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Дисертації з теми "Mitochondries humaines"
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Jeandard, Damien. "Import d'ARN dans les mitochondries de cellules humaines : identification à grande échelle et applications thérapeutiques." Thesis, Strasbourg, 2019. http://www.theses.fr/2019STRAJ005.
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Les mutations dans le génome mitochondrial humain sont souvent associées à de graves maladies neuromusculaires. Mon projet de thèse a consisté tout d’abord au développement d’une stratégie thérapeutique basée sur l’import mitochondrial de molécules d’ARN. J’ai pu démontrer que l’expression stable de molécules d’ARN recombinantes dans les cellules humaines permet de diminuer le taux de mutations pathogéniques de l’ADN mitochondrial. Dans une seconde partie, j’ai élaboré une nouvelle méthode, CoLoC-seq, permettant l’identification à grande échelle des ARN localisés dans les mitochondries. En appliquant cette méthode sur des cellules humaines, j’ai pu confirmer l’adressage mitochondrial de certains ARN cytosoliques non-codant et identifier de nouveaux ARN potentiellement importés. Ces données permettront d’élargir les connaissances sur les voies d’adressage mitochondrial des ARN, leurs mécanismes et leur régulation, et d’optimiser les stratégies thérapeutiques basées sur l’import d’ARNMutations in the human mitochondrial genome are often associated with severe neuromuscular disorders. The first part of my thesis project consisted in the development of a therapeutic strategy based on the mitochondrial import of RNA molecules. I demonstrated that the stable expression of recombinant RNA molecules in human cells induced the decrease of the pathogenic mutation load in mitochondrial DNA. In the second part, I developed a nex method, CoLoC-seq, for the large-scale identification of RNA species localized in the mitochondria. By applying this method to human cells, I confirmed the mitochondrial targeting of some non-coding cytosolic RNAs and identified new potentially imported RNAs. These data will broaden the knowledge on the pathway of RNA targeting into the mitochondria, its mechanisms and regulation, and will allow optimization of the therapeutic strategies based on RNA import
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Jugé, Romain. "Étude de la dynamique mitochondriale dans des cellules cutanées humaines : Mise en place de modèles pour des applications en cosmétologie." Thesis, Lyon, 2016. http://www.theses.fr/2016LYSEN007.
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La peau est un épithélium spécialisé vital et fragile, qui évolue avec l’âge et est influencé par l’environnement, notamment les radiations solaires. Des données sont disponibles sur la réponse du réseau mitochondrial et le devenir des mitochondries endommagées en réponse à des stress chimiques et environnementaux dans plusieurs systèmes expérimentaux, mais ces processus restent peu étudiés dans les cellules cutanées. Dans ce contexte, le projet de thèse visait à analyser l’effet (i) de l’irradiation UVB sur la dynamique mitochondriale (en particulier la fragmentation des mitochondries) dans des kératinocytes primaires humains normaux, qui constituent la première ligne de défense contre les agressions externes ; (ii) d’un traitement par des poisons mitochondriaux sur les mitochondries contenues dans des kératinocytes ou des fibroblastes primaires humains normaux. Dans un premier axe de la thèse, nous avons mis au point une méthode originale (Mitoshape) basée sur l’imagerie confocale, permettant d’estimer à la fois qualitativement et quantitativement la morphologie du réseau mitochondrial dans des cellules vivantes après irradiation UVB. Grâce à cette technologie, nous avons pu montrer que les UVB induisaient une fragmentation du réseau mitochondrial dans les kératinocytes primaires, dont nous avons étudié les acteurs biochimiques. Dans un deuxième axe, nous avons montré que les poisons mitochondriaux avaient la capacité d’endommager les mitochondries dans des kératinocytes et des fibroblastes humains primaires et induisaient une autophagie générale sans toutefois exclure la présence d’une mitophagie dépendante de la voie PINK1/PARKIN. Outre son intérêt fondamental, ce travail (réalisé en collaboration avec la société de cosmétologie SILAB dans le cadre d’un partenariat industriel CIFRE) ouvre la voie à l’identification d’actifs naturels capables de préserver et/ou restaurer les paramètres fonctionnels mitochondriaux suite à des stressThe skin is a specialized type of epithelium, both vital and fragile, which evolves with age and is continuously exposed to environmental stresses, such as solar radiations. While data is available about the response of the mitochondrial network and the fate of damaged mitochondria after chemical or environmental stresses in numerous experimental systems, little is known about these processes in skin cells. The aim of the present thesis was to study the impact (i) of UVB irradiation on mitochondrial dynamics (especially mitochondrial fragmentation) in normal human epidermal keratinocytes, which represent the first line of defence against environmental insults; (ii) of poisoning mitochondria of keratinocytes and normal human fibroblasts with chemical drugs. In a first axis, we developed an original method (called Mitoshape) based on confocal microscopy, to estimate qualitatively and quantitatively the morphology of the mitochondrial network within live cells following UVB irradiation. Using this technology, we demonstrated that UVB irradiation induces mitochondrial fragmentation in normal human keratinocytes, and studied the biochemical actors involved in this response. In a second axis, we showed that the use of mitochondrial poisons could damage mitochondria of keratinocytes and normal human fibroblasts and induce bulk autophagy, although it is not possible to formally rule out the involvement of a PINK1/PARKIN-dependent pathway of mitophagy. In addition to its fundamental interest, this work (performed in collaboration with the cosmetic company SILAB in the context of a CIFRE PhD fellowship from ANRT) paves the way for the screening of novel bioactive agents able to protect and restore mitochondria following stresses
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Val, Romain. "Adressage d'ARN et manipulation génétique des mitochondries dans les cellules végétales et humaines." Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 2008. http://www.theses.fr/2008STR13109.
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La connaissance des mécanismes moléculaires qui contrôlent le système génétique des mitochondries reste très parcellaire. Ceci est largement dû à l'incapacité de manipuler leur génome avec les méthodologies conventionnelles. Nous développons une nouvelle approche basée sur l'import naturel des ARNt. Nous utilisons un mime d'ARNt comme navette pour importer dans les mitochondries des cellules végétales des séquences-passagères fixées en 5'. Après transcription dans le noyau, les ARN chimériques sont adressés aux mitochondries. L'import de séquences allant jusqu'à 154 nucléotides a été obtenu. Le processus suit la spécificité de l'import naturel des ARNt. Un trans-ribozyme à tête de marteau ciblé contre l'ARNm mitochondrial atp9 a été élaboré et importé dans les mitochondries grâce à ce système, entraînant ainsi le premier "knockdown" d'un ARN mitochondrial dans des cellules de plante. Le phénotype associé était un retard de croissance. L'analyse de la quantité d'une vingtaine d'ARNm a permis de démontrer une diminution de 70% de l'ARNm nucléaire de l'oxydase alternative 1 (aox-1) suite au knockdown de l'ARNm atp9, avec une forte chute de la protéine correspondante dans les mitochondries et une diminution de la consommation d'oxygène. Ces résultats mettent en évidence l'influence d'un événement mitochondrial sur l'expression d'un gène nucléaire, démontrant ainsi l'existence d'une régulation rétrograde. Dans une optique de thérapie génique, la transposition du système de navette a été tentée dans des cellules humaines. Tous les ARN chimériques élaborés étaient arrêtés dans l'espace intermembranaire des mitochondries. D'autres mimes d'ARNt devront donc être testésThe understanding of the molecular mechanisms which control the genetic system of mitochondria remains restricted. This is mainly due to the impossibility to manipulate their genome with conventional methods. We are developing an alternate approach based on the physiological mechanism of tRNA import. We use a tRNA mimic as a shuttle to import into mitochondria in plant cells passenger RNAs attached to its 5' end. Following nuclear transformation and transcription in the nucleus, the chimeric RNAs are targeted to mitochondria. So far, we obtained the import of passenger sequences up to 154 nucleotides in size into the mitochondria of transformed plant cells. The process follows the natural specificity of the tRNA import pathway. A trans-cleaving hammerhead ribozyme targeted to the mitochondrial atp9 mRNA was designed and imported into mitochondria as a passenger RNA attached to the tRNA mimic, yielding the first knockdown of a mitochondrial RNA in plant cells. The associated phenotype was a decrease in cell growth rate. The analysis of the level of about twenty mRNAs showed that the atp9 mRNA knockdown led to a 70% decrease of the nuclear-encoded alternative oxidase (aox-1) mRNA, with a strong drop in the amount of the corresponding protein in mitochondria and a decrease in the oxygen consumption. These results highlight the influence of a mitochondrial event on the expression of a nuclear gene, demonstrating the existence of a retrograde regulation. From a gene therapy point of view, we tried to transpose our shuttling system into human cells. All chimeric RNAs used were retained in the intermembrane space of the mitochondria. Thus, other tRNA mimics need to be tested
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Baleva, Mariia. "Etudes des mécanismes d'adressage d'ARN de transfert dans les mitochondries de levure et humaines." Thesis, Strasbourg, 2016. http://www.theses.fr/2016STRAJ096/document.
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Des mutations dans le génome mitochondrial donnent lieu à l’apparition de maladies neuro-dégénératives ou de myopathies. Pour développer des approches de thérapie génique pour prévenir de ces syndromes, nous devons mieux comprendre les mécanismes moléculaires d’import mitochondrial des ARN. Pour cela nous tentons de récapituler in vitro l’import des ARN à partir d’extraits cellulaires fractionnés par différentes méthodes telles que la chromatographie d’exclusion ou d’affinité à l’aide d’étiquettes d’ARN ou de protéines. Nos résultats affinent nos connaissances de ces mécanismes et permettent d’avancer l’idée que l’énolase, une enzyme de la glycolyse, n’agit pas seule lors de la première étape de l’import de l’ARNtLys avec anticodon CUU (tRK1). En effet nous avons montré que l’énolase ultra-purifiée ne se fixait plus à tRK1 in vitro, alors que des préparations de mitochondries de levure récapitulaient l’import lorsque diverses fractions ajoutées à l’énolase étaient testées. Les fractionnements d’extraits opérés permettent de cerner certaines protéines qui pourraient fonctionner de concert avec l’énolase pour véhiculer tRK1 vers la mitochondrieMutations in the mitochondrial genome give rise to neurodegenerative diseases or myopathies. To develop gene therapy for preventing the appearance of these syndromes, we need to better understand the molecular mechanisms of mitochondrial RNA. For this purpose we try to recapitulate in vitro the import of RNA from cell extracts fractionated by different methods such as exclusion or affinity chromatography using tagged RNAs or proteins. Our results refine our knowledge of these mechanisms and allow to advance the idea that enolase, an enzyme of glycolysis, does not act alone during the first stage of import of tRNALys with anticodon CUU (tRK1). Indeed, we have shown that ultra-purified enolase no longer binds to tRK1 in vitro, while preparations of yeast mitochondria recapitulate the import when various fractions mixed with enolase were tested. The performed extracts fractionation make it possible to point to certain proteins which could work in concert with the enolase to convey tRK1 to mitochondria
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Dovydenko, Ilya. "Mise au point d'aptamères aux capacités thérapeutiques basés sur les ARN importables dans les mitochondries humaines." Thesis, Strasbourg, 2015. http://www.theses.fr/2015STRAJ046/document.
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Les défauts de génome mitochondrial provoquent des maladies neuromusculaires, pour lequel aucun traitement efficace n'a été mis au point. La plupart des mutations mitochondriales sont hétéroplasmique, ce qui signifie que l'ADN mitochondrial (ADNmt) de type sauvage et muté coexistent dans la même cellule, et le changement de proportion entre deux types d'ADNmt pourrait rétablir les fonctions mitochondriales. Le but du projet était le développement du système pour cibler l'ARN thérapeutique dans les cellules humaines vivantes. Au cours de ma thèse j'ai synthétisé une série de nouveaux ARN anti-réplicatifs contenant modifications chimiques pour augmenter leur stabilité dans la cellule, et mis au point la nouvelle méthode de synthèse chimique des molécules d'ARN contenant cholestérol fixé par l'intermédiaire d'un pont biodégradable. Ces ARN étaient capable de pénétrer dans les cellules humains, d'être adressées dans les mitochondries et de diminuer la proportion d' ADNmt mutéDefects in mitochondrial genome cause neuromuscular diseases, for which no efficient therapy has been developed. Since most mitochondrial mutations are heteroplasmic, wild type and mutated mitochondrial DNA (mtDNA) coexist in the same cell, and the shift in proportion between two mtDNA types could restore mitochondrial functions. The aim of the project was development of carrier-free system for targeting the therapeutic mitochondrially importable RNA into living human cells. During my PhD study, I have synthesized a set of new anti-replicative RNAs containing various chemical modifications, aiming to increase their stability in the cell, and developed a new method for the chemical synthesis of RNA molecules containing cholesterol attached through a biodegradable bridge. Cholesterol containing antireplicative RNAs were characterised by efficient cellular uptake, partial colocalisation with mitochondria and ability to decrease the proportion of mutant mtDNA
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Comte, Caroline. "Caractérisation d’ARN artificiels importables dans les mitochondries humaines à des fins thérapeutiques." Strasbourg, 2010. https://publication-theses.unistra.fr/public/theses_doctorat/2010/COMTE_Caroline_2010.pdf.
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Les mutations dans l’ADN mitochondrial (ADNmt) sont la cause de nombreuses pathologies, pour la plupart des myopathies et des maladies neurodégénératives. La majorité de ces mutations sont hétéroplasmiques, signifiant que les molécules d’ADNmt muté coexistent au sein de la même cellule avec des molécules d’ADNmt sauvage. Ce n’est cependant en général qu’à partir d’un seuil d’hétéroplasmie de l’ordre de 70% que les symptômes de la maladie apparaissent. L'objectif de cette thèse a été de tester si le taux d’hétéroplasmie pouvait être diminué en adressant des oligonucléotides complémentaires à l’ADNmt muté dans les mitochondries par la voie d’import des ARN afin d’inhiber leur réplication. Pour ce faire, nous avons utilisé un petit ARN artificiel construit sur la base des déterminants d’importation de l’ARNt Lys CUU importé dans les mitochondries de levure. Les résultats obtenus ont permis de montrer que cet ARN pouvait servir de vecteur pour importer dans les mitochondries humaines les oligonucléotides au potentiel anti-réplicatif et que ces derniers étaient capables d’inhiber la réplication des molécules d’ADNmt muté sans affecter celles des molécules d’ADNmt sauvage. C’est la première fois que la validité de cette stratégie dite anti-génomique a pu être testée dans un modèle de cellules humaines en culture, ce qui pourrait aboutir à une alternative prometteuse pour traiter les maladies mitochondriales causées par des mutations dans l’ADNmtMitochondrial DNA mutations, important cause of incurable human neuromuscular diseases, are mostly heteroplasmic: mutated mtDNA is present in cells simultaneously with wild-type genomes, the pathogenic threshold being generally > 70% of mutant mtDNA. We studied if heteroplasmy level could be decreased by RNAs complementary to mutant mtDNA regions. To target specifically designed oligoribonucleotides into the organelle, mitochondrial import of RNA was exploited, the pathway delivering nucleic acids into mitochondria in vivo. Using mitochondrially targeted RNAs as mitochondrial vectors we demonstrated, in cultured transmitochondrial cybrid cells, that RNAs complementary to the mutant mtDNA region can specifically reduce the proportion of mtDNA bearing a large deletion associated with the Kearns Sayre Syndrome. These findings may be relevant to developing of a new tool for therapy of mtDNA associated diseases
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Buchet-Poyau, Karine. "Cellules humaines dépourvues d'ADN mitochondrial : métabolisme adaptatif et utilisation dans l'étude génétique des pathologies mitochondriales." Lyon 1, 1999. http://www.theses.fr/1999LYO10192.
