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AbstractAimsCompared with those without obesity, patients with obesity‐related heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF) have worse symptoms, haemodynamics, and outcomes. Current weight loss strategies (diet, drug, and surgical) work through decreased energy intake rather than increased expenditure and cause significant loss of skeletal muscle mass in addition to adipose tissue. This may have adverse implications for patients with HFpEF, who already have reduced skeletal muscle mass and function and high rates of physical frailty. Mitochondrial uncoupling agents may have unique beneficial effects by producing weight loss via increased catabolism rather than reduced caloric intake, thereby causing loss of adipose tissue while sparing skeletal muscle. HU6 is a controlled metabolic accelerator that is metabolized to the mitochondrial uncoupling agent 2,4‐dinotrophenol. HU6 selectively increases carbon oxidation from fat and glucose while also decreasing toxic reactive oxygen species (ROS) production. In addition to sparing skeletal muscle loss, HU6 may have other benefits relevant to obesity‐related HFpEF, including reduced specific tissue depots contributing to HFpEF; improved glucose utilization; and reduction in systemic inflammation via both decreased ROS production from mitochondria and decreased cytokine elaboration from excess, dysfunctional adipose.MethodsWe describe the rationale and design of HuMAIN‐HFpEF, a Phase 2a randomized, double‐blind, placebo‐controlled, dose‐titration, parallel‐group trial in patients with obesity‐related HFpEF to evaluate the effects of HU6 on weight loss, body composition, exercise capacity, cardiac structure and function, metabolism, and inflammation, and identify optimal dosage for future Phase 3 trials.ConclusionsHuMAIN will test a promising novel agent for obesity‐related HFpEF.

ImportanceExcess body fat plays a pivotal role in the pathogenesis of heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF). HU6 is a novel, controlled metabolic accelerator that enhances mitochondrial uncoupling resulting in increased metabolism and fat-specific weight loss.ObjectiveTo assess efficacy and safety of HU6 in reducing body weight, improving peak volume of oxygen consumption (VO2) and body composition among patients with obesity-related HFpEF.Design, Setting, and ParticipantsThe Exploratory Phase 2A, Double-Blind, Placebo-Controlled Dose Escalation Study of Safety, Tolerability, Pharmacodynamics, and Pharmacokinetics of HU6 for Subjects With Obese HFpEF (HuMAIN-HFpEF) trial was a multicenter, dose-escalation randomized clinical trial among patients with chronic stable HFpEF and obesity. Data were analyzed from July to October 2024.InterventionHU6 treatment for 19 weeks, starting at 150 mg per day and potentially up titrated to 450 mg per day based on safety and tolerability vs placebo.Main Outcomes and MeasuresThe primary end point was change in body weight.ResultsOf 66 participants randomized (mean [SD] age, 64.5 [12] years; 38 female [58%]; mean [SD] weight, 110.9 [22.4] kg), 56 completed the trial. HU6 (vs placebo) significantly decreased weight (between-group difference, −2.86 kg; 95% CI, −4.68 to −1.04 kg; P = .003), total fat mass (between-group difference, −2.96 kg; 95% CI, −4.50 to −1.42 kg; P < .001), and percentage visceral fat (between-group difference,−1.3%; 95% CI, −2.1 to −0.5%; P = .003), with no significant loss of muscle mass. There were no statistically significant changes in peak VO2, 6-minute walk distance, Kansas City Cardiomyopathy Questionnaire score, high-sensitivity C-reactive protein level, N-terminal pro–brain natriuretic peptide level, or diastolic function. Serious adverse events were noted in 5 participants (4 in the HU6 group; 1 in the placebo group), including 1 death, all judged unrelated to treatment.Conclusions and RelevanceAmong patients with obesity-related HFpEF, treatment with HU6 for 19 weeks led to modest but statistically significant weight loss without significant changes in peak VO2. Larger trials of longer duration are warranted to determine whether longer-term administration of HU6 can improve exercise function, quality of life, and cardiovascular outcomes in this increasingly common disorder.Trial RegistrationClinicalTrials.gov Identifier: NCT05284617

