectual significantemente abaixo da média (QI<70). A prevalência de RM varia entre estudos epidemiológicos, sendo estimada em 2-3% da população mundial, constituindo assim, um dos mais importantes problemas de saúde pública. Há um consenso geral de que o RM é mais comum no sexo masculino, um achado atribuído às numerosas mutações nos genes encontrados no cromossomo X, levando ao retardo mental ligado ao X (RMLX). Dentre os genes presentes no cromossomo X, o Jumonji AT-rich interactive domain IC (JARID1C) foi recentemente identificado como um potencial candidato etiológico do RM, quando mutado. O JARID1C codifica uma proteína que atua como uma desmetilase da lisina 4 da histona H3 (H3K4), imprescindível para a regulação epigenética. Tão recente como a identificação do gene JARID1C, é a descoberta de que mudanças no número de cópias de sequências de DNA, caracterizadas por microdeleções e microduplicações, poderiam ser consideradas como razões funcionalmente importantes de RMLX. Atualmente, cerca de 5-10% dos casos de RM em homens são reconhecidos por ocorrerem devido a estas variações do número de cópias no cromossomo X. Neste estudo, investigamos mutações no gene JARID1C, através do rastreamento dos éxons 9, 11, 12, 13, 15 e 16, em 121 homens de famílias com RM provavelmente ligado ao X. Paralelamente, realizamos a análise da variação do número de cópias em 16 genes localizados no cromossomo X através da técnica de MLPA no mesmo grupo de pacientes. Esta metodologia consiste em uma amplificação múltipla que detecta variações no número de cópias de até 50 sequências diferentes de DNA genômico, sendo capaz de distinguir sequências que diferem em apenas um nucleotídeo. O DNA genômico foi extraído a partir de sangue periférico e as amostras foram amplificadas pela técnica de PCR, seguida da análise por sequenciamento direto. Foram identificadas três variantes na sequência do gene JARID1C entre os pacientes analisados: a variante intrônica 2243+11 G>T, que esteve presente em 67% dos pacientes, a variante silenciosa c.1794C>G e a mutação inédita nonsense c.2172C>A, ambas presentes em 0,82% dos indivíduos investigados. A análise através do MLPA revelou uma duplicação em um dos pacientes envolvendo as sondas referentes ao gene GDI1 e ao gene HUWE1. Este trabalho expande o estudo de mutações no gene JARID1C para a população brasileira ereforça a importância da triagem de mutações neste gene em homens portadores de RM familiar de origem idiopática, assim como, é primeiro relato científico relativo à investigação de variações no número de cópias de genes localizados no cromossomo X em homens brasileiros com RM, através da técnica de MLPA.
Mental retardation (MR) is defined as a disability characterized by significant below average intellectual functioning (IQ>70). The prevalence of MR varies between epidemiological studies, estimated at 2-3% of the population, thus constituting a major public health problem. There is a general consensus that MR is more common in males, a finding attributed, in part, to mutations in the genes located on the X chromosome, leading to an X-linked mental retardation (XLMR). Among all the genes present on X chromosome, Jumonji AT-rich interactive domain IC (JARID1C) was recently identified as aetiologic potential candidate of MR, when mutated. The JARID1C gene encodes a protein that acts as a histone demethylase specific for histone 3 lysine 4 (H3K4) and it is indispensable for the epigenetic regulation. As recently as the identification of the JARID1C gene, it is the discovery that changes in the number of copies of DNA sequences, characterized by microdeletions and microduplications, could be regarded as functionally important reasons to XLMR. Currently, about 5-10% of men MR cases are known to occur due to these variations in the number of copies of chromosome X. In this study we investigated mutations in the JARID1C gene by screening of exons 9, 11, 12, 13, 15 and 16 in 121 patients from families with X-linked MR. At the same time we analyzed the variation in the number of copies in 16 genes located in X chromosome through the MLPA technique. This metodology consists of a multiplex amplification that detects variations in the number of copies up to 50 different genomic DNA sequences, being able to distinguish sequences that differ by only one nucleotide. Genomic DNA was extracted from peripheral blood and the samples were amplified by PCR followed by direct sequencing analysis. We identified three sequence variants among 121 patients. The intronic variant c.2243 +11 G> T, which was present in 67% of patients analyzed, the silent variant c.1794C> G and the novel nonsense mutation c.2172C> A, which was present in 0,82% of patients analyzed. The MLPA analysis revealed that the patient 58 exhibited a duplication involving probes for the GDI1 gene and the HUWE1 gene, resulting in an increase in the number of copies of this gene. This work expands the study of mutations in the JARID1C gene for the Brazilian population and reinforces the importance of screening for mutations in this gene in men with idiopathic mental retardation, and it is the first scientific report on the investigation of variations in the number of copies in genes located on chromosome X in Brazilian men with MR using the MLPA technique.

Introducción: El cáncer escamoso de cabeza y cuello (CECC) es una patología con alta incidencia en nuestro medio. Los segundos tumores primarios (STP) y las recidivas tumorales (RT) tienen gran trascendencia en la progresión de la enfermedad y en la supervivencia de los pacientes. Objetivos: estudiar los cambios génicos en STP y RT para contribuir al conocimiento de la progresión tumoral, con posibles implicaciones en el diagnóstico precoz y en el pronóstico. Metodología: Se estudian 36 pacientes con CECC, 21 desarrollaron STP y 15 RT. Se excluyeron los que habían recibido radioterapia entre ambos diagnósticos. Empleamos la técnica de MLPA que utiliza una mínima cantidad de ADN (>20 ng) y permite amplificar más de 40 secuencias distintas de ADN, obteniendo un patrón de pérdidas/ganancias. Resultados: Los STP tienen mayor supervivencia (67%) que las RT (20%). Los cambios génicos que diferencian los CECC iniciales de los STP fueron las pérdidas en IL2, AI651963, IL18, BRCA2, DLEU, CDH2 y la ganancia de CDKN2D. Para las RT las pérdidas en IGSF4 y TP53 y las ganancias en LMNA y PTPN1. Los cambios génicos que diferencian los STP y las RT fueron las pérdidas en TP53, CDKN2A, AI651963, RENT2, IL18 y las ganancias en LMNA, CTSB, PTPN1 y N33. Entre los CECC con su correspondiente STP y RT predominan las discordancias, aunque también se observan concordancias. Conclusiones: El estudio realizado demuestra buen número de cambios génicos que diferencian los grupos estudiados, algunos no descritos previamente. El gran número de discordancias entre los CECC y sus RT, junto con algunas concordancias entre CECC y STP, sugieren que los criterios clínicos de progresión tumoral no son adecuados y deben modificarse por los genéticos.

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro
A Deficiência Intelectual (DI) é uma condição complexa, que acomete 2-3% da população mundial, constituindo um importante problema de saúde pública. No entanto, uma parcela significativa dos casos de DI permanece sem um diagnóstico definitivo, o que demonstra que muitos fatores etiológicos associados a esta condição ainda precisam ser elucidados. Há um consenso de que o número de homens com DI supera em 30% o número de mulheres, um achado atribuído à presença de mutações em genes localizados no cromossomo X. Dentre os genes presentes neste cromossomo que são expressos no cérebro, o Jumonji AT-rich interactive domain 1C (JARID1C) foi identificado como um potencial candidato a estar relacionado à DI ligada ao X (DILX). O gene JARID1C codifica uma desmetilase da lisina 4 da histona H3 (H3K4), imprescindível para a regulação epigenética. Tão importante quanto o estudo do gene JARID1C em pacientes com DI é a busca por variações no número de cópias gênicas (VNCs) em regiões cromossômicas subteloméricas. Genes relacionados ao desenvolvimento cerebral são enriquecidos em VNCs e as regiões subteloméricas são mais susceptíveis à formação destes rearranjos. Diante do exposto, neste estudo, investigamos mutações no gene JARID1C (exons 3, 4, 5, 8, 10, 14 e 23) em 148 homens portadores de DI pertencentes a famílias com padrão de segregação sugestivo de DILX. Paralelamente, analisamos VNCs subteloméricas em 174 homens com DI familiar de etiologia idiopática, independente do padrão de segregação. Para todos os indivíduos selecionados, amostras de DNA genômico foram extraídas a partir de sangue periférico e alterações genéticas frequentemente relacionadas à DI foram previamente excluídas (expansões trinucleotídicas nos loci FRAXA e FRAXE e mutações nos genes MECP2 e ARX). A análise do gene JARID1C foi realizada pela técnica de PCR, seguida da análise dos produtos amplificados por sequenciamento. Foram identificadas quatro variantes silenciosas (c.564G>A, c.633G>C, c.1884G>A, c.1902C>A). Através da análise in silico de sequências exônicas acentuadoras de splicing (ESEs) localizadas nas posições das variantes encontradas, foi possível classificar a variante c.1884G>A como neutra e as três variantes restantes como possíveis criadoras de ESEs. Já para a investigação das VNCs subteloméricas, foi utilizada a metodologia de Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA), capaz de identificar microdeleções e microduplicações nas 46 regiões subteloméricas. Para este fim, inicialmente, os indivíduos foram investigados pelo kit de MLPA P036, enquanto que para aqueles que exibiram alterações também foi utilizado o kit P070. A validação das VNCs encontradas foi realizada por PCR quantitativo em Tempo Real. A análise por MLPA revelou um indivíduo apresentando duas deleções (9p e 13q), um indivíduo apresentando duas amplificações (1p e 2p), dois indivíduos apresentando uma deleção e uma amplificação (18p e 18q; 4p e 8p), quatro indivíduos portadores de uma deleção cada (10p, 20p, 3q e 22q) e dois indivíduos com uma amplificação cada (7q e 20p). Algumas das alterações subteloméricas encontradas (2,87%) representam VNCs de relevância clínica para o estudo da DI, reforçando a importância do rastreamento de rotina de VNCs subteloméricas na DI familiar. Consideramos que a elucidação de novos genes ou mecanismos moleculares diretamente relacionados à DI é um caminho promissor e urgente para o estabelecimento de novas estratégias terapêuticas possíveis.
Intellectual Disability (ID) is a complex condition, which affects 2-3% of general population, constituting a major public health problem. Nevertheless, a significant number of ID cases remain to have a definitive diagnosis, showing that many etiologic factors associated with this condition need to be elucidated. There is a consensus that the number of ID males exceeds by 30% the number of females, a finding that is attributed to the presence of mutations in genes located on chromosome X. Among the X-linked brain-expressed genes, the Jumonji AT-rich interactive domain 1C (JARID1C) was identified as a potential candidate to be related to X-Linked ID (XLID). The JARID1C gene encodes a histone demethylase specific for histone 3 lysine 4 (H3K4), which is indispensable for the epigenetic regulation. As important as the study of JARID1C gene in ID patients is the search for subtelomeric copy number variations (CNVs). Genes related to brain development are enriched in CNVs and subtelomeric regions are particularly susceptible to these rearrangements. In view of this evidence, in this study we investigated JARID1C mutations (exons 3, 4, 5, 8, 10, 14 and 23) among 148 males with ID from families with a segregation pattern suggestive of XLID. In parallel, we analyzed subtelomeric CNVs among 174 males with idiopathic familial ID, regardless of the segregation pattern. For all selected individuals, genomic DNA was extracted from peripheral blood and other frequent genetic causes related to ID were previously excluded (trinucleotide expansions at FRAXA and FRAXE loci and mutations in MECP2 and ARX genes). The JARID1C gene analysis was performed by PCR followed by sequencing analysis of the amplified products. We identified four silent mutations (c.564G>A, c.633G>C, c.1884G>A and c.1902C>A). In silico analysis of exonic splicing enhancers (ESEs) located in the variants positions made possible to classify the variant c.1884G>A as neutral and the remaining variants as potential creators of new ESEs. For the investigation of subtelomeric CNVs, Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) methodology was applied to identify microdeletions and microduplications in the 46 subtelomeric regions. For this purpose, individuals were initially investigated by P036 MLPA kit, whereas for those who exhibited abnormalities, the P070 kit was also used. The CNVs validation was performed by quantitative Real Time PCR. The MLPA analysis revealed an individual with two deletions (9p and 13q), an individual with two amplifications (1p and 2p), two individuals with a deletion and amplification (18q and 18p; 4p and 8p), four individuals with a deletion (10p, 20p, 3q and 22q) and two individuals with an amplification (7q and 20p). Some of the changes found (2,87%) represent subtelomeric CNVs of clinical relevance for the study of ID, reinforcing the importance of routine screening of subtelomeric CVNs in cases of familial ID. We believe that the elucidation of novel genes or molecular mechanisms directly related to ID is a promising and urgent way for establishing new possible therapeutic strategies.

