Дисертації з теми "Métabolisme des dérivés du cholestérol"

Ce travail de thèse s'articule autour de deux axes :1/ Les plastifiants, y compris les phtalates, ont été identifiés comme cancérigènes, mutagènes, reprotoxiques (CMR) de catégorie 1b et comme perturbateurs endocriniens. Le di-2-éthylhexyle phtalate (DEHP) est l'un des plastifiants les plus courants et est généralement associé au polychlorure de vinyle (PVC) dans les dispositifs médicaux. Le DEHP n'étant pas lié de manière covalente au PVC, il peut facilement migrer dans des matrices lipophiles et atteindre ensuite la circulation sanguine. Il est métabolisé par le foie en mono-2-éthylhexyle phtalate (MEHP), tout aussi toxique. Ces dernières années, des plastifiants alternatifs au DEHP ont été développés, notamment le di-2-éthylhexyl téréphtalate (DEHT), qui est métabolisé in vivo en mono-2-éthylhexyl téréphtalate (MEHT).La première partie de ce travail de thèse a consisté à développer des méthodes de dosage des plastifiants et de leurs métabolites dans diverses matrices biologiques, comme par exemple le plasma. Deux méthodes LC-MS/MS ont été développées pour la détermination du DEHP et du MEHP ainsi que des métabolites du DEHT. L'ionisation par spectrométrie de masse du DEHT étant très faible, une méthode LC-UV a été développée pour quantifier ce téréphtalate. Ces méthodes ont permis d'estimer le relargage du DEHP et du DEHT à partir de poches de sang et le dosage de leurs métabolites primaires dans les produits sanguins.2/ Les acides biliaires (AB) constituent une large famille de stéroïdes composée de nombreuses espèces. Ils sont synthétisés dans le foie et l'intestin et représentent la voie principale de catabolisme du cholestérol. Le 7a-hydroxy-4-cholesten-3-one (C4) est le précurseur des AB. Les AB jouent un rôle essentiel dans l'absorption des lipides mais également dans la signalisation cellulaire, étant ligands du récepteur nucléaire « Farnesoid X receptor » (FXR) et/ou du récepteur membranaire couplé aux protéines G, TGR5. Ces récepteurs, et donc leurs ligands, sont impliqués dans la régulation de l'homéostasie du glucose, des lipides et de la dépense énergétique. Toute modulation du profil des AB peut donc conduire à une modification de l'homéostasie métabolique.La deuxième partie de ce travail de thèse a consisté à développer deux méthodes de dosage par LC-MS/MS de 31 espèces d'AB et du C4 dans différentes matrices biologiques, dont le plasma. Une méthode spécifique permettant le dosage d'AB dérivés du LCA, récemment décrits, dans du contenu caecal est en cours d'optimisation. Ces méthodes ont permis d'analyser les variations du profil des AB dans divers contextes de la maladie cardiométabolique (obésité, insulino-résistance, diabète de type 2, NAFLD).Pour conclure, les méthodes d'analyse développées pour la quantification des plastifiants et des AB ont été validées et appliquées dans des études précliniques et cliniques. De manière intéressante, des données de la littérature ainsi que des essais préliminaires de transfection transitoire ont montré que des phtalates et leurs métabolites modulent l'activité du récepteur alpha activé par les proliférateurs de peroxysomes (PPARa) régulateur clé de l'homéostasie métabolique et de l'expression de l'enzyme CYP7A1 (enzyme majeure de la synthèse hépatique des AB). Les outils analytiques développés dans cette thèse permettent d'ouvrir des perspectives originales d'étude des effets des phtalates sur l'homéostasie métabolique via la régulation du métabolisme des AB.L'ensemble de ces travaux a permis de lier développements analytiques et applications dans le domaine de la biologie et de la santé
This thesis has two main focuses:1/ Plasticizers, including phthalates, have been identified as category 1b carcinogenic, mutagenic and reprotoxic (CMR) and as endocrine disruptors. Di-2-ethylhexyl phthalate (DEHP) is one of the most common plasticizers and is generally associated with polyvinyl chloride (PVC) in medical devices. As DEHP is not covalently bound to PVC, it can easily migrate into lipophilic matrices and then reach the bloodstream. It is metabolized by the liver into mono-2-ethylhexyl phthalate (MEHP), which is just as toxic. In recent years, alternative plasticizers to DEHP have been developed, notably di-2-ethylhexyl terephthalate (DEHT), which is metabolized in vivo to mono-2-ethylhexyl terephthalate (MEHT).The first part of this thesis involved developing methods for measuring plasticizers and their metabolites in various biological matrices, such as plasma. Two LC-MS/MS methods were developed for the determination of DEHP and MEHP as well as DEHT metabolites. As the ionization in mass spectrometry of DEHT is very low, a LC-UV method was developed to quantify this terephthalate. These methods have made it possible to estimate the release of DEHP and DEHT from blood bags and to measure their primary metabolites in blood products.2/ Bile acids (BA) are a large family of steroids made up of numerous species. They are synthesized in the liver and intestine and represent the main route of cholesterol catabolism. 7a-hydroxy-4-cholesten-3-one (C4) is the precursor of BA. BA play an essential role in lipid absorption but also in cell signaling, as they are ligands for the nuclear receptor 'Farnesoid X receptor' (FXR) and/or the G protein-coupled membrane receptor, TGR5. These receptors, and hence their ligands, are involved in glucose homeostasis, lipid homeostasis and energy expenditure. Any modulation of the BA profile can therefore lead to changes in metabolic homeostasis. The second part of this thesis involved developing two LC-MS/MS assay methods for 31 BA species and C4 in different biological matrices, including plasma. A specific method for the determination of recently described BA derived from LCA in caecal contents is currently being optimized. These methods have made it possible to analyze variations in the BA profile in various cardiometabolic disease contexts (obesity, insulin resistance, type 2 diabetes, NAFLD).In conclusion, the analytical methods developed for quantifying plasticizers and BA have been validated and applied in preclinical and clinical studies. Interestingly, data from the literature and preliminary transient transfection assays have shown that phthalates and their metabolites modulate the activity of the peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARa), a key regulator of metabolic homeostasis and expression of CYP7A1 (a major enzyme in hepatic BA synthesis). The analytical tools developed in this thesis open up original perspectives for studying the effects of phthalates on metabolic homeostasis via the regulation of BA metabolism. All of this work has made it possible to link analytical developments and applications in the field of biology and health

Ce manuscrit décrit l'étude des dérégulations du métabolisme du cholestérol dans les processus cancéreux. Nous exposons notamment l'importance des esters de cholestérol pour la prolifération des cellules cancéreuses. L'évidence est apportée que les effets de drogues anticancéreuses comme le Tamoxifène sont concomitants à l'inhibition de la Cholestérol Epoxyde Hydrolase et potentiellement à l'accumulation de 5,6a-époxycholestanol dans les tissus. Nous avons postulé l'existence d'un nouveau métabolisme autour de cet époxyde, consistant en son aminolyse par des amines biogènes et avons montré que de tels produits, les Dendrogénines, ont des activités de différenciation se traduisant par une activité anticancéreuse (Dendrogénine A) ou neuroprotectrice (Dendrogénine B). Enfin nous avons pu expliquer la différence de réactivité entre les 5,6a- et 5,6beta-époxycholestanols et pu attester de la stéréospécificité de la réaction d'aminolyse
This manuscript describes the study of deregulations of the metabolism of cholesterol occuring in cancerous processes. This includes first the importance of esters of cholesterol to the proliferation of cancer cells. Evidence is given the effects of cancer drugs such as Tamoxifen are concurrent to inhibition of the Cholesterol Epoxyde Hydrolase and potentially to the accumulation of 5, 6a-epoxycholestanol in the tissues. We postulated the existence of a new metabolism around this epoxyde, consisting in its aminolysis by biogenic amines and have shown that such products, the Dendrogenines, promote differenciation in different cell lines resulting in either anticancerous (Dendrogenine A) or neuroprotective (Dendrogénine B) activities. Finally we could explain the difference of reactivity toward nucleophiles between 5,6a- and 5,6beta- epoxycholestanol and could vouch for the stereospecificity of aminolysis reaction

La schizophrénie est une maladie psychiatrique qui perturbe le fonctionnement social et mental des malades. Cette pathologie concerne plus de 1 % de la population mondiale et se caractérise par différents types de symptômes : positifs (hallucinations, illusions) et négatifs (perte de l’affect et de volonté, renfermement social). Ces symptômes sont contrôlés par les traitements antipsychotiques (APs) à travers la modulation des récepteurs à la dopamine et à la sérotonine. Malheureusement, certains de ces médicaments induisent d’importants effets secondaires métaboliques tels que des prises de poids (pouvant aller jusqu’à 10 kg la première année avec la clozapine par exemple), des dyslipémies, des altérations de l’homéostasie du glucose et l’apparition de diabète. Ces perturbations ont pour conséquence l’arrêt du traitement et l’augmentation des risques cardiovasculaires qui participent à la diminution de l’espérance de vie (de 10 ans en moyenne) et à l’augmentation du taux de mortalité (deux fois supérieur par rapport à la population générale). Les mécanismes d’induction de ces effets secondaires ne sont pas tous élucidés. Au niveau du système nerveux central, la liaison de ces molécules aux récepteurs sérotoninergiques, dopaminergiques ou histaminergiques est en partie responsable (en modifiant l’appétit ou l’homéostasie énergétique). Au niveau périphérique, ces APs perturbent certaines fonctions physiologiques essentielles telles que la sécrétion d’insuline par les cellules b du pancréas, le transport du glucose dans le muscle squelettique et la lipogenèse au niveau du tissu adipeux, ils altèrent également la sensibilité à l’insuline de différents tissus. Alors que le foie est l’organe de la métabolisation des xénobiotique, et qu’il est essentiel dans le maintien de l’homéostasie des nutriments, peu d’études se sont intéressées à l’influence directe de ces molécules sur ce tissu. L’objectif principal de cette thèse a consisté à examiner l’influence d’APs sur le métabolisme hépatique des lipides et du cholestérol à partir de modèles hépatocytaires adéquats, à l’aide de différents marqueurs : les synthèses de novo de lipides (acides gras, triglycérides et phospholipides) et de cholestérol (libre et estérifié), la quantification des facteurs de transcriptions matures SREBP-1 et SREBP-2 (sterol regulatory element binding protein) et l’évaluation de l’expression de gènes d’intérêt. Dans une première partie, nous avons sélectionné deux modèles cellulaires hépatocytaires (isolés de foie de rat et la lignée humaine IHH) et avons démontré leur pertinence pour l’étude des « effets adverses potentiels » de molécules sur le métabolisme des lipides et du cholestérol. Pour cela, le caractère physiologique et sensible de ces cellules a été validé au travers de leurs réponses aux variations nutritionnelles (ou hormonales) et aux traitements pharmacologiques. Dans une seconde partie, nous avons dressé un comparatif très clair des profils lipogéniques de ces molécules APs avec : -des molécules fortement inductrices de la lipogenèse et de la cholestérogenèse de novo (comme la clozapine, l’olanzapine, la risperidone et la NDMC), -des molécules avec des effets plus modérés (l’halopéridol et la palipéridone), -et des molécules avec peu ou pas d’effet(s) (l’aripiprazole, la quetiapine, le bifeprunox et la chlorpromazine). L’induction de la lipogenèse et de la cholestérogenèse de novo par certains APs est associée à la stimulation des voies SREBPs (facteurs de transcription et gènes cibles) et corrèle relativement bien avec les perturbations métaboliques cliniques observées chez les schizophrènes traités. Nous suggérons ainsi qu’une partie des effets adverses de ces molécules APs proviendrait d’une action directe sur le foie. De plus, nous avons constaté que les APs qui présentent les profils les plus délétères dans nos modèles in vitro, activent la voie PERK (protein kinase RNA-like ER kinase) de la réponse UPR (unfolding protein response), illustrant la présence d’un stress du RE. Or le stress du reticulum endoplasmique (RE) est décrit pour activer les voies SREBPs et provoquer sur du long terme des maladies telles que des stéatoses, des dyslipémies et du diabète. Cette découverte ouvre de nouvelles perspectives quant aux mécanismes d’action de ces molécules. Plus précisément, nous montrons dans notre modèle d’hépatocytes humains que le traitement à la thapsigargine (inducteur de stress du RE par la déplétion du RE en calcium) stimule les voies SREBPs. Alors qu’aucune modification détectable des concentrations cytosoliques en calcium n’est observée dans les IHH suite aux traitements APs, l’utilisation d’agent chélateur de calcium réverse les effets de la clozapine sur les voies SREBP-1 et -2. Ainsi, nous supposons que la clozapine en perturbant sensiblement les flux de calcium, engendrerait un stress du RE qui activerait les voies SREBP-1 et -2 et la lipogenèse et cholestérogenèse associées. Pour compléter ces travaux, deux études expérimentales chez le rat et la souris soutiennent nos résultats in vitro. Chez le rat, l’étude en aigu, confirme que la clozapine, l’olanzapine et la risperidone provoquent à des temps précoces (1 h, 3 h) des dérégulations hépatiques transcriptionnelles de génes lipogéniques et cholestérogéniques et de la réponse UPR. Chez la souris, l’étude en chronique avec la risperidone montre des inductions significatives de la prise de poids en relation avec l’activation de la voie SREBP-1c et de FAS (fatty acid synthase). L’ensemble de ces données suggère qu’indépendamment de leurs effets spécifiques au niveau du SNC, les APs peuvent déréguler le métabolisme hépatique des lipides. En conclusion, les cultures primaires d’hépatocytes de rat et les cellules IHH sont des modèles d’intérêt pour la détection des effets adverses potentiels de molécules sur le métabolisme hépatique des lipides et du cholestérol. De plus, les voies SREBPs (protéines et gènes cibles) sont de véritables témoins des perturbations métaboliques cellulaires et peuvent être considérés comme des marqueurs pertinents de ces états métaboliques. Ces modèles pourraient ainsi être intégrés dans le processus de recherche et de sélection de nouveaux composés chimiques destinés à devenir des APs. Au niveau clinique, nos résultats soutiennent l’intérêt d’associer des traitements hypolipémiants ou hypocholestérolémiants (statines) aux patients traités avec la clozapine, l’olanzapine et la rispéridone
Schizophrenia is a psychiatric disorder that heavily impacts the mental functions and social relations of the patients concerned. More than 1 % of the world population suffers from this disease that is characterized by different kinds of symptoms which are commonly subclassified as either positive (hallucinations, illusions) or negative (loss of affect and motivation, social withdrawal). These symptoms can be controlled by treatment with antipsychotic drugs (APDs) which act primarily through the modulation of dopamine and serotonin receptors. Unfortunately, some of these drugs induce important metabolic side effects such as weight gain (as much as 10 kg the first year with clozapine for example), dyslipemia, alterations of glucose homeostasis and development of diabetes. The consequences of these disturbances are treatment disruption and an increase of cardiovascular risks which contributes to a death rate twice as high for schizophrenic patients versus the general population, associated with a reduction in the average life expectancy by 10 years. The mechanisms underlying the side effects by APDs are not completely understood. At the level of the central nervous system (CNS), actions on serotoninergic, dopaminergic or histaminergic receptors are believed to be implicated in metabolic side effects (particularly by modifying appetite or energy homeostasis). In the periphery, certain APDs perturb essential physiological functions such as insulin secretion by pancreatic b cells, glucose transport into skeletal muscle and lipogenesis at the adipose tissue level, as well as physiological parameters like the sensitivity of various tissues to insulin. Althoug the liver is an essential organ for maintaining the nutrients homeostasis, few studies show an interest for the direct impact of these molecules on this tissue. The main goal of this thesis is to characterise the impact of APDs on hepatic lipid and cholesterol metabolism using various markers from appropriate hepatocyte cellular models, such as de novo synthesis of lipids and cholesterol, the quantification of the mature transcription factors SREBP-1 and -2 (sterol regulatory element binding protein) as well as the evaluation of the expression of several genes of interest. In the first part, we selected hepatocyte cellular models (cells isolated from rat liver and the human IHH cell line) and showed their relevance for the study of the “potential adverse effects” of different compounds on lipid and cholesterol metabolism. For this, the physiological and sensitive character of these cultures was shown through their response to nutritional (or hormonal) changes and to pharmacological treatments. In the second part, we highlighted three profiles of APD molecules :-molecules strongly inducting de novo lipogenesis and cholesterogenesis (clozapine, olanzapine, risperidone and NDMC), -molecules with more moderate effects (haloperidol and paliperidone), -molecules with little or no effect(s) (aripiprazole, quetiapine, bifeprunox and chlorpromazine). Induction of de novo lipogenesis and cholesterogenesis by certain APDs is associated to the stimulation of the SREBP pathway (transcription factors and SREBP target genes) and correlate relatively well with the metabolic disturbances of schizophrenia patients under APD treatment. We therefore suggest that certain unfavourable effects of these APD molecules are due to a direct action on the liver. Furthermore we stated that those APDs that present the most unfavourable profiles in our in vitro models, activate the PERK pathway (protein kinase RNA-like ER kinase) of the UPR (unfolding protein response), illustrating the presence of endoplasmic reticulum (ER) stress. However, the ER stress is known to activate the SREBP pathways and to cause, in chronic, diseases such as steatosis, dyslipidemia and diabetes. This discovery opens new perspectives regarding the research for the action mechanisms of these molecules. More precisely, in our human hepatocyte model we show that the treatment with thapsigargine (inductive of ER stress by calcium depletion) stimulates the SREBP pathways. Whereas no detectable modification of the cytosolic calcium concentrations was observed following APD treatment, the use of calcium chelating agents reverses the effects of clozapine on the SREBP-1 and -2 pathways. We therefore presume that clozapine, by disturbing calcium homeostasis, generates ER stress which would activate the SREBPs pathways and lipogenesis and cholesterogenesis in consequence. To corroborate these findings, two experimental studies in rat and mouse were conducted that support our in vitro results. In the rat, a study employing acute drug administration confirms that clozapine, olanzapine and risperidone, at an early stage (1h, 3h), cause transcriptional deregulations of hepatic lipogenic, cholesterogenic and UPR genes. In the mouse, a study with chronic administration of risperidone indicates significant inductions of weight gain in relation to the activation of the SREBP-1c pathway and of FAS (fatty acid synthase). Altogether these data suggest that independent of their specific effects at the CNS level, APDs can modulate hepatic lipid metabolism. In conclusion, rat primary hepatocyte cultures and IHH cells are models of interest for the detection of potential unfavourable effects of molecules on hepatic lipid and cholesterol metabolism. Moreover, the SREBP pathways (proteins and target genes associated) are appropriate indicators of cellular metabolic disturbances and thus can be considered as pertinent markers of the respective processes. These models could therefore be integrated in the research process and in the selection of new chemical compounds destined to become APDs. With respect to the clinic, our results support the strategy to associate hypolipemic or hypocholesterolemic (statines) treatments to patients treated with clozapine, olanzapine and risperidone