L’expression « procréation médicalement assistée (PMA) » est utilisée pour désigner les techniques médicales permettant la manipulation des gamètes – ovules et sperme – hors du corps humain dans le but d’engendrer un nouvel être humain, et, par extension, le domaine de la médecine qui a pour but de traiter l’infertilité. Les techniques de base comprennent l’insémination de sperme, la fécondation in vitro (FIV), ainsi que la congélation de gamètes ou d’embryons. En ouvrant les processus biologiques de la procréation à l’intervention médicale et à la contribution biologique de tiers – par exemple dans le don de sperme, d’ovules ou la grossesse pour autrui (GPA) – elles ouvrent des possibilités inédites de division du travail reproductif. On parle également de Nouvelles Techniques de Reproduction (NTR) (Tain 2015) ou de Techniques de Reproduction Assistée (TRA) en référence au terme anglais Assisted Reproductive Technologies (ART) (Courduriès et Herbrand 2014) pour désigner ces techniques. Depuis la naissance du premier « bébé éprouvette » en 1978 en Grande-Bretagne, leur liste ne cesse de s’étendre, marquant ainsi une technologisation croissante des processus de création de la vie humaine, mais également sa normalisation et standardisation (Franklin 2013a), ainsi que son inscription dans un marché globalisé de la procréation en pleine expansion (Waldby et Mitchell 2006). Dès ses débuts, l’anthropologie s’est intéressée aux différentes représentations qui entourent la création de la vie, ainsi qu’à son organisation sociale et à sa régulation. Cet intérêt s’est manifesté dans l’étude de la parenté, domaine ayant occupé une place centrale dans la discipline au point qu’il en est devenu un emblème. Dès les travaux de Lewis Henry Morgan (1871) sur les systèmes de parenté et la distinction qu’il établit entre systèmes classificatoires et descriptifs, on trouve les traces d’un questionnement sur ce qui fonde les liens de parenté et la place des liens de sang. Comment comprendre, toutefois, que la contribution physiologique masculine à la procréation n’apparaisse pas comme nécessaire au fondement de la paternité chez les Trobriandais étudiés par Malinowski (2010) ? Cette question qui a généré un débat de plusieurs décennies sur l’« immaculée conception (virgin birth) » et la supposée ignorance des peuples dits « primitifs » quant aux « faits de la vie (facts of life) » (Delaney 1986 ; Franklin 1997) montre à quel point l’étude de la parenté s’est construite sur une distinction implicite entre les faits biologiques de la procréation et les catégories sociales et culturelles de la parenté. Cette distinction se retrouve également au cœur de la célèbre analyse de Levi-Strauss (1949) sur les interdits et prescriptions qui régulent le choix de partenaires reproductifs et qui marqueraient le passage même de la nature à la culture. L’anthropologue américain Schneider (1984) a critiqué la distinction implicite entre parenté sociale et biologique qui sous-tend l’étude classique de la parenté, en montrant à quel point elle est façonnée par le modèle de parenté prévalant aux États-Unis. Cependant, l’apport majeur des travaux anthropologiques plus anciens à l’étude de la procréation médicalement assistée est de montrer que le biologique n’est jamais suffisant à faire des enfants, ou en d’autres termes que la procréation est toujours assistée, et que les systèmes de parenté et l’institution du mariage figurent parmi les premières techniques de reproduction permettant de diriger la transmission de la substance reproductive (Franklin 2013a). En suivant la critique de Schneider et sous l’impulsion des études féministes qui se développent dans les années 1970, les études de la parenté prennent alors une nouvelle orientation plus critique, en se rapprochant des études sur le genre, et en mettant la reproduction au cœur de la recherche anthropologique. L’essor de la procréation médicalement assistée auquel on assiste dans les années 1980 contribue grandement à ce renouvellement en raison des questions qu’elle pose pour ces domaines d’études. On distingue généralement deux grandes phases dans l’orientation des recherches sur la PMA (Thompson 2005). Ces techniques ont, dans une première phase qui couvre grosso modo les années 1980 et le début des années 1990, suscité beaucoup de débats. Elles ont été fortement critiquées tant dans les milieux féministes français (Testard 1990 ; Lesterpt et Doat 1989), qu’anglo-saxons (Spallone et Steinberg 1987). La critique produite dans cette première phase peut se lire à la lumière des débats générés par le mouvement féministe des années 1970 sur les inégalités entre les hommes et les femmes, la problématique médicalisation du corps des femmes et plus généralement l’invisibilisation de leur travail reproductif (Tabet 1985). Elle met notamment en avant le risque d’exploitation et de contrôle du corps des femmes soumises à l’injonction normative à la maternité (Rouch 2002). Elle vise également la fausse promesse faite par la PMA d’apporter une réponse médicale à l’infertilité, tout