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Dans les cellules eucaryotes aerobies, l'energie provient essentiellement de l'atp synthetise par les phosphorylations oxydatives (oxphos) au niveau de l'atpase-atpsynthetase f0-f1. L'atp est alors exporte hors des mitochondries par le translocateur des nucleotides adenyliques (ant). Certaines sous-unites des complexes oxphos sont codees par l'adn mitochondrial (adnmt), les autres par l'adn nucleaire et importees dans les mitochondries par un mecanisme faisant intervenir le potentiel de membrane mitochondrial (pmm) etabli par les oxphos. Nous avons verifie que 2 lignees de cellules rho o humaines sont totalement depourvues d'adnmt, d'arn et de proteines codees par l'adnmt. Par contre, elles importent normalement des proteines d'origine nucleaire dans leurs mitochondries. Comment un pmm suffisant pour cette importation peut s'etablir dans les rho o en l'absence des oxphos ? nous avons montre que les rho o, depourvues des 2 sous-unites du facteur f0 de l'atpase-atpsynthetase codees par l'adnmt, ont un f1 assemble et fonctionnel pour hydrolyser de l'atp. De plus, 2 inhibiteurs specifiques de f1 (aurovertine) ou de l'ant (acide bongkrekique) reduisent la croissance et le pmm des rho o. Ainsi, la survie des rho o necessite un pmm suffisant maintenu par l'importation d'atp 4 cytosolique dans la mitochondrie par l'ant qui l'echange contre de l'adp 3 mitochondrial produit par l'atpase-f1. Nous avons egalement utilise les rho o pour determiner l'origine genetique de pathologies dues a un deficit d'un complexe oxphos. Les cellules de 3 patients atteints du syndrome de leigh avec deficit en cytochrome oxydase (cox) ont ete enucleees et fusionnees avec les rho o. L'activite cox etant restauree dans les cybrides, le deficit est localise sur l'adn nucleaire des patients. Par contre, la fusion a ete inutilisable pour determiner l'origine d'un deficit en complexe iii. En effet, le deficit est rapidement perdu dans les lymphocytes en culture suggerant un defaut heteroplasmique de l'adnmt.
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Harmand, Pierre-Olivier. "Etude du processus apoptotique induit par l’acide ursolique sur deux lignées cellulaires humaines de la peau : les cellules HaCaT dérivées de kératinocytes humains, les cellules M4Beu issues d’un mélanome humain." Limoges, 2004. http://aurore.unilim.fr/theses/nxfile/default/55710612-66dd-441f-8201-7946125a0b6a/blobholder:0/2004LIMO330C.pdf.
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Nous avons étudié les effets anti-prolifératif et pro-apoptotique de l’acide ursolique (AU), triterpène contenu dans certains fruits et plantes, sur des lignées cellulaires de la peau : les cellules HaCaT immortalisées, dérivées de kératinocytes humains et les cellules M4Beu issues d’un mélanome humain métastasé. Nous avons mis en évidence l’effet anti-prolifératif dose et temps dépendants de l’AU sur les cellules HaCaT et M4Beu, et montré que cet effet était la conséquence d’un processus apoptotique. En effet, l’activité enzymatique de la caspase-3 est significativement augmentée. Sur les cellules M4Beu, nous avons montré que la voie mitochondriale était la voie de transduction conduisant à l’activation de la caspase-3. Nous avons mis en évidence l’activation de la caspase-9, la chute du potentiel transmembranaire mitochondrial, la libération du cytochrome c, l’augmentation de l’expression de p53, et l’augmentation du ratio Bax/Bcl-2. Sur les cellules HaCaT, l’AU induit à la fois un processus apoptotique et un blocage du cycle cellulaire par augmentation de l’expression de p21. La voie apoptotique impliquée dans cette lignée semble différente de celle mise en évidence dans les cellules M4Beu : si l’activation de la caspase-9 et la libération du cytochrome c ont été montrées dans les cellules HaCaT, la voie mitochondriale ne paraît pas prépondérante. La voie de transduction du signal apoptotique pourrait être la voie extrinsèque ou la voie du réticulum endoplasmique. Au regard des résultats et du fait de sa distribution dans le règne végétal, l’utilisation de l’AU pourrait être envisagé dans le traitement et/ou la prévention du mélanomeIn our study, we demonstrated anti-proliférative and pro-apoptotic effect of ursolic acid (UA), a pentacyclic triterpene acid, on skin cells : HaCaT derived keratinocyte cell line and on the M4Beu human melanoma cell line. Our results showed UA had a significant anti-proliferative effect on HaCaT and M4Beu cells, associated with the induction of an apoptotic process, characterized by caspase-3 activation. We demonstrated on M4Beu cells that UA-induced apoptosis was dependent upon the mitochondrial pathway, as shown by caspase-9 activation, by p53 and Bax increases, by transmembrane potential collapse, by cytochrome c leakage and by alteration of the Bax/Bcl-2 balance; with a concomitant increase in Bax expression and decrease in Bcl-2 expression. We demonstrated on HaCaT cells that UA decreased the viability of HaCat cells in a concentration- and time-dependent manner. UA induces apoptotic process and blocked cell cycle predominantly in G1 phase, by p21 increases. To define the apoptotic process, we demonstrated caspase-9 and -3 activation. Moreover, we also showed that UA induced cytochrome c leakage with a slight drop of ΔΨm. But we did not show neither an increasing of p53 and Bax nor an alteration of the Bax/Bcl-2 balance. The apoptotic pathway seems different of this demonstrated for M4Beu cell lines. The mitochondrial pathway does not seem predominant. The apoptotic signal transduction pathway could be extrinsic pathway or endoplasmic reticulum pathway. With our results and with the fact of his distribution in vegetal reign, the utilization of UA could be to consider in treatment and/or prevention against melanoma
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Tonin, Yann. "Développement d'une stratégie thérapeutique anti-réplicative via l'exploitation de la voie d'import des ARN dans les mitochondries humaines." Thesis, Strasbourg, 2013. http://www.theses.fr/2013STRAJ093/document.
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Les mitochondries sont impliquées dans de nombreuses voies métaboliques, et des mutations au sein de leur génome (ADNmt) conduisent à l’apparition de nombreuses pathologies. A l’heure actuelle, il n’existe aucun traitement contre ces affections mais différentes pistes thérapeutiques sont envisagées. L’objectif de ce travail a consisté en la mise au point d’une telle stratégie, dite anti-réplicative via l’exploitation de la voie d’import naturelle des ARN dans les mitochondries. De petits ARN artificiels importables dans les mitochondries humaines ont ainsi été utilisés comme vecteurs pour y importer une séquence capable de s’hybrider spécifiquement à l’ADNmt mutant et d’en stopper sa réplication. Les résultats obtenus ont permis de prouver la validité de cette stratégie vis-à-vis d’une large délétion et de mutations ponctuelles liées à divers cas pathologiques et de caractériser l’effet de modifications chimiques sur la stabilité, l’import et l’efficacité de ces ARN recombinantsMitochondria are involved in many metabolic pathways, and mutations in their genome (mtDNA) can cause a wide range of human disorders. No efficient treatment against these pathologies is currently available. The objective of this work consisted in the development of a therapeutic approach, called anti-replicative, based on the use of the natural pathway of RNA import into mitochondria. Small artificial RNA molecules able to be imported into human mitochondria have been used as vectors to address oligoribonucleotides capable to hybridize specifically to mutant mtDNA and to stop its replication. The effect of various chemical modifications on the stability, import and efficiency of these recombinant RNA has been characterized. All the data obtained prove the validity of the anti-replicative strategy for mtDNA containing a large deletion or pathogenic point mutations and can be considered as an important step to further develop an efficient therapy of mitochondrial diseases
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Sordet, Olivier. "Relations différenciation /apoptose dans les cellules leucémiques humaines." Dijon, 2001. http://www.theses.fr/2001DIJOMU12.
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Le traitement des leucémies aiguês fait appel, non seulement aux agents cytotoxiques qui induisent la mort des cellules leucémiques, le plus souvent par apoptose, mais aussi aux agents différenciants, c'est-à-dire capables de restaurer la capacité de différenciation des cellules tumorales. Ces deux approches thérapeutiques peuvent être utilisées simultanément. Dans une première partie, nous avons étudié les relations entre l'induction de la différenciation monocytaire/macrophagique des cellules leucémiques humaines U937 par les esters de phorbol et la réponse apoptotique aux agents cytotoxiques. Nous avons montré que la différenciation inhibait l'apoptose induite par divers médicamentsanticancéreux (étoposide, vinblastine) sans pour autant altérer les étapes mitochondriales et post-mitochondriales des voies de signalisation de la mort cellulaire. Ces observations nous ont conduit à montrer que les cellules différenciées restent au moins aussi sensibles que les cellules non différenciées à l'induction de l'apopotose par des agents ciblant directement la mitochondrie comme la lonidamide et le trioxide d'arsenic. Les molécules impliquées dans la mort cellulaire jouent probablement un rôle dans d'autres voies du métabolisme cellulaire. C'est ainsi que les caspases semblent jouer un rôle dans le contrôle de la prolifération des lymphocytes T et dans la différenciation des cellules de la lentille, des kératinocytes et des érythrocytes. Dans une seconde partie, nous nous sommes intéressés aux relations entre le processus de différenciation des cellules hématopoîétiques et les molécules impliquées dans la mort cellulaire. Ceci nous a conduit à 3 observations : (1) la répartition subcellulaire des procaspases varie au cours de la différenciation m macrophagique des cellules U937; (2) les caspases sont activées au cours de la différenciation des cellules leucémiques. Cette activation est transitoire et probablemnet contrôlée par la relocalisation de la protéine anti-apoptotique c-IAP1, tandis que Bcl-2 mainyient l'activité caspases et bloque la différenciation ; (3) il existe une balance entre activation des caspases et métabolismes oxydatif au cours de la différenciation.
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Chicherin, Ivan. "Adressage de l'ARN ribosomique 5S dans les mitochondries humaines et la traduction mitochondriale." Thesis, Strasbourg, 2016. http://www.theses.fr/2016STRAJ074/document.
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L’ARNr 5S est une petite molécule d'ARN codée par le noyau, qui est partiellement adressée dans les mitochondries dans les cellules humaines. Bien que le mécanisme d'importation a été étudié, la fonction de ce phénomène est mal comprise. Les données publiées suggèrent que l’ARNr 5S importé pourrait participer à la synthèse des protéines mitochondriales, éventuellement être associé aux mitoribosomes. Cependant, les études structurelles ne supportent pas ces observations. Pour comprendre le rôle de l’ARNr 5S dans les mitochondries humaines, nous avons exploité plusieurs approches. Nous avons montré que seule une petite fraction de l’ARNr 5S pourrait être associé à mitoribosomes humaines, insuffisante pour former un complexe stoechiométrique 1:1. Nous avons appliqué l’approche de chromatographie d'affinité à l’ARN MS2 pour identifier les partenaires protéiques de l’ARNr 5S importé. Les résultats suggèrent que l’ARNr 5S pourrait être associé à des protéines ribosomales et des facteurs mitochondriaux d'assemblage du ribosome mitochondrial. Cela nous a permis de formuler une hypothèse sur la participation de l'ARNr 5S dans la biogenèse mitoribosomale. Ces données ont été partiellement validées par des expériences de co-immunoprécipitation, bien que plusieurs expériences sont encore nécessaires pour valider la participation ARNr 5S dans cette voie5S rRNA is a small nuclear-encoded RNA molecule, which is partially imported into mitochondria from cytoplasm in human cells. Although the import mechanism was studied in details, the functional significance of this phenomenon is poorly understood. Published data suggest that imported 5S rRNA might participate in mitochondrial protein synthesis, possibly associating with mitoribosomes. However, structural studies do not support these observations. We have exploited several approaches to figure out the function of 5S rRNA in human mitochondria. Our studies showed that only a minor part of 5S rRNA pool could be associated with human mitoribosomes, insufficient to form stoichiometric 1:1 complex. We applied MS2 affinity chromatography approach to identify protein partners of 5S rRNA in human mitochondria. The results suggested that 5S rRNA could associate with mitochondrial ribosomal proteins and mitochondrial ribosome assembly factors. This allowed us to formulate a hypothesis about possible participation of 5S rRNA in mitoribosome biogenesis. The data were partially validated by co-immunoprecipitation experiments, although subsequent studies are required to validate 5S rRNA involvement in this pathway
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Millet, Girard Anne. "Apoptose de cellules cancéreuses coliques humaines traitées par un générateur de monoxyde d'azote." Dijon, 2006. http://www.theses.fr/2006DIJOMU10.
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Il a été observé dans notre laboratoire que la production de monoxyde d’azote (NO) par des cellules tumorales chez le rat est corrélée à l’apoptose de ces mêmes cellules. Afin de comprendre les mécanismes moléculaires de l’apoptose induite par le NO, nous avons étudié in vitro les effets d’un générateurs de NO, le glyceryltrinitrate (GTN) sur des lignées de cellules cancéreuses coliques humaines. Nos résultats montrent que le GTN induit une mort par apoptose des cellules cancéreuses coliques fonction de la dose de GTN et du temps de traitement. L’apoptose induite par le GNT implique les caspases et plus particulièrement les caspases-1 et -10, ainsi que la mitochondrie. Dans notre modèle, l’activation de la caspase-3 est limitée et plus tardive. Les récepteurs de mort ne sont pas impliqués dans la mort cellulaire induite par le GTN, mais le GTN sensibilise les cellules cancéreuses coliques à l’apoptose induite par un agoniste du récepteur Fas. Cet effet du GTN est en corrélation avec une augmentation de l’expression du récepteur Fas et une diminution de l’expression de plusieurs protéines de la famille Inhibitor of Apoptosis Protein. Ces résultats suggèrent que les donneurs de NO pourraient être une alternative dans le traitement du cancer du côlon, seuls ou en association à une chimiothérapie classiqueIt was observed in our laboratory that the production of nitric oxide (NO) by tumour cells in rats is correlated with their apoptosis. The present study was designed to explore the influence of an endogenous NO donor, glyceryltrinitrate (GTN) on the cell death pathways in colon cancer cells. GTN induces a dose- and a time-dependent cell apoptosis in colon cancer cells. This cell death pathway involves the mitochondria and caspases, mainly caspase-1 and -10. In contrast, caspase-3 activation is a late and limited event. Death receptors are not involved in GTN-mediated cell death, while GTN induces a Fas ligand (FasL)-independent plasma membrane Fas aggregation and sensitises tumour cells to FasL-induced apoptosis. This permissive effect correlates with an increased expression of Fas receptor and a decreased expression of several endogenous inhibitors of apoptosis (IAPs). Our results suggest that NO-donating drugs could have a beneficial effects in the treatment of colon cancer when used alone or in combination with chemotherapy
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Deffieu, Maïka Shérone. "La dégradation sélective des mitochondries par autophagie : de la levure Saccharomyces cerevisiae aux cellules humaines." Bordeaux 2, 2007. http://www.theses.fr/2007BOR21489.
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L'autophagie est un processus de dégradation des constituants cytoplasmiques et des organelles. Cette voie est induite dans des conditions de carence azotée. Nous avons récemment montré l'existence d'une dégradation sélective des mitochondries par autophagie, chez la levure Saccharomyces cerevisiae nommée : mitophagie sélective. Au cours de cette thèse, nous avons voulu identifier les signaux capables d'induire la mitophagie sélective dans la levure Saccharomyces cerevisiae. Nous nous sommes donc intéressés aux signaux morphologiques et fonctionnels pouvant intervenir dans le provcessus de dégradation sélective des mitochondries. Nous avons analysé les mutants du mécanisme de fission mitochondriale au cours de la carence azotée. Parallèlement à ces études, nous avons voulu déterminer le rôle des "espèces activées de l'oxygène" dans la régulation de la mitophagie sélective. Pour cela, nous avons cherché à moduler le processus mitophagique, induit par la carence azotée. Puis, nous avons voulu déterminer si une altération de la chaîne respiratoire mitochondriale dans des conditions de croissance, pouvait induire la mitophagie sélective. Dans la deuxième partie de notre étude, nous avons recherché le rôle physiologique de la mitophagie sélective au cours de la croissance cellulaire. Nous avons donc observé le comportement du mutant (delta)uth1, déficient dans ce processus. Dans la dernière partie, nous avons voulu déterminer la présence de la mitophagie sélective dans les cellules HeLa. Les cellules ont donc été observées au cours de la carence azotée. Nous avons étudié les conséquences de l'effet d'une altération mitochondriale sur la séquestration des mitochondriesAutophagy is a pathway that degrades cytoplasmic components and organelles. It is induced by nutrient starvation. We have recently evidenced the presence of a selective process of autophagic mitochondrial degradation in yeast Saccharomyces cerevisiae named the selective mitophagy. During this work, we aimed to determine the signals that induce selective mitophagy in the yeast Saccharaomyces cerevisiae. Thus, we have investigated morphological and functional signals that could regulate this process. First, we have abalysed mutants of mitochondrial fission during nitrogen starvation. Second we have observed the role of "reactive oxygen species" on the regulation of the selective degradation of mitochondria by autophagy. For this, we have tried to modulate the mitophagic process during nitrogen starvation. Moreover, we have tried to determine if a mitochondrial alteration could induce selective mitophagy. In the second part of this study, we have investigated the physiological role of selective mitophagy during cell growth. For this we have studied the (delta)uth1 mutant which is deficient in this process. In the third part, we evidenced the presence of a selective degradation of mitochondria by autophagy in human cells (HeLa). We have observed these cells during nutrient starvation. Alternatively, we have observed the effects of a mitochondrial alteration on the sequestration of mitochondria
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Dubot, Audrey. "Étude des déficiences en cytochrome c oxydase et en ATPase-ATPsynthétase dans des pathologies mitochondriales humaines et chez le nématode C. Elegans." Lyon 1, 2003. http://www.theses.fr/2003LYO10215.
