Добірка наукової літератури з теми "Microscopie d'imagerie à haut débit"

L’évaluation de l’état écologique des cours d’eau repose sur le calcul d’indices de qualité basés sur la sensibilité de certains groupes biologiques, dont les diatomées, à la pollution. La détermination et la quantification des espèces de diatomées reposent généralement sur des méthodes d’identification morphologique en microscopie qui peuvent paraître complexes, chronophages et relativement onéreuses. Au cours de la dernière décennie, une nouvelle méthode de biologie moléculaire basée sur l’ADN a été développée, permettant d’identifier les espèces sur la base de critères génétiques plutôt que sur des critères morphologiques : le métabarcoding. En combinaison avec les technologies de séquençage à haut débit, le métabarcoding permet d’identifier l’ensemble des espèces présentes au sein d’un échantillon environnemental et de traiter plusieurs centaines d’échantillons en parallèle. Cet article présente les résultats de deux études récentes menées sur les cours d’eau de Mayotte (2013-2018) et de France métropolitaine (2016-2018), visant à tester le potentiel d’application du métabarcoding pour la bio-indication au sens de la directive cadre sur l’eau (DCE). Nous abordons les différents développements méthodologiques et optimisations qui ont été réalisés pour fiabiliser les inventaires taxonomiques de diatomées produits en métabarcoding, notamment en matière de quantification des espèces basée sur l’abondance relative des séquences ADN. Nous présentons ensuite les résultats d’application de l’approche moléculaire pour l’évaluation de l’état écologique de plus de 500 sites de cours d’eau nationaux, en les confrontant avec les résultats obtenus via l’approche classique en morphologie. Finalement, nous discutons du potentiel d’application en routine du métabarcoding à l’échelle des réseaux de surveillance des cours d’eau, de ses limites d’application et proposons certaines recommandations pour une future implémentation complémentaire à l’approche morphologique actuellement prescrite dans les arrêtés réglementaires.

A la question «Qui de l’oeuf ou de la poule est né le premier ?» Silésius répondait «l’oeuf est dans la poule et la poule dans l’oeuf» soulignant sa dualité, le passage du deux en un. Dans l’imagerie populaire, l’oeuf reflète le tout et son contraire, fragilité, protection, épargne, abondance (être «plein comme un oeuf»), richesse («avoir pondu ses oeufs»), éternité (le Phénix est né de l’oeuf) mais aussi mort et destruction («casser ses oeufs» se dit d’une fausse couche). Dans la mythologie de nombreuses civilisations, l’oeuf est le symbole de la naissance du monde (Apollon, le dieu grec de la lumière est né de l’oeuf). L’oeuf décoré apparu 3000 ans avant J.-C. en Ukraine fête, au printemps, le retour de la fécondité de la nature ; l’oeuf de Pâques la résurrection du Christ. L’oeuf est un tout à condition d’en sortir ! Fragile cependant car selon La Fontaine briser l’oeuf de la poule aux oeufs d’or (par curiosité) rompt l’effet magique (Auer et Streff 1999). Pour l’Homme, l’oeuf séduit pour sa valeur nutritionnelle, sa diversité d’utilisation en cuisine et son prix modique. Il en existe une grande diversité, de l’oeuf de Colibri (0,5 g) à l’oeuf de l’Aepyornis (8 litres soit l’équivalent de 150 oeufs), un oiseau de Madagascar (500 kg) disparu au 18ème siècle. Mais l’Homme ne consomme que l’oeuf de caille, de poule ou de cane. L’ère moderne a considérablement intensifié la production de ces deux dernières espèces car les poules saisonnées, qui étaient élevées avec soin par la fermière, ont plus que doublé leur production en 60 ans (de 120 oeufs par an dans les années 50 à plus de 300 aujourd’hui). Cette révolution technique résulte des efforts conjugués de la sélection génétique, d’une alimentation raisonnée répondant aux besoins nutritionnels, d’une évolution du système de production (apparition des cages) et d’une meilleure connaissance de la pathologie aviaire. Qu’en est-il du contrôle de la qualité nutritionnelle, organoleptique, technologique et hygiénique de l’oeuf ? L’oeuf est la plus large cellule reproductrice en biologie animale. Il assure dans un milieu externe le développement et la protection d’un embryon dans une enceinte fermée matérialisée par la coquille. Aussi, une de ses particularités est la diversité de ses constituants, de leur parfait équilibre nutritionnel et leur forte digestibilité, qui assure la croissance d’un être vivant. Ces caractéristiques sont à l’origine de la qualité nutritionnelle exceptionnelle de l’oeuf pour l’Homme. Une autre particularité est la présence d’une protection physique, la coquille mais, aussi d’un système complexe de défenses chimiques. Aussi, ce produit est-il remarquable de par son aptitude à engendrer la vie et pour l’oeuf de table à se conserver. Outre les éléments nutritifs, on y trouve de multiples molécules participant au développement et à la protection de l’embryon (molécules antibactériennes, antivirales, antioxydantes). Certaines d’entre elles, comme par exemple le lysozyme de blanc d’oeuf, sont partiellement valorisées par différents secteurs industriels (agroalimentaire, cosmétique, santé animale/humaine). La révélation récente d’un grand nombre de nouveaux constituants de l’oeuf, suite au séquençage génomique de la poule et au développement de la biologie intégrative, a conforté l’existence d‘activités antimicrobiennes, anti-adhésives, immuno-modulatrices, hypertensives, anticancéreuses, antiinflammatoires ou cryoprotectrices, prometteuses en médecine humaine et devrait à terme enrichir le potentiel d’utilisation de ce produit en agroalimentaire et en santé. L’objet de ce numéro spécial d’INRA Productions Animales est de rassembler les principales informations qui ont contribué au développement économique récent de ce produit, de rappeler les efforts en génétique, élevage et nutrition qui ont assuré des progrès quantitatifs et qualitatifs remarquables de la production et de la qualité des oeufs au cours des trente dernières années. Les poules élevées à l’origine par la femme pour un usage domestique se comptent aujourd’hui par milliers dans les élevages. Quelle sera la durabilité de ce système d’élevage dans un contexte socio-économique européen remettant en cause en 2012 le système éprouvé de production conventionnel d’oeufs en cage pour des cages aménagées ou des systèmes alternatifs avec ou sans parcours ? Notre objectif est d’analyser les facteurs qui contribueront à son maintien, notamment le contrôle de la qualité de l’oeuf. Il est aussi de décrire l’évolution spectaculaire des connaissances sur ce produit liée au développement des techniques à haut débit et des outils d’analyse des séquences moléculaires. Il permettra enfin d’actualiser les atouts de ce produit. Ce numéro est complémentaire d’un ouvrage plus exhaustif sur la production et la qualité de l’oeuf (Nau et al 2010). Le premier article de P. Magdelaine souligne la croissance considérable en 20 ans de la production d’oeufs dans les pays d’Asie et d’Amérique du Sud (× 4 pour la Chine, × 2 en Inde et au Mexique). En revanche, les pays très développés notamment européens à forte consommation (> 150 oeufs/hab) ont stabilisé leur production malgré une évolution importante de la part des ovoproduits mais aussi de leurs systèmes de production. La consommation des protéines animales entre pays est tout aussi hétérogène puisque le ratio protéines de l’oeuf / protéines du lait varie de 0,4 au USA, à 0,9 en France et 2,7 en Chine ! Le doublement de la production mondiale d’oeufs en 20 ans n’a été possible que grâce à des progrès techniques considérables. La sélection génétique a renforcé les gains de productivité (+ 40 oeufs pour une année de production et réduction de l’indice de consommation de 