en dissimulant des taux de succès très bas et en parlant d’infertilité « de couple », alors que toutes les interventions ont lieu sur le corps des femmes (Van der Ploeg 1999). Si la critique féministe demeure présente, une attention croissante à la complexité de la PMA et de son vécu se développe dans une deuxième phase qui couvre grosso modo la deuxième moitié des années 1990 et les années 2000. En effet, alors que le recours à la PMA s’est de plus en plus normalisé, ces techniques ne cessent d’interroger les catégories de parenté et les représentations de la création de la vie qui semblent le plus tenues pour acquises. Ce qui est mis en avant c’est la dimension paradoxale de la PMA, notamment en raison de sa capacité à reproduire du même et imiter la nature, tout en produisant de l’entièrement nouveau (Franklin 2013b ; McKinnon 2015). Par exemple, ces techniques sont mises au service de la parenté génétique, et tendent à la naturaliser, mais la dénaturalisent également en mettant en lumière le travail nécessaire à sa réalisation (Thompson 2005). Ce faisant, elles déplacent et brouillent les frontières entre nature et culture, privé et public, local et global, passivité et agentivité, offrant ainsi un terrain fertile au développement de la réflexion anthropologique. Actuellement, deux grandes lignes de recherche se développent. La première – les New Kinship Studies ou Nouvelles Études de la Parenté – poursuit le questionnement de l’anthropologie de la parenté. Ces études cherchent, d’une part, à comprendre comment les techniques de procréation médicalement assistée troublent la distinction entre nature et culture et contribuent à transformer la notion même du biologique (Strathern 1992 ; Franklin 2013a). Elles investiguent, d’autre part, l’émergence de nouvelles configurations familiales rendues possibles par ces techniques. Elles s’interrogent notamment sur les transformations des conceptions de la maternité, de la paternité, et du modèle familial bilatéral, en se penchant sur les expériences vécues des couples ou sur les appareils juridiques qui les encadrent (Porqueres i Gené 2009). La division de la maternité entre ses dimensions éducative, gestationnelle et génétique, rendue possible par le don d’ovules et la GPA, est particulièrement discutée (Kirkmann 2008). La question de l’anonymat des donneurs de sperme et donneuses d’ovules (Konrad 2005) et de la ressemblance (Becker et al. 2005) font aussi l’objet d’analyses socio-anthropologiques, ainsi que, de manière émergente, les communautés de « frères » et « sœurs » qui peuvent se constituer autour d’un même donneur (Edwards 2015). De plus, tout un pan de la recherche s’intéresse aux manières de faire famille dans les couples gays, lesbiens, et trans, et à la manière dont le modèle de famille hétéronormatif est renforcé ou au contraire, contesté et transformé (Mamo 2007 ; Herbrand 2012). Une deuxième lignée de recherche – l’étude sociale de la reproduction – se focalise plutôt sur la médicalisation de l’expérience reproductive et de l’infertilité et sur ses conséquences pour les femmes. Elle s’interroge sur sa stratification (Ginsburg et Rapp 1991) et met en lumière l’imbrication de processus situés à différents niveaux allant du corporel – niveau cellulaire, génétique – au culturel, historique et structurel – comprenant par exemple l’État, le marché, et la religion (Almeling 2015). Adoptant une perspective globale et sortant du cadre national, tout un pan de recherche s’intéresse à la circulation des gamètes, des donneurs et donneuses, des couples en recherche d’enfants et à la constitution d’un marché et d’un « tourisme » de la reproduction (Waldby et Mitchell 2006 ; Kroløkke 2012). Cherchant à remédier à la focalisation générale des études sur les femmes, un nombre croissant de recherches se penche sur les expériences masculines de l’infertilité et de la PMA (Inhorn 2004). Finalement, suivant le développement récent de techniques permettant de congeler des ovules, d’anticiper la baisse de la réserve ovarienne et de préserver la possibilité d’avoir un enfant génétique dans le futur, on assiste à l’émergence d’études focalisant sur la biomédicalisation de l’infertilité liée à l’âge (Martin 2010 ; Baldwin et al. 2014 ; Bühler 2014 ; Waldby 2015). Alors que la technologisation de la procréation ne cesse de s’étendre, comme le montre la récente naissance d’un bébé conçu grâce à une technique de transfert mitochondrial, appelée couramment « FIV à trois parents » (génétiques) (Couzin-Frankel 2016), elle continue à aiguiser la réflexion anthropologique en offrant un « miroir au travers duquel nous pouvons nous regarder » (traduction de la citation en épigraphe, Franklin 2013a :1).