Les dérégulations de la sécrétion des facteurs protéiques produits par le tissu adipeux et couramment dénommés adipokines sont suspectées jouer un rôle majeur dans l’instauration de la plupart des comorbidités de l’obèse. De plus, l’accumulation excessive de lipides dans les cardiomyocytes conduit à un processus de lipoapoptose contribuant à l’altération de la fonction cardiaque. Les présents travaux ont eu pour but de caractériser les rôles physiologiques de deux protéines sécrétées dont l’expression augmente au cours de l’obésité. Nous démontrons ici que la première de ces protéines, surexprimée au niveau cardiaque chez l’obèse, est une nouvelle apolipoprotéine, majoritairement associée aux HDL et stimulant fortement l’efflux des lipides. Cette apolipoprotéine, que nous avons nommée apolipoprotéine O, pourrait être impliquée dans des mécanismes de protection du cœur vis-à-vis de l’accumulation délétère de lipides. L’autre protéine étudiée, l’adrénomédulline (AM), est un facteur déjà connu pour ses fonctions natriurétique et vasodilatatrice. Nos résultats prouvent que l’AM est une adipokine agissant localement sur le métabolisme et le développement du tissu adipeux. Tout d’abord, nous avons démontré que l’AM inhibe la lipolyse stimulée par l’isoprénaline par un mécanisme impliquant la production de monoxyde d’azote et l’oxydation des catécholamines. L’inhibition ou la surexpression du gène codant pour l’AM dans un modèle murin de préadipocytes ont ensuite permis d’établir que ce peptide ralentit la différenciation adipocytaire. De plus, nous démontrons que l’AM est régulée négativement par l’insuline au niveau transcriptionnel par l’intermédiaire de séquences ADN que nous avons identifiées par une approche de gènes rapporteurs. Les conséquences de cette nouvelle source d’AM sur le système cardiovasculaire restent à définir. Ces résultats ont toutefois permis de mettre à jour les caractéristiques nouvelles de deux facteurs sécrétés pouvant influer directement ou indirectement sur le développement des pathologies cardiaques associées à l’obésité
White adipose tissue is known to secrete a number of proteins named adipokines, whose dysregulations are suspected to play major roles in the development of several diseases commonly associated to obesity. Moreover, excess fat deposition in cardiomyocytes is believed to contribute to heart diseases through lipotoxicity and lipoapoptosis processes. The present data aimed to define the physiological functions of two secreted proteins up-regulated in obese patients. We demonstrate that one of these proteins, whose cardiac expression is increased with obesity, is a novel apolipoprotein (named Apo O) originally linked to a chondroitine sulfate chain, found mainly associated to HDL particles. Recombinant Apo O strongly stimulates cholesterol efflux from cells. Thus, Apo O could contribute to heart protection by preventing lipid accumulation in cardiomyocytes. The second protein studied, adrenomedullin (AM), is a multifunctional regulatory factor known for its natriuretic and vasodilating properties. Our results demonstrate that AM is a new adipokine that acts locally to modulate fat mass metabolism and development. First, we reported that AM inhibits isoproterenol-induced lipolysis through the nitric oxide-dependent oxidation of the beta-agonist. This reaction generates aminochromes, which is the product of catecholamines' oxidation and known to be cardiotoxic. Second, the molecular modulation of AM synthesis in a murine preadipocyte cell line showed that the peptide has anti-adipogenic properties. This last finding could be related to insulin proadipogenic effects since we found AM to be down-regulated by insulin at the transcriptional level through insulin-responsive elements

La cellule cancereuse ht29 cultivee en presence de glucose est indifferenciee. Comparee au colon normal, elle presente une modification de l'activite des enzymes cles de la glycolyse et du metabolisme du glycogene. La presence d'une forme r de la glycogene synthase explique l'accumulation du glycogene observee dans ces cellules. La deprivation en glutamine entraine un ralentissement de la croissance et une differenciation. Le glutamate remplace avantageusement la glutamine pour la croissance. Le role de la glutamine en tant que donneur de groupement amide peut etre assure en partie par le chlorure d'ammonium. Les stades precoces de la cancerisation s'accompagnent aussi d'alterations metaboliques et morphologiques. Ceci a ete verifie sur des cellules d'origine hepatique preneoplasique like non malignes. Ces cellules accumulent du glycogene et presentent des alterations metaboliques proches de la lignee d'hepatomes mh3924. De meme, l'induction chez le rat de cancer du colon par la dimethylhydrazine fait apparaitre au cours du temps differents types de lesions caracterise&es soit par un enrichissement en mucines, une hypercellularite des cryptes et un profil enzymatique cellulaire normal, soit par une augmentation des enzymes et des cryptes pauvres en mucines. La malignite pourrait etre liee au deuxieme type de lesions. L'etude du metabolisme du cholesterol a ete entreprise sur la lignee ht29 indifferenciee g#+ et une sous-population a differenciation enterocytaire g-rev. La cellule ht29 differenciee presente une activite acylcoenzyme a cholesterol acyltransferase (acat) comparable a celle des cellules intestinales et du colon. Cette cellule est capable de secreter des lipides. La cellule ht29 indifferenciee est depourvue d'activite acat et incapable de secreter des lipides. Les deux types cellulaires presentent un niveau de synthese eleve et sont equipes en recepteurs ldl fonctionnels. Le cholesterol issu des ldl n'entraine pas de repression ni du nombre des recepteurs ni de la neosynthese dans les cellules post confluentes g-rev. L'etude du devenir du cholesterol exogene ou endogene suggere l'existence d'un pool unique de cholesterol dans nos deux modeles. La modification du rapport cholesterol/phospholipides, tres augmentee dans le modele g#+ pourrait expliquer certaines differences dans le metabolisme et la differenciation des cellules ht29

L’obésité représente un problème de santé publique majeur, avec une prévalence en augmentation. Celle-ci peut s’accompagner de complications métaboliques telles que le diabète de type 2, l’hypertension artérielle, et les dyslipidémies. La chirurgie bariatrique constitue l’alternative thérapeutique de choix chez les patients obèses. La cholestérolémie est clairement améliorée chez les patients opérés, mais différemment en fonction des techniques chirurgicales pratiquées suggèrant que les mécanismes cellulaires et moléculaires impliquées varient selon les méthodes chirurgicales. Notre travail réalisé chez un modèle murin, a mis en évidence une baisse de la chlolestérolémie après roux en y gastric bypass (RYGB) plus importante qu’après une sleeve gastrectomie. Le RYGB induit une augmentation de l’excrétion fécale du cholestérol via une stimulation de l’excrétion transintestinale du cholestérol (TICE) et une réduction de la capacité intestinale à absorber le cholestérol. Dans ce contexte, et en élargissant dans la prise en charge de l’hypercholestérolémie, le TICE semble être une cible thérapeutique intéressante. Parallèlement à ce travail, nous avons étudié en collaboration avec l’INSERM U913 (Dr Neunlist), l’effet précoce de la sleeve gastrectomie sur la barrière intestinale. La sleeve induit des modifications de la perméabilité et de l'expression des protéines des jonctions serrées. Ces changements accroissent la translocation du LPS dans le plasma, favorisant ainsi un état pro-inflammatoire adipocytaire. L’effet tardif de la sleeve sur la perméabilité intestinale reste à être déterminé
Obesity is a major public health issue, with increasing prevalence. Metabolic complications such as type 2 diabetes, hypertension and dyslipidemia are frequently associated with morbid obesity. Bariatric surgery represents the therapeutic alternative of choice for these patients. Clinical studies show thatplasma cholesterol is clearly improved after surgery. Interestingly, the magnitude of reduction depends on the surgical techniques used suggesting that cellular and molecular mechanisms involved are different. Using mouse models,we demonstrated that Roux en Y Gastric Bypass (RYGB) strongly lowers plasma cholesterol compared to sleeve gastrectomy. RYGB increases fecal cholesterol excretion via the stimulation of trans intestinal cholesterol excretion (TICE) and a reduction of intestinal cholesterol absorption. In this context, and expanding in the management of hypercholesterolemia, TICE seems to be an interesting therapeutic target.In parallel with this work, we assessed, in collaboration with members of INSERM unit 913 (Dr Neunlist), the short-term effect of sleeve gastrectomy on intestinal barrier. We show that sleeve gastrectomy induces significant modifications of intestinal para and transcellular permeability by altering the expression of proteins involved in tight junctions. These changes favor plasma LPS translocation promoting a low grade pro-inflammatory state in adipose tissue. These effects of sleeve gastrectomy on intestinal permeability remain to be assessed after a longer post-surgical period

Revue Le catabolisme microbien des stérols passe par deux voies distinctes. L'une concerne la dégradation du noyau stéroïde, tandis que l'autre concerne le clivage de la chaîne latérale. Ce clivage est effectué par oxydation. Les actinomycètes sont généralement actifs dans le catabolisme des stérols. Le clivage sélectif de la chaîne latérale des stérols, qui fournit le noyau stéroïde est d'un intérêt économique remarquable. La cholestérol oxydase (COX), première enzyme du catabolisme des stérols, transforme la structure 5-ène-3[bêta]-ol en 4-ène-3-one. Les COXs microbiennes sont produites sous forme sécrétée et/ou sous forme cellulaire. Elles sont monomériques (54-62 kDa) et polymorphes. Le gène de l'enzyme et son opéron ont été identifiés chez une espèce de Streptomyces. Ce gène a été aussi étudié chez Brevibacterium sterolicum. Les COXs sont utilisées dans plusieurs applications. Resultats Deux isolats du sol (GK1, GK3), actifs dans le catabolisme des stérols, ont été identifiés comme appartenant au genre Rhodococcus. La souche GK1 (CIP 105335) produit la COX sous formes extracellulaire et cellulaire. La COX cellulaire est localisée à l'extérieur de la membrane cytoplasmique. Un essai calorimétrique a été mis au point pour doser l'activité de la COX. Il permet de doser l'enzyme acellulaire, et aussi l'enzyme liée aux cellules sans qu'elle soit extraite. L'induction de la COX de Rhodococcus sp. GK1 est liée à la chaîne latérale des stérols. La structure 3[bêta]-ol-5-ène ne suffit pas pour l'induire. La culture de cette souche sur stérols, comme seules sources de carbone et d'énergie, est marquée par la production de la COX cellulaire uniquement. Cette forme est extractible par traitement des cellules avec des détergents non ioniques. La croissance de GKl sur une source de carbone différente des stérols, ou sur un stérol plus un autre composé carboné, est marquée par une sécrétion importante de la COX. Les formes de la COX de GK1 ont la même spécificité de substrats. La double liaison en C-5 n'est pas nécessaire pour l'oxydation de la fonction alcool. La longueur de la chaîne latérale des stérols influence le niveau de l'activité. Ces formes possèdent un certain caractère hydrophobe. Le Triton X-100 ou le Lubrol PX (0,1- 0,2 %, p/v) stimulent leur activité. La COX de GK1 est relativement stable à des températures allant jusqu'à 50°C. La COX extracellulaire et cellulaire de cette souche ont été purifiées. Leur masse moléculaire est environ 59 kDa. La séquence en aminoacides du ségment N-terminal de la COX extracellulaire est: H2N-Ala-Pro-Pro-Val-Ala-Ser-XArg- Tyr-X-(Phe)-. Le pl de cette forme est de l'ordre de 9,0. Une cholestérol ester hydrolase (estérase) a été mise en évidence dans les cellules de GKl. Une alcool secondaire déshydrogénase NAD-dépendante a été obtenue de cette souche et caractérisée. Sa masse moléculaire apparente est 60 kDa. Elle catalyse la réduction des monocétones et des dicétones comme le 2-pentanone et le diacétyle. Elle oxyde des alcools secondaires comme l'isopropanol et le 2-octanol.