15% en 20 ans !). L’article de C. Beaumont et al décrit cette évolution, la prise en compte croissante de nouveaux critères de qualité technologique, nutritionnelle ou sanitaire. Ces auteurs soulignent les apports des nouvelles technologies, marqueurs moléculaires et cartes génétiques sur les méthodes de sélection. Ils dressent un bilan actualisé des apports et du potentiel de cette évolution récente en sélection. Le séquençage génomique et le développement de la génomique fonctionnelle est aussi à l’origine d’une vraie révolution des connaissances sur les constituants de l’oeuf comme le démontre l’article de J. Gautron et al. Le nombre de protéines identifiées dans l’oeuf a été multiplié par plus de dix fois et devrait dans un avenir proche permettre la caractérisation fonctionnelle de nombreuses molécules. Il donne aussi de nouveaux moyens pour prospecter les mécanismes d’élaboration de ce produit. Un exemple de l’apport de ces nouvelles technologies est illustré par l’article de Y. Nys et al sur les propriétés et la formation de la coquille. Des progrès considérables sur la compréhension de l’élaboration de cette structure minérale sophistiquée ont été réalisés suite à l’identification des constituants organiques de la coquille puis de l’analyse de leur fonction potentielle élucidée grâce à la disponibilité des séquences des gènes et protéines associés. La mise en place de collaborations internationales associant de nombreuses disciplines, (microscopie électronique, biochimie, cristallographie, mécanique des matériaux) a démontré le rôle de ces protéines dans le processus de minéralisation et du contrôle de la texture de la coquille et de ses propriétés mécaniques. Cette progression des connaissances a permis de mieux comprendre l’origine de la dégradation de la solidité de la coquille observée chez les poules en fin d’année de production. La physiologie de la poule est responsable d’évolution importante de la qualité de l’oeuf. Aussi, l’article de A. Travel et al rappelle l’importance d’effets négatifs de l’âge de la poule contre lequel nous disposons de peu de moyens. Cet article résume également les principales données, souvent anciennes, concernant l’influence importante des programmes lumineux ou de la mue pour améliorer la qualité de l’oeuf. Enfin, il souligne l’importance de l’exposition des poules à de hautes températures ambiantes sur leur physiologie et la qualité de l’oeuf. Le troisième facteur indispensable à l’expression du potentiel génétique des poules, et déterminant de la qualité technologique et nutritionnelle de l’oeuf, est la nutrition de la poule. Elle représente plus de 60% du coût de production. L’article de I. Bouvarel et al fait le point sur l’influence de la concentration énergétique de l’aliment, de l’apport en protéines et acides aminés, acides gras et minéraux sur le poids de l’oeuf, la proportion de blanc et de jaune ou sa composition notamment pour obtenir des oeufs enrichis en nutriments d’intérêt en nutrition humaine. Cependant, la préoccupation principale des éleveurs depuis une dizaine d’année est la mise en place en 2012 de nouveaux systèmes de production d’oeufs pour assurer une meilleure prise en compte du bien-être animal. L’article de S. Mallet et al traite de l’impact des systèmes alternatifs sur la qualité hygiénique de l’oeuf. Ces auteurs concluent positivement sur l’introduction de ces nouveaux systèmes pour la qualité hygiénique de l’oeuf une fois que les difficultés associées aux méconnaissances d’un nouveau système de production seront résolues. La qualité sanitaire de l’oeuf est la préoccupation majeure des consommateurs et un accident sanitaire a des conséquences considérables sur la consommation d’oeufs. L’article de F. Baron et S. Jan résume d’une manière exhaustive l’ensemble des éléments déterminants de la qualité microbiologique de l’oeuf et des ovoproduits : mode de contamination, développement des bactéries dans les compartiments de l’oeuf, défenses chimiques du blanc et moyens pour contrôler la contamination des oeufs et des ovoproduits. Le consommateur ne souhaite pas, à juste titre, ingérer d’éventuels contaminants chimiques présents dans ses aliments. L’article de C. Jondreville et al analyse ce risque associé à la consommation des oeufs. Il est exceptionnel de détecter la présence de polluants organiques au seuil toléré par la législation. Les auteurs insistent notamment sur l’importance de contrôler la consommation par les animaux élevés en plein air de sols qui peuvent être une source de contaminants. Une caractéristique de l’évolution de la production d’oeufs est le développement des ovoproduits qui répondent parfaitement à l’usage et à la sécurité sanitaire exigée en restauration collective. L’article de M. Anton et al décrit le processus d’obtention et l’intérêt des fractions d’oeufs du fait de leurs propriétés technologiques (pouvoirs moussant, foisonnant, gélifiant ou émulsifiant). Les différents processus de séparation, de décontamination et de stabilisation sont analysés pour leur effet sur la qualité du produit final. Enfin le dernier article de ce numéro spécial de F. Nau et al se devait d’aborder la principale qualité de l’oeuf qui conditionne son usage : la qualité nutritionnelle de ce produit pour l’Homme. Cet article actualise l’information dans ce domaine et fait le point sur les atouts nutritionnels en tentant de corriger de fausses idées. L’oeuf présente un intérêt nutritionnel du fait de la diversité et l’équilibre de ces constituants pour l’Homme mais mériterait plus d’études pour mieux évaluer son potentiel réel. En conclusion, l’oeuf est la source de protéines animales ayant la meilleure valeur nutritionnelle, la moins chère, facile d’emploi et possédant de nombreuses propriétés techno-fonctionnelles valorisées en cuisine. Dans les pays développés, l’oeuf a souffert jusqu’à aujourd’hui d’une image entachée par plusieurs éléments négatifs aux yeux des consommateurs : sa richesse en cholestérol, le risque sanitaire associé à sa consommation sous forme crue ou son système de production en cage. L’évolution des connaissances sur le risque cardio-vasculaire, les progrès réalisés sur le contrôle sanitaire des Salmonelloses en Europe et la modification radicale des systèmes de production d’oeufs devraient modifier positivement son image. La consommation de protéines de l’oeuf a augmenté de plus de 25% en 20 ans (2,53 g/personne/j vs 4,3 g pour le lait en 2005) et poursuivra sa croissance rapide notamment dans les pays en développementoù sa consommation par habitant reste faible. Cette évolution considérable de la production de ce produit devrait être mieux intégrée dans les formations des écoles spécialisées en productions animales. L’oeuf restera dans l’avenir une des sources de protéines animales dominantes et l’acquisition de connaissances sur la fonction des nombreux constituants récemment mis à jour devait renforcer son intérêt pour la santé de l’Homme. Je ne voudrais pas terminer cette préface sans remercier au nom des auteurs, Jean-Marc Perez, le responsable de la revue INRA Productions Animales, d’avoir pris l'initiative de la publication de ce numéro spécial dédié à l'oeuf et d’avoir amélioré par plusieurs lectures attentives la qualité finale des textes. Je voudrais aussi adresser mes remerciements à sa collaboratrice Danièle Caste pour le soin apporté dans la finition de ce document. Enfin, je n'oublie pas le travail d'évaluation critique des projets d'article par les différents lecteursarbitres que je tiens à remercier ici collectivement. Auer M., Streff J., 1999. Histoires d’oeufs. Idées et Calendes, Neuchatel, Suisse, 261p.Nau F., Guérin-Dubiard C., Baron F., Thapon J.L., 2010. Science et technologie de l’oeuf et des ovoproduits, Editions Tec et Doc Lavoisier, Paris, France, vol 1, 361p., vol 2, 552p.