Les mutations dans le génome mitochondrial humain sont souvent associées à de graves maladies neuromusculaires. Mon projet de thèse a consisté tout d’abord au développement d’une stratégie thérapeutique basée sur l’import mitochondrial de molécules d’ARN. J’ai pu démontrer que l’expression stable de molécules d’ARN recombinantes dans les cellules humaines permet de diminuer le taux de mutations pathogéniques de l’ADN mitochondrial. Dans une seconde partie, j’ai élaboré une nouvelle méthode, CoLoC-seq, permettant l’identification à grande échelle des ARN localisés dans les mitochondries. En appliquant cette méthode sur des cellules humaines, j’ai pu confirmer l’adressage mitochondrial de certains ARN cytosoliques non-codant et identifier de nouveaux ARN potentiellement importés. Ces données permettront d’élargir les connaissances sur les voies d’adressage mitochondrial des ARN, leurs mécanismes et leur régulation, et d’optimiser les stratégies thérapeutiques basées sur l’import d’ARN
Mutations in the human mitochondrial genome are often associated with severe neuromuscular disorders. The first part of my thesis project consisted in the development of a therapeutic strategy based on the mitochondrial import of RNA molecules. I demonstrated that the stable expression of recombinant RNA molecules in human cells induced the decrease of the pathogenic mutation load in mitochondrial DNA. In the second part, I developed a nex method, CoLoC-seq, for the large-scale identification of RNA species localized in the mitochondria. By applying this method to human cells, I confirmed the mitochondrial targeting of some non-coding cytosolic RNAs and identified new potentially imported RNAs. These data will broaden the knowledge on the pathway of RNA targeting into the mitochondria, its mechanisms and regulation, and will allow optimization of the therapeutic strategies based on RNA import

La peau est un épithélium spécialisé vital et fragile, qui évolue avec l’âge et est influencé par l’environnement, notamment les radiations solaires. Des données sont disponibles sur la réponse du réseau mitochondrial et le devenir des mitochondries endommagées en réponse à des stress chimiques et environnementaux dans plusieurs systèmes expérimentaux, mais ces processus restent peu étudiés dans les cellules cutanées. Dans ce contexte, le projet de thèse visait à analyser l’effet (i) de l’irradiation UVB sur la dynamique mitochondriale (en particulier la fragmentation des mitochondries) dans des kératinocytes primaires humains normaux, qui constituent la première ligne de défense contre les agressions externes ; (ii) d’un traitement par des poisons mitochondriaux sur les mitochondries contenues dans des kératinocytes ou des fibroblastes primaires humains normaux. Dans un premier axe de la thèse, nous avons mis au point une méthode originale (Mitoshape) basée sur l’imagerie confocale, permettant d’estimer à la fois qualitativement et quantitativement la morphologie du réseau mitochondrial dans des cellules vivantes après irradiation UVB. Grâce à cette technologie, nous avons pu montrer que les UVB induisaient une fragmentation du réseau mitochondrial dans les kératinocytes primaires, dont nous avons étudié les acteurs biochimiques. Dans un deuxième axe, nous avons montré que les poisons mitochondriaux avaient la capacité d’endommager les mitochondries dans des kératinocytes et des fibroblastes humains primaires et induisaient une autophagie générale sans toutefois exclure la présence d’une mitophagie dépendante de la voie PINK1/PARKIN. Outre son intérêt fondamental, ce travail (réalisé en collaboration avec la société de cosmétologie SILAB dans le cadre d’un partenariat industriel CIFRE) ouvre la voie à l’identification d’actifs naturels capables de préserver et/ou restaurer les paramètres fonctionnels mitochondriaux suite à des stress
The skin is a specialized type of epithelium, both vital and fragile, which evolves with age and is continuously exposed to environmental stresses, such as solar radiations. While data is available about the response of the mitochondrial network and the fate of damaged mitochondria after chemical or environmental stresses in numerous experimental systems, little is known about these processes in skin cells. The aim of the present thesis was to study the impact (i) of UVB irradiation on mitochondrial dynamics (especially mitochondrial fragmentation) in normal human epidermal keratinocytes, which represent the first line of defence against environmental insults; (ii) of poisoning mitochondria of keratinocytes and normal human fibroblasts with chemical drugs. In a first axis, we developed an original method (called Mitoshape) based on confocal microscopy, to estimate qualitatively and quantitatively the morphology of the mitochondrial network within live cells following UVB irradiation. Using this technology, we demonstrated that UVB irradiation induces mitochondrial fragmentation in normal human keratinocytes, and studied the biochemical actors involved in this response. In a second axis, we showed that the use of mitochondrial poisons could damage mitochondria of keratinocytes and normal human fibroblasts and induce bulk autophagy, although it is not possible to formally rule out the involvement of a PINK1/PARKIN-dependent pathway of mitophagy. In addition to its fundamental interest, this work (performed in collaboration with the cosmetic company SILAB in the context of a CIFRE PhD fellowship from ANRT) paves the way for the screening of novel bioactive agents able to protect and restore mitochondria following stresses