Orientadores: Antonia Paula Marques de Faria, Maricilda Palandi de Mello
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas
Made available in DSpace on 2018-08-13T16:41:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lincoln-de-Carvalho_CarolinaRodrigues_M.pdf: 7487008 bytes, checksum: 0ee30ed31ecc836e60c91e6c4128b2e9 (MD5) Previous issue date: 2009
Resumo: A deficiência mental (DM) corresponde a uma das categorias mais amplas de distúrbios, acometendo de 1% a 3% da população nos países industrializados, enquanto nos países em desenvolvimento estima-se prevalência cerca de três vezes maior. Devido à heterogeneidade de fatores causais associados a essa condição, sua investigação diagnóstica pode ser complexa e 40% dos casos não têm sua origem determinada. Recentemente, foi demonstrado que rearranjos subteloméricos são responsáveis por 5% a 7% dos casos de DM idiopática. Entre as técnicas mais promissoras para a identificação dessas alterações, está a Multiplex Ligationdependent Probe Amplification (MLPA), que possibilita a quantificação relativa, quanto ao número de cópias, de mais de 50 sequências de ácidos nucléicos em um único experimento, sendo capaz de detectar deleções e duplicações de diversos genes, além de mutações de ponto conhecidas. É baseada na hibridização do DNA genômico a uma mistura de sondas específicas para cada região estudada, com amplificação dos produtos de ligação pela técnica de PCR, utilizando um par de primers universal. A visualização dessas amplificações pode ser feita por eletroforese capilar e a análise por programas específicos de genotipagem. Entre as vantagens do método estão o custo relativamente baixo, simplicidade, rapidez e sensibilidade, justificando a implantação em serviços direcionados para o estudo da etiologia da DM. Assim, o propósito deste trabalho foi implantar o método em nosso laboratório, utilizando o kit SALSA MLPA P036 HUMAN TELOMERE para pesquisa de rearranjos subteloméricos em indivíduos com DM idiopática. Na padronização, foram empregados controles com e sem alteração subtelomérica, sendo avaliados os parâmetros de tempo de estocagem das reações em refrigerador; quantidade de DNA utilizado em cada reação; forma de normalização dos dados, e possibilidade de redução do volume das soluções empregadas para metade ou dois terços do preconizado no protocolo original, cujo volume final de reação é de 50 µL, dos quais somente 0,75 µL são utilizados na eletroforese capilar, com descarte do restante. A análise dos resultados, confirmados pela utilização de controles com e alterações subteloméricas, mostrou que a implantação do método foi bem-sucedida. Além disso, foi verificado que o tempo máximo de estocagem das reações em refrigerador sem prejuízo dos resultados é de aproximadamente três meses; que a quantidade de DNA satisfatória para o procedimento está entre 150-250 ng por reação; que não é aconselhável a utilização de protocolos com volumes reduzidos, pois a análise de reações realizadas dessa forma mostrou resultados falso-positivos quando comparados às reações feitas segundo o protocolo original; que a forma de normalização dos dados mais adequada para a análise dos resultados é a combinação dos programas GeneScan®, Genotyper® e planilha específica para cada kit ao invés do programa Coffalyser®, indicado pelo fabricante do produto. Após essa padronização, o método foi aplicado no estudo de 62 indivíduos com atraso do desenvolvimento ou DM de causa indeterminada, sendo identificadas alterações em seis deles. Duas foram constatadas também pelo kit de confirmação SALSA MLPA P070, sendo uma del(1p36) e outra um rearranjo del(5p)/dup(9p), ambas validadas pela análise por FISH. As quatro restantes [del(12p)] não foram observadas pelo kit de confirmação, sendo realizado sequenciamento automático que identificou o SNP (rs60220187). Concluindo, a técnica de MLPA foi implantada com sucesso, mostrando-se adequada e eficiente para a investigação de rearranjos subteloméricos.
Abstract: Mental retardation (MR) is the most frequent disability and affects 1% to 3% of general population in industrialized world, while in developing countries it is considered to be three times higher. The etiology is heterogeneous and includes multiple genetic and environmental factors, although in about 40% of the cases its cause remains undetermined. Recently, several studies suggest that chromosomal rearrangements involving subtelomeric regions are common causes of idiopathic MR and occur in approximately 5% to 7% of patients. The Multiplex Ligationdependent Probe Amplification (MLPA) technique has been proposed as one of the alternatives to identify these abnormalities. It is based on hybridization of genomic DNA to a mixture of standardized probes for each region studied. All of the probe ligation products are amplified by PCR using only one universal primer pair. Separation and visualization of the fragments can be developed and the analysis by means of specific softwares for genotyping. Relatively low cost, simplicity and sensitivity are among the advantages of this method, which has been considered as an alternative for diagnostic screening of individuals with undetermined MR or developmental delay. The present study aimed to implement this technique in our laboratory, using the SALSA MLPA P036 human telomere test kit for detecting subtelomeric rearrangements in idiopathic MR patients evaluated in our service. For validation study, eleven normal controls and two positive controls were utilized, as well as the following parameters were evaluated: period of storage of reaction, amount of DNA used for each reaction, procedures to data normalization and reduction of reaction volume. The validation was successful; in addition, it was verified that maximum period for storage of reaction was about three months; adequate amount of DNA for each reaction was approximately 150ng-250 ng; Reduction in volume reaction produced false-positive results; the more suitable method for data normalization was a combination of GeneScan®, Genotyper® softwares and a the use of a specific Microsoft Excel® spreadsheet for each kit, instead of the Coffalyser® program, recommended by the manufacturer. After validation, a pilot study was carried out with 62 patients considered as idiopathic MR using initially the SALSA MLPA P036 kit. MLPA analyses have indicated abnormal copy number in six patients. SALSA MLPA P070 kit confirmed 2 out of the 6 alterations: a 1p36 deletion and a 5p deletion / 9p duplication rearrangement, which were validated by FISH analysis. Other four alterations corresponded to a same 12p deletion, which was not further confirmed. Sequencing the correspondent fragment a known as SNP rs60220187 was identified. In conclusion, we demonstrated that MLPA is an appropriate and efficient technique and should be considered as a routine screening in the evaluation of individuals with unexplained mental retardation or developmental delay.
Mestrado
Ciencias Biomedicas
Mestre em Ciências Médicas