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Les pathologies mitochondriales dues à un défaut dans la synthèse d'ATP causé par une déficience d'une enzyme des OXPHOS peuvent avoir de graves manifestations pouvant aller jusqu'à une mort précoce. Tout d'abord, nous avons étudié le complexe IV (COX) dont le déficit est surtout dû à des mutations de SURF1. Diverses analyses réalisées sur des cellules de patients mutés pour ce gène se sont avérées très utiles pour la mise en place de diagnostics pré et post-natals pour le Syndrome de Leigh, mais aussi pour mieux comprendre l'assemblage de la COX. Un modèle C. Elegans de ces déficiences à été réalisé en inhibant par RNAi l'expression de protéines constitutives ou d'assemblage de l'enzyme. Il ne reste plus maintenant qu'à mettre en place un test pharmacologique à haut débit sur ces animaux. D'autre part, l'étude d'un patient portant le codon d'initiation GUG pour la traduction de la sous-unité 6 du complexe V apporte de nouveaux éléments sur le mécanisme traductionnel mitochondrial
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Rageul, Julie. "Rôles d'ERCC1, une protéine clé de la réparation de l'ADN, dans la progression du cycle cellulaire et la survie des cellules humaines, tumorales ou non." Rennes 1, 2011. http://www.theses.fr/2011REN1B081.
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ERCC1-XPF (Excision Repair Cross Complementing gene 1/Xeroderma Pigmentosum group F) est une endonucléase hétérodimérique impliquée dans différents systèmes de réparation de l’ADN. Les phénotypes de déficience en ERCC1 suggèrent que cette protéine pourrait avoir un rôle supplémentaire dans la régulation de la progression du cycle cellulaire. Afin de tester cette hypothèse dans des lignées cellulaires humaines tumorales ou non, nous avons invalidé ERCC1 par ARN interférence (ERCC1KD). Nos résultats montrent que les cellules ERCC1KD deviennent multinucléées, que ce soit dans des cellules saines ou tumorales, hépatiques ou non. Ces cellules multinucléées accumulent les noyaux suite à des mitoses anormales se terminant par une cytocinèse défectueuse. De plus, lorsque les anomalies mitotiques sont trop drastiques, les cellules ERCC1KD meurent en mitose, ce qui est fortement évocateur d’une catastrophe mitotique. De façon originale, les cellules déficientes en XPF n’ont pas ce phénotype, suggérant pour la première fois qu’ERCC1 puisse avoir un nouveau rôle indépendamment de son activité de réparation de l’ADN. De plus, nous apportons des arguments suggérant que ce nouveau rôle d’ERCC1 impliquerait potentiellement la régulation de la balance oxydant/antioxydant et qu’il pourrait être en lien avec la mitochondrie. Ce nouveau rôle d’ERCC1 serait crucial pour le développement, la croissance, la prolifération et la survie cellulaire. Enfin, il paraît envisageable qu’ERCC1 puisse devenir une nouvelle cible thérapeutique prometteuse pour le traitement des cancersERCC1-XPF (Excision Repair Cross Complementing gene 1/Xeroderma Pigmentosum group F) is a heterodimeric endonuclease involved in many DNA repair systems. Phenotypes of ERCC1 deficiency in diverse organisms suggest that this protein may have an additional role in the regulation of cell cycle progression. To evaluate this hypothesis in human tumoral and non-tumoral cell lines, we knocked-down ERCC1 by RNA interference (ERCC1KD). Our results have shown that ERCC1KD cells become multinucleated, not only in tumoral cells but also in non-tumoral cells and regardless of tissue type. These multinucleated cells accumulate nuclei through abnormal mitoses ending by a defective cytokinesis. In addition, when mitotic abnormalities are too drastic, ERCC1KD cells die in mitosis, and this is highly reminiscent of mitotic catastrophe. In an original way, cells knocked-down for XPF do not share this phenotype of multinucleation, suggesting for the first time that ERCC1 could bear a new role, independently of its known DNA repair activity. Furthermore, we have provided evidence suggesting that this new role of ERCC1 could potentially involve the oxidant/antioxidant balance and could be linked to a mitochondrial function. This ERCC1 new role may be crucial for development, growth, proliferation and cell survival. Finally, it may be conceivable that ERCC1 might become a new promising therapeutic target for cancer treatment
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Leger, Thibault. "Influence de l'acide eicosapentaénoïque sur l'activité cardiaque et sa modulation par le stress oxydant - Perspectives pour l'obésité et l'endocardite aigüe humaines." Thesis, Université Clermont Auvergne (2017-2020), 2019. http://www.theses.fr/2019CLFAS012.
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Les maladies cardiovasculaires constituent la première cause de mortalité dans le monde. De nombreuses situations conduisent à une insuffisance cardiaque généralement associée à une altération mitochondriale. Le stress oxydant est un acteur majeur favorisant ces dysfonctionnements. Les acides gras polyinsaturés de la famille 3 et, en particulier l’EPA, ont été souvent associés à des effets cardio-protecteurs. Cependant, dans certains cas, l’impact engendré était délétère. L’hypothèse qui a porté cette thèse soutient que l’EPA devient nocif dans les situations où le stress oxydant est trop intense : l’association avec un agent antioxydant adapté permettrait de maintenir les propriétés cardioprotectrices. Divers modèles de situations pathologiques, d’un stress oxydant faible vers une situation où il est sévère et chronique, ont été étudiés. L’EPA a montré des effets bénéfiques pour le cœur en modulant le collagène, la réactivité coronaire, la fonction mitochondriale, le statut oxydant, l’inflammation, le métabolisme énergétique, l’homéostasie calcique et le profil lipidique. Cependant, dans le cas d’un stress oxydant intense et chronique modélisé par un diabète sucré associé à un régime obésogène, l’EPA a entraîné un accroissement radical de la mortalité. Cet effet a été contrecarré par un enrichissement en extrait de thé vert grâce aux propriétés anti oxydantes et hypolipémiantes de ce dernier. L’association de l’EPA à un agent antioxydant adapté à la situation et administré à doses adéquates est indispensable dans les situations où le stress oxydant est suffisamment sévère pour induire une peroxydation lipidique. L’impact bénéfique de l’EPA est lié à des acteurs mitochondriaux tels que la SOD2, l’UCP3 et la Sirt3. Les observations récoltées au cours de ces travaux nous incitent à étudier la fonction mitochondriale chez l’Homme afin de déterminer si l’effet cardioprotecteur de l’EPA combiné à un antioxydant est maintenu. Cette thèse décrit également une méthode fiable pour extraire des mitochondries cardiaques humaines à partir de rejections atriales obtenues lors de circulations extracorporelles. Des analyses omiques sur le plasma permettraient également de découvrir des biomarqueurs du fonctionnement mitochondrial permettant la mise en lumière d’altérations éventuelles survenant en amont du développement de l’insuffisance cardiaque et l’adaptation précoce d’un traitement adéquatCardiovascular disease is the leading cause of death in the world. Many situations trigger heart failure which is usually associated with mitochondrial dysfunction. Oxidative stress is a major contributor to these dysfunctions. Polyunsaturated fatty acids of the 3 family, in particular EPA, have often been associated with cardioprotective effects, but in some cases their impact is deleterious. The hypothesis behind this thesis is that EPA becomes harmful in situations in which the oxidative stress is too high: an appropriate combination with an antioxidant would maintain the cardio-protective properties. Several models of pathological situations characterized by a low or severe and chronic oxidative stress were studied. EPA displays beneficial effects on the heart by modulating collagen, coronary reactivity, mitochondrial function, oxidative status, inflammation, energy metabolism, calcium homeostasis and lipid profile. However, in case of a high and chronic oxidative stress triggered by diabetes mellitus and an obesogenic diet, EPA results in a dramatic increase in animal mortality. This effect is countered by enriching the diet with green tea extract thanks to the antioxidant and lipid-lowering properties of this last. The combination of EPA with an antioxidant adapted to the situation and administered in adequate doses is essential when the oxidative stress is severe enough to induce lipid peroxidation. The beneficial impact of EPA is related to mitochondrial actors such as SOD2, UCP3 and Sirt3. The findings obtained in these animal studies need to be verified in humans to determine whether the cardioprotective effect of EPA combined with an antioxidant is maintained. This thesis also describes a reliable method allowing the extraction of human cardiac mitochondria from atrial rejection obtained during extracorporeal circulation. Omic studies on the plasma would also allow the discovery of new biomarkers of mitochondrial function permitting clinicians to highlight possible dysfunctions prior to onset of the heart failure and to adapt a precocious treatment to the particular patient situation
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Conjard, Agnès. "Effets de l'insuffisance rénale et d'une myopathie mitochondriale sur les activités enzymatiques du métabolisme énergétique dans les fibres musculaires uniques humaines." Lyon 1, 1995. http://www.theses.fr/1995LYO1T126.
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Safiedeen, Zainab. "Rôle de l'interaction entre le réticulum endoplasmique et les mitochondries dans la dysfonction endothéliale induite par des microparticules humaines." Thesis, Angers, 2016. http://www.theses.fr/2016ANGE0063/document.
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Le syndrome métabolique est constitué d'une constellation d'anomalies métaboliques telles que l'obésité centrale, une altération de la glycémie à jeun, une hypertriglycéridémie, un faible taux de cholestérol HDL et de l'hypertension artérielle. Les maladies cardiovasculaires caractérisées par une dysfonction endothéliale sont le résultat clinique primaire du syndrome métabolique. De plus, les microparticules (MP), de petites vésicules membranaires libérées de la membrane plasmique des cellules activées et / ou apoptotiques ont été décrites comme étant impliquées dans la pathogenèse du syndrome métabolique car elles induisent une dysfonction endothéliale par la diminution du monoxyde d’azote (NO). D'autre part, des MPs générées à partir de cellules T apoptotiques sont capables induire une dysfonction endothéliale par la diminution de la production de NO. Cependant, les mécanismes par lesquels les MPs humaines induisent cette dysfonction endothéliale ne sont pas complétement élucidés. Ainsi, l'objectif de cette étude est d'étudier les mécanismes par lesquels les MPs humaines induisent une dysfonction endothélialeMetabolic syndrome (MetS) consists of a constellation of metabolic abnormalities such as central obesity, impaired fasting glucose, hypertriglyceridemia, low HDL cholesterol and hypertension. Cardiovascular diseases are the primary clinical outcome of MetS whereas endothelial dysfunction represents a primary disturbance in cardiovascular events. Recently, it has been shown that microparticles (MPs), small membrane vesicles released from the plasma membrane of activated and/or apoptotic cells, are involved in the pathogenesis of MetS by inducing endothelial dysfunction through the decrease of nitric oxide (NO) production. Also, MPs from apoptotic T cells induce endothelial dysfunction by decreasing NO production. However, the mechanism through which this endothelial dysfunction takes place is not completely elucidated. Thus, the objective of this study is to study the mechanisms through which human MPs induce endothelial dysfunction
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Fischer, Barbara. "Etude de la signalisation cellulaire de l'apoptose induite par différents types de rayonnements ionisants dans des cellules lymphoblastoi͏̈des humaines différant par leur statut P53." Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 2004. https://publication-theses.unistra.fr/public/theses_doctorat/2004/FISCHER_Barbara_2004.pdf.
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Sourdeval, Matthieu. "Etude des mécanismes de l'apoptose (anoikis) induite par les moutardes sur les cellules respiratoires humaines en culture et recherche d'agents protecteurs." Paris 7, 2006. http://www.theses.fr/2006PA077165.
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L'ypérite et la méchloréthamine, induisent la mort des cellules des voies respiratoires par apoptose suite au détachement des cellules, ou anoïkis. Les événements précoces générant le détachement comprennent l'altération mitochondriale, l'activation de la caspase-2, l'altération des microfilaments et des protéines d'adhérence. Dans les cellules détachées, l'apoptose fait intervenir les caspases, la mitochondrie et p53. A partir des voies de signalisation mises en évidence, des protecteurs ont été identifiés, inhibiteurs des altérations mitochondriales : ebselen, mélatonine et cyclosporine A. Ils offrent une grande efficacité de protection, en réduisant le détachement et l'apoptose. Nous avons aussi analysé l'effet protecteur de la doxycycline, anti-protéase. Son efficacité de protection est limitée par sa toxicité propre. Cependant, sa capacité d'inhiber la prolifération cellulaire et d'induire une apoptose dépendante de la mitochondrie, pourrait représenter une avancée en chimiothérapieYperite and mechlorethamine induce cell death in airway cells by apoptosis related to cell detachment, or anoikis. Preliminary processes generating detachment included mitochondria alteration, activation of caspase-2, disruption of microfilaments network and reorganization of adhesion membrane proteins. After detachment, the apoptotic process involved the implication of caspases, mitochondria and p53. According to these signaling pathways, we identified protectors, inhibitors of mitochondrial alteration: ebselen, melatonin and cyclosporin A. They exerted a protective effect in decreasing both cell detachment and cell death and provided maintain of microfilaments and adhesion proteins, thus contributing to the cell survey. A protective effect of doxycyclin, an anti-protease, was also revealed, but limited since it interfered with its own toxicity. However, doxycyclin induces cell proliferation inhibition and mitochondrial-dependent apoptosis, representing new insight in cancer therapy
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Gouget, Karine. "Etude du complexe II de la chaîne respiratoire de la levure Saccharomyces cerevisiae et du nematode Caenorhabditis elegans : étude des pathologies humaines affectant le complexe II." Paris 11, 2005. http://www.theses.fr/2005PA112295.
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Les causes génétiques des déficits du complexe II (CII) de la chaîne respiratoire (SDH ou SQR) sont encore mal compris. En plus de l’identification de nouvelles mutations chez les patients, deux modèles animaux, S. Cerevisiae et C. Elegans, seront utilisés. Chez S. Cerevisiae, l’absence de chaque gène de SDH engendre l’incapacité à respirer. Le test de complémentation fonctionnelle d’une souche délétée pour SDH1 par le gène HsSDHA ne restaure pas le métabolisme respiratoire. De nouveaux gènes impliqués dans le fonctionnement du CII sont cherchés par tests d’activité enzymatique ou de résistance aux inhibiteurs du complexe II sur mutants. Chez C. Elegans, l’inactivation de chaque gène montre un phénotype embryonnaire létal ou un retard de développement. Le profil biochimique de ces mutants transitoires prouve la relation entre inactivation des gènes sdh-2, sdh-3 /mev-1 et sdh-4, et diminution d’activité enzymatique du CII. Trois gènes étaient initialement suspectés pour coder la sous-unité SDH-1 : seuls deux gènes coderaient en réalité pour cette sous-unité (sdh-1 et sdh-5). Le profil d’expression de SDH-1::GFP semble toxique à haute dose mais montre une spécificité d’expression tissulaire. Au vu de ces résultats et dans le but d’élaborer notre test de complémentation par des allèles HsSDHA, un mutant de délétion pour sdh-1 a été obtenu et est en cours d’étude : il montre un phénotype létal. Enfin, le séquençage des 4 gènes de structure de la SDH pour 18 patients ne montre pas de mutation. Pour deux de ces enfants, une région d’haplo-identité en 12p13, susceptible de contenir le gène de la maladie, a été trouvée et quelques gènes candidats ont été séquencés et exclusMutations causing respiratory chain complex II (CII) deficiency are still partly unknown. This work focuses on the identification of novel mutations or genes implicated in CII deficiency in the yeast S. Cerevisiae, the worm C. Elegans, or human patients. In S. Cerevisiae, absence of SDH genes leads to respiration incapacity. Functional complementation by the human gene SDHA in a deleted yeast strain does not save the respiratory phenotype. Enzymatic activity or CII inhibitors resistance assays are investigated among S. Cerevisiae CII mutants, in order to identify novel genes linked to CII function. In C. Elegans, RNAi of each SDH putative gene leads to embryonic lethality or delay in development. CII activity measurement on these worms shows that sdh-2, sdh-3 /mev-1 and sdh-4 are really CII genes. Three genes are supposed to encode subunit SDH-1 but we functionally demonstrated that only sdh-1 and sdh-5 code for this subunit. SDH-1::GFP construct seems to by toxic when overexpressed in wild type worms, but harbours a specific spatio-temporal expression pattern. A sdh-1 deletion strain has been investigated: the deletion, clearly identified, is homozygous lethal. Such a strain can now be transfected by sdh-1 or human SDHA in order to perform functional complementation in the nematode. In human, a cohort of 18 patients showing CII disorders has also been sequenced for the 4 SDH encoding genes, and no mutation has been found. Two sisters of this cohort have been further investigated: a region of 5 Mb in 12p13 contain the gene causing the CII deficiency. Some genes in this region have been sequenced and exhibit no mutation till now
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Kolesnikova, Olga. "Importation mitochondriale d'ARN de transfert : Etude du mécanisme de transport chez la levure et application à la thérapie génique de maladies neuromusculaires humaines." Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 2002. http://www.theses.fr/2002STR13074.