La connaissance des mécanismes moléculaires qui contrôlent le système génétique des mitochondries reste très parcellaire. Ceci est largement dû à l'incapacité de manipuler leur génome avec les méthodologies conventionnelles. Nous développons une nouvelle approche basée sur l'import naturel des ARNt. Nous utilisons un mime d'ARNt comme navette pour importer dans les mitochondries des cellules végétales des séquences-passagères fixées en 5'. Après transcription dans le noyau, les ARN chimériques sont adressés aux mitochondries. L'import de séquences allant jusqu'à 154 nucléotides a été obtenu. Le processus suit la spécificité de l'import naturel des ARNt. Un trans-ribozyme à tête de marteau ciblé contre l'ARNm mitochondrial atp9 a été élaboré et importé dans les mitochondries grâce à ce système, entraînant ainsi le premier "knockdown" d'un ARN mitochondrial dans des cellules de plante. Le phénotype associé était un retard de croissance. L'analyse de la quantité d'une vingtaine d'ARNm a permis de démontrer une diminution de 70% de l'ARNm nucléaire de l'oxydase alternative 1 (aox-1) suite au knockdown de l'ARNm atp9, avec une forte chute de la protéine correspondante dans les mitochondries et une diminution de la consommation d'oxygène. Ces résultats mettent en évidence l'influence d'un événement mitochondrial sur l'expression d'un gène nucléaire, démontrant ainsi l'existence d'une régulation rétrograde. Dans une optique de thérapie génique, la transposition du système de navette a été tentée dans des cellules humaines. Tous les ARN chimériques élaborés étaient arrêtés dans l'espace intermembranaire des mitochondries. D'autres mimes d'ARNt devront donc être testés
The understanding of the molecular mechanisms which control the genetic system of mitochondria remains restricted. This is mainly due to the impossibility to manipulate their genome with conventional methods. We are developing an alternate approach based on the physiological mechanism of tRNA import. We use a tRNA mimic as a shuttle to import into mitochondria in plant cells passenger RNAs attached to its 5' end. Following nuclear transformation and transcription in the nucleus, the chimeric RNAs are targeted to mitochondria. So far, we obtained the import of passenger sequences up to 154 nucleotides in size into the mitochondria of transformed plant cells. The process follows the natural specificity of the tRNA import pathway. A trans-cleaving hammerhead ribozyme targeted to the mitochondrial atp9 mRNA was designed and imported into mitochondria as a passenger RNA attached to the tRNA mimic, yielding the first knockdown of a mitochondrial RNA in plant cells. The associated phenotype was a decrease in cell growth rate. The analysis of the level of about twenty mRNAs showed that the atp9 mRNA knockdown led to a 70% decrease of the nuclear-encoded alternative oxidase (aox-1) mRNA, with a strong drop in the amount of the corresponding protein in mitochondria and a decrease in the oxygen consumption. These results highlight the influence of a mitochondrial event on the expression of a nuclear gene, demonstrating the existence of a retrograde regulation. From a gene therapy point of view, we tried to transpose our shuttling system into human cells. All chimeric RNAs used were retained in the intermembrane space of the mitochondria. Thus, other tRNA mimics need to be tested

Des mutations dans le génome mitochondrial donnent lieu à l’apparition de maladies neuro-dégénératives ou de myopathies. Pour développer des approches de thérapie génique pour prévenir de ces syndromes, nous devons mieux comprendre les mécanismes moléculaires d’import mitochondrial des ARN. Pour cela nous tentons de récapituler in vitro l’import des ARN à partir d’extraits cellulaires fractionnés par différentes méthodes telles que la chromatographie d’exclusion ou d’affinité à l’aide d’étiquettes d’ARN ou de protéines. Nos résultats affinent nos connaissances de ces mécanismes et permettent d’avancer l’idée que l’énolase, une enzyme de la glycolyse, n’agit pas seule lors de la première étape de l’import de l’ARNtLys avec anticodon CUU (tRK1). En effet nous avons montré que l’énolase ultra-purifiée ne se fixait plus à tRK1 in vitro, alors que des préparations de mitochondries de levure récapitulaient l’import lorsque diverses fractions ajoutées à l’énolase étaient testées. Les fractionnements d’extraits opérés permettent de cerner certaines protéines qui pourraient fonctionner de concert avec l’énolase pour véhiculer tRK1 vers la mitochondrie