L’athérosclérose débute par l’accumulation de cholestérol dans les cellules des parois artérielles, formant des plaques d’athéromes. LRP1 protège contre la maladie en inhibant l’accumulation intracellulaire de cholestérol et nous avions montré qu’une signalisation Wnt5a était impliquée dans cette inhibition. Le projet de thèse consistait à caractériser les mécanismes moléculaires de cette inhibition et à vérifier l’effet athéroprotecteur de Wnt5a. Nous avons montré in vitro et in vivo que Wnt5a inhibe l’accumulation de cholestérol via la stimulation de son export et l’inhibition de sa synthèse endogène. Nous avons ensuite observé que l’invalidation de Wnt5a spécifiquement dans les CMLv de souris LDLR-/- conduit à une augmentation des lésions athéromateuses après un régime riche en cholestérol, confirmant alors son rôle athéroprotecteur. Nos travaux ont ainsi permis de révéler le potentiel de Wnt5a en tant que cible thérapeutique dans le traitement contre l’athérosclérose
Protects against intracellular cholesterol accumulation and we identified the secreted protein Wnt5a as a partner of this inhibitory effect of LRP1. The aim of this thesis is to determine the molecular mechanisms by which the LRP1/Wnt5a signaling pathway prevents cholesterol accumulation in cells and to study the antiatherogenic potential of Wnt5a. We first showed in vitro and in vivo that Wnt5a decreases cellular cholesterol content by stimulating its efflux through the induction of cholesterol transporters expression and by down-regulating the expression of HMGCoA-reductase. Then we used mice deleted for Wnt5a specifically in smooth muscle cells, which present more atherosclerotic lesions than control mice after a high cholesterol diet. This confirms that Wnt5a protects against atherosclerosis and could be an interesting therapeutic target in the treatment of the disease

Le bis(monoacylglycéro)phosphate (BMP) est un phospholipide localisé quasi exclusivement dans les endosomes tardifs. Il est impliqué dans le transport de macromolécules qui transitent via ce compartiment cellulaire. Nous montrons qu’un anticorps anti-BMP ainsi que l’accumulation de BMP dans des macrophages en culture altère les flux du cholestérol issu des lipoprotéines, depuis les endosomes tardifs vers la membrane plasmique et le réticulum endoplasmique. Par ailleurs, le BMP incorpore sélectivement l’acide docosahexaénoïque (DHA, 22:6n-3) dont les bénéfices cardiovasculaires ont été rapportés chez l’Homme. Notre étude indique qu’un apport élevé de DHA in vitro ou in vivo stimule la formation de l’espèce moléculaire 22:6/22:6-BMP. Cette molécule présente une grande sensibilité à la peroxydation, ce qui lui confère un rôle protecteur vis-à-vis de l’oxydation du cholestérol. Nous proposons que le 22:6/22:6-BMP puisse agir comme un anti-oxydant local au niveau des endosomes tardifs
Bis(monoacylglycero)phosphate (BMP) is a unique phospholipid preferentially found in late endosomes of mammalian cells. BMP is involved in the transport of macromolecules that transit through this compartment. We show that an anti-BMP antibody or the accumulation of BMP in cultured macrophages alters the redistribution of lipoprotein-derived cholesterol from late endosomes to plasma membrane and endoplasmic reticulum. Moreover, BMP selectively incorporates docosahexaenoic acid (DHA, 22:6n-3) whose cardiovascular benefits have been reported in Humans. We here report that high supplementation of DHA both in vitro and in vivo stimulate the formation of the 22:6/22:6-BMP molecular species. This molecule is very prone to peroxidation, and as such, is able to protect cholesterol against oxidation. We therefore propose that 22:6/22:6-BMP could act as a potential anti-oxidant in its immediate vicinity in endosomal membranes

La maladie d'Alzheimer (MA) se caractérise par la présence d'agrégats de peptides amyloïdes β (Aβ) issus du clivage de la protéine APP par les β- et y-secrétases. Plusieurs études ont mis en évidence des connexions entre la MA et le métabolisme lipidique. Dans le cerveau, l'excès de cholestérol est exporté via sa conversion en 24S-hydroxycholestérol, une étape contrôlée par la cholestérol 24S-hydroxylase. Nous avons étudié les conséquences de la modulation de l'activité de la cholestérol-24-hydroxylase sur les manifestations de la pathologie dans le modèle murin APP23. Nos résultats suggèrent que la surexpression de la cholestérol 24-hydroxylase, via une approche de transfert intracérébral de gène, présente un intérêt thérapeutique dans le cadre de la MA. En revanche, son inhibition est toxique et augmente la production des peptides Aβ. La modulation de l'activité de la cholestérol 24-hydroxylase pourrait donc jouer un rôle, bénéfique ou délétère, sur la maladie d'Alzheimer
Alzheimer disease (AD) is characterized by the presence of extracellular amyloid β (Aβ) deposits. Aβ peptides are produced through the successive cleavage of APP by β- and y-secretases. Several studies have demonstrated a clear link between AD and lipid metabolism. In the brain, cholesterol in excess can only be exported as 24S-hydroxycholesterol, this conversion being controlled by the cholesterol 24-hydroxylase. We studied the effects of the modulations of the cholesterol 24-hydroxylase activity in the APP23 mice, an AD mouse model. Our results suggest that the overexpression of the cholesterol 24-hydroxylase (though intracerebral gene transfer) may be a valuable therapeutic strategy for AD. On the contrary, its inhibition seems toxic and increases the production of Aβ peptides. A change of cholesterol 24-hydroxylase activity is therefore able to play a beneficial or noxious role on AEX

Isolement d'une bacterie du sol capable de se developper, dans un milieu mineral simple, avec comme seule source de carbone et d'energie des composes aromatiques tels que le phenol, le gaiacol, le 2-ethoxyphenol, le benzoate, le p-hydroxybenzoate, le protocatechuate, etc. . . Plusieurs enzymes, inductibles en fonction du substrat de croissance, sont purifiees et caracterisees

Un certain nombre de facteurs de risques cardiovasculaires, comprenant en particulier la cholestérolémie, la triglycéridémie, l'insulinémie et la glycémie, sont modulables par des modifications de l'alimentation. Considérant l'influence des glucides alimentaires sur le métabolisme des lipides, et en particulier du cholestérol, nous avons essayé de comprendre quelle pouvait être l'interaction glucides/cholestérol au niveau intestinal. Une étude clinique chez l'homme sain, réalisée au cours de deux périodes post-prandiales consécutives, a montré que les pâtes enrichies en fibres solubles ne modifient pas significativement les réponses glycémiques et insulinémiques, mais ont tendance à induire un pic plasmatique d'apoB48 moins élevé et moins tardif que celui induit par les pâtes de référence. Cette étude a permis d'observer, en sus d'une variabilité inter­individuelle dans l'absorption intestinale du cholestérol, une variabilité inter-individuelle dans la régulation de l'absorption intestinale du cholestérol par les fibres alimentaires solubles. Dans le but d'étudier au niveau de la cellule absorbante intestinale, une éventuelle interaction glucides/cholestérol, nous avons tout d'abord caractérisé les capacités métaboliques de trois clones d'un modèle entérocytaire humain, la lignée cellulaire Caco-2. Le clone TC7, qui a montré une meilleure viabilité dans nos conditions expérimentales, a été choisi pour la suite de nos expérimentations. Le suivi de l'absorption du cholestérol radiomarqué dans les cellules Caco-2 du clone TC7 en l'absence et en présence de glucides côté luminal, a montré que l'absorption intestinale du cholestérol est stimulée par la présence de glucose et de fructose. Ce travail montre pour la première fois une interaction glucide/cholestérol au niveau de la cellule absorbante intestinale. Ce lien mécanistique, qui devra être approfondi, permet de mieux mesurer l'importance des relations glucido-lipidiques probablement très impliquées dans l'étiologie nutritionnelle de l'athérosclérose.

En nutrition parentérale, les lipides sont apportés sous forme d'émulsions lipidiques intraveineuses (ILE) constituées de particules riches en triglycérides (TGRP) ou en phospholipides. In vitro ou dès leur entrée dans la circulation, ces particules interagissent avec les lipoprotéines (acquisition d'apolipoprotéines et échanges de lipides). Nous avons mis en évidence un autre type d'interaction entre lipoprotéines de densité légère (LDL) et TGRP d'ILE. Après incubation, des apo B, apolipoprotéines structurales non échangeables des LDL, sont dosées dans une fraction contenant les TGRP. Ceci suggère la formation d'un complexe LDL-TGRP, isolable par ultracentrifugation ou par chromatographie, et visible en microscopie électronique [. . . ]
In parenteral nutrition, lipids are delivered in the form of intravenous lipid emulsions (ILE),which contain triglycerid-rich particles (TGRP) and phospholipid-rich particles. In vitro and in the bloodstream, ILE particles interact with lipoproteins (apolipoprotein acquisition and lipid exchanges). In the present work, a new type of interaction between low-density lipoprotein (LDL) and ILE particles, was observed. After incubation, some apo B, was measured in the incubated emulsion fraction, despite they are structural non-exchangeable apolipoprotein of LDL. These results suggest the formation of LDL-TGRP complex, which are separated by ultracentrifugation and chromatography and this was confirmed by electron microscopy [. . . ]

L'athérosclérose est due à une accumulation de lipides dans la paroi vasculaire et conduit à un accident cardio- ou cérébro-vasculaire. Un de ses facteurs de risque majeurs est l'hypercholestérolémie, ainsi les traitements actuels sont hypocholestérolémiants. Malgré les drogues existantes, les maladies cardio-vasculaires restent la cause majeure de mortalité dans les pays industrialisés. Le LF 08-0133 est un produit original des Laboratoires Fournier ayant une activité hypocholestérolémiante, anti-athéromateuse et d'inhibition d'absorption intestinale du cholestérol (IAIC) in vivo. Le but de ce travail est la recherche du mécanisme d'action moléculaire du LF 08-0133. D'abord, l'identification de gènes cibles du produit chez la souris dans l'intestin, le foie et l'aorte a été menée. Parmi de nombreux gènes étudiés du métabolisme du cholestérol, aucun ne voit son expression modifiée par le LF 08-0133 de façon directe. Selon la technique globale d'étude d'expression (RAP-PCR), la drogue ne modifie pas l'expression de gènes dans l'intestin. Cependant, l'hypothèse de modification d'expression ne peut pas être exclue totalement car le transcriptome entier n'a pas été exploré. Le mécanisme d'IAIC a ensuite été étudié en recherchant d'éventuelles protéines cibles intestinales du LF 08-0133. La chromatographie d'affinité avec immobilisation du produit sur une colonne, a permis de purifier 11 bandes protéiques dont l'identification est en cours. Enfin, pour développer un modèle in vitro, l'activité IAIC du LF 08-0133 a été testée sur les cellules Caco-2 (entérocyte), mais le produit s'est révélé inactif. Ainsi, le mécanisme d'action du LF 08-0133 ne semble pas résider dans la régulation de l'expression de gènes, mais pourrait consister en une interaction du produit avec une/des protéine(s) de la muqueuse intestinale. Un des organes cibles du produit semble être l'intestin. Des études supplémentaires sont nécessaires afin d'identifier les cibles moléculaires du LF 08-0133
Atherosclerosis is a disease characterised by lipid accumulation in the vascular wall leading to heart attack or stroke. Hypercholesterolemia is an important risk factor and current treatments are largely based on cholesterol lowering. In spite of proven efficacy of existing drugs, cardiovascular disease still remains the most common cause of death in industrialized countries. LF 08-0133 is an original compound from Fournier Laboratories with hypocholesterolemic and antiatherosclerotic properties. It has further been shown to be an intestinal cholesterol absorption inhibitor (ICAI) in vivo. The aim of this work is to determine the molecular mechanism of action of LF 08-0133. Firstly, the identification of target genes of this compound was attempted in the intestine, liver and aorta of mice. Among the numerous genes of cholesterol metabolism investigated, there was no direct modification of gene expression by LF 08-0133. Additionally, based on the broad gene expression technique employed (RAP-PCR), the compound did not modulate gene expression in the intestine. This does not totally exclude the hypothesis of modification of expression, as the technique employed did not permit a complete coverage of the transcriptome. Secondly, the ICAI mechanism of the drug was investigated by attempting to identify potential intestinal target proteins. LF 08-0133 column immobilisation and subsequent affinity chromatography resulted in the isolation of 11 intestinal protein bands, which are currently being identified. Finally, in an attempt to develop an in vitro model, the ICAI activity of LF 08-0133 was tested in Caco-2 cells (enterocyte) and the drug was found to be inactive. The LF 08-0133 molecular mechanism of action does not appear to involve the regulation of gene expression, but could result from drug – intestinal protein interactions. The Intestine appears to be one of target organs of the compound. Further studies are needed to identify molecular targets of LF 08-0133