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Chez la levure S. Cerevisiae, un seul ARNt codé par l'ADN nucléaire, l'ARNtLysCUU (tRK1), est partiellement importé dans la mitochondrie, le deuxième isoaccepteur de lysine (tRK2) étant localisé uniquement dans le cytosol. Après être aminoacylé par la lysyl-ARNt synthétase cytoplasmique, tRK1 est importée sous forme d'un complexe avec le précurseur de la lysyl-ARNt synthétase mitochondriale. Nous avons construit des transcrits d'ARNt contenant pour partie des séquences de tRK1 et pour partie des séquences de tRK2, ainsi que des transcrits avec des mutations dans l'anticodon. Le résidu C34 s'est révélé être un déterminant positif d'import. Certaines versions mutées étaient importées sous forme misacylée. Ceci nous a permis d'étudier si l'ARNt importé était fonctionnel dans la traduction mitochondriale. In vitro, nous avons trouvé que tRK1CAU était importée étant méthionylé. Après import de l'ARNt chargé par la [35S]-méthionine, nous avons observé l'incorporation de la méthionine marquée dans les produits de traduction mitochondriale. In vivo, nous avons développé un test de suppression d'une mutation Ala->ambre dans le gène COX2 mitochondrial. Nous avons démontré que le phénotype de déficience respiratoire était supprimé par l'expression dans le noyau d'un ARNt suppresseur importable. Nous avons exploité ces données pour développer un système artificiel d'importation d'ARNt dans cellules humaines. Un tel système permettrait d'utiliser la thérapie génique des maladies mitochondriales résultant de mutations dans l'ADN mitochondrial. Nous avons démontré que les mitochondries humaines étaient capables d'importer tRK1 et plusieurs de ses formes mutées in vitro et in vivo. Nous avons ensuite exprimé des versions importables de tRK1/2 dans les cellules cybrides contenant une mutation dans le gène de l'ARNtLys mitochondrial causant le syndrome MERRF. Nous avons observé que les cellules exprimant ces transgènes avaient partiellement récupéré leur capacité respiratoireIn the yeast S. Cerevisiae, a single nuclear-coded tRNA, tRNALysCUU (tRK1), is partially imported in the mitochondria, while the other lysine isoacceptor is restricted to the cytosolic (tRK2) compartment. To be imported, tRK1 must be aminoacylated by the cytoplasmic lysyl-tRNA synthetase and to interact with the precursor mitochondrial lysyl-tRNA synthetase. We constructed chimaeric tRNA transcripts containing in part sequences of tRK1 and in part sequences of tRK2, and tRK1 transcripts containing all possible one-base replacements in the anticodon. We found that the position C34 was a positive import determinant. Some mutant versions were imported in misacylated form. This was exploited to address the question of the functionality of the imported tRNA in mitochondrial translation. In vitro, we used the fact that the version tRK1CAU was imported in its methionylated form. After import of [35S]-methionine charged tRNA, we observed that the labeled amino acid was incorporated into mitochondrial translation products. In vivo, we developped a suppression assay in a strain bearing an Ala-to-amber mutation in the mitochondrial COX2 gene. The respiratory deficient phenotype could be suppressed by expression in the nucleus of an importable suppressor tRNA. We exploited these data to develop an artificial tRNA import system in human cells. Indeed, such a system could allow the use of gene therapy to cure mitochondrial diseases resulting from mutations in mitochondrial genes. We demonstrated that human mitochondria internalize tRK1 and several of its mutant versions in vitro and in vivo. We next used cybrid cell lines bearing mutation A8344G in the tRNALys gene (causing the MERRF syndrome). These cybrid lines are known to be respiratory deficient. Importable tRK versions were expressed in these cells and the clones expressing the transgenic tRNAs above a certain threshold level were shown to have partially recovered from their respiratory defect
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Habersetzer, Johan. "Formes supramoléculaires de la F1FO ATP synthase et morphologie mitochondriale : de la levure Saccharomyces cerevisiae aux cellules humaines." Thesis, Bordeaux 2, 2011. http://www.theses.fr/2011BOR21887/document.
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La F1 Fo ATP synthase est un complexe enzymatique localisé au sein de la membrane interne mitochondriale qui utilise le gradient électrochimique en protons formé par la chaîne respiratoire pour synthétiser de l'ATP à partir d'ADP et de Pi. Cette enzyme conservée de la levure S. cerevisiae aux cellules de mammifères s'organise dans les membranes internes mitochondriales sous forme de structures supramoléculaires d'ATP synthases. Chez la levure, il est aujourd'hui parfaitement identifiée que cette organisation nécessite la présence de deux sous-unités accessoires de l'enzyme : les sous-unités e et g.Les travaux présentés dans ce manuscrit visaient à étudier l'implication des sous-unités e et g dans les mécanismes de dimérisation et d'oligomérisation des ATP synthases ainsi que dans la morphogénèse des crêtes mitochondriales chez la levure S. cerevisiae et dans les cellules humaines en culture.Chez la levure, l'étude réalisée nous a permis de déterminer la stœchiométrie des sous-unités e et g, élément indispensable à la modélisation de l'agencement des sous-unités membranaires de l'enzyme dans la membrane interne mitochondriale.Dans les cellules humaines en culture, nous avons pu établir que les sous-unités e et g participent à la stabilité des dimères d'ATP synthases. Cependant l'implication de ces sous-unités dans la stabilité de l'enzyme semble différente des observations effectuées dans les cellules de levureThe F1Fo ATP synthase is an enzymatic complex embedded in the inner mitochondrial membrane which use the electrochemical proton gradient generated by the phosphorylation oxydative pathway to synthesize ATP from ADP and inorganic phosphate. This enzyme is conserved from yeast to mammalian cells and displays supramolecular organization in the inner mitochondrial membrane. In yeast, it is actually well-known that the supramolecular assembly required two accessory subunits : e and g subunits.The present work was realized to understand the involvement of subunits e and g in dimerization and oligomerization of mitochondrial ATP synthases as well as their effect on mitochondrial inner membrane morphogenesis in yeast S. cerevisiae and human cultured cells.In yeast, this study led us to determine subunits e and g stoechiometry, which was cruelly missing to establish a model of the ATP synthases membranous subunits layout in the inner mitochondrial membrane.In human cells, we have demonstrated that subunits e and g are implicated in ATP synthase dimer stabilization. However, their involvement in this stabilization seems to be quietly different of what have been observed in yeast cells
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Shebanov, Nikita. "Pathogenic mutations of the mitochondrial protein ND5 : the development of novel gene therapy strategies." Electronic Thesis or Diss., Strasbourg, 2024. http://www.theses.fr/2024STRAJ095.
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Les cellules humaines contiennent multiples copies d'ADNmt, qui code 37 gènes. L'ADNmt est sujet à des mutations qui peuvent conduire à des maladies affectant gravement les tissus ayant des besoins énergétiques élevés. Nous nous sommes concentrés sur deux mutations pathogènes du gène MT-ND5, 13513G>A et 13514A>G, qui altèrent Asp393, un résidu essentiel à la translocation des protons lors de la synthèse de l'ATP. Notre objectif était d'évaluer si la technologie CRISPR/Cas12a peut être appliquée à l'ADNmt humain. Nous avons démontré que les crRNA chimiquement modifiés améliorent la spécificité de Cas12a à des concentrations physiologiques de Mg²⁺. L'activité spécifique des éditeurs de bases mitochondriales fusionnés à AsCas12a ciblant les gènes ND4 et ND5 de l'ADNmt a été démontrée à la fois in vitro et, pour la première fois, dans les mitochondries de cellules HEK293 en culture. Nous avons également démontré que Cas12a et crRNA fusionnés étaient importés dans des mitochondries isolées, montrant le potentiel de la technologie crosslink pour améliorer l'adressage mitochondriale de crRNAHuman cells contain multiple copies of mtDNA, which encodes 37 genes. mtDNA is prone to mutations that can lead to diseases severely affecting tissues with high energy demands. We focused on two pathogenic mutations in the MT-ND5 gene,13513G>A and 13514A>G, that alter Asp393, a residue critical for proton translocation during ATP synthesis. Our aim was to evaluate whether CRISPR/Cas12a technology can be applied to human mtDNA. We demonstrated that chemically modified crRNAs improve the specificity of the Cas12a system under physiological levels of Mg²⁺. The specific activity of AsCas12a-fused mitochondrial base editors targeting the ND4 and ND5 genes of mtDNA was shown both in vitro and, for the first time, in the mitochondria of cultured HEK293 cells. We also demonstrated that crosslinked Cas12a and crRNA were imported into isolated mitochondria, showing the potential of crosslink technology in enhancing crRNA mitochondrial delivery
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Smirnov, Alexandre. "Investigation of the mechanism of 5S rRNA import into human mitochondria." Strasbourg, 2010. http://www.theses.fr/2010STRA6042.
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Le phénomène de l'import d' ARN cytosoliques dans les mitochondries est très répandu chez les Eucaryotes. Les cellules humaines n'en font pas l'exception car la présence de l'ARNr 5S importé dans les mitochondries des mammifères a été démontrée sans ambiguité. Même si un effort considérable a été fait pour déchiffrer le mécanisme et révéler la signification de ce processus, les connaissances dans ce domaine restent préliminaires. Les objectifs suivants ont été formulés pour mes travaux de thèse : (i) identifier les signaux de localisation mitochondriale de l'ARNr 5S; (ii)mettre en évidence les facteurs protéiques impliqués dans le processus de transport de cet ARN vers la surface mitochondriale (iii) étudier le fonctionnement de ce véhicule moléculaire ; (iv) investiguer le rôle éventuel de l'ARNr importé dans la traduction mitochondriale. Nous avons pu démontrer que l'ARNr 5S humain possède deux déterminants d'import mitochondrial localisés dans les domaines α et β, le domaine β étant sans importance. Ce fait nous a permis d'utiliser la voie d'import de l'ARNr 5S pour délivrer des séquences ARN hétérologues dans les mitochondries des cellules humaines. Nous avons ensuite trouvé que le véhicule minimal pour adresser l'ARNr 5S vers les mitochondries est constitué de deux protéines - la rhodanèse et la pré-MRP-L18, qui agissent en chaîne. Les deux protéines assurent la capture efficace de cet ARN cytosolique et le redirigent vers les mitochondries, en utilisant des effets chaperon réciproques. Finalement, nous avons démontré pour la première fois que l'ARNr 5S est impliqué dans la traduction mitochondriale, probablement étant un composant de mitoribosomes des mammifères.
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Ndozangue-Touriguine, Olivia. "Mécanisme moléculaires de l'acquisition d'une résistance à l'apoptose induite par TRAIL et à l'anoïkis par des cellules humaines coliques métastatiques." Paris 7, 2008. http://www.theses.fr/2008PA077083.
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L'apoptose est un processus essentiel participant au développement et à l'homéostasie des organismes multicellulaires. Une résistance acquise à l'apoptose est une caractéristique de presque tous les cancers et cette résistance augmente au fur et à mesure de la progression tumorale et de la formation de métastases. La plupart des agents anti-cancéreux agissent en induisant l'apoptose dans les cellules tumorales. Leur efficacité est donc en partie tributaire des voies de signalisation apoptotique. Ainsi, l'insensibilité à l'apoptose peut être la cause de l'échec de thérapies anti-tumorales. L'objectif de notre travail a été d'identifier les mécanismes moléculaires de résistance acquise à l'apoptose induite par TRAIL et à l'anoïkis, une forme physiologique d'apoptose qui survient normalement lorsqu'une cellule se détache de son tissu d'origine perdant tout contact avec la matrice extracellulaire. Nos résultats indiquent que les cellules SW620 ont développé une double résistance afin d'échapper à l'apoptose induite par TRAIL : un blocage mitochondrial qui empêche la perméabilisation de la membrane externe mitochondriale et suite à une conversion en cellules de type I, une augmentation de l'expression de XIAP qui au niveau du cytosol inhibe la maturation de la caspase-3 et donc bloque la voie de signalisation apoptotique de type I. Les mécanismes de résistance à l'anoïkis des cellules SW620 sont différents et semblent impliquer des tyrosine phosphorylations de la protéine transmembranaire CDCP1 par une ou des kinases de la famille SrcApoptosis is an essential process involved in thé development and homeostasis of multicellular organisms. Acquired résistance to apoptosis is a hallmark of almost ail cancers and this résistance increases during tumor progression and metastasis formation. Most anticancer agents act by inducing apoptosis of tumor cells. Therefore, their efficiency relies in part on intact cell death signaling pathways. Thus, an insensitivity to apoptosis can underly antitumor therapies failure. Using a pair of isogenic colon carcinoma cells, SW480 and SW620, issued respectively from the primary tumor and a lymph node metastasis, we aimed at identifying thé molecular mechanisms responsible for thé acquired résistance of metastatic cells to TRAIL-induced apoptosis and to anoïkis, a physiologically relevant form of apoptosis that occurs when normal cells loose contact with the extracellular matrix. Our results indicate that SW620 cells have developed a dual résistance to TRAIL-induced apoptosis: a block at the level of the mitochondria and, after a conversion to a type I pathway, an increased expression of XIAP which inhibits this pathway. The mechanisms implicated in anoïkis résistance are different and seems to give a crucial role to tyrosine phosphorylation of the transmembrane protein CDCP1 by Src family kinase
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Schwenzer, Hagen. "Aminoacyl-ARNt synthétases mitochondriales humaines : aspects fondamentaux et contribution à la compréhension de pathologies reliées." Thesis, Strasbourg, 2013. http://www.theses.fr/2013STRAJ045/document.
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Les aminoacyl-ARNt synthetases (aaRS) sont impliquées dans le mécanismes de la traduction. Dans les cellules humaines, il existe deux jeux de gènes nucléaires codant pour les aaRS : un pour les aaRS cytosolique (cyt), le second pour les aaRS mitochondriales (mt). Les aaRS mt sont traduites dans le cytosole, adressées et importées dans la mitochondrie.Mutations dans 9 gènes d’aaRS mt ont été démontrées comme responsables de pathologies mitochondriales. Certaines des mutations n’affectent pas la propriété originelle d’aminoacylation. Il a été proposé que certaines de ces mutations puissent affecter des propriétés alternatives.Alors l’organisation des aaRS cyt est bien étudiée et que des implications dans des fonctions alternatives établies pour certaines d’entre elles, les connaissances quant aux aaRS mt restent parcimonieuses. L’objectif principal de ce manuscrit de thèse est: (i) révéler d’organisation sous-mt de l’AspRS mt; (ii) étendre l’analyse de l’organisation sous-mt à l’ensemble des aaRS mt; et (iii) contribuer à la compréhension de mécanismes moléculaires sous-jacents à certaines pathologies. Ces travaux ouvrent la porte vers d’autres investigations de l’organisation des aaRS à l’intérieur de la mitochondrie. Ces contributions seront utiles à la meilleure compréhension de mécanismes moléculaires sous-jacents à pathologies mitochondrialesAminoacyl-tRNA synthetases (aaRSs) are housekeeping enzymes involved in translation. In human cells, 2 different sets of nuclear genes code for aaRSs. One codes for cytosolic (cyt) aaRSs, and the second one codes for aaRSs of mitochondrial (mt) location. Mt-aaRSs are translated in the cytosol, targeted and imported into mitochondria.Mutations in 9 mt-aaRSs have been described. Some of the mutations do not display significant influence on the housekeeping aminoacylation activity. It has been proposed that those mutations affect alternative functions.Alternate functions have been described for cyt-aaRSs. While the organization of cyt-aaRSs is explored and their involvement into alternate functions established, the properties of the human mt-aaRSs remain unknown. On one site, this thesis integrate mt-AspRS into new functional networks (sub-mitochondrial localization and partnership). On the other site, it expand the view of the sub-mitochondrial organization to the full set of mt-aaRSs and should ultimately shed light into the molecular mechanisms underlying some of the pathologies. These results open the door for additional investigations to gain a complete view about the sub-mitochondrial organization of aaRSs. Those contributions will be of help for the understanding of molecular mechanisms underlying some mitochondrial disorders
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Roussi, Stamatiki. "Etude de la signalisation cellulaire de l'apoptose induite par le 7β-hydroxysitosterol et le 7β-hydroxycholesterol dans les cellules cancéreuses coliques humaines". Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 2006. https://publication-theses.unistra.fr/public/theses_doctorat/2006/ROUSSI_Stamatiki_2006.pdf.