Mutations in the mitochondrial genome give rise to neurodegenerative diseases or myopathies. To develop gene therapy for preventing the appearance of these syndromes, we need to better understand the molecular mechanisms of mitochondrial RNA. For this purpose we try to recapitulate in vitro the import of RNA from cell extracts fractionated by different methods such as exclusion or affinity chromatography using tagged RNAs or proteins. Our results refine our knowledge of these mechanisms and allow to advance the idea that enolase, an enzyme of glycolysis, does not act alone during the first stage of import of tRNALys with anticodon CUU (tRK1). Indeed, we have shown that ultra-purified enolase no longer binds to tRK1 in vitro, while preparations of yeast mitochondria recapitulate the import when various fractions mixed with enolase were tested. The performed extracts fractionation make it possible to point to certain proteins which could work in concert with the enolase to convey tRK1 to mitochondria

Les défauts de génome mitochondrial provoquent des maladies neuromusculaires, pour lequel aucun traitement efficace n'a été mis au point. La plupart des mutations mitochondriales sont hétéroplasmique, ce qui signifie que l'ADN mitochondrial (ADNmt) de type sauvage et muté coexistent dans la même cellule, et le changement de proportion entre deux types d'ADNmt pourrait rétablir les fonctions mitochondriales. Le but du projet était le développement du système pour cibler l'ARN thérapeutique dans les cellules humaines vivantes. Au cours de ma thèse j'ai synthétisé une série de nouveaux ARN anti-réplicatifs contenant modifications chimiques pour augmenter leur stabilité dans la cellule, et mis au point la nouvelle méthode de synthèse chimique des molécules d'ARN contenant cholestérol fixé par l'intermédiaire d'un pont biodégradable. Ces ARN étaient capable de pénétrer dans les cellules humains, d'être adressées dans les mitochondries et de diminuer la proportion d' ADNmt muté
Defects in mitochondrial genome cause neuromuscular diseases, for which no efficient therapy has been developed. Since most mitochondrial mutations are heteroplasmic, wild type and mutated mitochondrial DNA (mtDNA) coexist in the same cell, and the shift in proportion between two mtDNA types could restore mitochondrial functions. The aim of the project was development of carrier-free system for targeting the therapeutic mitochondrially importable RNA into living human cells. During my PhD study, I have synthesized a set of new anti-replicative RNAs containing various chemical modifications, aiming to increase their stability in the cell, and developed a new method for the chemical synthesis of RNA molecules containing cholesterol attached through a biodegradable bridge. Cholesterol containing antireplicative RNAs were characterised by efficient cellular uptake, partial colocalisation with mitochondria and ability to decrease the proportion of mutant mtDNA

Les mutations dans l’ADN mitochondrial (ADNmt) sont la cause de nombreuses pathologies, pour la plupart des myopathies et des maladies neurodégénératives. La majorité de ces mutations sont hétéroplasmiques, signifiant que les molécules d’ADNmt muté coexistent au sein de la même cellule avec des molécules d’ADNmt sauvage. Ce n’est cependant en général qu’à partir d’un seuil d’hétéroplasmie de l’ordre de 70% que les symptômes de la maladie apparaissent. L'objectif de cette thèse a été de tester si le taux d’hétéroplasmie pouvait être diminué en adressant des oligonucléotides complémentaires à l’ADNmt muté dans les mitochondries par la voie d’import des ARN afin d’inhiber leur réplication. Pour ce faire, nous avons utilisé un petit ARN artificiel construit sur la base des déterminants d’importation de l’ARNt Lys CUU importé dans les mitochondries de levure. Les résultats obtenus ont permis de montrer que cet ARN pouvait servir de vecteur pour importer dans les mitochondries humaines les oligonucléotides au potentiel anti-réplicatif et que ces derniers étaient capables d’inhiber la réplication des molécules d’ADNmt muté sans affecter celles des molécules d’ADNmt sauvage. C’est la première fois que la validité de cette stratégie dite anti-génomique a pu être testée dans un modèle de cellules humaines en culture, ce qui pourrait aboutir à une alternative prometteuse pour traiter les maladies mitochondriales causées par des mutations dans l’ADNmt