Mestrado em Biologia Aplicada
O diagnóstico prénatal (DPN) tem demonstrado ser cada vez mais importante na deteção precoce de um vasto número de anomalias no feto. A grande maioria das anomalias cromossómicas detetadas em DPN devem-se a alterações numéricas dos cromossomas 13, 18, 21, X e Y. Para a pesquisa rápida das aneuploidias mais comuns, são utilizadas técnicas como a MLPA e a QF-PCR que permitem o diagnóstico rápido mas direcionado, possibilitando uma intervenção clínica mais atempada, reduzindo a ansiedade dos progenitores. Com este estudo pretendeu-se delinear a estratégia mais adequada a um laboratório de diagnóstico prénatal, com o objetivo de aplicar uma técnica rápida na deteção das aneuploidias mais comuns nos diferentes tipos de amostras rececionadas no laboratório (GDPN), com ênfase em amostras com risco elevado de contaminação materna. Para tal, foi estudada uma série de amostras de LA e BVC, e comparada a rapidez de resposta do resultado, a fidedignidade da mesma bem como os recursos técnicos e económicos despendidos. Este estudo partiu de 713 amostras prénatais das quais 530 eram referentes a LA e 183 a BVC, para as quais havia sido pedido a pesquisa rápida de aneuploidias. Dos 530 LA analisados, apenas 39 amostras, todas hemáticas, constituíram o universo do presente trabalho, juntamente com 183 BVC. Para este estudo, foi seguida a metodologia usada por rotina no nosso laboratório (GDPN), que consistia em iniciar o estudo da pesquisa rápida das aneuploidias mais comuns, independente do aspeto visual da amostra, pela técnica de MLPA, verificando-se que, das 713 amostras recebidas no período em estudo, em 104 amostras (LA hemáticos e BVC) (14,6%) foi necessário recorrer a uma segunda técnica (QF-PCR) de forma a validar o resultado (presença ou ausência de contaminação materna). A aplicação da QF-PCR revelou ser uma opção mais simples e economicamente mais viável, já que numa única reação, permite a deteção das aneuploidias mais comuns, deteção/exclusão de contaminação materna em qualquer amostra e, também, deteção/exclusão de triploidia nos resultados normais femininos de amostras de LA e BVC.
The prenatal diagnosis (DPN) has been important in the early detection on a large number of anomalies in the fetus. The majority of chromosomal abnormalities are detected in DPN to numerical abnormalities of chromosomes 13, 18, 21, X and Y. For a quick search of the most common aneuploidies, techniques such as MLPA and QF-PCR allow rapid diagnosis but directed, enabling a more timely clinical intervention, reducing the anxiety of the parents. With this study we delineate the most appropriate strategy to a laboratory for prenatal diagnosis, with the order to apply a rapid technique for the detection of the most common aneuploidies in different types of samples in the laboratory (GDPN), with emphasis on samples with high risk maternal contamination. To this end, we studied a series of samples AF and CVS, and compared the speed of the result, the reliability as well as the technical and economic resources spent. This study was based on 713 prenatal samples of which 530 were related to AF and 183 CVS, for which the rapid screening of aneuploidies was requested. Of the 530 analyzed AF, only 39 samples, all hematic, constituted the domain of this study, along with 183 CVS. For this study, the methodology was used routinely in our laboratory (GDPN), which consisted of starting the study on a rapid search of the most common aneuploidies, regardless of the visual appearance of the sample, by the MLPA, verifying that the 713 samples received during the study period, in 104 samples (AF hematic and CVS) (14.6%) was necessary to use a second technique (QF-PCR) in order to validate the results (presence or absence of maternal contamination).The application of QF-PCR has proved to be simpler and more economically viable option, since a single reaction, permits the detection of the most common aneuploidy detection/exclusion of maternal contamination of any sample and also, detection/exclusion of triploidy in female normal results of samples AF and CVS.

Mestrado em Biomedicina Molecular
Head and Neck Cancers (HNC) are a group of tumours located in the upper aero-digestive tract. Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC) represent about 90% of all HNC cases. It has been considered the sixth most malignant tumour worldwide and, despite clinical and technological advances, the five-year survival rate has not improved much in the last years. Nowadays, HNSCC is well established as a heterogeneous disease and that its development is due to accumulation of genetic events. Apart from the majority of the patients being diagnosed in an advanced stage, HNSCC is also a disease with poor therapeutic outcome. One of the therapeutic approaches is radiotherapy. However, this approach has different drawbacks like the radioresistance acquired by some tumour cells, leading to a worse prognosis. A major knowledge in radiation biology is imperative to improve this type of treatment and avoid late toxicities, maintaining patient quality of life in the subsequent years after treatment. Then, identification of genetic markers associated to radiotherapy response in patients and possible alterations in cells after radiotherapy are essential steps towards an improved diagnosis, higher survival rate and a better life quality. Not much is known about the radiation effects on cells, so, the principal aim of this study was to contribute to a more extensive knowledge about radiation treatment in HNSCC. For this, two commercial cell lines, HSC-3 and BICR-10, were used and characterized resorting to karyotyping, aCGH and MS-MLPA. These cell lines were submitted to different doses of irradiation and the resulting genetic and methylation alterations were evaluated. Our results showed a great difference in radiation response between the two cell lines, allowing the conclusion that HSC-3 was much more radiosensitive than BICR-10. Bearing this in mind, analysis of cell death, cell cycle and DNA damages was performed to try to elucidate the motifs behind this difference. The characterization of both cell lines allowed the confirmation that HSC-3 was derived from a metastatic tumour and the hypothesis that BICR-10 was derived from a dysplasia. Furthermore, this pilot study enabled the suggestion of some genetic and epigenetic alterations that cells suffer after radiation treatment. Additionally, it also allowed the association of some genetic characteristics that could be related to the differences in radiation response observable in this two cell lines. Taken together all of our results contribute to a better understanding of radiation effects on HNSCC allowing one further step towards the prediction of patients’ outcome, better choice of treatment approaches and ultimately a better quality of life.
Cancro da Cabeça e Pescoço refere-se a um grupo de tumores que aparecem no trato aerodigestivo superior, sendo que o carcinoma das células escamosas da cabeça e pescoço (CCECP) corresponde a mais de 90% de todos os casos de cancro nesta região. Foi considerado o sexto tumor mais maligno em todo o mundo e, apesar de todos os avanços tecnológicos e clínicos, a taxa de sobrevivência a cinco anos não melhorou significativamente nas últimas décadas. Atualmente sabe-se que o CCECP é uma doença bastante heterogénea que se desenvolve devido à acumulação de alterações genéticas e epigenéticas. Alguns dos grandes problemas associados a este tipo de cancro são o diagnóstico em fase tardia da doença e os poucos resultados terapêuticos. Uma das escolhas terapêuticas para o CCECP é a radioterapia, no entanto, esta tem diversos inconvenientes, como a radioresistência adquirida por algumas células tumorais, que se associam a piores prognósticos. Um aumento do conhecimento na área da biologia da radiação é necessário para melhorar esta opção terapêutica, evitando futuros efeitos tóxicos e fornecendo uma melhor qualidade de vida nos anos subsequentes ao tratamento. Desta forma, a identificação de marcadores moleculares associados quer a uma resposta à radioterapia, quer a possíveis alterações celulares após tratamento com radiação, é essencial para melhorar o diagnóstico, taxa de sobrevivência e qualidade de vida destes doentes. Adicionalmente, existe uma grande falha no conhecimento em relação aos efeitos da radiação nas células, como tal, o principal objetivo deste estudo foi o de contribuir para um conhecimento mais alargado do efeito da radiação em doentes com CCECP. Para isso foram utilizadas duas linhas comerciais celulares, HSC-3 (derivada de um tumor metastático da língua) e BICR-10 (derivada de um tumor da mucosa bucal), que foram caracterizadas com recurso a aCGH, MS-MLPA e citogenética convencional. Estas linhas foram submetidas a diferentes doses de radiação e as alterações genéticas e de metilação pós tratamento foram determinadas. Estes resultados demonstraram uma grande variação de resposta à radiação para estas duas linhas celulares, permitindo a conclusão que a linha HSC-3 é mais radiossensível que a linha BICR-10. Tendo isto em mente, procedeu-se a análise da morte celular, ciclo celular e danos no DNA de forma a tentar compreender esta diferença. A caracterização genética de ambas as linhas celulares permitiu corroborar que a linha HSC-3 era derivada de um tumor metastático e sugeriu que a linha celular BICR-10 estaria associada a um estado de displasia. Para além disto, foi possível analisar alterações genéticas e epigenéticas ocorridas após irradiação e associar determinados perfis genéticos a uma melhor ou pior resposta à radiação. Em suma, os nossos resultados contribuiram para um conhecimento mais aprofundado dos efeitos da radiação no CCECP possibilitando, no futuro, melhores opções de tratamento e uma melhor qualidade de vida para estes doentes.

Mestrado em Biotecnologia
Os copy number variations (CNVs) consistem em segmentos de DNA de uma kilobase ou mais, que se encontram num número variável de cópias, em comparação com um genoma de referência. A deteção de CNVs é convencionalmente realizada através de técnicas de citogenética, como fluorescence in situ hybridization e array comparative genomic hybridization, ou com base em PCR, como multiplex ligation-dependent probe amplification, SNP arrays ou deep sequencing. Porém, a evolução da técnica de PCR quantitativo em tempo real (qPCR) permitiu que fosse, actualmente, considerada o método gold standard para a detecção de CNVs devido, sobretudo, ao elevado rendimento, sensibilidade, precisão e versatilidade. O presente trabalho descreve o desenvolvimento e validação de um método de deteção de CNVs através da técnica de qPCR. A metodologia adotada provou ser um método preciso e sensível para a detecção de CNVs em regiões específicas.
Copy number variations (CNVs) consist in DNA segments of one kilobase or larger, that are present in variable copy number, in comparison to a reference genome. CNVs detection is conventionally performed through cytogenetic, such as fluorescence in situ hybridization and array comparative genomic hybridization, or PCR-based techniques, like multiplex ligation-dependent probe amplification, SNP arrays or deep sequencing. However, the evolution of quantitative PCR (qPCR) allows it to be considered the gold standard for CNVs detection, mainly due to its high throughput, precision and versatility. The present work describes the development and validation of a qPCR method for CNVs detection. This method proved to be an accurate and sensitive method for CNVs detection in targeted regions.