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Il est reconnu que la consommation des légumes peut contribuer à la diminution de risque du développement du cancer colorectal. Les hydroxyphytostérols sont issus de végétaux et ils ont des similitudes structurales avec les oxydes du cholestérol. Des formes oxydées du cholestérol et des phytostérols sont présentes dans l’alimentation et pourraient avoir des conséquences physiopathologiques encore mal connues. Le 7-OHsitostérol (7-OHsito) et le 7-OHcholestérol (7-OHchol) sont les oxydes les plus répandus. Ce travail de thèse a consisté à comparer l'activité de ces deux molécules sur les mécanismes impliqués dans la régulation de la croissance des cellules cancéreuses coliques humaines, Caco-2. Les cellules Caco-2 ne présentent pas la même sensibilité pour les deux hydroxystérols. Nous observons 50% d'inhibition de croissance à 60 µM pour le 7-OHsito et à 30 µM pour le 7-OHchol. Ils induisent l’apoptose en perturbant les membranes mitochondriales et lysosomiales. Le 7-OHsito déclenche une apoptose caspases-dépendante alors que le 7-OHchol active une apoptose caspases-indépendante associée à une production du stress oxydatif. Les deux processus sont indépendants de l’expression des protéines Bcl-2 et Bax. Nous avons également étudié l’impact de ces molécules sur le métabolisme des polyamines qui est fortement activé au cours de la cancérogenèse colique. Les enzymes de la biosynthèse des polyamines sont inhibées alors que le catabolisme est activé par les deux hydroxystérols. Seule la perturbation du métabolisme des polyamines provoquée par le 7-OHchol pourrait être liée à l’apoptose. La perturbation du métabolisme par le 7-OHsito pourrait être associée à l’apoptose sans l’influencer. Les deux hydroxystérols inhibent la croissance des cellules Caco-2 via l'activation de voies apoptotiques différentes malgré leur similitude structurale. Les différences dans les mécanismes d’action des deux hydroxystérols pourraient être liées à leur degré d’hydrophobicitéToday, it is well recognized that consumption of fruits and vegetables may contribute to the reduction of colon carcinogenesis. The phytosterols oxides are present in plants and they present structural similarities with cholesterol oxides. Cholesterol and phytosterols oxides have unknown physiopathologic properties. The 7-hydroxysitosterol (7-OHsito) and the 7-hydroxycholesterol (7-OHchol) are the most widespread oxides. Our study was aimed to compare the biological activity of both compounds on the mechanisms involved in the regulation of human colon cancer cell death. Our results have shown that the colon cancer Caco-2 cells did not exhibit the same sensibility towards hydroxysterols. In fact, we observed a 50% growth inhibition in the presence of 7-OHsito at 60µM and 7-OHchol at 30µM. Loss of mitochondrial membrane potential and lysosomal membrane integrity were observed in the presence of both compounds. The 7-OHsito induced a caspase-dependent apoptosis whereas, the 7-OHchol induced a caspase-independent apoptosis associated with oxidative stress production. All processes were independent of Bcl-2 and Bax protein expression. We also studied the impact of both compounds on polyamine metabolism which is highly activated during colon carcinogenesis. Our data showed that two key enzymes involved in polyamine biosynthesis are inhibited, whereas polyamine catabolism was enhanced by both hydroxysterols. These data indicate that polyamine metabolic perturbations triggered only by 7-OHchol are related to apoptotic cell death. In return, polyamine metabolism perturbations induced by 7-OHsito seem to be associated to apoptosis initiation of apoptosis without affecting it directly. In conclusion, both hydroxysterols inhibit the growth of human colon cancer cells (Caco-2) via different apoptotic pathways in spite of their structural similarities. The two hydroxysterols exhibit different lipophilic properties which may explain their different biological effects
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Simon-Lombes, Anne. "Investigations moleculaires des maladies mitochondriales humaines." Paris 5, 1997. http://www.theses.fr/1997PA05N003.
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Bidère, Nicolas. "Inter-relations entre les facteurs issus des lysosomes et des mitochondries au cours de la mort caspase-indépendante des lymphocytes T humaines activés : rôles de la cathepsine D et du granzyme B." Paris 11, 2004. http://www.theses.fr/2004PA11T001.
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Guais, Adeline. "Caractérisation d'une nouvelle protéine humaine, Goliath." Paris 12, 2003. https://athena.u-pec.fr/primo-explore/search?query=any,exact,990003949010204611&vid=upec.
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Cette thèse a consisté à caractériser Goliath, un nouveau gène homologue au gène Goliath de la drosophile, impliqué dans le développement. Dans l’introduction, sont présentés les travaux qui ont permis d’obtenir le clone Goliath dans le cadre du Projet Génome Humain. Puis les stratégies utilisées dans le post-génome pour la caractérisation de clones inconnus sont détaillées. La première partie des résultats est consacrée à la caractérisation de l’expression de Goliath dans les cellules sanguines et le testicule. Dans ces deux systèmes, nous avons caractérisé l’expression de la protéine, sa maturation et sa sensibilité à la LH. La deuxième partie est consacrée l’analyse fonctionnelle de Goliath. Nous avons recherché les partenaires de cette protéine par la technique de double-hybride. Nous réalisons actuellement l’extinction Goliath en utilisant la technique d’interférence ARN. La conclusion de cette thèse résume les données actuelles et hypothèses fonctionnelles sur GoliathThis thesis consists in the characterisation of Goliath, a new gene homologous to the Drosophila Goliath gene, implicated in development. In the introduction part, the work that allowed our lab to obtain the Goliath clone in the frame of the human genome project is described. Then, the strategies in use in the post-genome to characterize unknown clones are detailed. The first part of the results is dedicated to the study of Goliath expression in two systems : blood cells and testis. In this part, we established the cellular expression of the protein, its maturation and LH dependant regulation of its expression in rat testis. The second part of this thesis is dedicated to a functional analysis of Goliath. We looked for Goliath protein partner using the two-hyhrid method. We are doing the extinction of Goliath using the RNA interference technique. The conclusion summarizes all the data and functional hypotesis on the Goliath protein
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Guais, Adeline Guellaën Georges. "Caractérisation d'une nouvelle protéine humaine, Goliath." Créteil : Université de Paris-Val-de-Marne, 2007. http://doxa.scd.univ-paris12.fr:80/theses/th0394901.pdf.
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Kerbrat, Stéphane. "L’exposition à la fumée de cigarette induit la sénescence des lymphocytes T CD4+ Th17 humains." Thesis, Paris Est, 2016. http://www.theses.fr/2016PESC1017/document.
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Le tabagisme aggrave de nombreuses maladies inflammatoires chroniques (BPCO, maladie de Crohn, arthrite rhumatoïde, psoriasis) associées à la sous-population de lymphocytes T CD4+ (LT CD4+) inflammatoires sécrétant l’IL-17 (Th17). Le tabagisme est associé à une augmentation en nombre et en proportion, du nombre de Th17 systémiques et pulmonaires, contrastant avec la rareté habituelle de ces cellules dans les tissus périphériques-sites d’inflammation. Le tabagisme est associé à l’augmentation de la sénescence des cellules pulmonaires récemment impliquée dans la pathogénèse de la BPCO. Les mécanismes responsables de l’augmentation des Th17 chez les fumeurs sont encore inconnus, et le rôle potentiel de la sénescence dans cette augmentation et la modification des fonctions des Th17 n’a jamais été exploré.Dans ce travail, nous avons fait l’hypothèse que les Th17 présentent une susceptibilité augmentée à la sénescence induite par l’exposition à la fumée de cigarette, en comparaison des autres sous-populations de LT CD4+, qui serait responsable de l’augmentation des Th17, et contribuerait à l’aggravation de leur potentiel inflammatoire. Nous avons analysé la susceptibilité des Th17 à la sénescence induite par l’exposition au condensat de FC (CFC), et le rôle de la voie de signalisation ERK1/2 dans ce phénomène. Nous avons également analysé le rôle des espèces réactives de l’oxygène (ERO), impliquées, d’une part dans la régulation de l’activation de ERK1/2, et d’autre part dans la sénescence cellulaire.Des lymphocytes T CD4+ CCR6+ Th17 et T CD4+ CCR6- quiescents de donneurs sains ont été exposés in vitro au CFC. La production d’ERO est mesurée en analysant l’oxydation de la sonde H2DCF-DA (cytométrie de flux). La sénescence est évaluée en analysant l’expression de p16INK4a (ImmunoFluorescence). L’analyse de l’expression des cytokines (Luminex/CBA) évalue le potentiel inflammatoire des cellules.Nos résultats montrent que les LT CD4+ Th17 quiescents exposés au CFC présentent une augmentation de différents marqueurs de sénescence : activité -galactosidase, expression des inhibiteurs du cycle cellulaire p16INK4a et ATF3. L’exposition au CFC modifie le profil sécrétoire des Th17 quiescents et induit leur sécrétion d’IL-8. Nous montrons que la voie des MAPKs ERK1/2 est impliquée dans l’induction du phénotype sénescent des Th17 en réponse à une exposition au CFC. La sur-expression de p16INK4a est associée à une activation et une translocation nucléaire de ERK1/2 plus importante dans les Th17. Le traitement antioxydant par la NAC, diminue l’expression des ERO et de p16INK4a induite par l’exposition au CFC dans toutes les sous-populations de LT CD4+, mais maintient la production d’ERO et l’expression de p16INK4a plus importantes dans les Th17 en comparaison des autres sous-populations de LT CD4+. Le traitement par l’inhibiteur du complexe III de la chaîne respiratoire mitochondriale, l’antimycine, maintient la production d’ERO plus importante dans les Th17, mais l’expression de p16INK4a est diminuée à des niveaux comparables dans tous les LT CD4+. En revanche, le traitement par l’agent découplant, le FCCP, diminue l’expression de p16INK4a et la production d’ERO à des niveaux comparables dans tous les LT CD4+, et abroge les différences de production d’ERO entre les Th17 et les T CD4+ CCR6-.Nous montrons que les lymphocytes Th17 humains présentent une susceptibilité plus importante à la sénescence induite par l’exposition au CFC en comparaison des autres sous-populations de LT CD4+. Nos résultats suggèrent que l’activité mitochondriale basale plus importante dans les Th17, est responsable de la plus grande susceptibilité des Th17 à la sénescence après exposition au CFC. Enfin, nous montrons pour la première fois qu’un découplage modéré de la chaîne respiratoire mitochondriale est une solution efficace pour prévenir la sénescence des Th17 et pourrait être une stratégie anti-inflammatoire dans les maladies chroniques associées aux Th17Smoking worsens chronic inflammatory diseases (COPD, Crohn disease, rheumatoid arthritis, psoriasis) associated with inflammatory CD4+ IL-17 secreting lymphocytes (Th17). Smoking is associated with an absolute number and proportion increase, at both systemic and pulmonary levels, of Th17 cells. This increase of Th17 cells in smokers contrasts with their usual rarity in peripheral tissues and inflammatory sites. Most of the knowledge about the effects of cigarette smoke exposure comes from COPD studies, and, in COPD increased senescence of pulmonary cells has been associated to the pathogenesis of the disease. The mechanisms responsible for the increase of Th17 cells are still unknown, and the potential role of senescence in this increase and functional modifications of Th17 in smokers has never been explored.In this study, we hypothesized that Th17 present a higher susceptibility to cigarette smoke-induced senescence, as compared to other CD4+ T lymphocytes subsets, which could be responsible for the increased number and proportion of Th17 in smokers, and the higher inflammatory potential of these cells. We analyzed senescence susceptibility of Th17 exposed to cigarette smoke condensate (CSC), and the potential role of ERK1/2 signaling pathway in this phenomenon. We also analyzed the potential role of reactive oxygen species (ROS) known to be implicated, on one hand in ERK1/2 activation, and on another hand in cellular senescence.Quiescent CCR6+ Th17 and CCR6- CD4+ T lymphocytes of healthy donors are exposed in vitro to cigarette smoke extract (CSE). ROS production is measured by H2DCF-DA oxidation (flow cytometry). Senescence is evaluated by p16INK4a expression (ImmunoFluorescence). Expression of relevant cytokines (Luminex/CBA) evaluated inflammatory potential.Our results show that quiescent CD4+ Th17 exposed to CSE present an increase of senescence markers: -galactosidase activity and expression of cell cycle inhibitors p16INK4a and ATF3. Moreover, CSE exposure modifies Th17 secretion pattern and increases IL-8 secretion. Our results also show that ERK1/2 MAPK pathway is implicated in Th17 senescent phenotype induction upon CSE exposure. The overexpression of p16INK4a is associated with a higher activation and a nuclear translocation of ERK1/2 in Th17 cells. Treatment with the anti-oxidant NAC reduces CSE-induced ROS and p16INK4a expression in all CD4+ T cell subsets, but the higher production of ROS and higher p16INK4a expression in Th17 as compared to other CD4+ T cells are maintained. Treatment with mitochondrial complex III inhibitor, antimycine, maintains the higher production of ROS in Th17 as compared to other CD4+ T lymphocytes, whereas p16INK4a expression is reduced to the same level in all subsets. Conversely, treatment with the mitochondrial decoupling agent, FCCP, reduces p16INK4a expression to the same level in Th17 as in other CD4+ T cell subsets, and abrogates the difference of ROS production between Th17 compared to CCR6- CD4+ T lymphocytes.We show that human Th17 lymphocytes present a higher senescence susceptibility to CSE exposure as compared to other CD4+ T lymphocytes sub-populations. Moreover, our results suggest that a higher mitochondrial activity in Th17 in steady state is responsible for the Th17 higher senescence susceptibility upon CSC exposure. Finally, we show for the first time, that mild mitochondrial respiratory chain uncoupling is an effective solution to prevent Th17 senescent phenotype and could represent an anti-inflammatory strategy in Th17-associated chronic inflammatory diseases
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DEGOUL, FRANCOISE. "Mutations de l'adn mitochondrial dans differentes myopathies humaines." Clermont-Ferrand 2, 1991. http://www.theses.fr/1991CLF21276.
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L'adn mitochondrial (adn mt) code pour des proteines de la chaine respiratoire et de l'atp synthetase. Nous avons retrouve des deletions heteroplasmiques de l'adn mt dans les tissus de patients atteints de myopathies oculaires et des mutations ponctuelles de l'adn mt dans les tissus de patients atteints de syndrome de merrf et de melas. Les deletions sont differentes d'un individu a l'autre (3 a 8,5 kb) et sont identiques dans les tissus d'un meme individu mais la quantite de molecules anormales est variable d'un tissu a l'autre. Elles amputent plusieurs genes codant pour les sous-unites des complexes i, iii, iv, et v et plusieurs genes d'arnt. Plus la quantite de genome mute est importante plus le deficit biochimique est detectable. Le mecanisme implique dans la formation des deletions demeure inconnu pourtant la presence de sequences repetees dans les 3/4 des cas suggere des mecanismes de recombinaison apres appariements de sequences homologues. Les mutations ponctuelles a la position 8344 et 3243 sont specifiques respectivement du syndrome de merrf et du syndrome de melas. Elles se situent dans les genes d'arn de transfert de la lysine au niveau de la boucle t pseudouridine c (8344) et de la leucine au niveau de la boucle dihydouracile (3243). Elles sont heteroplasmiques et se retrouvent a des taux variables suivants les tissus. Les mutations ponctuelles sont transmises selon les lois de l'heredite maternelle. Pour les deletions ce schema n'est pas retrouve: certains cas sont sporadiques, d'autres sont familiaux montrant une heredite autosomale dominante ce qui suggere l'intervention d'une proteine nucleaire dans le processus de formation des deletions
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De, Taffin de Tilques Maxence. "Utilisation du modèle levure pour la recherche de voies thérapeutiques contre le syndrome de Barth." Thesis, Bordeaux, 2017. http://www.theses.fr/2017BORD0876/document.