Les maladies infectieuses ont de tout temps constitué une menace pour l'humanité. La preuve en a encore été faite récemment par la pandémie de COVID-19 (COronaVIrus Disease 2019). Cependant, cette dernière a également mis en avant le potentiel des nanotechnologies pour le développement de thérapies innovantes, grâce aux vaccins contenant des nanoparticules (NPs) pour la protection et la vectorisation d'ARN messager. Ce travail explore le potentiel de NPs de PLGA (acide poly(lactique-co-glycolique)) pour le traitement de deux maladies pulmonaires : la tuberculose, un mal vieux de plusieurs millénaires ainsi que la maladie infectieuse la plus meurtrière actuellement, et le COVID-19, la deuxième pandémie de ce siècle.Pour commencer, un travail de recherche bibliographique s'intéresse à la physiopathologie et au traitement de Mycobacterium tuberculosis (Mtb), mais surtout à l'évolution des NPs depuis trente ans pour l'optimisation de la thérapie antituberculeuse. Cette revue, publiée dans Pharmaceutics en 2023, met en exergue les NPs et antibiotiques les plus étudiés pour y parvenir, et donne des pistes sur l'avenir des traitements personnalisés.Pour l'étude des NPs de PLGA préparées, une technique de caractérisation, la NTA (nanoparticle tracking analysis), est détournée de son usage originel pour l'exploration des interactions cellules-NPs. En effet, les NPs sont incubées avec des cultures cellulaires avant que les surnageants ne soient analysés par NTA, permettant ainsi de quantifier leur internalisation au cours du temps. Un tel usage, détaillé dans un article paru dans l'International Journal of Pharmaceutics en 2021, n'avait jamais été décrit dans la littérature auparavant.Le potentiel des NPs pour le ciblage de Mtb est ensuite exploré. In vitro, il s'avère que les NPs sont préférentiellement internalisées par les cellules infectées par rapport aux cellules non-infectées. En outre, il existe une corrélation positive entre le nombre de bactéries intracellulaires et le nombre de NPs capturées. In vivo, chez la souris, une seule injection de NPs en intranasal permet de cibler l'organe d'intérêt (les poumons), le type cellulaire d'intérêt (les macrophages alvéolaires, siège de l'infection par Mtb), ainsi que les cellules infectées par rapport aux cellules non-infectées, les premières capturant trois fois plus de NPs en moyenne que les secondes. Ces résultats ont fait l'objet d'un article actuellement en cours de révision.Enfin, une étude est menée pour encapsuler et solubiliser une molécule active au sein des NPs pour le traitement du COVID-19. Un travail d'optimisation permet d'obtenir un taux d'encapsulation de 98,3%, une charge de 24,9%, et une concentration dans l'eau de 5 mg/mL pour cette molécule hydrophobe. Son mécanisme de libération est également étudié. Chez la souris et chez le hamster, il apparaît que quelques injections en intranasal seulement permettent de réduire la charge virale pulmonaire de 1,4 log10/mL, avec une toxicité très limitée. Par ailleurs, il est démontré chez la souris que la molécule encapsulée empêche l'inflammation pulmonaire habituellement associée au COVID-19. Cette étude, qui sera prochainement soumise pour publication, pose les bases d'une thérapie post-infection pour les sujets les plus vulnérables face au virus. D'autres résultats non-inclus dans l'article, par ailleurs, s'intéressent à différentes formulations de NPs pour influer sur la libération de la molécule et prolonger son activité antivirale et anti-inflammatoire in vivo. L'ensemble de cette étude a fait l'objet d'un dépôt de brevet en 2023.En conclusion, ce travail démontre le potentiel des NPs de PLGA pour le traitement de deux des maladies infectieuses pulmonaires les plus meurtrières actuellement, et offre des perspectives pour des études futures
Infectious diseases have always been a threat to mankind, as reminded by the recent COVID-19 (COronaVIrus Disease 2019) pandemic. However, the latter has also highlighted the potential of nanotechnologies for the development of innovative therapies, thanks to vaccines containing nanoparticles (NPs) for messenger RNA protection and vectorization. This work explores the potential of PLGA (poly(lactic-co-glycolic acid)) NPs for the treatment of two lung diseases: tuberculosis (TB), a millennia-old ailment as well as the deadliest infectious disease worldwide, and COVID-19, the second pandemic of this century.To begin with, we take interest in the physiopathology and treatment of Mycobacterium tuberculosis (Mtb), but most of all, in the evolution of NPs over the last thirty years for the optimization of TB therapy. This literature review, published in Pharmaceutics in 2023, highlights the most studied NPs and antibiotics to this end, and offers perspectives for the future of advanced and tailored treatments.For the study of the prepared PLGA NPs, a characterization technique, NTA (nanoparticle tracking analysis), is diverted from its original use to explore cell-NP interactions. NPs are incubated with cell cultures before the supernatants are analyzed by NTA, thus enabling to quantify NP internalization over time. Such a use, detailed in an article published in the International Journal of Pharmaceutics in 2021, had never been described in the literature before.The NP potential for the targeting of Mtb is then explored. In vitro, it appears that NPs are preferentially internalized by infected cells as compared to non-infected ones. Furthermore, there is a positive correlation between the number of intracellular bacteria and the number of captured NPs. In vivo, in a mouse model, a single intranasal NP injection allows for the targeting of the organ of interest (the lungs), the cell type of interest (alveolar macrophages, the site of Mtb infection), and infected cells rather than non-infected ones, the former capturing three times more NPs on average than the latter. These results are the subject of an article currently being reviewed.Finally, a study takes interest in the encapsulation and solubilization of an active molecule for the treatment of COVID-19. Optimization studies resulted in drug encapsulation of 98.3%, drug loading of 24.9%, and a concentration in water of 5 mg/mL for this hydrophobic molecule. Its release mechanism was also unraveled. In a mouse and in a hamster model, it appears that a few intranasal injections reduce the lung viral load by 1.4 log10/mL, with very limited toxicity. In a mouse model, the encapsulated molecule is shown to prevent lung inflammation usually associated with COVID-19. This study, which will be submitted for publication shortly, lays the foundations for a post-infection therapy for the most vulnerable patients. Other results, non-included in the article, explore different NP formulations to influence and prolong drug release in vivo. A patent has been filed for this study in 2023.In conclusion, this work demonstrates the potential of PLGA NPs for the treatment of two of the deadliest infectious lung diseases currently, and offers prospects for future studies