This work focuses on enhancing security in wireless sensor networks (WSNs) integrated into the Internet of Things (IoT) by employing different schemes. WSNs are widely used in various fields, such as defence, transportation, healthcare, and environmental monitoring, where they collect and process data from the surrounding environment. However, due to the nature of WSNs and resource constraints, they are vulnerable to security threats. Attacks such as Sybil attacks, routing attacks, and various other forms of malicious activities can compromise the integrity and reliability of WSNs. The strategies and frameworks proposed in this thesis aim to overcome these security issues. The proposed schemes include robust intrusion detection systems, localization techniques based on range-free and range-based strategies, secure clustering, data aggregation, routing, and optimization techniques. These schemes utilize machine learning models, such as hybrid machine learning algorithms, to detect and classify attacks. The performance of the proposed models is evaluated using benchmark datasets, considering metrics such as training and testing time, precision, recall, F1-score, and accuracy. The proposed research aims to address security challenges and vulnerabilities present in IoT based WSNs by employing the design of advanced intrusion detection systems to detect and mitigate both internal and external attacks in IoT-based WSNs. These systems are designed to identify and respond to malicious activities that can compromise the integrity and functionality of the network. Ensemble Machine learning techniques are utilized for classifying and detecting DoS attacks using benchmark datasets. Integrating trust evaluation methodologies into the localization process helps to solve the security concerns that arise as a result of the procedure. DV-Hop, RSSI, and DE localization techniques assess the nodes' trustworthiness in localization, considering factors such as their behaviour, reliability, and communication history. By evaluating the trustworthiness of nodes, the localization process can mitigate the impact of malicious nodes and ensure the accuracy and integrity of localization results. viii The hybrid DV-Hop-RSSI-DE localization approach is coupled with the MLPANN machine learning algorithm and achieves better localization accuracy to detect malicious nodes. MLPANN is trained using labelled datasets to identify patterns indicative of malicious behaviour. The system can detect and classify malicious nodes based on their localization characteristics by leveraging machine learning. Furthermore, as WSNs are an integral part of the IoT, this thesis also explores security challenges specific to IoT-based WSNs. A hierarchical design incorporating blockchain-based cascaded encryption and trust evaluation is proposed to improve security and service delivery in IoT-WSNs. By combining raw data from devices and identifying risks, federated machine learning improves data security and transport. The proposed approach demonstrates improved performance and security in large-scale IoT-WSNs, leveraging heterogeneous wireless sensor networks to provide secure services. Secure data aggregation and clustering techniques are also proposed to detect and classify attacks in WSNs. These techniques optimize data aggregation to extend the network lifetime and outperform existing security and performance metrics approaches. These techniques minimize communication overhead and maximize resource utilization while protecting sensitive information using hybrid GA-PSO based on fuzzy rule intelligent routing protocol in WSNs. Lastly, trust management and routing mechanisms enable secure and efficient communication in distributed and hierarchical network topologies. These mechanisms ensure that data is routed through trustworthy nodes and establish reliable communication paths within the network. The effectiveness of the proposed schemes and frameworks is validated through simulations and comparisons with recent works. The results confirm the improved security and performance achieved by the proposed methods. By addressing security concerns through intrusion detection, secure localization, machine learning, secure clustering, and trust management, the security and reliability of IoT-based WSNs can be significantly enhanced. The scalability and applicability of the techniques in large-scale deployments are also addressed. This research contributes to developing secure and reliable WSNs integrated into the IoT and provides avenues for future work.

Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018
A Leucemia Linfocítica Crónica (LLC) é o tipo de leucemia mais frequente na população adulta de países ocidentais, cuja idade média ao diagnóstico varia entre os 67 e os 72 anos. É caracterizada pela expansão clonal e acumulação de linfócitos B neoplásicos no sangue periférico e na medula óssea, resistentes à apoptose e imunologicamente incompetentes. Estas células têm também a capacidade de infiltrar outros órgãos como o baço ou o fígado. Os indivíduos com LLC apresentam diversas alterações genómicas características, que estão associadas a diferentes subtipos da doença com diferentes comportamentos biológicos e clínicos. Os dois principais subtipos de LLC são caracterizados pela ausência ou presença de genes mutados na região codificante da cadeia pesada da região variável das imunoglobulinas (IGHV), sendo que o estado não mutado destes genes é o que constitui a situação de doença mais agressiva. A sobre-expressão dos genes CD38 e ZAP70 é um parâmetro que auxilia na estratificação de doentes em grupos com diferentes prognósticos que, possivelmente, necessitam de diferentes estratégias terapêuticas. Para além destes marcadores, podem ocorrer alterações epigenéticas; mutações somáticas nos genes MYD88, NOTCH1, SF3B1 e TP53; variações no número de cópias (CNVs) de segmentos de DNA; trissomias 9, 12, 18 e 19, e translocações que envolvam o locus IGH. Uma CNV é um segmento de DNA com pelo menos 1 kilobase (Kb) que apresenta variação no número das suas cópias (perda ou ganho) relativamente a um DNA de referência de um indivíduo saudável. Uma translocação recíproca é uma troca de posições entre dois segmentos de DNA, entre cromossomas não homólogos. Ao longo das últimas décadas estas alterações têm vindo a ser detetadas, na prática clínica, pela técnica de Hibridização Fluorescente In Situ aplicada a células em interfase (iFISH). A iFISH permitiu realizar uma melhor estratificação destes doentes em diferentes grupos, aos quais são associados diferentes prognósticos. Estes grupos baseiam-se na presença de: (i) deleção em 13q como única alteração; (ii) nenhuma alteração; (iii) trissomia 12; (iv) deleção em 11q e (v) deleção em 17p (grupos apresentados por ordem crescente de pior prognóstico previsto), sendo (i) o grupo de melhor prognóstico e (v) o de pior prognóstico. Posteriormente, foram adicionadas a este painel sondas para a deteção da deleção em 6q e translocações do gene IGH. No entanto, devido à heterogeneidade biológica e clínica desta doença, existe consciência da importância de procurar novas CNVs com possível valor como marcadores de prognóstico. De facto, nem todas as terapias desenvolvidas são aplicáveis a doentes com diferentes tipos de alterações. Um exemplo disso é o caso dos doentes com a del(17p) e/ou mutação do gene TP53. Neste grupo de doentes, a quimioimunoterapia é altamente desaconselhada devido ao facto de esta recorrer a agentes dependentes da atividade da proteína p53 que, por estar ausente e/ou mutada nos doentes com del(17p) e/ou mutação do gene TP53, impede que esta terapêutica conduza a resultados favoráveis. Assim sendo, os doentes com estas alterações são candidatos a terapêutica dirigida recorrendo a inibidores da via BTK, como o ibrutinib. Com este trabalho piloto, o nosso grupo realizou a caracterização de uma coorte de 20 doentes com LLC, ao nível do seu conteúdo em CNVs. Para tal, aplicámos as técnicas de Amplificação Multiplex de Sondas Dependente de Ligação (MLPA) e arrays de Hibridização Genómica Comparativa (aCGH), após extração de DNA a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), e tendo em conta o genoma de referência GRCh37/hg9 (Genome Reference Consortium Human Build 37/human genome 19). Após a obtenção de resultados, fizemos um estudo de sobrevivência global ao longo de um período médio de follow-up de 114 meses, aplicando o método estatístico de Kaplan-Meier. Com base nos resultados de MLPA, dividimos as amostras em duas categorias: um grupo com doentes que tinham ≥2 alterações e outro com doentes que tinham <2 alterações. Interpretámos, também, a distribuição de algumas das alterações que detetámos em maior frequência: del(11q), del(14q), e mutação no gene NOTCH1, em doentes agrupados de acordo com o seu estadiamento pelos sistemas Binet e Rai (sistemas de classificação de estadiamento específicos para LLC). Para tal, aplicámos o teste qui-quadrado de Pearson. Relativamente à análise de sobrevivência, apesar de os nossos resultados não terem apresentado significância estatística, estes sugerem que existe uma associação entre o aumento no número de alterações genómicas que um doente tem e a diminuição na taxa de sobrevivência. Quanto às prevalências das alterações del(11q), del(14q) e mutação do gene NOTCH1, verificámos que estas são significativamente mais altas em doentes que se encontram num estadiamento intermédio/alto de risco de doença do que em doentes com estadiamento de baixo risco, o que sugere a sua importância como marcadores de mau prognóstico. Isto é algo que já foi previamente descrito para a del(11q) e para a mutação em NOTCH1 mas, tanto quanto é do nosso conhecimento, é algo que não foi ainda visto, por outros grupos, para doentes com a alteração del(14q). Para além das conclusões tiradas relativamente às alterações genómicas em doentes com esta neoplasia, foi-nos possível fazer algumas comparações entre as técnicas aplicadas. Apresentamos, também, uma comparação crítica entre a aplicação destas tecnologias e a utilização da técnica de diagnóstico iFISH, tanto ao nível da prática clínica como no âmbito da investigação científica. O MLPA e o aCGH demonstraram ser técnicas apropriadas para realizar a caracterização genómica da LLC, uma vez que estas foram capazes de detetar CNVs. A técnica de aCGH permitiu-nos detetar um total de 134 alterações, das quais a maior parte foi vista em regiões que não são estudadas pelo iFISH. Isto provou o seu valor do aCGH como técnica aplicável na investigação de alterações genómicas na LLC. Realizámos, de seguida, a validação dos resultados de aCGH pela técnica de MLPA, o que nos permitiu chegar à conclusão de que todas as alterações detetadas por ambas as técnicas são reais. Concluímos também que o MLPA é uma técnica candidata a substituir a aCGH no âmbito da investigação, principalmente por ser menos dispendiosa e menos morosa. Num contexto de prática clínica, o MLPA poderia eventualmente substituir o iFISH pois também fornece informação sobre a presença das alterações mais comuns: del(11q), trissomia 12, del(13q) e del(17p), bem como sobre a presença de outras alterações características da LLC, mas menos prevalentes: ganho em 2p, del(6q), perda em 8p, ganho em 8q, del(9p21) e trissomia 19. Para além disso, deteta também possíveis mutações somáticas nos genes NOTCH1, MYD88 e SF3B1, que podem ocorrer nesta doença. Contudo, o iFISH é a única destas três técnicas que é capaz de detetar mosaicismos de baixa expressão e a ocorrência de translocações na LLC, tais como: t(14,18)(q32,q24), t(14,18)(q32,q21) e t(14,19)(q32,q13). Estas translocações ocorrem em até 5% dos casos diagnosticados. As nossas perspetivas para trabalhos futuros consistem em aumentar o número de amostras estudadas bem como o tempo de seguimento destas com o objetivo de, numa próxima análise de sobrevivência, alcançar uma maior confiança nos resultados obtidos. Para além disso, temos também o objetivo de reavaliar a importância da del(14q) como possível marcador de mau prognóstico, num grupo maior de doentes. Finalmente, esperamos ser capazes de conhecer melhor a distribuição das alterações que encontrámos com elevada prevalência (del(5q13.2), del(8q24.23), del(22q11.22), del(Xq21.1), dup(4p16.3), dup(6p25.3), dup(8p11.1), and dup(10q11.22)) numa coorte de maior de doentes. Esperamos conseguir identificar, de entre estas alterações, possíveis marcadores de doença, algo que será apenas possível por comparação com uma população controlo. Com o nosso trabalho, esperamos incentivar não só a procura de novos alvos terapêuticos como também a descoberta e avaliação de novas terapias. Por último, propomos a continuação de estudos de caracterização genómica da leucemia linfocítica crónica, destacando o aCGH e MLPA como técnicas preferenciais para esse fim.
Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is one of the most common hematological malignancies, being the most recurrent type of leukemia in the adult population in western countries. It is characterized by a clonal expansion and accumulation of neoplastic B lymphocytes on peripheral blood and in the bone marrow. There are some characteristic genomic alterations in these individuals, linked to different subtypes of CLL with different biological and clinical behaviors. The two main types of CLL are characterized by either the lack or the presence of mutated genes at the coding region of the immunoglobulins heavy chain’s variable region (IGHV), being the unmutated state the one leading to a more aggressive disease course. Overexpression of the molecular markers CD38 and ZAP70 are also parameters that determine disease stage and help to stratify patients into groups with different prognosis and possible different therapy strategies. Furthermore, there are some CLL characteristic genomic alterations: epigenetic alterations; somatic mutations in MYD88, NOTCH1, SF3B1, and TP53; copy number variations (CNVs) of some DNA regions; trisomies 9, 12, 18, or 19; and some translocations involving the IGH locus. Over the last decades, CLL reported CNVs have been evaluated with the standard technique of interphase Fluorescent In Situ Hybridization (iFISH), in order to stratify patients into different groups of predicted outcomes. Those groups are based on the presence of: (i) 13q deletion as sole alteration; (ii) no alterations; (iii) Trisomy 12; (iv) 11q deletion; and (v) 17p deletion. These groups are presented in order of best (i) to worse disease outcome (v). Subsequently, probes for the detection of 6q deletion and IGH translocations have been added. However, due to the clinical and biological heterogeneity of this disease, it is currently acknowledged that it is important to search for other CNVs that may become new disease markers. Our team has characterized, in this pilot study, a cohort of 20 CLL patients, regarding their CNVs content, in agreement with the Genome Reference Consortium Human Build 37/human genome 19 (GRCh37/hg9). We have applied Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) and array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) technologies. We conducted an overall survival analysis of patients presenting either ≥2 alterations or <2 alterations detected by MLPA, based on a median follow-up time of 114 months. Moreover, we have interpreted the distribution of some of the common alterations found: del(11q), del(14q), and NOTCH1 mutation, in patients grouped according to their disease staging by Binet and Rai CLL staging systems. As for the survival analysis, despite the lack of statistical significance, our results show an association between the increasing number of alterations in a patient and a shorter overall survival. Finally, the prevalence of del(11q), del(14q), and NOTCH1 mutation in our samples are significantly higher in patients with intermediate/high risk stages than in low risk disease stage patients, suggesting their value as bad prognosis markers. That is something already known for del(11q) and NOTCH1 mutation but appears to be a new information for patients with del(14q). We conclude that MLPA and aCGH are competent techniques for the genomic characterization of CLL. The aCGH technique has detected additional alterations in regions other than the ones evaluated by the standard diagnosis method iFISH, proving its value as a research tool in CLL. The aCGH results regarding reported CLL CNVs were positively validated by MLPA, showing that MLPA is a good substitute of the aCGH technique on day-to-day research. Moreover, MLPA has the advantages of being a less expensive and less time-consuming technique. In terms of clinical practice, MLPA could substitute iFISH for delivering the same results on del(11q), trisomy 12, del(13q), and del(17p) assessment, and the additional information on the other CNVs it also evaluates (2p gain, del(6q), 8p loss, 8q gain, del(9p21), and trisomy 19), as well as the detection of NOTCH1, MYD88, and SF3B1 somatic mutations. However, iFISH is the only one of these three techniques capable of detecting low expression mosaicism and the presence of translocations, a type of alteration that occurs in up to 5% of patients, making it still irreplaceable. In the future, all our results should be re-evaluated using a larger cohort of patients. Additionally, the survival analysis must be repeated when a larger follow-up time is reached, and the number of samples analyzed is greater. It is also important to re-assess del(14q) value as a possible bad prognosis marker. Additionally, we intend to better characterize the prevalence of del(5q13.2), del(8q24.23), del(22q11.22), del(Xq21.1), dup(4p16.3), dup(6p25.3), dup(8p11.1), and dup(10q11.22) in a larger cohort of CLL patients. Among these alterations, it would be interesting if we could identify possible new markers of diseases something only possible after comparison with a control groups. With our work, we expect to stimulate further research on new therapeutic targets and new treatment strategies. At last, we encourage the continuation of CLL genomic characterization, with the use of both aCGH and MLPA.