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Les cardiolipines (CL) sont des phospholipides possédant de nombreux rôles dans la structure et le fonctionnement des mitochondries. Elles sont, par exemple, impliquées dans la stabilisation des complexes des oxydations phosphorylantes, la fusion/fission des membranes mitochondriales, l’import de protéines mitochondriales, la biogénèse des centres fer-soufre (Fe-S), l’apoptose, la protection des mitochondries contre le stress oxydatif…L’ensemble de ces fonctions nécessitent que les chaînes d’acides gras de la CL soient majoritairement insaturées. Le maintien de cette composition en chaînes insaturées requiert une activité acyltransférase portée par la protéine tafazzine, qui est codée par le gène nucléaire TAZ. Des mutations dans ce gène sont la cause du syndrome de Barth (BTHS), qui se caractérise notamment par des myopathies cardiaques et squelettiques, une neutropénie (responsable de nombreuses infections) et des défauts de la chaîne respiratoire. Malgré des progrès considérables dans la compréhension des mécanismes conduisant à la pathogénicité, il n’existe toujours aucune thérapie pour traiter cette maladie. Nous avons donc utilisé la levure Saccharomyces cerevisiae, chez qui la voie de remodelage des CL par la tafazzine est bien conservée, pour modéliser le BTHS et, ainsi non seulement étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents de cette maladie, mais aussi identifier différentes voies thérapeutiques potentielles (suppresseurs génétiques et molécules pharmacologiques). Nous avons tout d’abord construit une levure délétée pour le gène orthologue TAZ (TAZ1 chez la levure), la souche Δtaz1. En accord avec des études précédentes, la souche Δtaz1 présente une diminution quantitative de la CL accompagnée d’un changement qualitatif des chaînes d’acides gras1,2 (plus d’acides gras saturés et moins d’insaturés). Nous montrons aussi que cette levure mutante a un défaut de croissance en milieu respiratoire à température élevée (36°C) ainsi que des défauts dans plusieurs composants impliqués dans les oxydations phosphorylantes2. De façon intéressante, alors que le défaut primaire (diminution des CL et changement qualitatif des chaines d’acide gras) est toujours présent, nous montrons que les oxydations phosphorylantes sont restaurées dans la souche Δtaz1 surexprimant Odc1p2, un transporteur mitochondrial d’intermédiaires du cycle de Krebs, ou par plusieurs composés chimiques. Plusieurs de ces drogues sauvant le mutant, dont la cycloheximide, sont des inhibiteurs partiels de la synthèse protéique cytosolique. Cet effet a été confirmé génétiquement par des mutations affectant les ribosomes cytosoliques. L’ensemble des résultats suggère qu’un défaut au niveau des CL provoquerait un stress protéostatique probablement impliqué dans le processus pathologiqueThe phospholipid cardiolipin (CL) has many roles in mitochondrial structure and function, ranging from assembly/stability and functioning of the oxidative phosphorylation (OXPHOS) system, fusion and fission of mitochondrial membranes, mitochondrial protein import, iron-sulfur (Fe-S) biogenesis, apoptosis, and protection of mitochondria against oxidative damage. The maintenance of a proper unsaturated acyl chain composition of CL involves the acyltransferase tafazzin in which mutations cause Barth syndrome (BTHS), resulting in cardiac and skeletal myopathy, cyclic neutropenia and respiratory chain defects. Despite considerable progress in the understanding of the underlying pathogenic mechanisms, there are still no effective therapies to treat this disease. We are using the yeast Saccharomyces cerevisiae, in which the tafazzin-based cardiolipin remodeling pathway is conserved, as a model system for the exploration of potential therapeutic pathways against BTHS, by way of genetic suppressors and chemical screening. We first constructed a yeast strain lacking the orthologous taffazin gene (Δtaz1). Consistent with previous studies, our Δtaz1 yeast failed to grow on non-fermentable carbon sources at elevated temperatures (36°C) and exhibited defects in several components of the mitochondrial respiratory system. Interestingly, we found that oxidative phosphorylation was fully restored in Δtaz1 yeast by overexpressing Odc1p [1]-a mitochondrial carrier that transports Krebs cycle intermediates- and by a number of chemical compounds. Some of the rescuing drugs, especially cycloheximide, act by partially inhibiting cytosolic protein synthesis leading to a full recovery of oxidative phosphorylations. Our findings identify potential cellular components and pathways for the pharmacological treatment of BTHS patients
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Poyau, Alain. "Etude moléculaire et génétique de la cytochrome c oxydase humaine et de la déficience de son assemblage dans le syndrome de Leigh." Lyon 1, 2000. http://www.theses.fr/2000LYO10110.
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Bonnefond, Luc. "La tyrosyl-ARNt synthétase mitochondriale humaine : originalités fonctionnelles, structurales et place dans l'évolution." Phd thesis, Université Louis Pasteur - Strasbourg I, 2007. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00196315.
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Ma thèse porte sur l'étude fonctionnelle et structurale des partenaires de la réaction d'aminoacylation spécifique de la tyrosine dans la mitochondrie humaine. Contrairement à ce qui a été observé pour les autres systèmes d'aminoacylation, les réactions de charges croisées entre bactéries et archaea/eucaryotes sont impossibles suite à la nature différente de la première paire de bases de l'ARNtTyr. La tyrosyl-ARNt synthétase (TyrRS) mitochondriale humaine est la première TyrRS connue à ce jour qui s'affranchisse de la barrière d'espèces et qui ne discrimine pas les ARNtTyr en fonction de la nature de leur première paire de bases. La TyrRS mitochondriale est un homodimère de forme allongée susceptible de fixer l'ARNtTyr à cheval sur ses deux monomères. Elle se distingue des autres TyrRS par la présence de deux insertions à sa surface, l'une potentiellement impliquée dans la reconnaissance de l'ARNtTyr et l'autre qui pourrait constituer une zone d'interaction avec un cofacteur.
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Fould, Benjamin. "Caractérisation fonctionnelle et structurale de la protéine trifonctionnelle (TFP) humaine, impliquée dans la beta-oxydation mitochondriale des acides gras à chaîne longue." Grenoble 1, 2009. http://www.theses.fr/2009GRE10294.
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La l3-oxydation des acides gras est un processus cyclique essentiel du métabolisme énergétique cellulaire. (protéine trifonctionnelle) joue un rôle central dans ce mécanisme, en catalysant les 3 dernières étapes de la 13-0XYL des acides gras à longue chaîne. Ce complexe associé à la membrane interne mitochondriale est constitué de deux SL unités, a (activités énoyl-CoA hydratase et hydroxyacyl-CoA déshydrogénase) et 13 (activité 3-kétoacyl-CoA thiolase). Les données actuelles sont peu nombreuses et contradictoires, notamment concernant la stoechiométrie du TFP et l'effet inhibiteur supposé de la trimétazidine, un médicament utilisé dans les cardiopathies. La nature précise de l'association du TFP avec la membrane n'est pas connue. Le TFP humain a été obtenu sous forme recombinante chez E. Coli avec une pureté supérieure à 95%. Une caractérisation enzymatique a été réalisée, révélant des propriétés proches de celles du TFP porcin. Des mécanismes de rétrocontrôle négatif ont été mis en évidence, ainsi que l'absence d'inhibition par la trimétazidine. L'interaction du TFP avec la membrane a été analysée par co-sédimentation et résonance plasmonique de surface, démontrant une forte affinité pour la phosphatidylcholine et la cardiolipine, composants majoritaires de la membrane interne mitochondriale. Une caractérisation structurale a également été réalisée, montrant que le TFP existe majoritairement sous une forme hétéro-octamérique 04,B4. Une analyse par microscopie électronique a permis de reconstruire la structure de l'assemblage élémentaire d2{J2 et de valider le modèle 3D proposé d'après la structure cristallographique de 1 'homologue bactérien du TFP (FOM)F atty acid l3-oxidation is a cyclic process essential for the energy metabolism of the cell. The trifunctional protein (TFP) complex plays a central role in this process, by catalysing the last 3 steps of the l3-oxidation of long-chain fatty acids. This complex is associated with the internaI mitochondrial membrane and comprises two subunits, a (harbouring the enoyl-CoA hydratase and hydroxyacyl-CoA dehydrogenase activities) and 13 (bearing the 3-ketoacyl-CoA thiolase activity). Very few data are currently available, and they are often contradictory, particularly with regard to the stoichiometry ofTFP and the putative inhibitory effect oftrimetazidine, a drug used to cure heart disorders. The precise nature of the association ofTFP with the membrane remains to be determined. Recombinant human TFP was expressed in E. Coli with a purity of over 95%. The complex was characterized enzymatically, revealing properties close to those of porcine heart TFP. Evidence for negative feedback mechanisms was obtained, and trimetazidine was shown to lack inhibitory effects. . The interaction of TFP with the membrane was analyzed by co-sedimentation and surface plasmon resonance, demonstrating strong affinity for phosphatidylcholine and cardiolipin, the major components of the inner mitochondrial membrane. Structural analyses were also performed, revealing that the major form ofTFP is a hetero-octamer 04134. Analysis by electron microscopy allowed us to reconstruct the structure of the elementary assembly d2132 and thereby to validate the model derived ITom the X-ray structure of the bacterial homologue ofTFP (FOM)
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Perrière, Clémentine. "Effets d’un mélange de polluants organiques persistants sur le métabolisme énergétique de cellules cancéreuses coliques humaines." Thesis, Paris 5, 2013. http://www.theses.fr/2013PA05P629.
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L’être humain est exposé quotidiennement et simultanément à des dizaines de polluants environnementaux, pourtant il n’existe encore que peu ou pas d’études sur les effets de ces mélanges. Des études épidémiologiques et transcriptomiques montrent que les polluants peuvent perturber le métabolisme glucidique et lipidique. Le lien entre métabolisme et cancer a été démontré depuis plusieurs décennies, en effet, une dérégulation du métabolisme oxydatif, appelée effet Warburg, et commune à presque toutes les cellules tumorales se caractérise par une déviation du métabolisme oxydatif mitochondrial vers une glycolyse anaérobie entrainant une augmentation de la production de lactate. Pour ce travail les effets d’un mélange de deux polluants organiques persistants ayant des voies de signalisation différentes sont étudiés. Le mélange associe la TCDD, une substance cancérigène, à un pesticide l’α-endosulfan, afin d’évaluer les effets combinés de ces deux polluants sur le métabolisme énergétique de cellules cancéreuses coliques humaines Caco2. Le traitement des cellules pendant 48 heures par la TCDD (25 nM) et l’α-endosulfan (10µM) conduit à une diminution de l’oxydation du glucose, corrélée à une augmentation de la production de lactate, alors que chaque polluant seul exerce un effet peu significatif. Le mélange diminue l’activité globale de la mitochondrie caractérisée par une diminution de la respiration cellulaire, et de la production d’ATP sans toutefois modifier l’intégrité mitochondriale. L’étude des mécanismes impliqués dans ces effets indique l’implication de l’AMPK et du complexe PDH, deux enzymes clés régulant de façon très importante la glycolyse cellulaire ; en effet l’inhibition de l’AMPK abolit les effets des polluants. Des modifications du calcium intracellulaire qui régule entre autre l’activité de ces deux enzymes sont observées et l’inhibition du calcium abolit également les effets des polluants. Ces travaux montrent que le mélange induit une aggravation de la dérégulation du phénotype métabolique des cellules Caco2 à l’état prolifératif. Cela pourrait signifier une synergie de l’activité de ces polluants qui pourrait accentuer ce phénotype dans un contexte tumorale via un mécanisme impliquant le calciumDuring tumorigenesis most of cancer cells exhibit an altered metabolism that is characterized by an elevated uptake of glucose and an increased glycolytic rate; this phenomenon is known as the Warburg effect. Compelling recent evidences suggest that alteration of cellular metabolism is critical during cancer development and constitutes a major feature of aggressive tumour. Considering the recent observations on the impact of persistent organic pollutants (POPs) on cell metabolism, we hypothesize that POPs could exert their carcinogenic effects by promoting metabolic alterations that could converge to a metabolic shift supporting a tumoral phenotype. Proliferating colon cancer cells (Caco2) were treated with TCDD (25 nM) or/and α-endosulfan (10 µM), two environmental pollutants mainly produced by human activities and designated by the International Agency for Research on Cancer as probably or well-established carcinogenic to humans. A significant decrease of glucose and glutamine oxidation (60%) was observed after a treatment for 48 hours with the two pollutants while each pollutant alone had no significant effect. These observations are correlated with an increased lactate production by two fold. These effects are maintained in the presence of antioxidative NAC (10 mM), suggesting that they are independent of the oxidative status of the cell. We also observed a decreased incorporation of glucose in total lipids (50%). The ATP production and the cell respiration level were significantly decreased by the mixture by about 50% and 80%, respectively. In the same conditions, the glycogen production and the NADPH/NADPH,H+ ratio were unchanged. Taken together, these results suggest that POPs could worsen the metabolic phenotype of cancer cells. The molecular mechanisms underlying the POPs-induced metabolic reprograming are under investigation and should provide a better understanding of the signalling pathways involved in POPs action on the regulation of the energetic metabolism balance and their consequence on cancer
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Sternberg, Damien. "Contribution à trois aspects de la génétique mitochondriale humaine : étude de transmission de l'ADN mitochondrial lors de fécondations in vitro - caractérisation de mutations de l'ADN mitochondrial dans les maladies mitochondriales et le vieillissement musculaire." Paris 12, 2002. http://www.theses.fr/2002PA120010.
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L'ensemble de notre travail concerne trois aspects de la recherche en génétique mitochondriale humaine. Notre premier axe d'étude a été la transmission de l'ADN mitochondrial des parents aux enfants conçus par injection intracytoplasmique de spermatozoi͏̈de (ICSI). Si les risques de transmission de défauts de l'ADN nucléaire paternel sont reconnus depuis les débuts de cette technique de procréation médicalement assistée, aucune étude n'avait recherché à l'aide de techniques hautement sensibles chez les enfants conçus par ICSI la présence de molécules d'ADN mitochondrial d'origine paternelle. Nous avons montré qu'il n'existait pas, dans le sang circulant des enfants étudiés, d'ADN mitochondrial paternel détectable par les techniques utilisées. Notre deuxième axe d'étude avisé à préciser la responsabilité d'une classe de gènes de l'ADN mitochondrial, les gènes d'ARN de transfert, dans certaines maladies mitochondriales. Nous avons mis au point un outil d'analyse de l'ADN mitochondrial permettant d'analyser rapidement la séquence des 22 gènes d'ARN de transfert à la recherche de mutations de ces gènes. Appliqué à l'investigation d'une vaste cohorte de patients, cet outil a permis de détecter de très nombreuses variations de séquence, certaines déjà connues pour être pathogènes ou au contraire anodines, d'autres nouvelles et suspectes d'être pathogènes. Un travail complémentaire d'analyse des données et de validation des mutations a été nécessaire à l'interprétation des résultats. Il a également permis de mieux définir les indications d'une telle recherche. En troisième lieu, nous nous sommes intéressés à la part que pouvaient avoir les lésions de l'ADN mitochondrial dans la physiopathologie du vieillissement musculaire, et plus particulièrement dans la genèse des fibres négatives pour l'activité cytochrome oxidase. Nous avons recherché des mutations de l'ADN mitochondrial dans ces fibres, et avons pu montrer que, dans un certains nombre d'entre elles, une expansion clonale de molécules d'ADN mitochondrial porteuses de mutations ponctuelles des gènes d'ARN de transfert était responsable du déficit enzymatiqueMitochondrial genetics is important to consider when dealing with infertility, mitochondrial diseases or ageing. Our work contributes to the clarification of the role and behaviour of mitochondrial DNA (mtDNA) in those three circumstances. First, we studied mtDNA inheritance in children born after a particular in vitro fertilisation technique, i. E. Intracytoplasmic injection of spermatozoon (ICSI). Although the risk of transmission of a paternal infertility-linked nuclear defect by this technique is well known, the possible transmission of the patemal mtDNA had never been addressed by means of highly sensitive detection assays. By using different sensitive techniques, we showed that there was no detectable paternally inherited mtDNA in the peripheral blood of the 27 children who were studied. Second, we aimed at determining the contribution of mtDNA tranfer RNA (tRNA) gene defects to the pathogenesis ofmitochondrial disorders. We set up an exhaustive scanning method to screen ah tRNA genes for mutations, and applied it to a large number of selected patients with mitochondrial disorders. We found numerous sequence variations of those genes, some of them already known to be pathogenic or polymorphie, others being questionable from a functional point of view. We performed an evaluation of each questionable sequence variation by all possible means, and were able to assign a precise significance to most of them. In retrospect, we tried to delineate the best indications for the screening ofmtDNA tRNA genes. Third, we wanted to determine the contribution of mtDNA mutations to the ageing process of human muscle, at a single fibre level. We looked for large-scale rearrangements and tRNA gene point mutations in a large number of fibres defective in cytochrome c oxidase (COX- fibres) activity and an equal number of normal fibres (COX+ fibres) from normal biopsy samples taken from ageing subjects. We detected large scale rearrangements in several fibres. Most interestingly, we detected, characterised and quantified tRNA gene point mutations in several COX- fibres, such mutations being absent from COX+ fibres. We showed that clonally expanded point mutations contribute toageing process in muscle, by a segmental alteration of the respiratory chain activity
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Guittaut, Michaël. "Mise en évidence et caractérisation d'un gène cytotoxique emboîté dans le gène de la Galectine-3 humaine." Orléans, 2001. http://www.theses.fr/2001ORLE2030.