Les organismes planctoniques, acteurs clés des écosystèmes, soutiennent les réseaux trophiques et ont un rôle majeur dans les cycles biogéochimiques et la régulation du climat. Tandis que la répartition spatio-temporelle de la diversité planctonique peut être étudiée à plusieurs niveaux, du gène jusqu’à l’écosystème, comprendre les mécanismes qui sous-tendent cette organisation est un défi. En effet, la structure de la diversité résulte de différents processus évolutifs et écologiques qui peuvent agir simultanément sur le vivant. Depuis le début du XXIème siècle, le milieu océanique fait l'objet d’une surveillance croissante. De nombreuses plateformes d’observation ont été déployées permettant l’acquisition de très nombreuses données couvrant de multiples caractéristiques environnementales. En parallèle, les technologies d’étude du vivant se sont développées, conduisant à un échantillonnage sans précédent des organismes planctoniques. En particulier, les données à haut débit de séquençage et d’imagerie permettent de fournir des informations moléculaires, taxonomiques et fonctionnelles à l’échelle des communautés. L’objectif de cette thèse était d’explorer la structure des écosystèmes planctoniques à l’aide des données à haut débit de séquençage et d’imagerie. Le couplage avec les données environnementales pourrait contribuer à une meilleure compréhension de la répartition spatiale de la diversité planctonique, des espèces jusqu’au communautés. Dans une première partie, la diversité génétique de protistes a été étudiée à l’échelle de l’espèce. L’hypothèse était que les données métagénomiques pourraient permettre d’accéder à l’organisation de cette diversité mal caractérisée pour les protistes, ainsi qu’aux mécanismes qui la sous-tendent. Dans une deuxième partie, le lien entre diversité génétique et diversité fonctionnelle a été exploré. La transparence a été ciblée. Ce trait fonctionnel est peu exploré à l’échelle des communautés et les bases moléculaires sont mal identifiées. Une approche permettant de faire émerger ce trait des données d’imagerie a été utilisée, ayant conduit à l’exploration de sa biogéographie et ses bases moléculaires. Dans la dernière partie, le haut potentiel de complémentarité entre jeux de données de séquençage, d’imagerie et environnementaux a été exploré, afin de mettre en lumière la structure multi-échelle de l’écosystème planctonique et d’identifier sa structure globale. Enfin, l’ensemble des résultats a été discuté pour mettre en évidence les apports que peuvent fournir ces données à la compréhension des écosystèmes planctoniques, ainsi que les limites auxquelles elles peuvent faire face
Planktonic organisms are key actors in oceanic ecosystems, which support trophic networks and play a major role in biogeochemical cycles and climate regulation. While the spatio-temporal distribution of planktonic diversity can be investigated at several levels, from the gene to the ecosystem, identifying the underlying mechanisms is challenging. Indeed, the structure of diversity results from different evolutionary and ecological processes that can act simultaneously. Since the beginning of the 21st century, the oceanic environment has been increasingly monitored. Numerous observation platforms have been deployed, leading to the acquisition of a large amount of data for multiple environmental characteristics. At the same time, technologies for studying living organisms have been developed. Thus, an unprecedented sampling of planktonic organisms has taken place. In particular, high-throughput sequencing and imaging data provide molecular, taxonomic and functional information at several biological levels. The objective of this thesis was to explore the structure of planktonic ecosystems using high-throughput sequencing and imaging data. Coupling with environmental data could contribute to a better understanding of the spatial distribution of planktonic diversity, from species to communities. In the first part, the genetic diversity of protists was studied at the species level. The hypothesis was that metagenomics could provide access to the poorly characterized spatial organization of the intraspecific protist genetic diversity, as well as to the mechanisms underlying it. In a second part, the link between genetic diversity and functional diversity was explored. Transparency was targeted. This functional trait is little explored at the community level and its molecular basis is poorly identified. A data-driven approach allowed this trait to emerge from imaging data, leading to the exploration of its biogeography and molecular basis. In the last part, the high potential of complementarity between sequencing, imaging and environmental datasets was explored, in order to highlight the multi-scale structure of the planktonic ecosystem and to identify its global structure. Finally, all the results were discussed to highlight the contributions that these data can provide to the understanding of planktonic ecosystems, as well as the limitations they can face

La psychopathologie de la tuberculose associée à l'épidémie de SIDA et l'apparition de bacilles multi - résistants et extrêmement - résistants conduisent à des situations d’échecs thérapeutiques. Une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le processus de colonisation de l'organisme hôte par Mycobacteriun tuberculosis est nécessaire pour permettre des progrès radicaux en matière de lutte contre la tuberculose. M. Tuberculosis a la capacité de coloniser différents types de cellules pulmonaires constituant ainsi des véritables réservoirs du bacille. Si la contribution du bacille intramacrophagique dans la pathogenèse est bien établie, en revanche, le processus de colonisation des cellules épithéliales par M. Tuberculosis par microscopie haut débit haut contenu et l'avons appliqué au calibrage de 20 000 ARN interférents. Nous avons ainsi identifié 88 gènes candidats impliqués dans la réplication du bac. ARFGAP1 est un régulateur négatif de l'activation d'ARF1 qui est impliqué dans les système de trafic vésiculaire COPI et les voies de signalisation par la phospholipase D. L'ensemble de nos résultats ouvrent de nouvelles perspectives de recherche dans la signalisation intercellulaire de M. Tuberculosis. The current TB lengthy antibiotic therapy fails to be effective against multidrug and extremly resistant strains. To this end, improved understanding of the fundamental biology of this complex disease is needed to come up with radical advances in TB control. Pathology is intimately linked to the interplay between the host immune response and the persistence of the mycobacterium. In the lungs -the major affected organ- M. Tuberculosis has a preferential tropism for alveolar macrophages, dendritic cells and type II alveolar pneumocytes. Whereas the colonization of macrophages by M. Tuberculosis has been comprehensively studied, much less is knowm abaout that of lungs epithelial cells in which the bacillus penetrates but hardly replicates. To uncover key cellular genes involved in the invasion of M. Tuberculosis in pneumocytes, we undertook a genome wide RNAi screening on the M. Tuberculosis infected type II pneumocyte cell model A549. To do this we established a method relying on high content high troughput microscopy enabling the screening of a library of 20 000 RNAi and the selection and confirmation of the 88 RNAi hits. Among them, we carried out a more thorough study on ARFGAP1 for which silencing led to extensive bacterial internalization inside the epithelial cells followed by strong replication. We showed that in the context of out in vitro M. Tuberculosis model of infection, ARFGAP1 negatively regulates ARF1, which impacts on vesicular trafficking, signaling through phospholipase D and actin remodeling. Altogether, our results reveal novel host pathways that are involved in the succesful intracellular colonization of the tubercle becillus. S.