Notre laboratoire a récemment démontré l'existence d'un nouveau métabolite dérivé du cholestérol qui de plus est doué de propriétés suppresseur de tumeur: la dendrogénine A (DDA). La DDA est présente dans des tissus sains alors qu’elle est retrouvée en quantité plus faible dans les tumeurs. Ces observations suggèrent une dérégulation du métabolisme de la DDA dans les cancers, il apparait donc important d'identifier la DDA synthétase. Au cours de ma thèse j’ai 1/. Identifié la DDA synthétase, étudié son mode de fonctionnement, son expression et sa localisation dans des tissus mammaires humains sains et cancéreux. 2/. Mis au point une méthode de quantification de la DDA par couplage HPLC/MS 3/. Optimisé l’extraction et la purification de dérivés oxydés du cholestérol présents dans les matrices biologiques complexes pour les quantifiés par spectrométrie de masse
Our laboratory has recently demonstrated the existence of dendrogenine A (DDA), a new metabolite derived from cholesterol with tumor suppressor properties: DDA is present in healthy tissue while it is found in smaller amounts in tumors. These observations suggest a deregulation of the metabolism of the DDA in cancers, it seems important to identify the DDA synthetase. During my PhD I have: 1) identified the DDA synthetase studied its enzymatic parameters, its expression and localization in normal and cancerous human breast tissue; 2) developed a method for quantifying the DDA by coupling HPLC / MS; 3) Ioptimized the extraction and the purification of oxidized derivatives of cholesterol present in complex biological matrices for their quantification by mass spectrometry

Le déséquilibre de l’homéostasie cellulaire du cholestérol dans les macrophages et les CMLv ainsi qu’au niveau du tissu adipeux a plusieurs conséquences néfastes dans l’organisme vivant. Au niveau de la paroi vasculaire, le déséquilibre de l’homéostasie cellulaire du cholestérol induit également la formation des cellules spumeuses sécrétant un grand nombre de facteurs de croissance et de cytokines qui vont amplifier la réponse inflammatoire et contribuer ainsi au développement de la plaque d’ athérosclérose. De plus, dans le tissu adipeux, la modulation de l’homéostasie cellulaire du cholestérol favorise l’installation de l’obésité. La connaissance des molécules cibles et la compréhension des mécanismes impliqués dans la régulation de l’homéostasie cellulaire du cholestérol est donc primordiale pour prévenir l’accumulation intracellulaire du cholestérol et la formation des plaques d’athérosclérose. Le rôle de la protéine Wnt5a dans la régulation de l’accumulation cellulaire de cholestérol n’avait, à ce jour, pas été étudié. Nos résultats in vitro ont permis de montrer, pour la première fois, qu’en présence de LRP1, Wnt5a est exprimé et pourrait réduire l’accumulation cellulaire de cholestérol dans les MEFs après traitement avec un cocktail adipogénique. En plus, nous avons montré in vivo qu’en présence de LRP1, Wnt5a induit l’expression des gènes Sox9 et Cart1 marqueurs de la chondrogenèse et participe ainsi à l’activation de programme de la différenciation chondrocytaire au niveau des lésions athéroscléreuses. In vivo, nous avons montré que la surexpression de Wnt5a au dans le tissu adipeux blanc et brun chez la souris pourrait réduire l’accumulation du cholestérol dans les adipocytes. Nous avons montré que Wnt5a induit une diminution de l’expression des gènes codant pour les enzymes de la synthèse du cholestérol (HMGCoA synthase 2 et HMGCoA réductase) et pour le transporteur impliqué dans l’efflux du cholestérol (ABCA1) chez la souris
The imbalance of the cellular homeostasis of cholesterol in macrophages and VSMCs as well as adipose tissue has several adverse consequences in the organism. At the vessel wall, the imbalance of the cellular homeostasis of cholesterol induces the formation of foam cells secrete, many growth factors and cytokines. That amplifies the inflammatory response and contributes to the development of plate atherosclerosis. In adipose tissue, modulation of cellular homeostasis of cholesterol promotes the installation of obesity. Knowledge of target molecules and understanding of the mechanisms involved in regulating cellular homeostasis of cholesterol is essential to prevent the intracellular accumulation of cholesterol and the formation of atherosclerotic plaques. The role of Wnt5a protein in the regulation of cellular cholesterol accumulation had, to date, not been studied. In vitro, our results have shown for the first time we have shown in the presence of LRP1, Wnt5a is expressed and could reduce the cellular accumulation of cholesterol in MEFs after treatment with an adipogenic cocktail. In addition, we have shown in vivo in the presence of LRP1, Wnt5a induces the expression of genes Sox9 and Cart1 markers of chondrogenesis and thus contribute to the activation of chondrocyte differentiation program in terms of atherosclerotic lesions. In vivo, we showed that overexpression of Wnt5a in the white and brown adipose tissue in mice could reduce cholesterol accumulation in adipocytes. We demonstrated that Wnt5a induces a decrease the expression of genes encoding for enzymes involved in cholesterol synthesis (HMGCoA synthase and HMGCoA reductase 2) and the transporter involved in cholesterol efflux (ABCA1) in mice

Dans les cellules stéroi͏̈dogènes, le cholestérol est un substrat essentiel pour la production des hormones stéroi͏̈diennes. Nous avons examiné in vitro, sur les cellules de Leydig de rat mature, les effets d'inhibiteurs de l'HMG-CoA réductase, une enzyme impliquée dans l'étape limitante de la biosynthèse de cholestérol. La pravastatine, médicament utilisé couramment dans le traitement de l'hypercholestérolémie, affecte au-delà de 25 mu g/ml la viabilité cellulaire et induit une diminution de 25 % à la fois de la production de testostérone, de la synthèse endogène de cholestérol et des réserves de cholestérol estérifié. L'addition de lipoprotéines plasmatiques de faible densité (LDL) ou de haute densité (HDL) contrecarre entièrement la réduction des esters de cholestérol cellulaire et l'inhibition de la synthèse de testostérone induites par la pravastatine. Afin de préciser la contribution des voies apo A-I et apo E dans la capture du cholestérol HDL, les cellules de Leydig ont été mises en culture en présence de HDL sans apo E et de pravastatine. En présence ou non d'héparine, les HDL sans apo E contrecarrent l'inhibition de la synthèse de testostérone induite par la pravastatine, ce qui indique que la capture de cholestérol HDL sans apo E via une sécrétion d'apo E par les cellules elles-mêmes n'est pas envisageable. Ces résultats suggèrent que les cellules de Leydig sont capables d'utiliser les HDL par la voie apo A-I pour réguler leur stéroi͏̈dogenèse. Contrairement au 7béta-hydroxycholestérol, le 25-hydroxycholestérol induit dès 25 mu g/ml une inhibition de 50 % de la synthèse endogène de cholestérol. Par contre, la production de testostérone est augmentée de 30 %. Ces résultats suggèrent que la cellule de Leydig est capable d'utiliser le 25-hydroxycholestérol pour la synthèse de stéroi͏̈des. Cependant, à 25 mu g de 25--hydroxycholestérol/ml, les cellules de Leydig présentent des caractéristiques d'apoptose révélées par les tests DAPI et TUNEL ainsi qu'une augmentation de la perméabilité membranaire mise en évidence par le test au bleu Trypan. En définitive, nos résultats ont montré que le danger potentiel des inhibiteurs de l'HMG-CoA réductase vis-à-vis des cellules de Leydig de rat mature ne semble pas résider dans l'inhibition de la synthèse de testostérone mais plutôt dans leurs effets cytotoxiques.

Le but de ce travail était d'étudier le métabolisme des lipoprotéines et le transport inverse du cholestérol chez le chien sain, animal à faible activité CETP puis chez le chien insulinorésistant (IR). Chez le chien sain, l'apo B100 apparaît exclusivement dans les VLDL dont la production élevée est associée à un catabolisme important, égal à 5 fois celui de l'homme. L'apo B100 des LDL a un métabolisme similaire à celui de l'homme. Nos résultats montrent que le chien sain ne manifeste pas d'activité CETP in vivo mais présente un transport inverse du cholestérol très actif associé à une forte activité de la LCAT et à une importante captation sélective du cholestérol estérifié des HDL. Le chien est ainsi, parmi les espèces sans activité CETP, un bon modèle pour l'étude de la modulation de cette captation sélective du cholestérol. Les profils lipidiques des lipoprotéines obtenus par FPLC chez le chien obèse IR ont montré les mêmes perturbations que celles observées chez l'homme IR Ces résultats, confirmés par ceux obtenus par les méthodes cinétiques, suggèrent une activité CETP chez le chien obèse IR. Lors d'IR, la production d'apo B100 dans les VLDL est augmentée et la lipolyse diminuée. La concentration en apo B100 des LDL est diminuée, conséquence d'un catabolisme augmenté. Le chien pourrait donc constituer un bon modèle d'étude de certains effets de l'IR chez l'homme
Our aim was to study lipoproteins metabolism and reverse cholesterol transport in healthy dogs, a species which has a low CETP activity, and then in insulin resistant (IR) dogs. In healthy dogs, apo B100 exclusively appears in VLDL, which high production is associated with a high catabolism (5-fold greater than that of human). LDL-apoB100 metabolism seems to be similar in dogs and humans. Our results showed that the healthy dog does not exhibit any CETP activity in vivo, and that a high level of reverse cholesterol transport is due to a very important LCAT activity and a high HDL cholesteryl ester selective uptake. Indeed, among species lacking of CETP activity, the dog could to be the best model for the study of the modulation of HDL cholesteryl ester selective uptake. Lipoprotein profiles obtained from FPLC in obese IR dog show that lipids abnormalities are similar to those observed in IR human. These results, confirmed by kinetics suggest that obese IR dogs could have a CETP activity. IR leads to an increase in VLDL-apo B100, as a consequence of a lower lipolysis, and to a decrease in LDL-apo B100 level as a consequence of a higher catabolism. The model we developed could thus be useful for studying some effects of IR in humans

L’intestin est un acteur majeur du métabolisme du cholestérol de part son rôle dans dans l’absorption, la sécrétion des lipoprotéines et l’efflux transintestinal de cholestérol (TICE). De plus, c’est le second organe majeur, après le foie, à exprimer la Proproteine Convertase Subtilisine Kexine de type 9 (PCSK9), un inhibiteur naturel du récepteur aux LDL. Notre analyse des mécanismes moléculaires impliqués dans l’ hypocholestérolémie induite par les chirurgies bariatriques montre que la sleeve gastrectomie induit une hypocholestérolémie transitoire et modérée lié aux modifications de prise alimentaire. En revanche, le by-pass Roux en Y (RYGB) réduit fortement la cholestérolémie, stimule significativement son élimination fécale en induisant le TICE et en réduisant l’absorption intestinale de cholestérol. La seconde partie de ma thèse visait à répondre à une controverse autour de la faculté de l’intestin à sécréter PCSK9. In vivo (souris) et ex vivo (souris et homme), il ne semble pas que les cellules intestinales matures sécrètent PCSK9. En revanche, nous confirmons que la lignée humaine Caco2 est capable de sécréter PCSK9 mais que cette sécrétion est abolie lorsque les cellules deviennent matures. Les mécanismes responsables de cette perte de sécrétion restent mal définies mais sont dues au moins à deux paramètres: 1) une réduction du contenu intracellulaire induite par un catabolisme lysosomal accru; 2) une modification posttraductionelle de PCSK9 (glycosilation) altérant les voies de sécrétion post-Golgiennes. Les cellules Caco2 constituent un outil précieux pour disséquer les mécanismes et partenaires protéiques nécessaires à la sécrétion de PCSK9. Leurs identifications pourraient permettre de développer de nouveaux inhibiteurs pour réduire la sécrétion de PCSK9, réduire l’hypercholestérolémie et lutter plus efficacement contre les maladies cardiovasculaires
The intestine is a major actor of cholesterol metabolism from its role in absorption, secretion of lipoproteins and transintestinal cholesterol efflux (TICE). In addition, it is the second major organ, after the liver, to express the Proproteine Convertase Subtilisin Kexin type 9 (PCSK9), the natural inhibitor of the LDL receptor. Our analysis of molecular mechanism involved in hypocholesterolemia induced by bariatric surgeries shows that the gastrectomy sleeve induces a transient and moderate hypocholesterolemia linked to the modification of the food intake. In contrast, the Roux-Y by-pass (RYGB) strongly reduces cholesterol, significantly stimulates its fecal elimination by inducing TICE and decreasing intestinal absorption of cholesterol. The second part of my thesis consisted to elucidate the controversy around the faculty of the intestine to secrete PCSK9. In vivo (mice) and ex vivo (mice and human), it seems that mature enterocytes can’t secrete PCSK9. On the other hand, we confirm that the Caco2, an human intestinal cell line, is capable of secreting PCSK9, but this secretion is abolished when the cells become mature. Mechanisms responsible for this loss of secretion remain poorly defined and are, at least, due to: 1) a reduction in the intracellular content induced by increased lysosomal catabolism; 2) a post-translational modification of PCSK9 (glycosilation) altering post-Golgi secretion pathways. Caco2 cells are a powerfull tool for identify the mechanisms and partners required for the secretion of PCSK9. Their identifiers allow the development of new inhibitors to reduce the secretion of PCSK9, reduce hypercholesterolemia and fight more effectively against cardiovascular diseases