Dissertação de mestrado em Biologia Celular e Molecular, apresentada ao Departamento Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.
O cancro da bexiga (CB) é considerado uma das neoplasias mais comuns do tracto urinário sendo a quarta neoplasia mais frequente no sexo masculino e a décima quarta no sexo feminino, correspondendo a cerca de 5 a 10% do total de neoplasias na Europa. A principal problemática associada ao CB é a elevada taxa de recidiva. Cerca de 50 a 80% dos tumores superficiais irão apresentar recidivas e cerca de 10-15% irão progredir para formas neoplásicas mais agressivas, num período de cinco anos. Deste modo, o principal objectivo da investigação nesta área passa pelo desenvolvimento e aperfeiçoamento de metodologias que permitam o diagnóstico e a detecção de recidivas desta neoplasia o mais precocemente possível e de forma eficaz. Actualmente, já se encontram disponíveis alguns biomarcadores, contudo estes apresentam baixas taxas de sensibilidade e especificidade. Os principais objectivos deste estudo foram a caracterização do perfil genómico do CB bem como o estudo do estado de metilação de genes relacionados com esta neoplasia. Por outro lado, pretendeu-se também avaliar a capacidade de utilização da urina como material biológico para uma metodologia não invasiva na obtenção de células tumorais. Neste estudo foram estudadas 14 biópsias tumorais por MLPA e MSMLPA, das quais 13 foram também avaliadas por aCGH. A urina correspondente a 12 das 14 amostras foram também avaliadas por MLPA. Verificou-se a existência de padrões de alterações muito evidentes entre as amostras estudadas. Por MLPA, as alterações mais frequentes corresponderam a perdas nos cromossomas 7q, 9p, 9q e 17q e ganhos nos cromossomas 3p, 3q, 7p, 10q, 17q e 20q. Por outro lado, por MS-MLPA foi possível detectar uma elevada taxa de incidência de perdas associadas ao gene TP53. Os genes MSH6, PAX5 e KLLN apresentaram-se muito frequentemente metilados nas amostras estudadas. Por aCGH foi igualmento possível identificar padrões de alterações muito evidentes, porém a sua associação com o estadio e o grau tumoral não foi clara. Quanto ao estudo por MLPA de amostras provenientes de urina, foi possível obter resultados estatisticamente significativos para vários genes. Deste modo, a utilização da urina como metodologia não invasiva para o estudo e caracterização tumoral, mostra-se extremamente promissora.
Bladder cancer (BC) is one of the most common malignancies of urinary tract being the fourth most common neoplasia in men and the fourteenth in woman, accounting with 5 – 10% of all malignancies in Europe. Bladder tumors have high recurrent rates and 50 to 80% of superficial tumors will recur and 10 to 15% will progress to more aggressive neoplasias, within five years. The main goal of research in this field is to optimize or develop new strategies that will allow an early and efficient diagnosis and a detection of recurrences. Nowadays, there are some biomarkers that can be used in clinical practice, however these markers have low sensitivity and specificity rates. The main goals of this study were the characterization of the genomic profile of bladder cancer and the evaluatation of the methylation profile of some genes related with this neoplasia. On the other hand, in this study the ability of using urine as a source of bladder cancer cells for a non-invasive method was evaluated. 14 tumor biopsies were studied by MLPA and MS-MLPA, which 13 were also studied by aCGH. Urine from 12 of 14 studied samples, were also studied by MLPA. Some genetic and epigenetic alterations patterns were identified. By MLPA, the most common changes were losses in chromosomes 7q, 9p, 9q and 17q and gains in chromosomes 3p, 3q, 7p, 10q, 17q and 20q. On the other hand, by MS-MLPA a high frequencies of losses of TP53 gene were detected. MSH6, PAX5 and KLLN genes showed a high methilation rate. By aCGH some genetic alterations patterns were also detected, however their association with tumor stage and grade were not clear. The study of urine samples by MLPA revealed concordance, with statistical significancy for some genetic alterations. Thus, the use of urine as a non-invasive strategy for bladder tumor study and characterization is very promising.

Dissertação de mestrado em Bioquímica, apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra
O autismo é um distúrbio do desenvolvimento e apresenta uma incidência cerca de 34/10000 indivíduos. Esta patologia manifesta-se na infância, persistindo ao longo da vida e pode dar origem a uma grande variedade de quadros clínicos, tais como, dificuldades de interação social e de comunicação, comportamentos repetitivos e estereotipados. Os factores genéticos representam um papel importante, apesar da sua origem por vezes incerta e numa taxa relevante de casos o diagnóstico etiológico é desconhecido. Porém, regiões cromossómicas, tais como, 15q11-q13, 16p11 e o 22q13.3 têm sido associadas ao autismo. O objectivo deste trabalho é relacionar as manifestações do espectro do autismo com alterações cromossómicas submicroscópicas, das regiões 15q11-q13, 16p11.2 e 22q13.3, através da técnica de MLPA, avaliando a sua incidência na população em estudo. Foram encontradas anomalias cromossómicas em três pacientes, duas na região 15q11.2-q13.3 e uma na região 16p11.2, comprovando a sua importância na etiologia do autismo. A técnica de MLPA revelou ser adequada na pesquisa direcionada de alterações cromossómicas e é uma mais valia num laboratório de diagnóstico.
Autism is a developmental disorder and has an incidence of about 34/10000 individuals. This pathology manifests itself in childhood and persists throughout life and can give rise to a wide variety of clinical manifestations, such as difficulties in social interaction and communication, repetitive and stereotyped behaviors. Genetic factors play an important role, despite its origins sometimes uncertain. In most of the cases its etiology is unknown. In some cases chromosomal rearrangements are the most commonly identified abnormalities. There are certain chromosomal regions that have been most associated with autism, as for exemple the regions 15q11-q13, 16p11 and 22q13. The aim of this work is to relate the manifestations of the autism spectrum with the above submicroscopic chromosomal changes through the MLPA technique, assessing its impact in the population. Chromosomal abnormalities were found two in region 15q11-q13 and one in 16p11.2 confirming its importance in the autism etiology. The MLPA technique has proved suitable for the research of chromosomal abnormalies and is an asset in a diagnostic laboratory.