L'immuno-oncologie est un domaine en pleine expansion, à la frontière de la thérapie du cancer. Les immunothérapies du cancer visent à stimuler le système immunitaire de l'organisme pour qu'il cible et attaque la tumeur, grâce à des anticorps thérapeutiques. Ces anticorps se lient spécifiquement aux récepteurs membranaires des cellules T, lymphocytes jouant un rôle central dans la réponse immunitaire, modifiant leur signalisation intracellulaire. Comprendre comment l'organisation spatiale des récepteurs et des protéines de signalisation est régulée, et comment elle détermine l'activation des lymphocytes, est devenu le "Saint Graal" de l'immunologie cellulaire. Dans cette optique, une meilleure compréhension des fonctions des anticorps et du trafic intracellulaire associé, permettrait d’expliciter les différences d’efficacité des candidats thérapeutiques ciblant les récepteurs d'intérêt. La microscopie de super-résolution permet l’accès à l'organisation et la dynamique des récepteurs membranaires avec des résolutions nanométrique. Elle offre la capacité de révéler des informations sur les évènements précoces déclenchés par la liaison d’un anticorps à son récepteur, permettant à terme l’optimisation de leur efficacité fonctionnelle. Associée aux techniques de criblage à haut débit, elle a le potentiel de jouer un rôle prépondérant dans les phases précoces des projets où il est nécessaire de sélectionner les meilleurs anticorps issus de banques pouvant en compter plusieurs centaines.L'objectif de cette thèse CIFRE a été de caractériser fonctionnellement l'organisation et le trafic de paires récepteur/anticorps par l’association de méthodes de microscopie super-résolution par localisation de molécules individuelles (SMLM) et de criblage à haut débit (HCS). Dans ce contexte, nous avons mis au point et utilisé une plateforme permettant de caractériser différents anticorps thérapeutiques ciblant des récepteurs de cellules T, dans le but de recueillir des informations quantitatives sur les candidats thérapeutiques potentiels. Nous avons également optimisé la technique d'imagerie à feuille de lumière simple objectif (soSPIM) dans le but de pouvoir réaliser une cartographie 3D des récepteurs membranaires sur d'une cellule T entière avec une résolution nanométrique. Cette nouvelle approche permet l'imagerie de cellules T dans des conditions plus physiologiques, fournissant des informations complémentaires par rapport aux expériences de criblage à grande échelle. Ces deux techniques nous ont permis d’améliorer notre compréhension du mode d'action des anticorps sur les récepteurs au niveau de la cellule unique. Les expériences à grande échelle réalisées dans le cadre de ce travail ont nécessité plusieurs développements logiciels pour l'automatisation de l'acquisition et l'analyse statistique des Téraoctets de données de molécules individuelles générées. Ce projet de thèse s'est concentré sur la cible PD-1, un point de contrôle crucial du système immunitaire impliqué dans la modulation de l'activation des lymphocytes. La première partie de la thèse a été principalement consacrée à la mise en place de nouveaux protocoles pour l'imagerie de super-résolution des récepteurs PD-1 sur cellules Jurkat activées. La seconde partie concerne l’étude de l'impact d’anticorps thérapeutiques anti-PD-1 utilisés en routine en clinique, sur l'organisation spatiale et la dynamique des récepteurs PD-1 sur cellules vivantes, à l’échelle nanométrique. Ce travail est la preuve concept de l’utilité de ces outils d’imagerie de pointe pour la caractérisation quantitative d’anticorps monoclonaux thérapeutiques ciblant PD-1 à la membrane des cellules T
Immuno-oncology is a young and growing field at the frontier of cancer therapy. Immuno-oncology therapies aim to stimulate the body's immune system to target and attack the tumor through therapeutic antibodies, by binding and modifying the intracellular signaling of T-cells (lymphocytes playing a central role in the immune response) surface receptors. Understanding how the spatial organization of receptors and signaling proteins is regulated and how it determines lymphocyte activation and cell fate decisions has become a ‘holy grail’ for cellular immunology. To achieve this goal, a better comprehension of antibodies functions and subcellular trafficking is requested to explain the differential efficacies of therapeutic candidates targeting receptors of interest. Quantitative super-resolution microscopy provides access to the nanoscale organization of membrane receptors playing a physiological role. It offers a new investigation tool for antibody optimization as well as maximizing their functional efficacy. In combination with high throughput screening techniques, it has the potential to play a crucial role in the early phases of projects in which it is necessary to select the best antibodies from banks that may contain several hundred of them. The goal of this PhD thesis was to functionally characterize receptor/antibodies pairs organization and trafficking by quantitative single-molecule localization microscopy (SMLM) combined with high content screening (HCS). In this context, we have developed and used an HCS-SMLM platform to characterize multiple antibodies targeting T-cell membrane receptors, allowing gathering unprecedented quantitative insight of potential therapeutic candidates. We also optimized the single objective light-sheet microscope (soSPIM) to permit 3D mapping of membrane receptors across an entire T-cell, with single molecule resolution. It allows 3D nanoscale imaging of T-cells in more physiological conditions, and provide complementary information compared to large scale single molecule screening experiments. Altogether, these developments improved our comprehension of antibody mode of action on receptors at the single cell level. Large-scale experiments performed during this work required the development of several software for the automation of the acquisition and the statistical analysis of the Terabytes of single molecule data generated.This project is focused on targeting PD-1, a control point of the immune system involved in the modulation of immune cells activation. The first part of the thesis was mainly devoted to the implementation of new protocols for PD-1 receptors super-resolution imaging on activated Jurkat cells. In the second part, we further investigated the impact of known anti-PD-1 therapeutic antibodies used in clinics, on the nanoscale spatial organization and dynamics of PD-1 receptors in living cells using our HCS-SMLM platform. This work provides the proof of concept of the capacity of these cutting-edge imaging techniques to characterize quantitatively different therapeutic monoclonal antibodies targeting PD-1 on T-cell membrane

La génomique moderne conduit à une augmentation exponentielle du nombre de génomes disponibles, si bienqu' aujourd'hui, on ne peut se contenter d'une approche candidate "gène par gène" pour déterminer leur fonction. L'équipe dans laquelle j'ai effectué ma thèse a décidé de mettre en place une approche de microscopie à haut débit afin de cribler une banque de mutants de la bactérie à Gram positif modèle Bacillus subtilis à l'échelle de la cellule unique. L'idée était d'identifier des mutants perturbés dans les processus cellulaires que sont la morphogenèse, la division et la dynamique du chromosome. Cette approche nous a permis d'identifier 6 nouvelles protéines et au cours de ma thèse, je me suis intéressé à deux d'entre elles.La première protéine est TseB. Son absence entraîne un défaut morphologique se traduisant par la formation de cellules plus courtes et plus larges que celles de la souche sauvage.Nous avons montré que TseB appartient à la machinerie d'élongation de la paroi cellulaire et interagit directement avec une transpeptidase de ce complexe. Nos résultats suggèrent que TseB est un cofacteur et qu'elle stimule son activité. Mon second projet porte sur la caractérisation de la protéine TerA. Lorsque le mutant ΔterA est cultivé en milieuminimum, les cellules présentent un défaut d'organisation du chromosome.Le mutant ΔterA est plus sensible au stress oxydant qu'une souche sauvage. De plus, nous avons montré que la réplication est perturbée dans la région du terminus en absence de TerA. Notre hypothèse est que TerA contribue à la réparation des dommages à l'ADN générés par le stress oxydant. Elle recruterait des enzymes spécialisées au niveau des lésions