Le cholestérol est un lipide présent dans toutes les cellules animales et indispensable à leur survie. Parmi les rôles multiples qu’il joue dans l’organisme, celui de composant des membranes cellulaires est essentiel pour le maintien de leur structure, de leur fluidité et donc clé dans la modulation de nombreuses voies de signalisation. A ce titre, les neurones sont particulièrement dépendants de l’apport en cholestérol car l’intégrité de la composition de leur membrane est requise pour l’exocytose vésiculaire des neurotransmetteurs et la transduction du signal post-synaptique. Ainsi, il a été montré qu’un excès ou un défaut de ce composé est neurotoxique. De nombreuses maladies neurodégénératives, comme la maladie d’Alzheimer, ont d’ailleurs été associées à des perturbations de l’homéostasie du cholestérol, soulignant la nécessité d’une régulation fine de son métabolisme dans les tissus nerveux. Dans ce cadre, l’existence de mécanismes de coordination entre les actions des neurones et de la glie, dont les fonctions sont complémentaires, semble indispensable. Dans le cerveau, les astrocytes, cellules macrogliales majoritaires, seraient le principal lieu de synthèse et d’export du cholestérol. Les neurones, plutôt consommateurs, seraient spécifiquement en charge de son élimination, via sa conversion en 24(S)-hydroxycholestérol (24S-OHC) par l’enzyme CYP46A1. Ce métabolite ne serait pas seulement un produit d’excrétion du cholestérol, mais jouerait également le rôle de molécule signal dans les cellules gliales. Il permettrait d’adapter le métabolisme de la glie aux besoins en cholestérol, afin d’éviter toute surcharge dans les tissus cérébraux. Dans la rétine, le métabolisme du cholestérol et sa régulation, en condition physiologique et pathologique, sont encore peu décrits. Les cellules de Müller, macroglie majoritaire de la rétine, pourraient participer à la synthèse de cholestérol dans ce tissu, mais les arguments dans ce sens méritent d’être étoffés. Concernant le 24S-OHC, sa synthèse est essentiellement restreinte aux cellules ganglionnaires, neurones chargés de transmettre l’influx nerveux de la rétine au cerveau. Les résultats de quelques études menées au laboratoire suggèrent d’ailleurs que l’enzyme CYP46A1 et son métabolite seraient impliqués dans la physiopathologie du glaucome, maladie liée à la dégénérescence des cellules ganglionnaires.Le but de ce projet de thèse est de contribuer à une meilleure compréhension du métabolisme du cholestérol dans les cellules de Müller et son éventuelle régulation par le 24S-OHC. L’objectif était également de mettre en évidence de potentielles altérations du métabolisme du cholestérol au cours du glaucome en caractérisant, à différents points de temps, les acteurs moléculaires impliqués dans sa synthèse, son transport et son élimination.Nos expériences menées sur des cultures primaires de cellules de Müller indiquent que ces cellules possèdent la machinerie moléculaire pour synthétiser et exporter le cholestérol, et pourraient donc participer activement à son métabolisme dans la rétine. Nous avons également décrit un effet hypocholestérolémiant du 24S-OHC dans les cellules de Müller, ce qui renforce l’hypothèse selon laquelle ce composé pourrait intervenir dans la régulation du métabolisme du cholestérol dans la rétine. Dans un modèle de glaucome expérimental, par hyperpression oculaire chez le rat, nous avons observé des modifications majeures du métabolisme du cholestérol. De manière très précoce, il s’agit d’une surexpression des gènes impliqués dans la synthèse et la captation de cholestérol dans la rétine, puis d’une élévation transitoire des taux de ses précurseurs. Un élément important de notre travail a été de montrer que ces perturbations initiales sont suivies de l’activation de mécanismes de contre-régulation coordonnés, permettant de maintenir l’homéostasie du cholestérol dans la rétine et participant donc sans doute positivement à la survie des cellules ganglionnaires
Cholesterol is a lipid found in every animal cell and is necessary for its survival. Among its multiple roles in the body, it is a component of cell membranes that is crucial for the maintenance of their structure and fluidity and is thus implicated in the modulation of many signalling pathways. Neurons are especially dependant on cholesterol input since the proper composition of their plasma membrane is required for vesicular exocytosis of neurotransmitters and transduction of the post-synaptic signal. It has been shown that both an excess and a lack of cholesterol is neurotoxic. Moreover, many neurodegenerative diseases, such as Alzheimer’s or Huntington’s disease, have been associated with dysregulation of cholesterol homeostasis, highlighting the need for a fine regulation of its metabolism in nervous tissues. Coordinated actions of neurons and glia, that exhibit complementary functions, are mandatory in that respect. In the brain, astrocytes, the main macroglial cells, may be the major source of cholesterol biosynthesis and export. Neurons, acting as consumers, may be specifically in charge of cholesterol elimination via conversion into 24S-OHC by the CYP46A1 enzyme. This metabolite is likely not only an elimination product of cholesterol but also a signalling molecule in glial cells. It might enable glial cholesterol metabolism to adjust as needed and avoid an overload in brain tissues. In the retina, cholesterol metabolism and its regulation under physiological and pathological conditions remain largely unknown. Müller cells, the major macroglial cells of the retina, could participate in cholesterol synthesis in this tissue even though evidence is still needed. Regarding 24S-OHC, its synthesis is mainly restricted to retinal ganglion cells, neurons responsible for nervous signal transmission from the retina to the brain. Studies performed in our laboratory suggest that CYP46A1 and its product could be implicated in the physiopathology of glaucoma, a disease characterized by ganglion cell degeneration.The present project aims to provide a better understanding of cholesterol metabolism in Müller cells and its potential regulation by 24S-OHC. The goal is also to unveil changes in cholesterol metabolism during the progression of glaucoma by characterizing, at different time points, the molecular players implicated in its biosynthesis, transport and elimination. Our experiments performed on primary Müller cell cultures indicate that these cells possess the molecular machinery to synthesize and export cholesterol and could therefore actively participate in its metabolism in the retina. We also reported a strong hypocholesterolemic effect of 24S-OHC in Müller cells, reinforcing the hypothesis that this compound could be a regulator of cholesterol metabolism in the retina. In an experimental glaucoma model, induced by an elevation in intraocular pressure in rats, we observed major changes in cholesterol metabolism. At the earliest time points, genes implicated in cholesterol biosynthesis and uptake in the retina were upregulated, and cholesterol precursor levels were consecutively and transiently elevated. An important component of our work was to demonstrate that counter-regulatory mechanisms were activated in response to these initial dysregulations, that enabled the maintenance of cholesterol homeostasis in the retina and likely participated in ganglion cell survival

Les œstrogènes sont des hormones bien connues pour leur implication dans le développement sexué et la reproduction chez la femme. La distribution ubiquitaire des récepteurs des œstrogènes α et β favorise l’implication importante des œstrogènes dans plusieurs voies métaboliques dont celle des lipides, la balance énergétique, la masse osseuse et la cognition. Les œstrogènes sont malheureusement fortement associés à l’augmentation du risque de cancer du sein et de l’utérus. Le développement d’anti-œstrogènes pour traiter et prévenir les cancers œstrogénosensibles a mené à la découverte de modulateurs sélectifs des récepteurs des œstrogènes (SERM) ayant une action antagoniste au niveau de la glande mammaire et de l’endomètre, mais qui conservent des actions agonistes au niveau de la masse osseuse et du métabolisme des lipides. Les résultats présentés dans cette thèse démontrent que le SERM EM-652.HCl (EM), un puissant antagoniste dans la glande mammaire et l’utérus, possède des propriétés agonistes importantes au niveau du métabolisme des lipides. Nous avons observé que le EM diminue la prise alimentaire, ce qui résulte en une importante diminution de la masse adipeuse chez la rate intacte ou ovariectomisée et chez la souris. Dans ce dernier modèle, nous avons établi que les effets métaboliques bénéfiques du EM étaient entièrement dus à son interaction avec le récepteur des œstrogènes α. De plus, le traitement avec le EM induit une très forte diminution de la cholestérolémie. Le EM a augmenté la quantité de deux récepteurs hépatiques importants, le LDLr et le SR-B1, ce qui suggère fortement que l’effet hypocholestérolémiant du EM résulte d’une augmentation de la captation hépatique de cholestérol provenant des lipoprotéines circulantes. Enfin, le EM s’est avéré capable de diminuer fortement la cholestérolémie même chez des rats présentant une hypercholestérolémie induite par la diète. Ces données suggèrent donc un potentiel positif agoniste du EM-652.HCl sur le métabolisme des lipides et permettent de penser à une nouvelle thérapie chez la femme pour contrer les effets métaboliques négatifs de la ménopause, tout en la protégeant contre les cancers œstrogénosensibles.

Les effets de la nutrition parentérale (NP) sur la biodynamique du cholestérol et des lipoprotéines ont été étudiés chez des rats. Après 5 j d'infusion intraveineuse d'un mélange nutritif contenant ou non une émulsion lipidique (Intralipide 20 %), on observe une réduction de la masse intestinale et peu de changements des lipides plasmatiques. Les concentrations des HDL, d'apo-AIV et d'apo-AI sont abaissées, celles d'apo-E et B48 augmentées. La NP ne modifie pas la vitesse globale de captation des HDL (marquées au saccharose-14 C), mais l'intestin devient moins actif, et le foie et la rate plus actifs pour les internaliser. L'effet le plus spectaculaire, induit par l'émulsion infusée est une accumulation plasmatique d'une lipoprotéine anormale (lipoprotéine-X), dans la zone de densité des LDL (1,006-1,040). Elle se forme par captation de cholestérol endogène par les phospholipides résiduels de l'émulsion. La comparaison des effets de 2 émulsions montre clairement que l'lntralipide 20% (triglycérides/ phospholipides, TG/PL=100/6) génère, à même débit d'infusion, moins de lipoprotéine-X que l'émulsion à 10 % (TG / PL=100/12). Des phytostérols, initialement présents dans l'huile de soja de l'émulsion, sont mis en évidence dans l'ensemble des lipoprotéines du plasma et dans le contenu intestinal. L'activité de la cholestérogenèse, estimée in vivo par incorporation d'acétate-14c dans les stérols hépatiques et intestinaux, est fortement stimulée par la NP. Chez les rats recevant l'émulsion par voie intraveineuse, cet effet est la conséquence directe de l'accumulation de lipoprotéine-X. Une augmentation du pool des acides biliaires, témoignant d'une stase biliaire, a été mise en évidence chez des rats en NP, par méthode d'équilibre isotopique
The effects of parenteral nutrition (PN) on cholesterol and lipoprotein biodynamics have been studied in rats. After 5 days of intravenous infusion of a nutritive mixture, with or without lipids (Intralipid 20 %), rats exhibit a reduction of the intestinal mass and plasma levels of HDL, apo-AIV and apo-AI decrease, whereas those of apo-E and apo-B48 increased. PN does not change the overall uptake rate of 14c-labelled-HDL: intestine becomes less active, and the liver and spleen more active to internalize the HDL. The more spectacular effect induced by infused emulsion, is the plasma accumulation of an abnormal lipoprotein (lipoprotein-X) in the density zone of LDL (1,006-1,040). This particle results from the uptake of endogenous cholesterol by residual phospholipids of the emulsion after Iipolysis. The compared effects of 2 emulsions clearly indicate that, at the same infusion rate, Intralipid 20 % (triglycerides/ phospholids, TG/PL=100/6) generates less Iipoprotein-X than lntralipid 10 % (TG/ PL=100/12). Phytosterols, initially present in the soya oil of the emulsion, have been detected in all the lipoproteins and the intestinal content in rats infused with lipids. The activity of cholesterol synthesis, in vivo assessed by measurement of the 14c-acetate incorporation into hepatic and intestinal sterols, is markedly stimulated by PN. In rats intravenously infused with lipids, this effect directly results from the formation of lipoprotein-X. Finally, an increase of the bile acid pool, that reflects bile stasis, has been shown by an isotopic equilibrium method

La maladie d’Alzheimer (MA) se caractérise par une perte mnésique progressive et au plan neuropathologique par le dépôt extracellulaire de plaques amyloïdes, résultant de l’agrégation de peptides amyloïdes (Aβ), et par l’apparition d’une dégénérescence neurofibrillaire (DNF) constituée d’agrégats intraneuronaux de protéines Tau hyper et anormalement phosphorylées. L’évolution des déficits cognitifs des patients est particulièrement corrélée à la progression spatio-temporelle de la DNF. A l’heure actuelle, il n’existe aucun traitement curatif de la maladie. Le cholestérol joue un rôle central dans la physiopathologie de la MA. En particulier, l’allèle ε4 du gène de l’apolipoprotéine E, transporteur cérébral essentiel du cholestérol, est le principal facteur de risque génétique des formes sporadiques de la MA. De nombreuses études in vitro montrent qu’une surcharge en cholestérol induit la production d’Aβ pathogènes et qu’inversement, une déplétion en cholestérol entraîne une diminution de la voie amyloïde. Le cholestérol ne peut pas passer librement la barrière hémato-encéphalique (BHE). Le cholestérol cérébral est exclusivement synthétisé in situ. Le cholestérol cérébral en excès doit être exporté dans la circulation sanguine pour être métabolisé. Pour franchir la BHE, sa conversion en 24(S)-hydroxycholestérol est nécessaire, étape contrôlée par la cholestérol 24-hydroxylase (CYP46A1). Deux précédents travaux de thèse effectués dans le laboratoire ont permis de mettre en évidence des connexions étroites entre le métabolisme du cholestérol et la MA in vivo. La surexpression intracérébrale de CYP46A1 dans un modèle murin amyloïde à l’aide d’un vecteur viral adéno-associé (AAV) a conduit à la diminution de la production d’Aβ, des plaques amyloïdes et à l’amélioration des performances mnésiques des animaux. A l’inverse, l’inhibition de l’expression de CYP46A1 dans l’hippocampe de souris sauvages induit la production d’Aβ, la phosphorylation de Tau et des défauts mnésiques chez la souris. L’objectif de mon travail de doctorat a été de déterminer s’il existait un lien direct entre CYP46A1 et la pathologie Tau et si la modulation du métabolisme du cholestérol pourrait avoir un effet bénéfique sur la pathologie Tau associée à la MA. Pour répondre à ces questions, le modèle murin THY-Tau22, qui développe une pathologie Tau de type Alzheimer, a été utilisé. Cette pathologie, essentiellement hippocampique, est évolutive et associée à des déficits mnésiques. Dans l’hippocampe des souris THY-Tau22, le cholestérol libre total n’est pas modifié, alors que l’expression protéique de CYP46A1 est diminuée, et en conséquence le contenu en 24(S)-hydroxycholestérol. L’expression protéique de CYP46A1 dans l’hippocampe est également réduite dans un autre modèle murin de pathologie Tau, le modèle THY-Tau30. Ainsi, la pathologie Tau semble être à l’origine de la diminution de l’expression protéique de CYP46A1. Afin de déterminer si la surexpression de CYP46A1 chez la souris THY-Tau22 pouvait améliorer son phénotype biochimique, neuropathologique et clinique, un vecteur AAV codant pour CYP46A1 a été injecté dans l’hippocampe de souris THY-Tau22 âgées de trois mois et demi. Deux mois et demi après injection, la surexpression de CYP46A1 chez les souris THY-Tau22 induit une restauration de la concentration hippocampique en 24(S)-hydroxycholestérol et une augmentation de l’expression des gènes impliqués dans la synthèse du cholestérol, et plus particulièrement dans la voie du mévalonate. Deux mois et demi et cinq mois et demi post-injection, la surexpression de CYP46A1 entraîne une restauration complète des performances mnésiques des animaux qui s’accompagne d’un rétablissement de la dépression à long terme, de la longueur des dendrites secondaires, de la densité synaptique et de l’expression des gènes d’activité précoce dans l’hippocampe. (...)
Alzheimer’s disease (AD) is characterized by a progressive memory loss and neuropathologically by senile plaques and neurofibrillary tangles (NFTs). Senile plaques are constituted of extracellular amyloid peptide (Aβ) deposits while NFTs result from the accumulation and the aggregation of intracellular hyperphosphorylated Tau proteins. Spatiotemporal progression of NFTs particularly correlates with cognitive impairments. To date, there is no curative treatment for this disease. Cholesterol plays a central role in AD physiopathology. Indeed, the ε4 allele of the apolipoprotein E, the brain’s principal cholesterol-carrier protein, is the main genetic risk factor for sporadic forms of AD. Numerous in vitro studies have shown that cholesterol overload induces production of pathogenic Aβ and conversely, cholesterol depletion causes a reduction of the amyloidogenic pathway. In adult, brain cholesterol is exclusively synthesized in situ. Brain cholesterol is not able to freely cross the blood brain barrier and its major exportable form is 24(S)-hydroxycholesterol generated by the cholesterol 24-hydroxylase (CYP46A1). Two previous thesis works in this laboratory highlighted narrow connections between cholesterol metabolism and AD in vivo. The intracerebral overexpression of CYP46A1 mediated by an adeno-associated viral (AAV) vector, in a murine amyloid model, led to the decrease of Aβ production, senile plaques and improvement of memory abilities. At the opposite, hippocampal CYP46A1 inhibition in wild-type (WT) mice induced Aβ production, Tau phosphorylation and memory impairments. The aim of this thesis work was to determine whether there was a direct link between CYP46A1 and Tau pathology and whether cholesterol metabolism modulation could have a beneficial effect on AD-like Tau pathology. In order to answer these questions, the THY-Tau22 mouse model, that develops AD-like Tau pathology, was used. In this model, the pathology mainly occurs in the hippocampus, it is progressive, and associated with memory deficits. In THY-Tau22 mice, total free cholesterol in the hippocampus was unchanged, whereas both CYP46A1 protein expression and 24(S)-hydroxycholesterol content were decreased. Furthermore, we also demonstrated that CYP46A1 protein expression was reduced in another murine model of Tau pathology, the THY-Tau30 model. Therefore, it may suggest that Tau pathology can be responsible for CYP46A1 decrease. We next determined whether CYP46A1 overexpression in the THY-Tau22 mouse could improve its biochemical, clinical and neuropathologic phenotype. For this purpose, an AAV vector encoding CYP46A1 was injected in the hippocampus of 3.5-month-old WT and THY-Tau22 mice. Two and a half months after injection, hippocampal CYP46A1 overexpression in THY-Tau22 mice induced restoration of hippocampal 24(S)-hydroxycholesterol content and increased expression of genes involved in cholesterol synthesis, more particularly in the mevalonate pathway. Two and a half and five and a half months post-injection, CYP46A1 overexpression resulted in a complete restoration of memory abilities and was accompanied by restoration of long-term depression, length of secondary dendrites, synaptic density and expression of immediate-early genes in hippocampus. Despite this, abnormal Tau hyperphosphorylation and gliosis, that characterizes this model, remained unchanged after CYP46A1 overexpression. Altogether, these results suggest a direct connection between Tau pathology and CYP46A1 in vivo. In other words, Tau pathology could lead to memory deficits via CYP46A1 decrease. These data, together with the fact that CYP46A1 overexpression can modulate the amyloid pathology in mice, suggest that CYP46A1 may be a relevant therapeutic target for AD