Mitochondrial DNA mutations, important cause of incurable human neuromuscular diseases, are mostly heteroplasmic: mutated mtDNA is present in cells simultaneously with wild-type genomes, the pathogenic threshold being generally > 70% of mutant mtDNA. We studied if heteroplasmy level could be decreased by RNAs complementary to mutant mtDNA regions. To target specifically designed oligoribonucleotides into the organelle, mitochondrial import of RNA was exploited, the pathway delivering nucleic acids into mitochondria in vivo. Using mitochondrially targeted RNAs as mitochondrial vectors we demonstrated, in cultured transmitochondrial cybrid cells, that RNAs complementary to the mutant mtDNA region can specifically reduce the proportion of mtDNA bearing a large deletion associated with the Kearns Sayre Syndrome. These findings may be relevant to developing of a new tool for therapy of mtDNA associated diseases

Dans les cellules eucaryotes aerobies, l'energie provient essentiellement de l'atp synthetise par les phosphorylations oxydatives (oxphos) au niveau de l'atpase-atpsynthetase f0-f1. L'atp est alors exporte hors des mitochondries par le translocateur des nucleotides adenyliques (ant). Certaines sous-unites des complexes oxphos sont codees par l'adn mitochondrial (adnmt), les autres par l'adn nucleaire et importees dans les mitochondries par un mecanisme faisant intervenir le potentiel de membrane mitochondrial (pmm) etabli par les oxphos. Nous avons verifie que 2 lignees de cellules rho o humaines sont totalement depourvues d'adnmt, d'arn et de proteines codees par l'adnmt. Par contre, elles importent normalement des proteines d'origine nucleaire dans leurs mitochondries. Comment un pmm suffisant pour cette importation peut s'etablir dans les rho o en l'absence des oxphos ? nous avons montre que les rho o, depourvues des 2 sous-unites du facteur f0 de l'atpase-atpsynthetase codees par l'adnmt, ont un f1 assemble et fonctionnel pour hydrolyser de l'atp. De plus, 2 inhibiteurs specifiques de f1 (aurovertine) ou de l'ant (acide bongkrekique) reduisent la croissance et le pmm des rho o. Ainsi, la survie des rho o necessite un pmm suffisant maintenu par l'importation d'atp 4 cytosolique dans la mitochondrie par l'ant qui l'echange contre de l'adp 3 mitochondrial produit par l'atpase-f1. Nous avons egalement utilise les rho o pour determiner l'origine genetique de pathologies dues a un deficit d'un complexe oxphos. Les cellules de 3 patients atteints du syndrome de leigh avec deficit en cytochrome oxydase (cox) ont ete enucleees et fusionnees avec les rho o. L'activite cox etant restauree dans les cybrides, le deficit est localise sur l'adn nucleaire des patients. Par contre, la fusion a ete inutilisable pour determiner l'origine d'un deficit en complexe iii. En effet, le deficit est rapidement perdu dans les lymphocytes en culture suggerant un defaut heteroplasmique de l'adnmt.

Nous avons étudié les effets anti-prolifératif et pro-apoptotique de l’acide ursolique (AU), triterpène contenu dans certains fruits et plantes, sur des lignées cellulaires de la peau : les cellules HaCaT immortalisées, dérivées de kératinocytes humains et les cellules M4Beu issues d’un mélanome humain métastasé. Nous avons mis en évidence l’effet anti-prolifératif dose et temps dépendants de l’AU sur les cellules HaCaT et M4Beu, et montré que cet effet était la conséquence d’un processus apoptotique. En effet, l’activité enzymatique de la caspase-3 est significativement augmentée. Sur les cellules M4Beu, nous avons montré que la voie mitochondriale était la voie de transduction conduisant à l’activation de la caspase-3. Nous avons mis en évidence l’activation de la caspase-9, la chute du potentiel transmembranaire mitochondrial, la libération du cytochrome c, l’augmentation de l’expression de p53, et l’augmentation du ratio Bax/Bcl-2. Sur les cellules HaCaT, l’AU induit à la fois un processus apoptotique et un blocage du cycle cellulaire par augmentation de l’expression de p21. La voie apoptotique impliquée dans cette lignée semble différente de celle mise en évidence dans les cellules M4Beu : si l’activation de la caspase-9 et la libération du cytochrome c ont été montrées dans les cellules HaCaT, la voie mitochondriale ne paraît pas prépondérante. La voie de transduction du signal apoptotique pourrait être la voie extrinsèque ou la voie du réticulum endoplasmique. Au regard des résultats et du fait de sa distribution dans le règne végétal, l’utilisation de l’AU pourrait être envisagé dans le traitement et/ou la prévention du mélanome
In our study, we demonstrated anti-proliférative and pro-apoptotic effect of ursolic acid (UA), a pentacyclic triterpene acid, on skin cells : HaCaT derived keratinocyte cell line and on the M4Beu human melanoma cell line. Our results showed UA had a significant anti-proliferative effect on HaCaT and M4Beu cells, associated with the induction of an apoptotic process, characterized by caspase-3 activation. We demonstrated on M4Beu cells that UA-induced apoptosis was dependent upon the mitochondrial pathway, as shown by caspase-9 activation, by p53 and Bax increases, by transmembrane potential collapse, by cytochrome c leakage and by alteration of the Bax/Bcl-2 balance; with a concomitant increase in Bax expression and decrease in Bcl-2 expression. We demonstrated on HaCaT cells that UA decreased the viability of