Nephroblastoma is the most prevalent pediatric kidney tumor, which occurs primarily in younger children with the average age at diagnosis of 42,5 months for girls and 36,5 months for boys. Even though its treatment is currently very succesful and the overall survival rate reaches over 90 %, there are still more things to be discovered and improved. An important role for the right choice of treatment plays not only the histology of tumor, but also the chromosomal changes present at tumor. Some of them (for example 1q gain, simultaneous deletion of 1p and 16q, TP53 deletion) were confirmed as negative prognostic markers because they are associated with an increased risk of relapse or with anaplastic type of nephroblastoma that is included in a high risk group. These changes are therefore used together with the tumor histology for stratification of nephroblastomas. Some of these changes were found in a heterogeneous state (only in a part of the cells) in nephroblastoma, which also complicates the treatment of the patient and which cannot be solved when only one sample is taken from the tumor. In this work we concentrated on the detection of chromosomal changes present in nephroblastomas of 44 patients and their associations with clinical data. We have proved some of the known associations (22q...

Dissertação de mestrado em Biologia Celular e Molecular, apresentada ao Departamento de Zoologia da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.
O autismo trata-se de uma síndrome comportamental complexa, em que o paciente apresenta dificuldades de interacção social e de comunicação, assim como comportamentos repetitivos e estereotipados, havendo uma prevalência de cerca de 34/10000 indivíduos. Nesta patologia, os factores genéticos representam um papel importante, não se sabendo ainda quais os genes associados, no entanto, existem determinadas regiões cromossómicas mais susceptíveis, como por exemplo, a região proximal do braço longo do cromossoma 15 (15q11-q13). Aproximadamente, 1% a 4% das crianças que têm autismo apresentam anomalias citogenéticas nesta região. Como a citogenética convencional apenas detecta delecções ou duplicações com tamanho entre 3-5 Mb é necessário recorrer a técnicas de citogenética molecular, como a Fluorescent in situ Hybridization (FISH), que tem sido amplamente usada na deteccção de anomalias cromossómicas em pacientes autistas. Recentemente, têm surgido novas metodologias, como a Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA) que tem vindo a responder às necessidades exigidas pelos novos avanços da ciência. O objectivo deste trabalho foi relacionar o autismo com alterações cromossómicas na região 15q11.2, e assim, avaliar a sua frequência na etiologia do autismo. Dos 556 casos autistas que foram referenciados ao laboratório, 429 foram estudados pela metodologia de FISH com as sondas para os loci SNRPN e UBE3A. Desses, 134 foram ainda analisados pela técnica de Methylation-Specific Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MS-MLPA) com o kit ME028. Dos 429 casos, foram encontradas um total de 7 alterações: duas duplicações intersticiais da região 15q11-q13, duas triplicações intersticiais desta mesma região, um cromossoma supranumerário derivado do cromossoma 15, um marcador do cromossoma 15 em mosaico, e uma microduplicação localizada na região entre os pontos de quebra BP1 e BP2. A frequência destas anomalias cromossómicas neste estudo (1,6%) está dentro da variabilidade reportada noutros trabalhos e são uma causa significante para a etiologia do autismo. Estas descobertas indicam que a MS-MLPA é um método eficiente para o screening deste tipo de anomalias cromossómicas, sendo um método simples, rápido,sensível e económico, permitindo a detecção simultânea de alterações no número de cópias e nos padrões de metilação.
Autism is a complex behavioral syndrome, in which the patient presents deficit in social interaction and communication and has stereotyped and repetitive behaviors. Autism has a prevalence of 34/10000 individuals. In this pathology, genetic factors play a significant role, and although the autism associated genes are not yet known, there are chromosomes regions such as the proximal region of the long arm of the chromosome 15 (15q11-q13) that share a certain susceptibilities. Approximately 1 to 4% of the children who have autism present cytogenetic abnormalities in this region. As the convencional cytogenetic methods only detect deletions or duplications of 3-5 Mb in size, researchers usually use molecular cytogenetic techniques such as the Fluorescent in situ Hybridization (FISH) to evaluate them. Recently, new methodologies have arise such as the Multiplex Ligationdependent Probe Amplification (MLPA), which has several advantages in the diagnosis of such chromosomal abnormalities. The aim of this work was to find an association between autism and chromosomal alterations in the 15q11.2 region and to evaluate its prevalence in the autism etiology. 556 cases of autism have been reported to the laboratory. 429 were studied by FISH technique with probes to the SNRPN and UBE3A loci. Of these, 134 were analyzed by Methylation-Specific Multiplex ligation-dependent Probe Amplification (MS-MLPA) technique with the ME028 kit.Of the 429 cases, we found two interstitial duplications and two interstitial triplications in the region 15q11-q13, one supernumerary marker chromosome derived from chromosome 15, one supernumerary mosaic marker chromosome 15 and a microduplication of the region between breakpoint BP1 and breakpoint BP2. The frequency of these chromosomal abnormalities in this study (1,6%) is within the reported frequencies in other studies. These findings also showed that the MSMLPA is an efficient method for the screening of this type of chromosomal abnormalities, being simple, rapid, sensitive, economic and allowing the simultaneous detection of copy number alterations as well as methylation patterns.

DNA methylation is an epigenetic mechanism that affects the level of gene expression. Methylation is a physiological for imprinted genes, when is required to express a gene derived only from a particular parent. If a fault occurs in the DNA methylation of these genes, various diseases may develop. The object of this work was to determine the level of methylation of H19 and KCNQ1OT1 genes, located on the short arm of chromosome 11 in 15.5 region. The aim of this study was to investigate the changes in methylation of these genes in nephroblastomas, pheochromocytomas and paragangliomas, determine what changes of target genes are present in the samples, examined and divided samples into groups according to the detected changes. File of nephroblastomas is divided into 3 groups according to the methylation changes in genes and compared with a similar study by Scott et al. 2012. File of pheochromocytomas and paragangliomas are found according to changes in the methylation of genes divided into 4 groups entirety. Found changes are aligned with the research Margetts et al. 2005.

Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia
As Gamapatias Monoclonais são um conjunto de doenças do sistema hematopoiético, resultantes da proliferação clonal de plasmócitos malignos na medula óssea, devido a alterações genéticas/epigenéticas e a fatores ambientais. Apesar de nem todas as Gamapatias Monoclonais serem consideradas neoplasias malignas, como é o caso da Gamapatia Monoclonal de Significado Indeterminado (MGUS), estas podem progredir para Mieloma Múltiplo (MM), uma neoplasia maligna de plasmócitos.Uma vez que o MM ainda não tem cura, a correta determinação do estádio de risco é necessária para prever a sobrevivência global e auxiliar na escolha da melhor opção terapêutica para cada doente. A análise genética tem sido proposta como um bom preditor para o estabelecimento do prognóstico e como uma oportunidade de estudo da biologia do cancro. Várias alterações genéticas numéricas e estruturais e várias mutações são conhecidas no MM. Estas podem ser classificadas como eventos primários ou secundários, sendo associadas ao desenvolvimento inicial ou à progressão do tumor, respetivamente. Como eventos primários, duas vias oncogénicas distintas foram reportadas: hiperdiploidia e translocações envolvendo o locus da cadeia pesada da imunoglobulina; ao passo que eventos envolvendo braços cromossómicos, translocações associadas com outros loci, variação do número de cópias (CNVs) e mutações de genes envolvidos em vias de sinalização, foram descritos como eventos secundários.Atualmente, várias tecnologias estão disponíveis para realizar a análise genética de doentes com Gamapatias Monoclonais. No entanto, a “interphase fluorescence in situ hybridization”(i-FISH) é a única técnica aplicada na prática clínica, ainda que pareça não ser suficiente. Assim, os objetivos deste projeto são a caracterização genómica e molecular de doentes com Gamapatias Monoclonais e a validação das tecnologias de “Array Comparative Genomic Hybridization” (aCGH) e “Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification” (MLPA) no prognóstico de doentes com Gamapatias Monoclonais. Embora ambas as tecnologias permitam a deteção de CNVs, a resolução do aCGH é superior à do MLPA, uma vez que o estudo é realizado ao nível de todo o genoma. Nesse sentido, o MLPA foi realizado maioritariamente para validar os resultados do aCGH.Das 10 amostras estudadas por aCGH, 7 apresentaram deleções no 13q, 5 apresentaram duplicações no 1q, trissomia 9 foi detetada em 4 amostras e deleções do 14q foram detetadas em 4 amostras. Notavelmente, o MLPA apenas confirmou parcialmente as alterações genéticas detetadas por aCGH. Além disso, permitiu o estudo de outras 3 amostras, que não foi possível analisar por aCGH, tendo sido estudado, efetivamente, um total de 13 doentes (3 doentes com MGUS, 5 doentes com MM e 5 doentes com MM em recidiva).Embora o número reduzido de amostras não permita generalizações para a população Portuguesa, este estudo preliminar contribui para o esclarecimento das alterações genéticas na base das Gamapatias Monoclonais do grupo de doentes estudado, permitindo, assim, os primeiros passos no sentido da possível validação do aCGH e/ou MLPA como técnicas complementares ao i-FISH na prática clínica.
Monoclonal Gammopathies are a set of disorders of the haematopoietic system, resulted from the clonal proliferation of malignant plasma cells in the bone marrow, due to genetic/epigenetic alterations and environmental factors. Even though that not all Monoclonal Gammopathies are considered malignant neoplasms, which is the case of Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance (MGUS), they can evolve to Multiple Myeloma (MM), a malignant plasma cells neoplasm.Because MM still remains with no cure, a good establishment of MM risk stage is necessary in order to predict the overall survival and to apply the best therapeutic option for each patient. Genetic analysis has been proposed as a good predictor for prognosis establishment and as an opportunity to study the cancer biology. Several numerical and structural genetic alterations and mutations are known in MM. These abnormalities can be classified as primary or secondary events, being associated with either initial tumour development or tumour progression, respectively. As primary events, two different oncogenic pathways have been reported: hyperdiploidy and translocations involving immunoglobulin heavy chain (IGH) locus; while events involving chromosome arms, translocations associated with other partner loci, copy number variations (CNVs) and mutations involving important genes in cell signalling pathways, have been described as secondary events.Nowadays, several technologies are available to perform Monoclonal Gammopathies patients’ genetic analysis. However, interphase fluorescence in situ hybridization (i-FISH) is the only technique applied in the clinical practice, even though that it seems not to be enough. Therefore, the aims of this project are the genomic and molecular characterization of Monoclonal Gammopathies patients and the validation of Array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) and Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA) technologies in the Monoclonal Gammopathies patients’ prognosis. Although both technologies allow the CNVs detection, the resolution of aCGH is higher than the one of MLPA, given that the study is performed at a genome wide level. In that sense, MLPA was mainly performed to validate aCGH results.From the 10 studied samples by aCGH, 7 presented 13q deletions, 5 presented 1q duplications, trisomy 9 was detected in 4 samples and 14q deletions were detected in 4 samples. Remarkably, MLPA technology only partially confirmed the genetic alterations detected by aCGH. Furthermore, it allowed the study of other 3 samples which were not possible to be analysed by aCGH, thus being effectively studied a total of 13 patients (3 patients with MGUS, 5 patients with MM and 5 patients with relapsed MM).Even though that the reduced number of samples did not allow to establish generalizations for the Portuguese population, this pilot study contributes to the unveiling of the genomic alterations behind Monoclonal Gammopathies in the studied cohort, thus allowing the first steps in the possible validation of aCGH and/or MLPA as complementary techniques to i-FISH in the clinical practice.