Modern genomics has lead to an exponential increase in the number of available genomes, such that we can nolonger only use a "gene-by- gene" candidate approach to determine gene function. The team in which I did my Ph.D decided to develop a high-throughput fluorescencemicroscopy screening approach to analyze a mutant library of the model Gram-positive bacterium Bacillus subtilis at the single-cell level. The aim was to identify mutants altered in cellular processes such as morphogenesis, division andchromosome dynamics. This approach allowed us to identify 6 novel proteins involvedin these cellular processes, and during my thesis, I focused on two of them.The first candidate is TseB. Its absence leads to a morphological defect. Mutant cells are shorter and wider thanwild-type cells. Through genetic andbiochemical approaches, we showed that TseB belongs to the cell wall elongation machinery and directly interacts with PBP2A, a transpeptidase of this complex. Our data support the idea that TseB could induce a conformational change in PBP2A that would increase substrate affinity.My second project was the characterization of the TerA protein. When a ΔterA mutant is grown in minimummedium, cells exhibit a chromosome organization defect. We know that a terA mutant is more sensitive to theoxidative stress than the wild-type strain. Moreover, we showed that replication is blocked near the terminus region in theabsence of TerA. Our hypothesis is that TerA contributes to repair of DNA damages induced by oxidative stress. It mayrecruit specialized enzymes to these lesions

La sclérose en plaques est une maladie chronique, auto-immune et neurodégénérative qui se traduit par l’apparition de plaques inflammatoires démyélinisantes dans le système nerveux central. Pour caractériser la réponse immunitaire innée, j’ai développé des outils d’imagerie optique non linéaire multispectrale intravitale, et des solutions semi automatisées d’analyse d’images. J’ai participé à la mise au point d’un protocole d’identification des phénotypes immunitaires en cytométrie. Ces outils appliqués à l’étude de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, un modèle murin de SEP, ont permis d’analyser la cascade immunitaire par immunomarquages et marquages fluorescents transgéniques, de décrire les distributions des populations cellulaires dans le SNC, et de les associer à la dégradation axonale sur des échelles de temps de la seconde à la semaine. Sur une lignée de souris transgénique, Thy1-CFP/Cd11c-EYFP/LysM-EGFP, j’ai suivi en microscopie biphotonique l’évolution des densités de cellules fluorescentes dans la moelle épinière pendant plusieurs semaines. J’ai conclu que la dégénération axonale et les déficits moteurs sont corrélés avec l’infiltration par les méninges de neutrophiles et monocytes. Les monocytes se différencient in situ en cellules dendritiques d’origine monocytaire (moDCs) parallèlement à l'activation de la microglie. Ces événements cellulaires, dont la maturation des moDCs sont corrélés avec la résorption de l’inflammation. La méthodologie est en place pour poursuivre ces investigations sur d’autres modèles. L’optimisation du microscope m’a aussi permis d’accéder simultanément au contraste endogène CARS pour visualiser la gaine de myéline
Multiple sclerosis is a chronic auto-immune neurodegenerative disease characterized by the appearance of inflammatory plaques in the central nervous system. To characterize the innate immune response I have developed nonlinear optical tools for intravital multispectral imaging as well as semi-automated image processing solutions. I also contributed to the development of a flow cytometry protocol allowing the identification of immune cell phenotypes. Applied to study of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, a mouse model of MS, these tools have allowed to analyze the immune cascade thanks to immunolabelings and transgenic expression of fluorescence, describe the distributions of cell populations in the CNS with regard to neuron degeneration on time scales ranging from seconds to weeks. On a transgenic mouse line Thy1-CFP/Cd11c-EYFP/LysM-EGFP, I have followed by two-photon microscopy the evolution of fluorescent cells densities in the same area of the spinal cord for several weeks. I conclude that axonal degeneration and motor deficits are correlated with neutrophils and monocytes infiltration from the meninges. The monocytes differentiate in situ in monocyte-derived dendritic cells (moDCs) along with the recruitment of activated microglia. These cellular events correlated with a stabilization/remission phase of the disease. MoDCS maturation thus seems involved in the dampening of inflammation. Methodology and tools are now set for further investigations with other models. The microscope optimization for multicolor excitation allowed me to access simultaneously to the endogenous CARS contrast to visualize the myelin sheath

Les biotechnologies sont arrivées au point ou la quantité d'information disponible permet de penser les objets biologiques comme des systèmes complexes. Dans ce contexte, les phénomènes qui émergent de ces systèmes sont intimement liés aux spécificités de leur organisation. Cela pose des problèmes computationnels et statistiques qui sont précisément l'objet d'étude de la communauté liée à l'apprentissage statistique. Cette thèse traite d'applications de méthodes d'apprentissage pour l'étude de phénomène biologique dans une perspective de système complexe. Ces méthodes sont appliquées dans le cadre de l'analyse d'interactions protéine-ligand et d'effets secondaires, du phenotypage de populations de cellules et du plan d'expérience pour des systèmes dynamiques non linéaires partiellement observés.D'importantes quantités de données sont désormais disponibles concernant les molécules mises sur le marché, tels que les profils d'interactions protéiques et d'effets secondaires. Cela pose le problème d'intégrer ces données et de trouver une forme de structure sous tendant ces observations à grandes échelles. Nous appliquons des méthodes récentes d'apprentissage non supervisé à l'analyse d'importants jeux de données sur des médicaments. Des exemples illustrent la pertinence de l'information extraite qui est ensuite validée dans un contexte de prédiction.Les variations de réponses à un traitement entre différents individus posent le problème de définir l'effet d'un stimulus à l'échelle d'une population d'individus. Par exemple, dans le contexte de la microscopie à haut débit, une population de cellules est exposée à différents stimuli. Les variations d'une cellule à l'autre rendent la comparaison de différents traitement non triviale. Un modèle génératif est proposé pour attaquer ce problème et ses propriétés sont étudiées sur la base de données expérimentales.A l'échelle moléculaire, des comportements complexes émergent de cascades d'interactions non linéaires entre différentes espèces moléculaires. Ces non linéarités engendrent des problèmes d'identifiabilité du système. Elles peuvent cependant être contournées par des plans expérimentaux spécifiques, un des champs de recherche de la biologie des systèmes. Une stratégie Bayésienne itérative de plan expérimental est proposée est des résultats numériques basés sur des simulations in silico d'un réseau biologique sont présentées.