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La Galectine-3 est une lectine spécifique des ?-galactosides impliquée dans de nombreux phénomènes tels que l'épissage des ARNm, la prolifération cellulaire et les phénomènes apoptotiques. Nous avons montré l'existence d'un second gène, dénommé galig (galectin-3 internal gene), emboîté dans les séquences du gène de la Galectine-3. Les transcrits de galig, initiés dans le second intron du gène de la Galectine-3, sont principalement détectés dans les leucocytes et à un niveau moindre dans le placenta, le cœur, les muscles, l'estomac et les testicules. L'ARNm de galig présente l'originalité de posséder deux phases ouvertes de lecture décalées et chevauchantes qui permettent la traduction de deux protéines entièrement différentes. Cette structure génique constitue, à notre connaissance, un cas unique parmi les gènes d'eucaryotes supérieurs. Les deux protéines distribuées dans le cytosol et le noyau ou dans les mitochondries ont été dénommées, respectivement, Cytogaligine et Mitogaligine. Le signal mitochondrial de cette dernière protéine a été localisé en position centrale de la molécule entre les résidus 31 et 54. D'un point de vue biologique, la Mitogaligine produit de profonds changements morphologiques dans les cellules transfectées (forme arrondie et condensation des mitochondries), effet qui est accentué quand la Cytogaligine est exprimée avec la Mitogaligine. D'autres expériences ont permis de mettre en évidence que la toxicité cellulaire ou bactérienne peut également être induite par un peptide couvrant la région centrale de la Mitogaligine (position 35-54). Il apparaît donc que la région toxique de la molécule est située dans la région contenant le signal de localisation mitochondriale. Si l'effet cytotoxique de la Mitogaligine est lié à sa localisation intracellulaire, l'activation de l'expression du gène galig pourrait induire un phénomène apoptotique via son intervention sur les mitochondries.
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Marmolino, Daniele. "Alterations of mitochondrial biogenesis and alterations of mitochondrial antioxidant defense in Friedreich's ataxia." Doctoral thesis, Universite Libre de Bruxelles, 2011. http://hdl.handle.net/2013/ULB-DIPOT:oai:dipot.ulb.ac.be:2013/209972.
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Friedreich’s ataxia (FRDA) is an autosomal recessive inherited disorder affecting approximately 1 every 40,000 individuals in Western Europe, is characterized by progressive gait and limb ataxia, dysarthria, areflexia, loss of vibratory and position sense, and a progressive weakness of central origin. Additional features particularly include an hypertrophic cardiomyopathy that can cause premature death. A large GAA repeat expansion in the first intron of the FXN gene is the most common mutation underlying FRDA. Patients show severely reduced levels of the FXN-encoded mitochondrial protein frataxin.Frataxin function is not yet completely elucidated. In frataxin deficiency conditions abnormalities of iron metabolism occur: decreased activities of iron-sulfur cluster (ISC) containing proteins, accumulation of iron in mitochondria and depletion in the cytosol, enhanced cellular iron uptake, and, in some models, reduced heme synthesis.
Evidence of oxidative stress has also been found in most though not all models of frataxin deficiency. Accordingly, yfh1-deficient yeast and cells from FRDA patients are highly sensitive to oxidants. Respiratory chain dysfunction further aggravate oxidative stress by increasing leakage of electrons and the formation of superoxide. Frataxin deficient cells not only generate more free radicals, but, they also show a reduced ability to mobilize antioxidant defenses, in particular to induce superoxide dismutase 2 (SOD2).
Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) isoform-gamma play a key role in numerous cellular functions and is a key regulator of mitochondrial biogenesis and of the ROS metabolism. Recruitment of the PPAR coactivator-1a (PGC-1a) mediates many effects of the PPAR-γ activation.
In a first work we assessed the potential beneficial effects of a potent PPAR-gamma agonist on frataxin expression in primary fibroblasts from healthy controls and FRDA patients, and Neuroblastoma cells. We used the APAF molecule (1-0-hexadecyl-2-azelaoyl-sn-glycero-3-phosphocoline; C33H66NO9P). Our results show that this compound is able to increase frataxin amount both at transcriptional and post-transcriptional level. At a dose of 20µM frataxin mRNA significantly increases in both controls (p=0.03) and FRDA patients (p=0.002) fibroblasts (1). The finding was confirmed in Neuroblastoma cells (p=0.042). According to previous publications APAF, as others PPAR-gamma agonists is able to up-regulate PGC-1a transcription.
In a second part of the study we investigate the role of the PPAR-gamma/PGC-1a pathway in the pathogenesis of FRDA. We performed a microarray analysis of heart and skeletal muscle in a mouse model of frataxin deficiency and we found molecular evidence of increased lipogenesis in skeletal muscle and alteration of fiber-type composition in heart, consistent with insulin resistance and cardiomyopathy, respectively. Since the PPAR-gamma pathway is known to regulate both processes, we hypothesized that dysregulation of this pathway could play a key role in frataxin deficiency. We confirmed this by showing a coordinate dysregulation of Pgc1a and the transcription factor Srebp1 in cellular and animal models of frataxin deficiency, and in cells from FRDA patients, who have marked insulin resistance. Particularly, PGC-1a was found significantly reduced (2) in primary fibroblasts and lymphocytes from FRDA patients (p<0.05). Furthermore, PGC-1a mRNA levels strongly correlate with frataxin relative mRNA levels (r2=0.9, p<0.001). According to this observation, in C2C12 myoblasts, PGC-1a and a reporter gene under the control of the PGC-1a promoter are rapidly down-regulated (p<0.05) when frataxin expression is inhibited by an shRNA in vitro. To further investigate this relation, we then generate PGC-1a deficient fibroblasts cells using a specific siRNA; at 72 hours of transfection frataxin was found down-regulate (p<0.05) in control cells.
Taken together those data indicate that some mechanism directly links an early effect of frataxin deficiency with reduced PGC-1a transcription in this cell type, and presumably in other cells that also down-regulate PGC-1α when frataxin levels are low.
Finally, since PGC-1a has also emerged as a key factor in the induction of many antioxidant programs in response to oxidative stress, both in vivo and in vitro, in particular in neurons, we tested whether the PGC-1a down-regulation occurring in FRDA cells could be in part responsible for the blunted antioxidant response observed in frataxin deficiency.
Using primary fibroblasts from FRDA patients we found reduced SOD2 levels (p<0.05), according to PGC1&
Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques
info:eu-repo/semantics/nonPublished
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Duneau, Mélanie. "Galig : un nouveau gène humain inducteur de la mort cellulaire." Orléans, 2005. http://www.theses.fr/2005ORLE2008.
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Galig, gène interne au gène de la galectine-3, code deux protéines : la mitogaligine et la cytogaligine. Mon travail de thèse a montré que l'expression de galig conduit à une mort cellulaire présentant des marqueurs caractéristiques de l'apoptose. Ainsi, la co-expression de Bcl-XL, protéine anti-apoptotique, réduit significativement la libération de cytochrome c et la mort cellulaire. Cependant, certains caractères apoptotiques ne sont pas mis en évidence suggérant une nouvelle forme de mort cellulaire programmée. Des études de relation structure-fonction ont permis de délimiter le signal d'adressage mitochondrial en position interne dans la mitogaligine. Des anticorps anti-cytogaligine polyclonaux ont été développés puis utilisés en immunofluorescence et en western-blot. Un test de PCR quantitative a également été mis au point. Ces outils devraient permettre de quantifier l'expression du gène galig et la production des protéines in vivo dans différents échantillons de tissus humains.
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Poidatz, Dorothée. "Caractérisation et rôles du récepteur apparenté aux récepteurs des oestrogènes-γ (ERRγ) dans le placenta humain normal et pathologique". Thesis, Versailles-St Quentin en Yvelines, 2015. http://www.theses.fr/2015VERS037V/document.
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Le placenta humain est un organe indispensable au maintien de la grossesse et au développement fœtal. Son unité structurale et fonctionnelle est la villosité choriale, constituée principalement de cytotrophoblastes qui se différencient selon la voie villeuse endocrine ou extravilleuse invasive. Le développement intense du placenta et ses fonctions multiples requièrent des besoins en énergie importants. La régulation du métabolisme énergétique placentaire passe, en partie, par le contrôle de l’activité mitochondriale.La mitochondrie est l’organelle clé du métabolisme énergétique. Cependant, elle intervient dans de nombreuses autres fonctions cellulaires telles que l’apoptose et la biosynthèse des hormones stéroïdes. Des études récentes suggèrent que les mitochondries sont impliquées dans la différenciation cellulaire.Le récepteur apparenté aux récepteurs des oestrogènes-γ, (ERRγ), est un facteur de transcription qui joue un rôle crucial dans le contrôle du métabolisme énergétique. Des travaux préliminaires ont montré qu’ERR est fortement exprimé dans le placenta humain.Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à l’implication d’ERRγ dans le développement placentaire.Dans une première partie, nous avons caractérisé l’expression d’ERRγ dans les trophoblastes de placentas humains de 1er et de 3ème trimestre. Nous avons montré que l’expression d’ERRγ i) augmente au cours de la grossesse et ii) est plus importante dans les cytotrophoblastes villeux en comparaison aux cytotrophoblastes extra-villeux.Dans une seconde partie, nous avons montré que la différenciation des cytotrophoblastes villeux est associée à des modifications du métabolisme énergétique et du contenu mitochondrial. De plus, nous avons clairement démontré qu’ERRγ contrôle positivement la différenciation des trophoblastes villeux en modulant les fonctions mitochondriales.Enfin, nous avons montré qu’ERRγ est moins exprimé dans les placentas issus de retards de croissance intra-utérins en comparaison à des placentas normaux. De plus, la diminution d’ERRγ est associée à une baisse du contenu mitochondrial placentaire.L’ensemble de ce travail a permis de mettre en évidence le rôle clé d’ERRγ et des mitochondries dans le développement du placenta humainHuman placenta is a vital organ for pregnancy support and fetal development. The chorionic villi is the structural and functional unit of the placenta and is mainly constituted by trophoblastic cells. The trophoblast differentiate in villous endocrine and extra-villous invasive trophoblast. Placental development and its numerous functions require the availability of high energy. Placental energetic metabolism control is partially mediated by the regulation of mitochondrial activity.Mitochondria are key organelles of the energetic metabolism. However, mitochondria are involved in numerous other cellular functions such as apoptosis and steroid hormone biosynthesis. Moreover, recent studies suggest that mitochondria are involved in cell differentiation.Estrogen related receptor-γ (ERRγ) is a transcriptional factor implicated in the control of energetic metabolism. Preliminary studies showed that ERRγ is highly expressed in human placenta.In this work, we decided to study ERRγ implication in human placental development.In a first part, we characterized ERRγ expression in trophoblast from first and third trimester human placentas. We showed that ERRγ expression i) increased during pregnancy and ii) was higher in villous than extra-villous trophoblasts.In a second part, we showed that villous trophoblast differentiation was associated with modifications of energetic metabolism and mitochondrial content. Moreover, we clearly demonstrated that ERRγ positively controled villous differentiation by the modulation of mitochondrial functions.In a last part, we showed that ERRγ was less expressed in placentas from intra-uterine growth restriction as compared to non-pathological placentas. Moreover, this down-regulation was associated with a decrease of mitochondrial content.This work thus showed, for the first time, that ERRγ and mitochondria played a key role in placental development
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Brière, Jean-Jacques. "Le cycle de Krebs dans la pathologie humaine : succinate désydrogénase et tumorigenèse." Paris 5, 2006. http://www.theses.fr/2006PA05P621.
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Les gènes des sous-unités B, C et D de la succinate déshydrogénase(SDH) sont des suppresseurs de tumeurs. Dans ces tumeurs l’activité de la SDH est quasi nulle et le facteur de transcription lié à l’hypoxie HIF1α est stabilisé. Nous avons montré que la perte d’activité de la SDH conduit à une accumulation de succinate. La stabilisation de HIF1α est causée par l’inhibition, la prolyl hydroxylase (PHD), sensible aux superoxydes, qui utilise le fer réduit comme cofacteur, l’α cétoglutarate comme substrat et produit du succinate. Ni la quantité de fer ou son état de réduction, ni la surproduction de superoxydes dans les cellules déficitaires en SDH ne sont responsables de l’inhibition de la PHD. Par contre, l’accumulation de succinate rend le rapport des concentrations α cétoglutarate/succinate suffisamment faible pour conduire à l’inhibition de la PHD. Ainsi pour les déficits en SDH, les acides organiques sont la clé de l’activation de la voie pseudo-hypoxique dépendante de HIF1αThe genes encoding succinate dehydrogenase (SDH) subunits B, C and D, act as tumour suppressors in neuro-endocrine tissues. In these tumours the SDH activity is almost null and the Hypoxia Inductible Factor HIF1α is stabilized. We showed that the loss of SDH activity leads to an accumulation of succinate. HIF1α stabilization is due to the inhibition of the prolyl hydroxylase (PHD), a superoxides sensitive enzyme, with iron as a cofactor, α ketoglutarate as a subtract and succinate as a product. Neither the redox state or the quantity of iron, nor the superoxide overproduction in the SDH deficient cells are responsible for the PHD inhibition. On the other hand the succinate accumulation leads to a ratio of α ketoglutarate to succinate concentrations low enough to inhibit the PHD. In SDH deficient cells, organic acids thus appear instrumental in the HIF1α-dependent pseudo hypoxic pathway
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Migdal, Camille. "Étude des évènements précoces impliqués dans l’activation des cellules dendritiques humaines induite par le thimerosal : rôle du stress oxydant : implication dans le développement de nouvelles méthodes alternatives à l’expérimentation animale." Thesis, Lyon 1, 2010. http://www.theses.fr/2010LYO10087/document.
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L'eczéma allergique de contact (EAC) est une pathologie inflammatoire cutanée de plus en plus fréquente. Il s’agit d’une sensibilisation vis-à-vis de substances chimiques, appelées haptènes, qui sont en contact répété avec la peau. A l’heure actuelle, le pouvoir sensibilisant d’une molécule est évalué principalement grâce à des modèles animaux. Cependant, dans un contexte européen exigeant le développement de méthodes alternatives, la compréhension et la reproduction in vitro des mécanismes de l’EAC permettent le développement de nouvelles stratégies. Le but de ce travail, réalisé sur des cellules dendritiques (DCs) et la lignée humaine U937, est de mettre en évidence les événements précoces de la signalisation intracellulaire à l’origine de l’activation des DCs induite par des allergènes, et notamment par le composé mercurique thimerosal. Les résultats obtenus démontrent que l’induction d’un stress oxydant par les allergènes est un mécanisme induit précocement. L’utilisation d’antioxydants montre que ce mécanisme participe de manière directe à l’initiation du processus d’activation des DCs (expression du CD86 et sécrétion d’IL-8) et de l’apoptose. Le stress oxydant, caractérisé par une production d’ERO associée à une chute du potentiel membranaire mitochondrial et une déplétion en glutathion intracellulaire, est un acteur majeur de la signalisation induite par les allergènes et notamment dans la réponse induite par le thimerosal et le DNCB. Plus particulièrement, ce travail démontre le rôle des groupements thiols dans l’initiation de la transduction du signal aboutissant à l’activation des DCs. Par ailleurs, une signalisation calcique, dépendante du stress oxydant, a également été mise en évidence en réponse aux allergènes. Ces résultats mettent en valeur l’importance de l’étude de la réactivité des allergènes vis-à-vis des groupements thiols et de la nécessité de tenir compte du potentiel oxydant (rédox) des haptènes ainsi que du métabolisme cellulaire dans la mise en place de modèles prédictifs in vitroAllergic Contact Dermatitis (ACD) resulting from skin sensitization is a frequent inflammatory skin disease linked to the use of chemicals, called haptens. At this time, the sensitizing potential of a new chemical is evaluated on animal models. However, new European legislation requires alternative methods for skin sensitization. In this context, a better knowledge of ACD and the capacity to reproduce in vitro its mechanisms lead to the development of new alternative methods. The aim of this study performed with human dendritic cells (DCs) and the human cell line U937 was to determine the early events involved in dendritic cell activation induced by contact sensitizers and especially by the mercury compound thimerosal. Data show that oxidative stress induced by sensitizers is an early signaling event leading to DC activation (expression of CD86 and IL-8 release) and to apoptosis. Using antioxidants, our data show that oxidative stress, characterized by ROS production in correlation with the depletion of the mitochondrial membrane potential and of intracellular glutathione, is a key player in signal transduction induced by sensitizers, especially in the response of DCs towards thimerosal and DNCB. More specifically, these studies demonstrate that thiol groups play a direct role in the initiating events leading to DC activation. In addition, calcium influx was detected in DCs exposed to sensitizers, in correlation with oxidative stress. These data highlight the great interest in the development of a hapten-protein binding assay based on thiol groups and the necessity to better understand the redox status of chemicals as well as cell metabolism for predicting skin sensitization
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Gonzalez, Serrano Ligia Elena. "Caractérisation de l'ArgRS mitochondriale humaine et contribution à la compréhension des pathologies liées aux mutations des aminoacyl-ARNt synthétases mitochondriales." Thesis, Strasbourg, 2018. http://www.theses.fr/2018STRAJ074/document.