L'influence de différentes formes d'apport d'acides gras (AG) insaturés sur le métabolisme cellulaire a été étudiée chez le rat selon deux approches différentes : 1) étude in vitro de l'influence sur la stéroïdogénèse de la nature des AG d'esters de cholesterol (EC) apportés par des lipoprotéines de haute densité (HDL) à des cellules corticosurrénaliennes de rat nouveau né en culture primaire. 2) Etude in vivo de l'apport au cerveau d'AG saturé [acide palmitique (16:0)] et insaturés [acide oléïque (18:1), linoléïque (18:2) et arachidonique (20:4)] liés à l'albumine sous forme de 2-acyl lysophosphatidylcholines (lysoPC) ou sous forme non estérifiée. Les deux techniques suivantes, synthèse d'EC et de 2-acyl-lysoPC doublement marqués et reconstitution de HDL contenant un EC bien défini, i. E. Composé d'une seule sorte d'AG (18:1 ou 18:2 ou 20:4), ont été mises au point pour réaliser nos experiences et sont donc décrites en détail. Les principaux résultats obtenus sont les suivants : 1) nous avons mis en évidence au niveau des cellules corticosurrénaliennes de rat une captation sélective des EC portés par des HDL en fonction du type d'AG, les EC contenant du 20:4 étant captés préférentiellement aux EC contenant du 18:1 ou du 18:2. La stéroïdogénèse globale des cellules est plus importante avec un EC contenant du 20:4 comparé aux autres types d'EC. De plus, la contribution des différentes voies métaboliques permettant l'utilisation du cholesterol pour la stéroïdogénèse diffère selon la nature de l'EC apporté aux cellules par les HDL. La contribution du cholesterol synthétisé de novo par les cellules est correlée négativement avec le degré d'insaturation des AG composant les EC. 2) Les 2-acyl-lysoPC représentent une source importante d'AG insaturés, notamment de 20:4, pour le cerveau en développement chez le rat. La captation des 2-acyl-lysoPC au niveau de cet organe augmente en fonction du degré d'insaturation des AG composant les lysoPC. Les AG insaturés liés à l'albumine sont captés plus efficacement par le cerveau sous leur forme estérifiée (2-acyl-lysoPC) que sous leur forme libre. En comparaison avec les autres organes étudiés (foie, cur et rein), le cerveau privilégie l'utilisation des 2-acyl-lysoPC insaturées par rapport à celle des AG insaturés correspondants circulant dans le plasma sous forme non estérifiée. Ces résultats montrent que la captation et le métabolisme des AG insaturés par différents organes sont influencés considérablement par la forme d'apport de ces AG.

Chez le rat génétiquement hypercholestérolémique (RICO), la forte augmentation du cholestérol plasmatique est liée principalement à celle des LDL et des HDL2. L'étude du système cholestérol a été entreprise après injection intraveineuse de cholestérol tritié, par application du principe d’occupation et analyse compartimentale. Ce système est caractérisé par une augmentation des entrées du cholestérol associée à une augmentation secondaire des sorties. Un plus faible mouvement du cholestérol du plasma vers les organes est également noté. Le renouvellement du cholestérol de chaque classe de lipoprotéines a été ainsi étudié chez le rat RICO et son témoin normocholestérolémique. L'utilisation d’analogues non dégradables dans la cellule (14C-Saccharose, 14C-Cholestéryl-linoléyl-éther) a permis la détermination des sites de captation des LDL et des HDL. Les principaux résultats de ce travail sont les suivants : -Une baisse du taux de catabolisme du cholestérol estérifié des chylomicrons, liée à une perturbation de la lipoprotéine. Une transformation des VLDL en LDL plus élevée chez le rat RICO. Une augmentation de la production des LDL liée à une baisse de leur taux de catabolisme. Ce dernier est associé en partie à une perturbation de la lipoprotéine accompagnée d'une faible captation par tous les organes. Une augmentation de la production du cholestérol estérifié des HDL sans modification de leur catabolisme global. La captation du cholestérol estérifié des HDL est plus basse dans les surrénales, le foie et les testicules, ce qui suggère une perturbation de l'activité phospholipasique de la lipase hépatique chez le rat RICO
In the genetically hypercholesterolemic (RICO) rat, the high cholesterol results mainly from an increase in the cholesterol content of LDL and HDL. The input-output analysis method showed an increase in cholesterol inputs associated with a secondary stimulation of the output. By using two pools analysis we observed slower movements of plasma cholesterol to the tissues. A study of plasma lipoprotein cholesterol turnover has been undertaken. The use of analogs undegradable by cells (14C-Saccharose, 14C-Cholestéryl-linoléyl-éther) allowed to measure the LDL and HDL uptake rates. Our main results in the RICO versus normocholesterolemic are the following : a decrease in the fractional catabolic rate of chylomicrons cholesterol ester related to the lipoprotein modification. An increase in the plasma VLDL transformation to LDL. A slower LDL fractional catabolic rate which is due to a modified LDL composition and a diminished LDL uptake in all tissues. An elevated production of HDL esterified cholesterol without any change in their catabolism. The uptake of HDL esterified cholesterol was lower in the adrenals, liver and testis in the RICO than in the control rats suggesting a lowered phospholipasic activity in the hypercholesterolemic animal

Le cholestérol est le principal stérol présent dans la rétine. Dans sa forme libre, le cholestérol est distribué dans toutes les couches cellulaires de la rétine, alors que le cholestérol estérifié s'accumule essentiellement à la base de l'épithélium pigmentaire rétinien. La capacité intrinsèque de la rétine à synthétiser le cholestérol paraît limitée, ce qui implique nécessairement que des voies extra-rétiniennes participent activement à suppléer la rétine en cholestérol. Les cellules gliales de Müller contribueraient à l'apport de cholestérol aux neurones de la rétine, en particulier pour la formation des synapses. Les conséquences délétères d'une accumulation ou à l'inverse d'un déficit en cholestérol dans les neurones sur leur survie souligne l'importance de maintenir l'équilibre entre l'apport et la néosynthèse du cholestérol d'une part et son élimination d'autre part. Pour cela, la rétine neurale a en particulier la capacité de convertir, pour l'éliminer, le cholestérol en 24S-hydroxycholestérol. En effet, le transport du 24S-hydroxycholestérol au travers des membranes est facilité par la présence d'un groupe hydroxyle supplémentaire, lui conférant une polarité plus importante par rapport au cholestérol. L'enzyme qui catalyse cette réaction est la cholestérol-24S-hydroxylase (CYP46A1). Des liens ont été établis entre CYP46A1, 24S-hydroxycholestérol et processus neurodégénératifs dans le cerveau, suggérant un rôle potentiel dans certaines pathologies comme la maladie d'Alzheimer. CYP46A1 est exprimée dans la rétine neurale, et plus particulièrement dans les cellules ganglionnaires de la rétine. Le rôle de CYP46A1 dans la rétine reste pour l'instant inconnu. Cependant, par analogie avec le cerveau, nous pouvons supposer une fonction dans le contrôle de l'homéostasie du cholestérol dans les neurones et envisager une association avec des pathologies dégénératives de la rétine comme la Dégénérescence Maculaire Liée à l'Âge (DMLA) ou le glaucome. Dans ce contexte, l'objectif de nos travaux a consisté à évaluer le rôle de la cholestérol-24S-hydroxylase dans la rétine en conditions physiologiques et pathologiques. Par une approche clinique, nous avons trouvé qu'un polymorphisme génétique dans CYP46A1 était un facteur de risque de glaucome (Risque relatif=1,26, intervalle de confiance à 95%=1,006-1,574, p<0,05) (Fourgeux et al. 2009, Invest Ophthalmol Vis Sci 50:5712-7). Par contre, ce polymorphisme génétique n'a pas été retrouvé, en tant que tel, comme facteur de risque chez des patients DMLA, mais pourrait l'être chez les patients non porteurs d'allèles à risque dans les gènes CFH et LOC388715 (Fourgeux et al. 2012, Invest Ophthalmol Vis Sci 53:7026-33). Deux approches expérimentales nous ont permis de suggérer qu'il existe un lien entre le stress des cellules de la rétine et le 24S-hydroxycholestérol. En effet, dans une étude in vivo faite chez le rat, après avoir reproduit une caractéristique principale du glaucome par l'augmentation de la pression intraoculaire, nous avons suggéré le rôle crucial de la glie dans le maintien de l'expression de CYP46A1 au cours de la neurodégénérescence de la rétine (Fourgeux et al. 2012, Acta Ophthalmol, Sep 23 ; doi: 10.1111/j.1755-3768.2012.02490.x.). Enfin, l'inhibition pharmacologique de l'activité CYP46A1 dans la rétine par le voriconazole injecté in vivo chez le rat nous a permis de mettre en évidence que la diminution du contenu en 24S-hydroxycholestérol de la rétine était associée à une dysfonction des cellules ganglionnaires, évaluée par électrorétinographie. En parallèle, nous avons observé une activation gliale, dont l'amplitude était amplifiée par l'inhibition de l'activation microgliale induite par la minocycline [...]

L'hypercholestérolémie est un facteur de risque majeur des maladies cardiovasculaires. La compréhension des mécanismes régissant l'homéostasie du cholestérol est cruciale puisqu'elle peut concourir au développement de nouvelles thérapies hypocholestérolémiantes. Les acides biliaires (AB) sont des dérivés terminaux du métabolisme du cholestérol. Ces molécules, produites dans le foie, jouent un rôle clef dans la digestion et l'absorption intestinale des lipides. Par ailleurs, elles représentent la principale voie d'élimination physiologique du cholestérol. Les résultats obtenus au cours de cette thèse montrent qu'il existe une régulation coordonnée des gènes codant pour les transporteurs d'AB dans l'intestin, le foie et rein. Ce mécanisme assure une élimination efficace des AB par voie fécale et urinaire et contribue à expliquer la résistance de la souris à l'hypercholestérolémie induite par voie alimentaire. Les facteurs de transcription SREBP-2 et HNF-1, et le récepteur nucléaire PPAR, jouent un rôle clef dans ce mécanisme adaptatif puisqu'ils assurent la régulation cholestérol-dépendante de plusieurs transporteurs clefs d'AB, en particulier l'ASBT dans l'iléon et le rein, et la L-FABP dans le foie
Hypercholesterolemia is a major risk factor of cardiovascular diseases. Understanding of mechanisms ensuring the maintenance of body cholesterol homeostasis is crucial, since it can allow the development of new hypocholesterolemiant therapies. Bile Acids (BA) are end-products of cholesterol metabolism. These molecules, produced in the liver, participate to fat digestion and absorption in the intestine. Moreover, BA represent the main pathway of body cholesterol removal. The results presented in this thesis show that genes encoding intestinal, hepatic and renal BA transporters are coordinately regulated. This mechanism ensures efficient BA elimination through faecal and urinary route, and thus contributes to explain the resistance of mice to diet-induced hypercholesterolemia. The transcription factors SREBP-2 and HNF-1, and the nuclear receptor PPAR, play a key role in this adaptative process since they allow cholesterol-dependent regulation of several key BA transporters, particularly ASBT in the ileum and the kidney, and L-FABP in the liver