Les travaux de recherche que présente cette thèse sont le fruit de collaborations fructueuses entre mon entreprise d’accueil, l’Institut de Recherches SERVIER, mon laboratoire d’accueil, la plateforme BioPhenics de l’Institut Curie, et moi-même préparant mon doctorat à l’Ecole Doctorale CBMS de l’Université Paris-Saclay. Des partenariats internationaux ont également permis de générer et d’enrichir de multiples données dans un même but : identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement du cancer du sein triple-négatif (TNBC, Triple-negative breast cancer). Le cancer TNBC est une forme de cancer mammaire caractérisée par l’absence des récepteurs aux œstrogènes (ER, Estrogen Receptor), à la progestérone (PR, Progesterone receptor), et du récepteur de facteur de croissance épidermique humain 2 (HER2, Human epidermal growth factor receptor 2), touchant près de 20% des femmes diagnostiquées avec un cancer mammaire. Par l’absence de ces récepteurs, les patientes ne sont éligibles ni aux thérapies hormonales ni aux thérapies ciblées anti-HER2. Alors que le cancer TNBC est enrichi en cellule-souches cancéreuses (CSC) et que des dérégulations épigénétiques ont été identifiées dans les voies de signalisation des CSC des TNBC, nous avons émis l'hypothèse que les mécanismes épigénétiques pourraient être modulés et aboutir à deux phénotypes : un impact sur la viabilité des cellules d'une part, et un effet sur l'expression de HER2 de façon à sensibiliser les cellules aux thérapies anti-HER2 existantes d'autre part. Afin de vérifier ces hypothèses, nous avons réalisé des cribles de génomique fonctionnelle en siRNA ciblant 863 modulateurs épigénétiques par des approches à haut débit et haut contenu. Bien que l’utilisation de siRNA représente une approche puissante, le risque d’effets hors cible est important. Afin de renforcer la découverte de hits spécifiques et de limiter l’identification de hits non-spécifiques, différentes stratégies ont été mises en place pour les deux études. Alors que l’identification de gènes impliqués dans l’expression de HER2 est toujours à l’étude, nous avons identifié 3 gènes clés pour la viabilité des cellules TNBC, parmi lesquels CHAF1A, dont le rôle dans la viabilité des cellules TNBC est identifié pour la première fois. Aussi, suite à des analyses bioinformatiques réalisées à partir des résultats générés en viabilité, les effets non spécifiques à la cible initiale ont été considérés comme sources de hits potentiels, permettant d’envisager de nouvelles approches de génomique fonctionnelle
Research presented in this thesis manuscript is the result of a fruitful collaboration between my host company, Institut de Recherches SERVIER, my host laboratory, BioPhenics Laboratory at Institut Curie, and I, preparing my PhD at the doctoral school CBMS at Université Paris-Saclay. International partnerships also led to the generation of numerous data towards the same purpose: identifying novel therapeutic targets in triple-negative breast cancer (TNBC) treatment. TNBC is a breast cancer subtype characterized by its ER(Estrogen receptor)-, PR(Progesterone receptor)- and HER2(Human epidermal growth factor receptor 2)-negative phenotype, affecting almost 20% of breast cancer diagnosed women. In the absence of these receptors, patients cannot respond neither to hormone therapy nor anti-HER2 targeted therapies. While TNBC is enriched in cancer-stem cells (CSC) and epigenetic deregulations were identified in TNBC CSC signaling pathways, we supposed that epigenetic mechanisms could be modulated to result in two phenotypes : an impact on TNBC cell viability, and an impact on HER2 expression in order to sensitize cells to existing anti-HER2 therapies. To investigate these hypotheses, we performed siRNA functional genomics screening targeting 863 epigenetic modulators through high-throughput and high-content approaches. Although using siRNA represents a powerful approach, the risk of off-target effects is important. In order to reinforce on-target hits discovery and to prevent the identification of non-specific hits, various strategies were used for the two studies. While the identification of genes involved in HER2 expression is currently in progress, we identified 3 key genes for TNBC cell viability, including CHAF1A for which the role in TNBC cell viability was never revealed. Also, following bioinformatic analyses performed from viability data, off-target effects were considered as sources of potential hits, highlighting the potential of a new functional genomics screening approach

La maintenance de l'information génétique est essentielle pendant la prolifération cellulaire. Chez les bactéries, la réplication et la ségrégation sont concomitantes. La réplication débute à l'origine de réplication bidirectionnelle du chromosome bactérien. Deux bras de réplications sont ensuite définis, et la réplication se termine dans la région diamétralement opposée à l'origine, le terminus. Alors que la réplication progresse, les chromatides sœurs nouvellement répliquées migrent vers des côtés opposés de la cellule. Cependant, des observations par microscopie suggèrent qu'il existe un délai entre la réplication et la ségrégation qui varie le long du chromosome. Ce délai entre la réplication et ségrégation des chromatides sœurs est appelé cohésion des chromatides sœurs. Pendant ma thèse, j'ai utilisé l'outil de haute-résolution qui permet une analyse de la cohésion du génome entier (High-SC2) pour étudier le profil de cohésion de l'organisme modèle Vibrio cholerae. Il a été démontré chez E. coli que la cohésion responsable de la variation de la vitesse de ségrégation est modulée par Topoisomérase IV, une enzyme de décaténation majeure. L'un des partenaires identifiés de cette décaténase est le complexe SMC, MukBEF. Les cellules portant une délétion de mukB montrent une production de cellules anucléées, ainsi qu'une origine de réplication mal positionnée. La ségrégation des chromosomes est affectée, et la cohésion des chromatides sœurs est augmentée. L'interaction Topo IV-MukBEF est régulée par MatP qui chasserait MukBEF du terminus de réplication, facilitant ainsi l'association de MukBEF à l'origine de réplication. J'ai donc décidé d'étudier le rôle de MukB dans la formation des motifs de cohésion chez V. cholerae. Grâce à des approches génétiques couplées à l'outil High-SC2, j'ai pu démontrer que la délétion de mukB mène à une augmentation de la cohésion sur le Chr1, plus précisément sur le bras gauche, assez loin de l'origine. Mes résultats suggèrent que MukB n'agit pas préférentiellement sur des régions spécifiques, mais que ces effets différents sur les deux chromosomes de cet organisme sont dus aux différences dans leurs origines de réplication et/ou leurs systèmes de partition. De précédentes observations dans notre laboratoire ont montré qu'une double délétion de MukB et ParAB1 cause un phénotype sévère, plus important que les délétions individuelles, j'ai donc étudié les conséquences de cette double délétion sur le profil de cohésion. Mes résultats montrent une augmentation additionnelle de la cohésion dans le Chr1 près de l'origine, suggérant ainsi que le système de partition agit sur la décohésion sur le domaine de l'origine pendant que MukB agit sur le reste du chromosome. Il a été également montré que MatP retardait la ségrégation des chromatides soeurs du terminus de réplication du Chr1. J'ai utilisé le même outil qui m'a permis d'étudier le rôle de MatP dans la cohésion de cette région. J'ai pu montrer que MatP était responsable de cette cohésion uniquement au moment de la division cellulaire et non pas pendant la réplication contrairement à MukB. Mes résultats montrent également que la densité des matS présents dans le domaine ter de chaque chromosome qui influent sur la cohésion de ce même domaine