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Les aminoacyl-ARNt synthétases mitochondriales humaines (aaRS mt) sont des enzymes clés de la traduction mitochondriale. Elles catalysent l'aminoacylation des ARNt par les acides aminés correspondent. Des mutations dans leurs gènes sont corrélées à des pathologies avec un large spectre de phénotypes cliniques, mais aux mécanismes moléculaires sous-jacents encore incompris. L'objectif de ce travail de thèse s'intègre dans les axes scientifiques du laboratoire, mais élargit l'intérêt et les connaissance à un système encore peu exploré: l'arginyl-ARNt synthétase mitochondriale (ArgRS mt). Des mutations dans la ArgRS sont liées à une hypoplasie Pontocérébelleuse (PCH6), une pathologie neurodéveloppementale sévère. Le travail de cette thèse s’articule autour de 3 axes : (I) L’analyse des phénotypes cliniques des pathologies liées aux mutations dans les aaRS mt, (II) La caractérisation des propriétéscellulaires de l’ArgRS mt, et (III) L'étude de l’impact de mutations « pathologiques » sur diverses propriétés de l’ArgRS mt. Combinés avec les travaux précédents, les résultats obtenus sont une contribution importante à l'élargissement des connaissances fondamentales des mt aaRSs, et apportent un nouvel éclairage sur le lien entre les mt-aaRSs-mutations et la maladieHuman mitochondrial aminoacyl-tRNA synthetases (mt-aaRSs) are housekeeping enzymes involved in the mitochondrial translation. They catalyze the aminoacylation of tRNAs with their cognate amino acids. Mutations in their nuclear genes are correlated with pathologies with a broad spectrum of clinical phenotypes, but with so far no clear explanations about the underlying molecular mechanism(s). The aim of this PhD work follows the long-standing efforts of the host laboratory but expand the interest and knowledge to an unexplored system: the human mitochondrial arginyl-tRNA synthetase (mt-ArgRS). Mutations in the mt-ArgRS lead to Pontocebellar hypoplasia type 6, a severe neuro-developmental pathology. I thus contributed to i) comprehensively analyze the clinical data reported in pathologies related to mutations on mt-aaRSs, resulting in a categorization according to the affected anatomical system; ii) decipher some cellular properties of the mt-ArgRS; and iii) investigate to impact of disease-associated mutations on mt-aaRSs properties. Combined with previous works, the present results expand the knowledge of the mt-aaRSs, shedding new light on the link between mt-aaRSs-mutations and disease
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Assoum, Mirna. "Identification de nouveaux gènes d’ataxies récessives : implication de la mitochondrie et de nouvelles voies physiopathologiques." Strasbourg, 2010. https://publication-theses.unistra.fr/public/theses_doctorat/2010/ASSOUM_Mirna_2010.pdf.
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Nous avons analysé un ensemble de 97 familles consanguines par puces de génotypage 10K ou 50K. Nous avons ainsi pu identifier 10 mutations dans 4 gènes déjà connus d'ataxie (sacsin, aprataxin, senataxin, ATM). Grâce à notre stratégie de cartographie par homozygotie, nous avons pu identifier quatre nouveaux gènes responsables d'ataxies autosomiques récessives. Nous avons identifié des mutations dans le gène ADCK3 codant pour une kinase atypique mitochondriale impliquée dans la synthèse du coenzyme Q10. Ces mutations sont responsables d'une ataxie cérébelleuse précoce et associée à un déficit en coenzyme Q10. Nous avons identifié des mutations dans le gène ABHD12 responsables du syndrome PHARC ( pour Polyneuropathy, Hearing loss, Ataxia, Retinitis pigmentosa and Cataract). Le gène ABHD12 code pour une α/β hydrolase impliquée dans l'hydrolyse de l'acide 2-arachidonique-glycérol, un endocannabinoïde majeur du SNC. Une collaboration avec S. Vermeer et collègues (Nimègue) a permis d'identifier des mutations dans le gène ANO10 dans une nouvelle forme d'ataxie avec atrophie cérébelleuse sévère. ANO10 est un membre de la famille des anoctamines et code pour un canal chlore activé par le calcium. Finalement, nous avons identifié la mutation causale ches les 3 patientes d'une grande famille originaire d'Arabie Saoudite consanguine. La mutation, une délétion homozygote (2927delC) au niveau du gène KIAAO226, entraîne un décalage du cadre de lecture. KIAAO226 code pour une nouvelle protéine nommée Rubicon. Rubicon (rundataxine) colocalise avec Rab7 au niveau des endosomes précoces. La rundataxine mutante exprimée dans les cellules Hela présente une localisation cytosolique diffusePatients from 97 families were analyzed with GeneChip Mapping 10K 50K SNP Affymetrix microarrays. We identified 10 mutations in 4 known ataxia genes (sacsin. Aprataxin, senataxin, ATM). Our homozygosity mapping strategy allowed us also to identify 4 new genes responsible of new forms of reçessive ataxias. We have identified mutations in the ADCK3 gene coding for a mitochondrial atypical kinase involved in CoQ10 biosynthesis. ADCK3 mutations are responsible for an early onset cerebellar ataxia associated with coenzyme Ql0 deficiency. We have also identified mutations in the ABHD12 responsible for PHARC (Polyneuropathy, hearing loss, ataxia, retinitis pigmenltosa, and cataract). The ABfHD12 gene encodes an α/β hydrolase recently shown to hydrolyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG), one of the 2 main endocannabinoid neurotransmitters. The collaboration \\ith S. Vermeer and colleagues (Nijmegen) permited to identify mutations in the gene ANO10 involved in a new form of cerebellar ataxia with severe cerebellar atrophy. ANO10 is a member of the human Ianoctamins (ANO) family. ANO10 encodes a calcium-activated chloride channel. Finally, with the same approach. We identified the causative gene in three children affected with childhood onset ataxia in a large consanguineous Saudi Arabian famiy. The mutation, a single nucleotide deletion, 2927delC in the KIAA0226 gene, results in a frame-sbift and in the usage of a novel 145 amino-acid reading frame which is longer than the normal C-terminal sequence. The K1AA0226 gene encodes a protein, we named rundataxin (Rubicon) which colocalizes with Rab7 on the late endosomes. The mutation leads to a diffuse cytoplasmic distribution of rundataxin
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Lescuyer, Pierre. "Étude de l'expression des gènes nucléaires codant pour les sous-unités du complexe I mitochondrial humain." Phd thesis, Université Joseph Fourier (Grenoble), 2002. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00175098.
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La NADH:ubiquinone oxydoréductase (complexe I) est le plus gros complexe enzymatique du système mitochondrial d'oxydation phosphorylante (43 sous-unités chez l'homme). Très peu de données sont disponibles concernant les mécanismes régulant l'expression de ces protéines. Cette étude a été initiée par l'étude des promoteurs de deux gènes du complexe I mitochondrial humain. Les résultats montrent que le gène NDUFS8 qui code pour la sous-unité 23 kDa (TYKY) est transcrit sous le contrôle des facteurs de transcription YY1 et Sp1 tandis que gène NDUFS7 codant pour la sous-unité 20 kDa (PSST) est régulé par NRF-1 et Sp1.
Dans la deuxième partie de ce travail, une méthode d'analyse du protéome mitochondrial humain par électrophorèse bidimensionnelle a été développée. Le but est d'aborder de manière globale et sans a priori l'expression des protéines du complexe I : déterminer qui est régulé et comment en réponse à un stimulus déterminé?
Des cartes de référence ont été développées à partir de mitochondries extraites de placenta humain en utilisant deux types de gradient de pH : l'un est adapté aux protéines acides et neutres, l'autre aux protéines basiques. Sur ces cartes, 85 protéines mitochondriales ont été identifiées par spectrométrie de masse dont 17 sous-unités du complexe I. Cette technique d'analyse protéomique a ensuite été utilisée pour étudier la régulation de l'expression des protéines mitochondriales par le fer. Sur le plan technique, les premiers résultats sont encourageants : les gels d'électrophorèse bidimensionnelle préparés avec des mitochondries extraites de cellules en culture sont de bonne qualité et des variations reproductibles de l'expression de sous-unités du complexe I et d'autres protéines mitochondriales ont pu être détectées. Sur le plan fondamental, les données obtenues sont préliminaires. Il sera nécessaire de réaliser de nouvelles expériences pour confirmer les premières observations et analyser la cinétique des variations détectées.
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Asfogo, Noemi. "Intéraction entre synucléinopathie et dysfonctionnement mitochondrial dans des modèles neuronaux de la maladie de Parkinson." Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2023. https://accesdistant.sorbonne-universite.fr/login?url=https://theses-intra.sorbonne-universite.fr/2023SORUS732.pdf.
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La maladie de Parkinson (MP) est une maladie neurodégénérative fréquente, caractérisée par la perte progressive des neurones dopaminergiques de la substance noire pars compacta (SNpc) et la présence d’inclusions nommées Corps de Lewy (CLs), contenant la protéine présynaptique alpha-synucléine (αSyn) comme composant majeur. Un certain nombre d’arguments, soutenus par les avancées dans le domaine de la génétique, plaident en faveur d’un rôle de l’altération de l’homéostasie de l’αSyn et du dysfonctionnement mitochondrial dans la MP. Des espèces d’αSyn qui se forment au cours de son accumulation pathologique pourraient en effet impacter la fonction mitochondriale. Cependant, nous manquons d’une vision consensuelle et intégrée des conséquences de ces formes d’αSyn sur la physiologie mitochondriale au cours du temps, ainsi que des mécanismes mis en jeu. Ce projet de thèse s’est inscrit dans le contexte de l’étude détaillée de la dysfonction mitochondriale engendrée par l’αSyn dans des modèles neuronaux et in vivo, dans le cadre du projet européen IMI2/PD-MitoQUANT. La thèse a porté sur la mise en jeu de modèles neuronaux d’agrégation pathologique de l’αSyn, induite par l’apport de fibrilles d’αSyn produites in vitro (PFFs), pour étudier l’impact de ce processus sur des aspects relatifs au contrôle de la qualité mitochondriale. Dans un premier temps, nous avons reproduit et validé au laboratoire un modèle de synucléinopathie basé sur l’exposition aux PFFs, dans des neurones primaires corticaux de souris. Après deux semaines d’exposition, nous avons observé la présence de dépôts riches en αSyn phopshorylée (pS129) dans ces neurones, ainsi qu’une forte colocalisation de cette protéine avec la mitochondrie. Ensuite, nous avons évalué l’impact des PFFs et de la synucléinopathie sur la mitophagie, à l’aide du rapporteur fluorescent MitoRosella. Nous avons démontré une hausse de ce processus suite à l’exposition aiguë des neurones aux PFFs, qui n’était pas retrouvée dans les neurones déficients en Parkine (PRKN(-/-)). Cela suggère que les PFFs endommagent les mitochondries, activant un programme de clairance mitochondriale régulé par la Parkine. Une hausse similaire de la mitophagie était retrouvée dans les neurones exposés chroniquement aux PFFs, cette fois-ci également dans un contexte PRKN(-/-), et indépendamment de la présence de dépôts de pS129 dans les cellules. En parallèle, nous avons suivi l’impact des PFFs sur la biogénèse mitochondriale, en étudiant la synthèse de novo de l’ADNmt par une approche basée sur l’incorporation de l’analogue de nucléoside EdU et sa visualisation par imagerie. Nous avons observé une hausse de la synthèse de l’ADNmt suite à une exposition courte aux PFFs, qui était absente dans les neurones PRKN(-/-). Dans un contexte d’exposition chronique, au contraire, nous avons observé une diminution progressive de la synthèse de novo de l’ADNmt qui était similaire en présence et absence de Parkine. Au cours de la dernière partie de ma thèse, j’ai cherché à confirmer une partie de ces résultats dans un modèle neuronal humain, et j’ai débuté l’exploration des mécanismes responsables de la hausse de mitophagie engendrée par la progression de la synucléinopathie. L’ensemble de ces résultats démontre une perte de l’homéostasie mitochondriale dans le contexte de synucléinopathie, avec d’une part une augmentation de la dégradation des mitochondries par la voie de mitophagie et, d’autre part, une absence de compensation par la biogénèse mitochondriale. A terme, ces altérations pourraient conduire à une dysfonction mitochondriale, comme le montrent des résultats complémentaires obtenus in vitro et in vivo dans le contexte plus global du projet PD-MitoQUANT. Des études complémentaires seront nécessaires pour identifier les mécanismes responsables des altérations observées et déterminer dans quelle mesure ils prennent part à la vulnérabilité neuronale qui conduira à leur dégénérescence dans la MPParkinson's disease (PD) is a common neurodegenerative disorder characterized by the progressive loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta (SNpc) and the presence of inclusions called Lewy bodies (LBs), containing the presynaptic protein alpha-synuclein (αSyn) as a major component. A number of arguments, supported by advances in genetics, point to a role for altered αSyn homeostasis and mitochondrial dysfunction in PD. The αSyn species formed during its pathological accumulation are indeed suspected to affect the function of the mitochondria. However, we lack a consensual and integrated view of the consequences of these forms of αSyn on mitochondrial physiology over time, as well as the mechanisms involved. This thesis project was part of a detailed study aimed at exploring the contribution of αSyn-to mitochondrial dysfunction in neuronal and in vivo models, as part of the European IMI2/PD-MitoQUANT project. The thesis focused on the use of neuronal models of pathological αSyn aggregation, induced by exposure to Syn fibrils preformed in vitro (PFFs), to study the impact of this process on various aspects related to mitochondrial quality control. We first reproduced and validated in our laboratory a model of synucleinopathy based on exposure of primary mouse cortical neurons to PFFs. After two weeks of exposure, we observed the presence of deposits rich in phosphorylated αSyn (pS129) in these neurons, as well as a strong colocalization of pS129with mitochondria. We then assessed the impact of PFFs and synucleinopathy on mitophagy, using the fluorescent reporter MitoRosella. We demonstrated an increase in mitophagy following acute exposure of neurons to PFFs, which was not found in Parkin-deficient neurons (PRKN(-/-)). This suggests that PFFs damage mitochondria, activating a Parkin-dependent mitochondrial clearance program. A similar increase in mitophagy was found in neurons chronically exposed to PFFs in both wild type and PRKN(-/-) context, irrespective of the presence of pS129 deposits in the cells. In parallel, we monitored the impact of PFFs on mitochondrial biogenesis, studying de novo mitochondrial DNA (mtDNA) synthesis using an approach based on incorporation of the nucleoside analogue EdU and its visualization by imaging. We observed an increase in mtDNA synthesis following acute exposure to PFFs, which again did not occur in PRKN(-/-) neurons. In a context of chronic exposure, on the contrary, we observed a progressive decrease in de novo mtDNA synthesis, which was similar in the presence and absence of Parkin. In the last part of my thesis, I sought to confirm some of these key observations in a human neuronal model, and began exploring the mechanisms responsible for mitophagy activation in the synucleinopathy model. Taken together, these results demonstrate that progression of PFFs-induced Syn pathology is associated with imbalanced mitochondrial turnover, with on one hand enhanced mitochondrial degradation via mitophagy, and on the other hand lack of compensation via mitochondrial biogenesis. Ultimately, these alterations could lead to mitochondrial dysfunction, as shown by complementary results obtained in vitro and in vivo in the broader context of the PD-MitoQUANT project. Further studies are required to identify the mechanisms responsible for the observed alterations and determine to what extent they contribute to the neuronal vulnerability underlying neurodegeneration in PD