Este trabalho foi expressamente elaborado com vista à obtenção do grau de Mestre em Biotecnologia para as Ciências da Saúde.
O genoma é o que define o indivíduo, a sua espécie e as suas características individuais. Sendo uma entidade dinâmica, está em constante evolução, com o surgimento de novos elementos e o desaparecimento de outros. O DNA está compactado e distribui-se por 23 pares de cromossomas, sendo que cada cromossoma possui genes que garantem a transmissão correta da informação genética ao longo das gerações. O cariótipo é o método mais completo quanto à análise para a caracterização dos cromossomas. As anomalias em termos do número de cópias e as alterações estruturais dos cromossomas podem provocar alterações fenotípicas e mostrar-se patogénicas para os indivíduos que as possuem. A Citogenética Clássica consiste num método de análise direta dos cromossomas, através da observação direta de metafases, que visa identificá-los, classificá-los e avaliar a sua integridade e número. O cariótipo é realizado quando existe suspeita de anomalias cromossómicas e quando existem desordens do foro sexual, múltiplas anomalias congénitas e/ou défice cognitivo, dificuldades de aprendizagem, infertilidade ou abortos de repetição, no caso de se tratar de diagnóstico pós-natal, ou quando existem anomalias ecográficas ou rastreio bioquímico alterado, no caso de se tratar de diagnóstico pré-natal. Entre setembro de 2019 e março de 2020, na Unidade de Citogenética do Centro de Genética Médica Jacinto Magalhães, foram efetuadas culturas sincronizadas de linfócitos, a partir de amostras de sangue periférico, seguidas da manipulação conveniente e da técnica de bandeamento GTL, de forma a poder observar e estudar os cromossomas dos respetivos indivíduos. As células provenientes de amostras fetais foram cultivadas até que pudessem ser devidamente manipuladas, com posterior bandeamento GTL. Em ambos os casos, a análise do cariótipo foi realizada com recurso ao microscópio e ao sistema de captura e tratamento de imagens de metafases, o Citovision, de forma a avaliar o número e estrutura dos cromossomas. Das 59 amostras analisadas, identificaram-se seis anomalias. Destas, apenas duas envolviam alterações estruturais dos cromossomas. As restantes quatro consistiam em anomalias numéricas, sendo que duas envolviam os cromossomas sexuais. Foi observada a execução da técnica Fluorescent in situ hybridization, com recurso sondas específicas para a anomalia que se pretende detetar e de acordo com o protocolo estabelecido pelo fabricante. A técnica de citogenética molecular MLPA foi aplicada a amostras que requeriam tal intervenção, seguindo o protocolo definido pelo fabricante, com o objetivo de detetar alterações do número de cópias causadoras de patologia. Foram utilizados os painéis SALSA®MLPA®ProbemixP245(MRC-Holland™) e SALSA®MLPA®ProbemixP297(MRC-Holland™). Dos 50 indivíduos estudados recorrendo a esta técnica, nove apresentaram anomalia. O painel SALSA®MLPA®ProbemixP250(MRCHolland™) foi utilizado para melhor caracterizar dois dos casos e confirmar a alteração envolvida.
The human genome is what defines an individual, his species and individual characteristics. Being a dynamic entity, it is constantly evolving, with the appearance of new elements and the disappearance of others. The DNA is compacted over 23 pairs of chromosomes, each containing genes that ensure the correct transmission of genetic traits over the generations. The karyotype analysis is the most complete method regarding the characterization of the chromosomes. Abnormalities in terms of the number and structure of the chromosomes may lead to phenotypic anomalies and prove to be pathogenic for the individuals who carry them. Classical cytogenetics consists of a method of direct analysis of chromosomes, through direct observation of metaphases, which aims to identify and classify them and evaluate their integrity and number. This analysis is performed when chromosomal abnormalities are suspected and when there are sexual disorders, multiple congenital anomalies and/or cognitive impairment, learning difficulties, infertility or recurrent abortions, regarding postnatal diagnosis, or when there are echographic anomalies or altered biochemical screening, regarding prenatal diagnosis. Between September 2019 and March 2020, at the Cytogenetics Unit of Jacinto Magalhães Medical Genetics Center, synchronized lymphocyte cultures were performed from peripheral blood samples, followed by convenient manipulation and GTL banding technique, in order to observe and study the chromosomes of the respective individuals. The cells from foetal samples were cultured until they could be properly manipulated, with subsequent GTL banding. In both cases, karyotype analysis was performed using a microscope and a system for capturing and treating metaphase images named Citovision, in order to evaluate the number and structure of chromosomes. Of the 59 samples analyzed, six anomalies were identified. Only two involved structural anomalies of chromosomes. The remaining four consisted of numerical anomalies, two of which involved the sex chromosomes. It was observed the execution of the Fluorescent technique in situ hybridization, using probes specific for the anomaly that is intended to be detected and according to the protocol established by the manufacturer. The molecular cytogenetic technique MLPA was performed using samples that required such intervention, following the protocol defined by the manufacturer, with the objective of detecting chromosomal alterations causing pathology. The panels SALSA®MLPA®ProbemixP245(MRC-Holland™) and SALSA®MLPA®ProbemixP297(MRC-Holland™) were used. Of the 50 individuals studied using this technique, nine presented with anomaly. The panel SALSA®MLPA®ProbemixP250(MRC-Holland™) was used to better characterize two of the cases and confirm the alteration involved

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia
O carcinoma epidermoide oral é um subgrupo de tumores do cancro da cabeça e do pescoço constituindo 90% dos tumores que afetam esta localização. Dentro das patologias malignas tem grande peso pela sua elevada taxa de mortalidade que se deve à sua localização anatómica na proximidade de estruturas vitais, dificultando a cirurgia, e devido à sua proximidade com os nódulos linfáticos do pescoço conferindo-lhe grande capacidade de metastização. Estes tumores têm maior incidência em duas localizações anatómicas específicas da cavidade oral, a língua e o pavimento e são mais frequentes em homens na faixa etária dos 60 aos 70 anos, ainda que se esteja a observar uma tendência para a diminuição da idade dos doentes que apresentam esta patologia. A sua etiologia tem sido associada a uma origem multifatorial genética e ambiental, em que o tabaco e o consumo abusivo de bebidas alcoólicas são os principais fatores de risco principalmente devido ao seu efeito sinergético. As variações de número de cópias em regiões com genes sensíveis à dosagem podem ter um papel importante na carcinogénese, estão já estão descritas associações entre alterações genéticas e a carcinogénese do cancro oral, como são exemplo os genes TP53, RB1, EGFR e FHIT. Em vários tipos de cancros algumas alterações genéticas descobertas já demonstram a sua importância como biomarcadores melhorando a qualidade e esperança de vida dos doentes com cancro.O objetivo principal deste trabalho foi validar um painel de sondas de MLPA, na pesquisa de alterações de número de cópias, específico para cancro epidermoide da cabeça e do pescoço em 62 amostras de cancro epidermoide oral. Para além desta técnica foi utilizada a técnica de aCGH, com fim de validação deste painel e para a identificação de novas regiões de interesse. Os resultados de ambas as técnicas, para a mesma cohort, foram correlacionados de forma a robustecer os resultados.Neste estudo foram observadas maiores frequências de alteração de número de cópias nos cromossomas 3 e 8q e na região 11q13.3, por ambas as técnicas realizadas, permitindo-nos antecipar que nestas regiões estarão localizados vários genes alvo importantes no processo de carcinogénese do cancro oral. Nas regiões incluídas no painel de MLPA em estudo, observámos que os cromossomas 4, 5, 13 e 18 apresentavam menor frequência de alterações por ambas as técnicas, levantando a dúvida quanto à sua relevância no estudo do cancro epidermoide oral. Pela técnica de aCGH observaram-se várias alterações com elevada frequência em regiões ausentes do painel de sondas de MLPA, tendo sido identificados 27 genes que deverão ser explorados futuramente para serem inclui dos neste painel. Ainda não se encontram descritas evidencias da associação de 12 destes genes (SST, RNF168, FBXO45, SPIDR, COPS5, C8orf44-SGK3, SGK3, TP53INP1, POLR2K, UBR5, ODF1, ANGPT1 e EBAG9), localizados nos cromossomas 3 e 8, com o cancro epidermoide da cabeça e do pescoço. Os resultados obtidos permitiram validar o painel de sondas o painel de sondas de MLPA e melhorar o seu desenho futuro, no sentido de incorporar outras regiões de interesse como biomarcadores no carcinoma epidermoide oral.
Oral squamous cell carcinoma (OSCC) is a subtype of disease of head and neck cancer (HNC) comprising 90% of the tumours that affect this location. Due to their proximity with structures of vital importance, making surgical treatment complex, and due to the proximity with neck nodes, conferring them a high metastatic capacity, it has a poor prognosis leading to high rates of mortality. The two mostly affected anatomical locations within oral cavity are the tongue and the floor of the mouth. This carcinoma is more common in males in their sixth/seventh decade of life. But, a decrease trend in OSCC patients’ age is being observed. Its aetiology has been associated with genetic and environmental factors in which tobacco and abusive alcohol consumption are major risk factors, especially due to their synergetic effect. Alterations in copy number occurring in gene-dosage sensitive genes can have an important role in oral cancer (OC) carcinogenesis, being already reported associations between some gene imbalances and OC as in TP53, RB1, EGFR and FHIT. In a wide range of cancer types some genetic alteration showed to be important as biomarkers, with value in cancer patients’ outcome improvement.The main goal of this work was the validation of HNSCC multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) specific probe panel, by assessing copy number alterations, in 62 OSCC samples. Besides MLPA we also performed microarray based comparative genomic hybridization (aCGH) technique, to validate this MPLA probe panel and to identify new possible regions of interest. The results obtained by both techniques, for the same group of samples of OSCC patients, were correlated giving strength to our findings.In this study we observed higher values of frequency of alterations in both techniques in chromosomes 3 and 8q and in 11q13.3 region, allowing us to anticipate, that these regions harbour multiple target genes that play an important role in OSCC carcinogenesis. From the studied regions included in the MLPA probe panel we found in both techniques a low frequency of alterations in chromosomes 4, 5, 13 and 18 leaving the doubt about its relevance in the study of OSCC imbalances. In the aCGH analysis was observed high frequency of alterations in absent regions in the MLPA probe panel being identified 27 genes that should be further explored, in order to be included in this probe panel. Also for 12 of these genes (SST, RNF168, FBXO45, SPIDR, COPS5, C8orf44-SGK3, SGK3, TP53INP1, POLR2K, UBR5, ODF1, ANGPT1 and EBAG9) localised in chromosomes 3 and 8, associations with OSCC have not yet been described.