During cell proliferation, the maintenance of genetic information is essential. In bacteria, replication and segregation are concomitant. Replication starts at the single, bidirectional origin of replication of bacterial chromosomes. Two replication arms are then defined, and replication ends in a region diametrically opposite to the origin, the terminus. As replication progresses, the newly replicated sister chromosomes migrate to opposite cell compartments. However, microscopic observations suggest that there is a delay between replication and segregation, and that this delay varies along the length of chromosomes. The delay between replication and segregation of the sister copies of a genomic position is referred to as sister chromatid cohesion. During my PhD, I used the high-resolution tool that allows for a genome-wide analysis of Sister Chromatid Cohesion (High-SC2) and studied the cohesion profile of the model organism Vibrio cholerae. It has been shown in E. coli that the cohesion responsible for the variation of segregation speed is modulated by Topoisomerase IV, a major decatenating enzyme. One of the identified partners of this decatenase is an SMC complex, MukBEF. Cells carrying a mukB deletion show a production of anucleate cells, and a mispositioned origin of replication. Chromosome segregation is impaired, and therefore sister chromatid cohesion is increased overall. The Topo IV-MukBEF interaction is regulated by MatP, which seems to displace MukBEF from the terminus of replication, facilitating the association of the MukBEF complex with the origin of replication. I therefore decided to investigate the role of MukB, in the formation of the long-range patterns of cohesion in V. cholerae. Using genetic approaches coupled with the High-SC2 assay, I demonstrated that the deletion of mukB leads to an increase in cohesion on Chr1, especially on its left replication arm, far from the origin. These results suggested that MukB does not preferentially act on specific regions and that the differential effect of the mukB deletion on Chr1 and Chr2 is probably linked to differences in their origin of replication and/or partition systems. Previous observations in the lab have in fact shown that a double deletion of MukB and ParAB1 leads to a strong phenotype, thus I investigated its effect on the cohesion profile. My results show an additional increase of cohesion in Chr1 near the ori, suggesting that the partitioning system acts on the decohesion of the ori domain while MukB acts on the chromosomal arms. In addition, it has been shown that MatP kept the sister-copies of the ter domain of Chr1 together until cell division. I used the Hi-SC2 assay to study its role in the increased cohesion of this region. I showed that MatP was responsible for the cohesion of the ter1 domain at cell division not behind the replication fork, unlike MukB. My results have also shown that it is the density of the matS sites located on the ter domain of each chromosome that influence the level of cohesion of these domains

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste responsable d’infections nosocomiales sévères associées à un taux élevé de mortalité. Le système de sécrétion de Type III (SST3) et les effecteurs qu’il injecte sont considérés comme des facteurs de virulence prépondérants de P. aeruginosa. Récemment nous avons caractérisé, un groupe de souches ne possédant pas les gènes du SST3, mais dont la virulence repose sur la sécrétion d’une nouvelle toxine de 172 kDa, nommée Exolysine (ExlA) qui provoque la perméabilisation de la membrane des cellules hôtes. ExlA est sécrétée dans le milieu par une porine de la membrane externe, nommée ExlB, formant ainsi un nouveau système de sécrétion à deux partenaires (TPS), ExlBA. Outre le domaine TPS du coté N-terminal de la protéine, impliqué dans sa sécrétion, ExlA possède différents domaines ; des répétitions hémagglutinines, cinq motifs Arginine-Glycine-Acide Aspartique (RGD) et un domaine C-Terminal faiblement conservé. Des tests de cytotoxicité sur des cellules eucaryotes ont montrés que la délétion du domaine C-terminal abolissait l’activité toxique d’ExlA. En utilisant un modèle de liposomes et différents types de cellules eucaryotes, comme les globules rouges, nous avons démontré qu’ExlA forme des pores membranaires de 1.6 nm. De plus, par un criblage cellulaire à haut-débit d’une banque de mutants obtenus par une mutagenèse de transposition, nous avons montré qu’un facteur bactérien additionnel était requis dans la toxicité d’ExlA. En effet, parmi les 7 400 mutants, nous avons identifiés 3 transposons insérés dans des gènes codant pour le pili de type IV, démontrant ainsi que cet appendice impliqué dans l’adhésion des bactéries participe à la toxicité d’ExlA, en permettant un contact rapproché entre la bactérie et les cellules hôtes. Un criblage de macrophages primaires de souris KO pour différentes protéines impliquées dans la voie de l’activation de l’inflammasome, nous a permis de démontrer que le pore formé par ExlA est responsable de l’activation de la Caspase-1 par l’inflammasome NLRP3 conduisant à la maturation de l’interleukine-1ß. Une étude bio-informatique a révélé la présence de gènes homologues à exlA chez d’autres espèces de Pseudomonas non pathogènes, comme P. putida, P. protegens, P. entomophila. Nous avons montré que ces bactéries environnementales sont aussi capables de provoquer une mort cellulaire dépendante de la Caspase-1. Finalement, un criblage d’une banque de macrophages dont les gènes ont été invalidés par la technologie CRISPR/cas9 a révélé que plusieurs protéines du système immunitaire, indirectement liées à l’activation de la Caspase-1 sont impliquées dans la mort cellulaire médiée par ExlA. De plus, nous avons montré que plusieurs sgRNAs ciblant un microARN, mir-741, était grandement enrichi dans les macrophages ayant résisté à une infection avec ExlA. Mir-741 régule l’expression d’enzymes (St8sIa1 et Agpat5) impliquées dans la voie de biosynthèse des sphingolipides et des glycérophospholipides, suggérant ainsi que l’activité d’ExlA requiert un environnement lipidique particulier
Pseudomonas aeruginosa is a human opportunistic pathogen responsible for nosocomial infections associated with high mortality. The type III secretion system (T3SS) and T3SS-exported toxins have been considered as key infectivity virulence factors. Our team recently characterized a group of strains lacking T3SS, but employing a new pore-forming toxin of 172 kDa, named Exolysin (ExlA) that provokes cell membrane disruption. In this work we demonstrated that the ExlA secretion requires ExlB, a predicted outer membrane protein encoded in the same operon, showing that ExlA-ExlB define a new active Two-Partner Secretion (TPS) system. In addition to the TPS secretion signals, ExlA harbors several distinct domains, which comprise hemagglutinin domains, five Arginine-Glycine-Aspartic acid (RGD) motifs and a non-conserved C-terminal region lacking any identifiable sequence motifs. Cytotoxic assays showed that the deletion of the C-terminal region abolishes host-cell cytolysis. Using liposomes and eukaryotic cells, including red blood cells, we demonstrated that ExlA forms membrane pores of 1.6 nm. Based on a transposon mutagenesis strategy and a high throughput cellular live-dead screen, we identified additional bacterial factors required for ExlA-mediated cell lysis. Among 7 400 mutants, we identified three transposons inserted in genes encoding components of the Type IV pili, which are adhesive extracellular appendices. Type IV pili probably mediate close contact between bacteria and host cells and facilitate ExlA cytotoxic activity. These findings represent the first example of cooperation between a pore-forming toxin of the TPS family and surface appendages to achieve host cell intoxication. Using mice primary bone marrow macrophages we showed that ExlA pores provoke activation of Caspase-1 via the NLRP3-inflamasomme followed by the maturation of the pro-interleukin-1ß. Mining of microbial genomic databases revealed the presence of exlA-like genes in other Pseudomonas species rarely associated with human infections P. putida, P. protegens and P. entomophila. Interestingly, we showed that these environmental bacteria are also able to provoke Caspase-1 cleavage and pro-inflammatory cell death of macrophages. Finally, genome-wide loss-of-function CRISPR/cas9 RAW library screen revealed that several components of the immune system response, indirectly linked to Caspase-1 are involved in the ExlA-mediated cell lysis. Moreover, we found at least three sgRNAs targeting miRNA, mir-741 were highly enriched in resistant macrophages challenged by ExlA. This miRNA regulates enzymes (St8sIa1 and Agpat5) in the sphingolipids and glycerophololipids biosynthesis pathways, suggesting that ExlA activity may require proper lipid environment