HaCat cells in a concentration- and time-dependent manner. UA induces apoptotic process and blocked cell cycle predominantly in G1 phase, by p21 increases. To define the apoptotic process, we demonstrated caspase-9 and -3 activation. Moreover, we also showed that UA induced cytochrome c leakage with a slight drop of ΔΨm. But we did not show neither an increasing of p53 and Bax nor an alteration of the Bax/Bcl-2 balance. The apoptotic pathway seems different of this demonstrated for M4Beu cell lines. The mitochondrial pathway does not seem predominant. The apoptotic signal transduction pathway could be extrinsic pathway or endoplasmic reticulum pathway. With our results and with the fact of his distribution in vegetal reign, the utilization of UA could be to consider in treatment and/or prevention against melanoma

Les mitochondries sont impliquées dans de nombreuses voies métaboliques, et des mutations au sein de leur génome (ADNmt) conduisent à l’apparition de nombreuses pathologies. A l’heure actuelle, il n’existe aucun traitement contre ces affections mais différentes pistes thérapeutiques sont envisagées. L’objectif de ce travail a consisté en la mise au point d’une telle stratégie, dite anti-réplicative via l’exploitation de la voie d’import naturelle des ARN dans les mitochondries. De petits ARN artificiels importables dans les mitochondries humaines ont ainsi été utilisés comme vecteurs pour y importer une séquence capable de s’hybrider spécifiquement à l’ADNmt mutant et d’en stopper sa réplication. Les résultats obtenus ont permis de prouver la validité de cette stratégie vis-à-vis d’une large délétion et de mutations ponctuelles liées à divers cas pathologiques et de caractériser l’effet de modifications chimiques sur la stabilité, l’import et l’efficacité de ces ARN recombinants
Mitochondria are involved in many metabolic pathways, and mutations in their genome (mtDNA) can cause a wide range of human disorders. No efficient treatment against these pathologies is currently available. The objective of this work consisted in the development of a therapeutic approach, called anti-replicative, based on the use of the natural pathway of RNA import into mitochondria. Small artificial RNA molecules able to be imported into human mitochondria have been used as vectors to address oligoribonucleotides capable to hybridize specifically to mutant mtDNA and to stop its replication. The effect of various chemical modifications on the stability, import and efficiency of these recombinant RNA has been characterized. All the data obtained prove the validity of the anti-replicative strategy for mtDNA containing a large deletion or pathogenic point mutations and can be considered as an important step to further develop an efficient therapy of mitochondrial diseases

Le traitement des leucémies aiguês fait appel, non seulement aux agents cytotoxiques qui induisent la mort des cellules leucémiques, le plus souvent par apoptose, mais aussi aux agents différenciants, c'est-à-dire capables de restaurer la capacité de différenciation des cellules tumorales. Ces deux approches thérapeutiques peuvent être utilisées simultanément. Dans une première partie, nous avons étudié les relations entre l'induction de la différenciation monocytaire/macrophagique des cellules leucémiques humaines U937 par les esters de phorbol et la réponse apoptotique aux agents cytotoxiques. Nous avons montré que la différenciation inhibait l'apoptose induite par divers médicamentsanticancéreux (étoposide, vinblastine) sans pour autant altérer les étapes mitochondriales et post-mitochondriales des voies de signalisation de la mort cellulaire. Ces observations nous ont conduit à montrer que les cellules différenciées restent au moins aussi sensibles que les cellules non différenciées à l'induction de l'apopotose par des agents ciblant directement la mitochondrie comme la lonidamide et le trioxide d'arsenic. Les molécules impliquées dans la mort cellulaire jouent probablement un rôle dans d'autres voies du métabolisme cellulaire. C'est ainsi que les caspases semblent jouer un rôle dans le contrôle de la prolifération des lymphocytes T et dans la différenciation des cellules de la lentille, des kératinocytes et des érythrocytes. Dans une seconde partie, nous nous sommes intéressés aux relations entre le processus de différenciation des cellules hématopoîétiques et les molécules impliquées dans la mort cellulaire. Ceci nous a conduit à 3 observations : (1) la répartition subcellulaire des procaspases varie au cours de la différenciation m macrophagique des cellules U937; (2) les caspases sont activées au cours de la différenciation des cellules leucémiques. Cette activation est transitoire et probablemnet contrôlée par la relocalisation de la protéine anti-apoptotique c-IAP1, tandis que Bcl-2 mainyient l'activité caspases et bloque la différenciation ; (3) il existe une balance entre activation des caspases et métabolismes oxydatif au cours de la différenciation.