Dissertação de mestrado em Genética Molecular
Oral cancer is considered the sixth most common cancer worldwide. It is reported that 90% of the cases corresponds to oral squamous cell carcinoma (OSCC). Despite the progress in cancer research, the five-year survival rate remains low, mostly due to advanced stages of diagnosis and development of loco-regional recurrence. OSCC results from accumulation of numerous genetic and epigenetic changes, followed by clonal expansion. Therefore, one goal of this project was to characterize OSCC genetic and epigenetic profiles in order to find potential biomarkers that can be used to detect OSCC in early stages and also predict the disease progression. Moreover, since biopsy is an invasive and painful method, it is mostly used when there is a suspicion of malignancy. Consequently, it was also aimed to try to validate a non-invasive method for OSCC diagnosis and to follow up the patients. Taking into account the aims of this project, 65 samples from tumour tissues were acquired and analysed by MS-MLPA in order to detect the genetic and epigenetic alterations that can be associated with OSCC initiation and progression. Furthermore, 12 of this 65 samples were also analysed by aCGH. Regarding genetic events, the most frequent copy number variations (CNVs) detected by MS-MLPA were gains at chromosomes 16p and 19p, and losses at 3p, 9p and 11q. Additionally, the main rearrangements detected through aCGH were gains at chromosomes 3q, 8q and Xq, and losses at 3p,18q Yp and Yq. The methylation status of 25 genes was assessed and the results revealed that gene promotor methylation of WT1, PAX5, GATA5, MSH6 and RARβ represent good epigenetic biomarkers for OSCC. After the OSCC characterization, 59 samples acquired by scraping the tumour surface from the patients were also analysed by MS-MLPA. The results from this non-invasive method were compared with tumour tissue results and it was found agreement between the two samples in 60% and 72% of the genes analysed, as respects to CNVs and methylation status, respectively. These results were truly promising in an attempt to validate this non-invasive approach for screening the oral cavity and to follow up the patients diagnosed with OSCC. In order to discovery some potential genetic and epigenetic alterations that can be associated with early stages of disease and risk of develop tumour relapses or metastasis, 49 samples of the surgery resection margin were analysed by MS-MLPA. It was suggested that deletion of CDKN2A and methylation of TP53 and WT1 are initial alterations in the OSCC carcinogenesis process.
O cancro oral é considerado a sexta neoplasia mais comum a nível mundial, sendo que mais de 90 % dos casos correspondem a carcinomas do tipo epidermoide. Apesar dos avanços a nível tecnológico e clínico, a taxa de sobrevivência a cinco anos não melhorou significativamente nos últimos anos devido, essencialmente, ao diagnóstico tardio e à elevada taxa de recidivas locais ou metástases. Atualmente, sabe-se que o carcinoma epidermoide da cavidade oral (CECO) resulta da acumulação de alterações genéticas e epigenéticas, seguida de expansão clonal. Assim sendo, este trabalho teve como objetivo a caracterização molecular do CECO na tentativa de encontrar potenciais biomarcardores que possam vir a ser úteis no diagnóstico precoce e na previsão da progressão da doença. Além disso, tendo em conta que a biopsia é um método invasivo e que causa desconforto, apenas é usado quando existe suspeita de malignidade. Consequentemente, através da realização deste projeto, pretendeu-se também validar uma metodologia não invasiva para diagnosticar o CECO e acompanhar os doentes. Tendo em conta os principais objetivos deste estudo foram inicialmente analisadas 65 amostras de tecido tumoral, recorrendo à metodologia MS-MLPA, na tentativa de encontrar as principais alterações genéticas e epigenéticas associadas com o CECO. Além disso, 12 dessas amostras foram também analisadas por aCGH. Considerando as variações genéticas, as alterações mais frequentes detetadas por MS-MLPA dizem respeito a ganhos localizados nos cromossomas 16p e 19p e perdas nos localizadas nos cromossomas 3p, 9p e 11q. Os resultados obtidos com a técnica aCGH demostraram maioritariamente ganhos nos cromossomas 3q, 8q e Xq e perdas nos cromossomas 3p, 18q, Yp e Yq. A metodologia MS-MLPA permitiu inferir o estado de metilação de 25 genes, levando a concluir que a metilação dos genes WT1, PAX5, GATA5, MSH6 e RARβ podem funcionar como biomarcadores para o CECO. Após a caracterização molecular do tumor foram analisadas, por MS-MLPA, 59 amostras provenientes da raspagem de células na região tumoral. A comparação destes resultados com os obtidos no tecido tumoral revelou que 60% dos genes analisados para o número de variação de cópias eram concordantes entre as duas amostras e, ainda, que o estado de metilação de 72% dos genes analisados também era concordante. Estes resultados demonstram ser promissores na tentativa de validação desta metodologia não invasiva. A análise de 49 amostras de tecido macroscopicamente não tumoral, contíguo ao tumor, permitiu sugerir que a deleção do gene CDKN2A e a metilação dos genes TP53 e WT1 são alterações iniciais no processo de carcinogénese do CECO.

Dissertação de Mestrado em Genética Molecular Comparativa e Tecnológica
A obtenção de melhores preparações cromossómicas e a descoberta do número de cromossomas da espécie humana permitiu o desenvolvimento da citogenética clínica, especialmente após a descoberta de que certas doenças resultam de alterações na estrutura e/ou número dos cromossomas. O desenvolvimento das técnicas de bandeamento permitiu a identificação dos cromossomas assim como a sua análise. Apesar destes desenvolvimentos, ainda existiam limitações e foram criadas técnicas com resoluções superiores para as colmatar. Para tal, foram desenvolvidas técnicas citogenéticas moleculares que oferecem uma melhor resolução e a possibilidade de deteção de anomalias que antes não eram possíveis de detetar. Técnicas como a amplificação da sonda dependente da ligação multiplex (MLPA) que permite analisar até 50 sequências de DNA numa única reação e detetar variações no número de cópias (CNVs) de genes específicos, sendo por isso de interesse para detetar síndromes causadas por CNVs. A síndrome de Williams-Beuren (WBS) é uma dessas síndromes. É causada por uma microdeleção no braço longo do cromossoma 7 em 7q11.23. Os pacientes são afetados por um fenótipo muito característico que envolve dismorfia facial, atraso mental, malformação cardíaca congénita e um perfil psicológico específico. Ao longo deste estágio foi possível adquirir competências experimentais em técnicas de citogenética convencional e molecular através da observação e prática das mesmas. Foram tratadas mais de 400 amostras de sangue periférico e analisadas 25 amostras de sangue e duas de líquido amniótico com vista a obtenção do cariótipo. Alguns casos de interesse incluem, uma síndrome de Edwards, uma síndrome de Klinefelter, uma translocação Robertsoniana, uma inversão pericêntrica do cromossoma 1 e uma trissomia do cromossoma 16 em mosaico de baixa expressão que tinha sido detetada por aCGH. Foi implementada uma nova análise com a técnica de MLPA e o painel P029 B1-0315, assim como um novo software de análise (Coffalyser.Net) que mostrou excelentes resultados. Com esta análise foi possível caracterizar pacientes com WBS, oferecendo um teste genético rápido para confirmação da suspeita clínica assim como uma técnica mais simples para detetar a extensão de duplicações da região 7q11.23.
Due to the discovery of the number of human chromosomes as well as obtaining better chromosome preparations, it became possible for clinical cytogenetics to evolve, especially when it was found that changes in structure and/or number of chromosomes could cause diseases. The banding techniques allowed the identification and analyses of chromosomes. Despite these advancements there were limitations to the older techniques and new techniques were created with increased resolution to overtake those limitations. Molecular cytogenetic techniques were developed, allowing superior resolutions and the ability to detect anomalies that were previously undetectable. One of these techniques is called multiplex ligationdependent probe amplification (MLPA). This technique allows the analysis of up to 50 DNA sequences in a single reaction and can detect copy number variations (CNVs) of specific genes. This technique is especially useful for detection of syndromes caused by CNVs. Williams-Beuren syndrome (WBS) is one of those syndromes. It is caused by a microdeletion in the long arm of the chromosome 7, in 7q11.23. WBS patients have a very characteristic phenotype which includes facial dysmorphism, mental retardation, congenital heart defects and a specific psychological profile. During this MSc internship, experience in conventional and molecular cytogenetic techniques was acquired through observation and practice. There were more than 400 samples of blood treated and there were 27 samples of blood and amniotic fluid analyzed, in order to obtain their karyotype. The most interesting cases studied include, Edwards syndrome, Klinefelter syndrome, a Robertsonian translocation, a pericentric inversion in chromosome 1 and a low expression mosaic chromosome 16 trisomy that was detected by aCGH. A new analysis with the MLPA technique was implemented, panel P029 B1-0315, as well as a new analysis software (Coffalyser.Net), which showed excellent results. This analysis allowed the distinction of WBS patients from normal individuals, offering a quick genetic test to confirm the clinical suspicion of WBS and is a simpler technique to determine the extension of duplications in the 7q11.23 region.