La prévention et le traitement de l'athérosclérose nécessitent la réduction des facteurs de risque d'athérome et la compréhension des mécanismes conduisant à l'accumulation de cholestérol dans les cellules spumeuses de la plaque d'athérome. Les fibrates, ligands agonistes des récepteurs nucléaires PPAR, réduisent le risque d'athérome, en particulier par leur action hypolipidémiante. Nous avons montré dans une première étude que cette amélioration du profil lipidique par les fibrates chez des sujets diabétiques de type 2 implique une réduction de la lipogenèse hépatique, participant à la baisse des triglycérides plasmatiques, et une stimulation de l'expression du transporteur ABCA1, protéine clef de l'efflux de cholestérol hors des cellules et de la voie de retour du cholestérol, favorisant l'augmentation des concentrations d'HDL-cholestérol. Dans une deuxième étude nous avons comparé l'expression de gènes régulateurs du métabolisme du cholestérol dans les plaques d'athérome carotidien humain par rapport au tissu artériel situé au voisinage de la plaque. Les quantités de protéine ABCA1 sont diminuées de manière majeure dans la plaque, ce qui réduit les capacités d'efflux de cholestérol, alors que l'expression de CD36, impliqué dans la captation du cholestérol, est augmentée. Ces deux modifications favorisent le dépôt de cholestérol. De plus l'expression de protéines entourant les gouttelettes lipidiques, ADRP et périlipine, est au contraire augmentée dans les plaques. Si lors rôle est comparable à celui décrit dans les adipocytes, ces deux protéines pourraient contribuer aussi à la constitution et au maintien des dépôts de cholestérol dans la plaque

Certains radionucléides sont dispersés dans l'environnement du fait d'accidents, d'incidents ou de leur utilisation industrielle. L'Homme est donc susceptible d'être exposé à de faibles concentrations de radionucléides via des aliments contaminés. L'impact d'une ingestion chronique d'uranium appauvri (UA) ou de césium-137 (137Cs) a été étudié sur le métabolisme hépatique et cérébral du cholestérol. En effet, le cholestérol est un composé essentiel en tant que constituant des membranes cellulaires et précurseur de nombreuses molécules physiologiques (acides biliaires, neurostéroïdes. . . ). La perturbation de son métabolisme est associée à de nombreuses pathologies (athéosclérose, maladie d'Alzheimer. . . ). Des rats ont ingéré quotidiennement une faible concentration d'UA ou de 137Cs pendant 9 mois. Pour chaque radionucléide, le modèle de référence (contaminé depuis l'âge adulte) et un modèle plus sensible (contaminé depuis la vie foetale ou hypercholestérolémique) ont été étudiés. Les effets affectent en majorité l'expression génique ou l'activité enzymatique. L'UA affecte une enzyme de catabolisme dans les deux modèles, ainsi que des transporteurs membranaires et des facteurs de régulation. Le 137Cs affecte principalement l'enzyme de stockage dans les deux modèles, ainsi que des apolipoprotéines, des enzymes de catabolisme et des facteurs de régulation. Aucun changement du bilan biochimique sanguin ni du taux de cholestérol tissulaire (foie/ cerveau) n'est observé quels que soient le modèle et le radionucléide. Ainsi, une contamination interne chronique par l'UA ou le 137Cs induit des effets biologiques de niveau moléculaire sur le métabolisme du cholestérol, sans affecter son homéostasie ni l'état génaral de tous nos modèles expérimentaux

La détermination des valeurs usuelles des constituants lipidiques chez 465 chèvres a permis de montrer que les concentrations des différents constituants sont davantage affectées par les conditions d'alimentation que par l'âge ou le sexe, sauf chez les nouveaux-nés qui sont en fait des monogastriques. Les lipoprotéines ont un profil voisin de celui des autres ruminants avec prédominance des HDL sur les autres fractions. Elles peuvent être fractionnées par électrophorèse, ultracentrifugation, et précipitation par le sulfate de dextran. Le fractionnement des apolipoprotéines par électrophorèse en milieu SDS a révélé des apolipoprotéines similaires à celles qui sont observées chez l'homme. Lors de la restriction hydrique ou alimentaire, les triglycérides restent inchangés alors que le cholestérol total et les phospholipides sont fortement abaissés. Parallèlement, les meilleurs indicateurs de ces restrictions ont été les corps cétoniques et le glucose plasmatiques dont les variations on été intenses, précoces et durables. Chez les chèvres de la zone d'endémie de fluorose au Maros, il y avait de même une légère diminution du cholestérol total et des phospholipides parallèle à une diminution des HDL.

La revue générale est consacrée au métabolisme des triglycérides et esters de cholestérol cellulaires d'origines exogène et endogène ainsi qu'aux divers systèmes enzymatiques impliques dans leur dégradation. Elle fait également le point sur la myopathie a surcharge lipidique multisystemique, (ou neutral lipid storage disease, nlsd) et sur la maladie de wolman, maladies génétiques présentant respectivement un blocage de la dégradation des triglycérides cytoplasmiques et lysosomiques. Les cellules de ces maladies nous servent de modèle pour les études de compartimentation métabolique. La dégradation des triglycérides et des esters de cholestérol apportes par les hdl dans les fibroblastes semble se produire dans des compartiments subcellulaires extra-lysosomiques similaires a ceux impliques dans la dégradation des triglycérides et esters de cholestérol d'origine endogène. Les triglycérides neosynthetises par la cellule ou apportes par les hdl s'accumulent dans les fibroblastes de nlsd, alors que les esters de cholestérol sont dégrades normalement (febs lett. , 1993, 328, 230-234). Les triglycérides lies aux hdl sont captes sélectivement sans internalisation des apoprotéines (biochem. J. , 1994, 297, 467-473). Il existe deux systèmes enzymatiques différents impliques dans la dégradation des triglycérides endogènes en fonction de la longueur de chaîne des acides gras incorpores. Au dessous de 10 atomes de carbone, les enzymes impliques seraient apparentes a des carboxylesterases (non déficitaire dans la nlsd). Au dessus de 10 atomes de carbone, les triglycérides seraient degrades par la lipase neutre cytoplasmique (déficitaire dans la nlsd). La lipase neutre est transférée du cytosol vers les membranes lors de la charge en acide oléique dans les cellules normales alors que dans les cellules de nlsd elle reste cytosolique. Cette translocation peut être bloquée par des inhibiteurs de la synthèse protéique ainsi que par un inhibiteur de la protéine kinase c. Enfin la dernière partie de notre travail expérimental a consiste en une thérapie génique des cellules de nlsd par transsection avec de l'ADN génomique murin puis sélection des cellules corrigées par photosensibilisation

La compréhension des mécanismes de la captation hépatique des Lipoprotéines de Haute Densité (HDL), dans le cadre de d'élimination du cholestérol, est au coeur de nos travaux. Une nouvelle voie a été décrite au laboratoire où l'apolipoprotéine A-I des HDL se lie à une F1-ATPase à la surface des hépatocytes et induit la production d'ADP. Cet ADP active secondairement une signalisation dépendante du récepteur nucléotidique P2Y13 et stimule in fine l'endocytose des HDL. Nous avons mis en évidence l'importance de la réorganisation du cytosquelette d'actine sous le contrôle de la GTPase RhoA et son effecteur ROCKI, en aval du récepteur P2Y13. En parallèle, nous avons démontré in vivo l'importance physiologique de cette voie dans le catabolisme des HDL et l'élimination biliaire du cholestérol qui en découle. Ainsi, le récepteur nucléotidique P2Y13 apparaît comme une nouvelle cible pharmacologique en complément aux traitements actuels de l'hypercholestérolémie
HDL mediate the elimination of cholesterol thanks to their internalization by hepatocytes. We identified in hepatocytes a new pathway for HDL endocytosis as following: stimulation of an ectopic cell surface F1-ATPase by the HDL apolipoprotein A-I, induces the production of ADP which in turn activates the purinergic receptor P2Y13, triggering HDL endocytosis through unknown low affinity receptor(s). In one hand, we identified a major role of the small GTPase RhoA and its effector ROCK1 downstream P2Y13. This cell signalling stimulates the HDL endocytosis by remodelling actin cytoskeleton. In other hand, the study in mice showed the crucial role of P2Y13 in HDL catabolism and in the subsequent cholesterol biliary elimination. Taking together, these results demonstrate the importance of the receptor P2Y13 in cholesterol metabolism. Thus, P2Y13 appears as a new pharmacological target to control reverse cholesterol transport and prevent hypercholesterolemia

L’intestin joue un rôle clé dans le contrôle de l’homéostasie énergétique. Les entérocytes sont des cellules polarisées qui permettent les échanges entre la lumière intestinale (membrane apicale) et le compartiment lymphatique et sanguin (membrane baso-latérale). Dans cette thèse, nous nous sommes particulièrement intéressés au contrôle par les entérocytes de deux processus liés au métabolisme des lipides et du cholestérol : l’excrétion trans-intestinale de cholestérol (TICE) et l’absorption des lipides alimentaires.Très récemment, il a été montré que l’intestin contribue à 20-30% de l’excrétion fécale du cholestérol chez la souris. Ce mécanisme, appelé TICE, implique le passage direct du cholestérol provenant de la circulation sanguine à travers les entérocytes vers les fèces. De par son caractère modulable par des substances pharmacologiques comme l’ézétimibe et les statines, le TICE représente une cible thérapeutique potentielle pour corriger les dyslipidémies athérogènes du diabétique. Cependant, les mécanismes moléculaires gouvernant le transport rétrograde du cholestérol (du pôle baso-latéral au pôle apical) dans l’entérocyte lors du TICE, sont complètement inconnus. Dans une première étude, nous avons mis en évidence la lignée entérocytaire humaine Caco-2/TC7 comme un modèle d’étude des processus trans-entérocytaires liés au TICE. Nous avons d’abord montré que suite à l’incubation avec du plasma humain dans le compartiment baso-latéral et des micelles lipidiques dans le compartiment apical, les cellules Caco-2/TC7 miment des caractéristiques du TICE in vivo. De plus, grâce à ce modèle in vitro, nous avons pu identifier les microtubules comme acteurs nécessaires au transport rétrograde du cholestérol dans l’entérocyte. Dans une seconde étude, nous nous sommes intéressés au contrôle par le récepteur nucléaire Rev-erbα de la production des chylomicrons (CM) par les entérocytes. En effet, bien qu’essentiellement vue comme la conséquence d’une clairance retardée, des données émergentes présentent la surproduction de CM par l’intestin comme un contributeur majeur de la dyslipidémie chez l’insulino-résistant. Il existe une balance, au sein de l’entérocyte, entre l’utilisation des lipides absorbés pour un stockage transitoire sous forme de gouttelettes lipidiques (GL) cytosoliques ou pour l’assemblage de lipoprotéines riches en triglycérides (LRT). Le récepteur nucléaire Rev-erbα est un répresseur transcriptionnel impliqué dans le métabolisme énergétique et le rythme circadien. Rev-erbα contrôle particulièrement le métabolisme lipidique au niveau du foie et le catabolisme des LRT. Pour cette seconde étude, une lignée Caco-2/TC7 invalidée pour Rev-erbα (sh Rev-erbα) a donc été développée par infection lentivirale et différenciée sur insert. Les résultats indiquent que suite à l’incubation avec des micelles lipidiques dans le compartiment apical, les cellules Caco-2/TC7 sh Rev-erbα sécrètent plus de LRT dans le milieu baso-latéral et stockent moins de lipides sous la forme de GL cytosoliques. De plus, la lignée Caco-2/TC7 sh Rev-erbα présente une activité lipophagique plus importante et l’inhibition de l’autophagie par la bafilomycine dans cette lignée restaure la sécrétion baso-latérale de LRT et le stockage intracellulaire de GL aux mêmes niveaux que ceux de la lignée sh control. Cette seconde étude montre donc que l’invalidation de Rev-erbα dans l’entérocyte entraîne une augmentation de la mobilisation des lipides des GL via le processus de la lipophagie résultant en une augmentation de la sécrétion de LRT. Notre hypothèse est que Rev-erbα joue un rôle clé dans le contrôle de la balance GL/LRT et donc de la triglycéridémie post-prandiale.Les deux études présentées dans cette thèse permettent une meilleure compréhension des mécanismes liés au contrôle du métabolisme lipidique par l’intestin et mettent ainsi en avant l’intestin comme une cible thérapeutique potentielle pour corriger les dyslipidémies du diabétique
The intestine plays a key role in the control of energy homeostasis. Enterocytes, which constitute the main cellular type of intestinal epithelium (> 90%), are polarized cells allowing exchanges between intestinal lumen (apical membrane) and lymph/blood compartment (basolateral membrane). In this thesis, cholesterol and lipid metabolism control by enterocytes was studied and particularly, trans intestinal cholesterol excretion (TICE) and dietary lipid absorption.Recently, it has been estimated that intestine contributes 20-30% of fecal neutral sterol excretion in chow-fed mice. This pathway called TICE involves the direct luminal secretion of plasma-derived cholesterol by enterocytes. Moreover, TICE can be pharmacologically modulated, for instance by ezetimibe and statins and so, represents a new therapeutic target in order to prevent atherosclerosis in type 2 diabetic patients. However, at present, the molecular mechanisms behind the trans-enterocytic process of TICE are still unknown, especially the steps sustaining cholesterol entry, trafficking and efflux in enterocytes. In the first study of this thesis, we highlighted the human enterocytic Caco-2/TC7 cell line as a suitable model to study the enterocyte-related processes of TICE. We have first shown that upon basolateral incubation with human plasma and apical incubation with lipid micelles, differentiated Caco-2/TC7 cells mimic some of the in vivo TICE features. Moreover, using this model, we have identified a key role of the microtubule network in the process.In the second study of this thesis, chylomicron secretion by enterocytes and its control by the nuclear receptor Rev-erbα were investigated. Indeed, although chylomicron remnant accumulation has been associated to a delayed clearance by the liver, some recent studies show that chylomicron overproduction by the intestine is a major contributor to dyslipidemia in insulin resistant patients. Dietary lipid absorption results from a balance between transient storage in enterocytes as cytosolic lipid droplets (LD) and secretion as triglyceride-rich lipoproteins (TRL). The nuclear receptor Rev-erbα is a transcriptional repressor involved in the energy metabolism and the circadian rhythm. Particularly, Rev-erbα controls lipid metabolism in the liver and thus the catabolism of TRL. The aim of this second study was to investigate the role of Rev-erbα in intestinal lipid metabolism and particularly in TRL secretion. To study that, Caco-2/TC7 cells infected with lentivirus encoding or not a shRNA targeting Rev-erbα (sh Rev-erbα) were grown on transwells. Compared to sh control, sh Rev-erbα Caco-2/TC7 cells secrete higher amounts of micelle-derived LRT in the basolateral medium and exhibit lower quantity of neutral lipids stored as cytosolic LD, whereas the apical uptake is not different. Activation of lipophagy in sh Rev-erbα compared to sh control cells was evidenced by a higher autophagic flux and an increased colocalization of the autophagy marker LC3 with LD. Finally, autophagy inhibition with bafilomycin in sh Rev-erbα cells restores lipid secretion to the same level as in sh control cells. This second study show that Rev-erbα knock-down in enterocytes leads to a higher lipophagy-mediated remobilization of intracellular lipids and an increased TRL secretion. Our hypothesis is that Rev-erbα may be a molecular gear in the control of chylomicron secretion and a major regulator of post-prandial triglyceridemia.In conclusion, these two studies allow to better understand lipid metabolism control by the intestine: the first one by identifying the contribution of the microtubule network in enterocytes for trans-enterocytic retrograde cholesterol transport; the second one by highlighting the nuclear receptor Rev-erbα as a regulator of TRL secretion by enterocytes. These two studies point out the intestine as a potential therapeutic target to treat dyslipidemia in type 2 diabetic patients

La synthèse et le catabolisme du cholestérol impliquent, dans certaines étapes, des enzymes localisées dans les peroxysomes. L'objectif de notre travail a été de caractériser l'effet sur ce métabolisme du ciprofibrate, hypolipémiant et puissant proliférateur de peroxysomes. Dans la première partie, nous avons validé pour leur réponse péroxysomale au ciprofibrate, les lignées d'hépatome de rat FAO et MH#1c#1, et la lignée d'hépatoblastome humain HEP2. Cette réponse a été évaluée au niveau ultrastructural par une analyse de la taille, du nombre et de la forme des peroxysomes et au niveau biochimique par une étude de l'expression de l'AOX, enzyme marqueur de la prolifération des peroxysomes. Les lignées FAO et HEPG2 possédant des réponses comparables à celles in vivo chez le rat et l'homme respectivement, sont des modèles adaptés à l'étude des différences interespèces dans l'effet du ciprofibrate. La seconde partie concerne l'effet du ciprofibrate sur la synthèse des acides biliaires, dans des hépatocytes de rat cultivés en milieu riche en lipides (SVF), et en milieu appauvri en lipides (SD). Le ciprofibrate diminue la conversion de cholestérol (#1#4c) exogène en acides biliaires radiomarqués, en milieu SD seulement, mais ne modifie pas la production globale des acides biliaires, en milieu SD ou SVF. De plus, le ciprofibrate modifie l'équilibre entre la voie neutre et la voie acide de synthèse des acides biliaires, favorisant la voie neutre engagée par la 7 alpha-hydroxylase et qui produit les acides cholique et chénodésoxycholique. Le dernier volet aborde la régulation par le ciprofibrate d'une des enzymes clés de la cholestérogenèse, la farnesyl pyrophosphate (FPP) synthase, dans différents modèles cellulaires. L'activité FPP synthase est stimulée par le ciprofibrate dans les cultures d'hépatocytes de rat, ainsi que dans les lignées de rat MH#1c#1 et humaine HEPG2. La régulation s'effectue au niveau transcriptionnel et l'induction est réprimée par le 25-hydroxycholesterol.

Le but de notre travail a ete d'evaluer et de comparer chez le veau preruminant, les effets de deux sources d'acides gras, l'une riche en acides gras (ag) satures et monoinsatures a 18 atomes de carbone (suif), l'autre riche en ag essentiels de la famille n-6 (acide linoleique) (huile de soja) en combinaison ou non avec l'apport de cholesterol (1% de la ms). Cette etude a permis de mettre en evidence les points suivants: l'huile de soja, riche en acide linoleique provoque a la difference de l'homme et des rongeurs, une hypercholesterolemie due a la forte accumulation de hdl de type 1 riches en esters de cholesterol. Ce regime riche en agpi, entraine simultanement une hypotriglyceridemie en raison de la chute de la teneur plasmatique en chylomicrons. L'addition de cholesterol renforce l'effet hypercholesterolemiant en favorisant l'accumulation des idl et ldl plasmatiques probablement par un effet negatif sur le recepteur tissulaire ldl. Le cholesterol associe au regime huile de soja stimule la secretion de vldl par le foie par un mecanisme independant de l'expression du gene de l'apo b. Les regimes a base d'huile de soja, riches en acide linoleique, stimulent l'accumulation de triglycerides dans le tissu hepatique, intestinal ou musculaire. Ils entrainent l'incorporation massive de l'acide linoleique dans les lipides tissulaires, notamment dans les triglycerides du muscle au detriment de l'acide palmitique, ameliorant ainsi la qualite dietetique de la viande de veau

Le maintien de l’homéostasie énergétique est un processus fondamental pour l’organisme. Un déséquilibre de la balance énergétique, c'est-à-dire un déséquilibre entre l’apport et la dépense énergétique peut avoir de graves conséquences et aboutir au développement de maladies métaboliques telles que le diabète de type 2 et l’obésité. L’AMP-activated protein kinase (AMPK) est considérée comme un régulateur majeur de l’homéostasie énergétique. Activée par une déplétion en énergie de la cellule, son rôle est de rétablir l’équilibre énergétique. Pour cela, elle induit les voies métaboliques qui produisent de l’énergie (par exemple l’oxydation des acides gras) et inhibent celles qui en consomment (par exemple la lipogenèse ou la néoglucogenèse). L’intérêt de l’AMPK en tant que cible thérapeutique vient du fait qu’elle est impliquée dans le contrôle de nombreuses voies métaboliques ayant un défaut de régulation dans des pathologies telles que le diabète de type 2. Ce travail de recherche s’est inscrit dans une optique d’approfondissement des connaissances sur les rôles physiologiques de l’AMPK dans deux tissus jouant un rôle majeur dans la régulation du métabolisme énergétique, le tissu adipeux et le foie. Dans la première partie de ce travail, nous nous sommes intéressés à l’AMPK adipocytaire et son rôle dans la régulation du métabolisme du tissu adipeux. Cette étude nous a permis de montrer que l’AMPK adipocytaire était activée dans des conditions de stimulation de la lipolyse, à savoir au cours du jeûne ou en réponse à une stimulation du système -adrénergique. Dans ces conditions, l’AMPK exerce un rétrocontrôle négatif sur l’activité lipolytique et inhibe la libération des acides gras. L’activation de l’AMPK dans le tissu adipeux pourrait donc être bénéfique dans le cadre des maladies métaboliques. En effet, en exerçant un frein à la libération des acides gras, l’AMPK pourrait contribuer à diminuer les concentrations plasmatiques d’acides gras libres et l’accumulation ectopique de lipides observée chez les patients diabétiques. Une amélioration du profil lipidique de ces patients permettrait de rétablir la sensibilité des tissus périphériques à l’action de l’insuline et diminuer l’incidence des complications qui y sont associées. La deuxième partie de ce travail a porté sur l’étude du rôle physiologique de l’AMPK dans le foie. Différentes études se sont déjà intéressées aux conséquences d’une activation ou inhibition de l’AMPK sur le métabolisme hépatique. Pour aller plus loin dans ces investigations, nous avons, à l’aide d’un adénovirus, étudié les conséquences d’une inhibition aiguë de l’AMPK hépatique. Cette inhibition engendre un phénotype original extrêmement marqué, caractéristique d’une altération importante du métabolisme hépatique et d’une souffrance hépatique. L’atteinte hépatique observée chez ces animaux semble être la conséquence d’une altération de l’homéostasie biliaire hépatique. La sécrétion biliaire est un processus extrêmement important qui représente pour le foie l’unique voie d’épuration du cholestérol. Les acides biliaires, principaux constituants de la bile sont en effet synthétisés dans le foie à partir de cholestérol. L’AMPK étant un inhibiteur de l’HMG-CoA réductase et de la synthèse du cholestérol, la perte de cette régulation pourrait entraîner une accumulation d’acides biliaires dans le foie de ces animaux et être responsable du développement d’une cholestase hépatique. Cette étude nous a permis de mettre en évidence un rôle essentiel de l’AMPK dans le maintien de l’homéostasie du cholestérol. Ces observations suggèrent également un rôle de l’AMPK dans la voie de biosynthèse des acides biliaires qui n’avait jusqu’ici jamais été décrit.

Saccharothrix algeriensis est une bactérie filamenteuse productrice de plusieurs molécules de la famille des dithiolopyrrolones aux propriétés à la fois antibiotiques et anticancéreuses. Ces composés sont constitués d'un noyau bicyclique commun, la pyrrothine, lié par une liaison amide à différents radicaux acyls (R). Lors de ce projet de thèse, la réaction enzymatique d'acylation du noyau pyrrothine, dite pyrrothine N-acyltransférase, a été étudiée chez Sa. algeriensis pour mieux comprendre la régulation exercée par les acides organiques sur la biosynthèse des dithiolopyrrolones et synthétiser par voie enzymatique de nouveaux composés avec différents radicaux R. Deux activités enzymatiques pyrrothine Nacétyltransférase et N-benzoyltransférase catalysant la formation de deux dithiolopyrrolones, la thiolutine (R= CH3) et la benzoyl-pyrrothine (BEP, R= C6H5) ont d'abord été mise en évidence dans l'extrait cellulaire brut de Sa. algeriensis. Ensuite la régulation exercée par les acides organiques a été étudiée en mesurant ces activités enzymatiques dans des extraits cellulaires de Sa. algeriensis obtenus au cours de cultures sur différents milieux supplémentés en acides organiques. Les résultats obtenus montrent que l'augmentation de la production de BEP en présence d'acide benzoïque à 1,25 mM est en partie due à l'induction de l'activité benzoyltransférase. Par ailleurs, les activités acétyltransférase et benzoyltransférase ont montré des profils d'expression très différents qui laissent supposer que deux enzymes catalysent le transfert de l'acétyl- et du benzoyl-. Leur purification a aussi été entreprise et l'extrait cellulaire de Sa. algeriensis, sous une forme brute ou semi-purifiée, a été utilisé pour catalyser la synthèse enzymatique de 9 dérivés dithiolopyrrolones, susceptibles de posséder des activités biologiques innovantes et/ou accrues
Saccharothrix algeriensis is a filamentous bacterium that produces many dithiolopyrrolone compounds with antibiotic and anti-tumour properties. These metabolites possess a common bicyclic nucleus, the pyrrothine, amide linked with variable acyl groups R. During this PhD project, the enzymatic reaction of pyrrothine acylation, identified as pyrrothine N-acyltransferase, was studied in Sa. algeriensis to further our understanding of the regulation exerted by organic acids on the dithiolopyrrolone biosynthesis and to produce new dithiolopyrrolone compounds by enzymatic catalysis. Evidence for the presence in the crude cell free extract of Sa. algeriensis of two enzymatic activities, pyrrothine Nacetyltransferase and N-benzoyltransferase is provided. They catalyze respectively the formation of the two dithiolopyrrolones, thiolutin (R= CH3) and benzoyl-pyrrothine (BEP, R = C6H5). To study the regulation exerted by organic acids, these enzymatic activities were then assayed in crude cell free extracts of Sa. algeriensis obtained during cultures on media supplemented with organic acids. The results show that BEP-production is enhanced in the presence of benzoic acid partly because of an induction of pyrrothine N-benzoyltransferase. Differences in the expression time courses of pyrrothine N-acetyltransferase and Nbenzoyltransferase activities were also observed. It supports the idea that the transfer reactions of acetyl-CoA and benzoyl-CoA on pyrrothine are catalyzed by two different enzymes. Their purification was undertaken and the cell free extract, crude or semi-purified was used as catalyst to synthetize nine dithiolopyrrolones with biological activities potentially new and better

Le cholestérol est essentiel à l’organisme. Son homéostasie est contrôlée par le facteur de transcription SREBP2. Il est stocké en grande quantité dans le tissu adipeux. Afin de mieux comprendre les mécanismes qui régulent ces stocks, nous nous sommes intéressés aux flux adipocytaires de cholestérol et à ses effets géniques. Nous avons étudié l’efflux de cholestérol dépendant du transporteur ABCA1 et montré que cette voie est peu active dans l’adipocyte, probablement en raison de la séquestration du cholestérol dans des pools intracellulaires. Nous nous sommes ensuite intéressés au récepteur SR-BI et avons montré qu’un stimulus lipogénique induit la relocalisation de SR-BI à la surface des adipocytes. Ces résultats suggèrent que SR-BI pourrait participer au stockage adipocytaire de lipides. Enfin, nous avons identifié une nouvelle cible de SREBP2, la protéine chaperonne DnaJA4 de la famille des HSP40. Nos résultats suggèrent que DnaJA4 serait impliquée dans la biosynthèse du cholestérol.

L’athérosclérose et les affections cardiaques associées sont d’importantes causes de mortalité. Le métabolisme des lipoprotéines est fortement impliqué dans ces pathologies. Des travaux antérieurs d’analyse du transcriptome cardiaque de chiens obèses hypertendus ont permis d’identifier par homologie une nouvelle apolipoprotéine humaine, l’Apo O. L’Apo O est présente sur les HDL, LDL et VLDL et est probablement échangée entre elles. L’Apo O est sécrétée par une voie MTP dépendante. L’Apo O est présente dans le sérum sous deux formes, non glycosylée de 20 kDa et glycosylée par des chondroïtines sulfate de 55 kDa. L’Apo O promeut l’efflux de cholestérol des macrophages et augmente les activités des enzymes LCAT, CETP, paraoxonase, LPL et MTP. L’Apo O possèderait des propriétés antiathérogéniques et de protection contre la lipotoxicité cardiaque. L’Apo O est un nouvel acteur du métabolisme des lipoprotéines qui jouerait un rôle protecteur du système cardiovasculaire contre l’athérosclérose.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2010-2011
Notre groupe de recherche a récemment démontré que des apports très élevés en acides gras trans naturels (AGTn) et industriels (AGTi) avaient des effets comparables sur les lipides et lipoprotéines plasmatiques. L'impact des différents AGT sur les processus impliqués dans l'homéostasie du cholestérol demeure toutefois inconnu et il nous est apparu important d'investiguer dans cette voie. Ce mémoire présente les résultats d'une étude dont l'objectif était de comparer l'impact des AGTi et des AGTn sur les marqueurs de la synthèse endogène et de l'absorption intestinale du cholestérol. Les résultats démontrent que le niveau d'absorption du cholestérol est modifié de façon plus importante suite à la consommation d'AGTn que d'AGTi, mais cette différence ne se reflète pas dans les concentrations de LDL-C entre les deux sources d'AGT. Il semble également que la consommation d'AGT n'affecte pas la synthèse endogène de cholestérol, peu importe leur origine.