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Objectif : Cette étude a pour but de déterminer le profil clinique et bactériologique des infections néonatales bactériennes précoces à Maradi. Patients et méthodes : Il s’agissait d’une étude prospective descriptive qui s’est déroulée de juillet à septembre 2018 à Maradi. Etaient inclus, tous les nouveau-nés âgés de zéro à trois jours suspects d’infection (critères ANAES, 2002). Des examens bactériologiques étaient effectués aussitôt après la naissance, à partir des prélèvements périphériques (conduit auditif externe et méconium). L’analyse des données a été faite à l’aide du logiciel Epi info 7.2.1. Résultats : Cent cinquante nouveau-nés étaient étudiés. Le critère infectieux anamnestique le plus retrouvé était la rupture prématurée des membranes (65,33%). La symptomatologie était dominée par les signes respiratoires (23%). La CRP était supérieure à 20mg/l dans 44,44 % des cas. Soixante et huit prélèvements étaient positifs. Au niveau du conduit auditif externe, le Staphylococcus aureus, le Streptococcus agalactiae et l’Escherichia coli k1 étaient retrouvés avec respectivement 27 cas, 15 cas et 7 cas. Les mêmes germes étaient aussi rapportés dans le méconium avec 11 cas, 6 cas et 5 cas respectivement. Les souches de Staphylocoques ont présenté une bonne sensibilité à la vancomycine (88,9%).Conclusion : De par leur fréquence, les INBP restent un problème de santé publique dans nos régions. L’écologie bactérienne était dominée par les staphylocoques, témoignant le plus souvent de l’infection nosocomiale.

Chez les bactéries à Gram négatif, toutes les protéines destinées à la membrane externe sont synthétisées avec une séquence signal qui est clivée lors de leur acheminement. Ce clivage s’effectue lors du passage de la membrane interne, par LepB pour les protéines intégrales de la membrane externe ou par LspA pour les lipoprotéines. Les séquençage du génome de Dickeya dadantii a permis de mettre en évidence une seconde machinerie de sécrétion de type II nommée Stt (pour Second Type Two). En aval de ce système se trouve un gène dénommé pnlH dont le produit est homologue à des pectines lyases. L’étude de cette protéine a montré qu’elle est un substrat de la machinerie Stt qui permet son passage de la face interne de la membrane externe à sa face externe. En l’absence de Stt ou chez Escherichia coli, PnlH est localisée à la face interne de la membrane externe. Cet ancrage est dû à l’extrémité N-terminale de la protéine qui n’est pas clivée lors du passage de la membrane interne et contient toute l’information pour l’adressage de la protéine. En effet, la fusion des 41 premiers acides aminés de PnlH à des protéines de différents compartiments cellulaires provoque l’adressage de celle-ci à la membrane externe. L’analyse plus approfondie de cette partie N-terminale montre certaines caractéristiques d’une séquence signal Tat-dépendante, permettant le passage de la membrane interne par le système Tat. L’analyse de mutants de la séquence signal ou de la machinerie Tat a confirmé que celle-ci est nécessaire pour le transfert de PnlH à travers la membrane interne. Ainsi, l’analyse de l’adressage de PnlH à la membrane externe a permis de mettre en évidence une nouvelle voie d’acheminement de protéines à la membrane externe des bactéries. Ce nouveau mécanisme de ciblage de protéines à la membrane externe est probablement répandu puisque PnlH est aussi localisée à la membrane externe quand elle est exprimée dans le E. Coli. PnlH n’étant pas détectée comme substrat de la machinerie Tat par les programmes de prédiction, cela suggère qu’il reste à découvrir d’autres protéines de la membrane externe Tat-dépendante encore non identifiées
In Gram negative bacteria, ali the proteins destined for the outer membrane arc synthesized with a sequence signal which is cleaved during their routing. This cleavage is perfonned during the passage of the inner membrane, by LepB for outer membrane proteins (OMPs) or by LspA for lipoproteins. The sequencing of the genome of Dickeya dadamii allowed to bring to Light a second type II secretion machinery named Stt (for Second Type Two). Downstream to this system is a gene called pnlH, the product of which has homology with pectin lyases. The study of this protein showed that it is a substrate of the Stt machinery which allows its passage from the inner face to the outer face of outer membrane. In absence of Stt or in Escherichia coli, PnlH is localized in the inner face of the outer membrane. This anchoring is due to the terminal extremity of the protein which is not cleaved during the crossing of the inner membrane and contains all the information for the addressing of the protein. Indeed, the fusion of the first 41 amino acids of PnlH with proteins of various cellular compartments allows the addressing of these hybrids to the outer membrane. A more detailed analysis of this N-tenninal part shows characteristies of a Tat-dependant sequence signal, allowing the passage of the inner membrane by the Tat system. Analysis of mutants of the sequence signal or of the machinery Tat confirmed that this one is necessary for the passage of PnlH through the inner membrane. So, the analysis of the addressing of PnlH to the outer membrane allowed the identification a new way of routing of proteins to the outer membrane of bacteria. This new mechanism of targeting of proteins in the outer membrane is probably widespread because PnlH is also localized in the outer membrane when it is expressed in E. Coli. Since PnlH is not detected as a substrate of the Tat machinery by the prediction programs this suggests that other Tat targeted outer membrane proteins remain to be identified

L'enveloppe bactérienne est essentielle à de nombreuses fonctions cellulaires, comme le maintien de l'intégrité structurelle, la division cellulaire, la motilité, l'absorption des nutriments et la communication. Elle joue également un rôle crucial dans la pathogénicité bactérienne, faisant de son assemblage et de son maintien un domaine de recherche clé pour le développement de nouveaux antimicrobiens. Les enveloppes bactériennes présentent une dichotomie unique entre les structures monodermes (membrane unique) et didermes (double membrane). Traditionnellement, cette distinction correspond aux bactéries à Gram-positif (monodermes) et à Gram-négatif (didermes). On considérait initialement que les bactéries didermes avaient évolué à partir des monodermes par complexification progressive. Cependant, des études phylogénomiques récentes montrent que le dernier ancêtre commun bactérien (LBCA) était probablement déjà un diderme, et que la transition vers une structure monoderme s'est produite via des pertes indépendantes de la membrane externe (ME). Ces transitions ont principalement eu lieu chez les Terrabacteries, un sous-domaine regroupant des phylums comme les Cyanobactéries, Firmicutes et Actinobactéries. Les raisons de ces pertes d'ME chez les Terrabacteries restent floues, mais pourraient être liées à des mécanismes de biogenèse de la ME encore inconnus. Dans ma thèse, j'ai étudié la biogenèse de la ME sur deux modèles de Terrabacteries. Le premier est Veillonella parvula, une bactérie diderme du microbiome humain appartenant aux Firmicutes, mieux connus pour leurs modèles monodermes (Bacillus, Staphylococcus). J'ai caractérisé deux gènes (lap1 et lap2), associés aux didermes dans une analyses bioinformatique précédemment réalisée par le laboratoire, et montré leur rôle dans la biogenèse de la ME. J'ai montré que Lap1 et Lap2 sont localisés respectivement à la membrane cytoplasmique et à la ME. De manière surprenante, les mutations de Lap1-2 ont été compensées par des gènes de biosynthèse des lipides, y compris PlsA, une enzyme récemment découverte de synthèse d'étherlipides. Bien que je n'aie pas pu établir un lien direct entre plsA et la biogenèse de la ME, j'ai pu démontrer son rôle dans la résistance au stress oxydatif chez les bactéries. J'ai aussi développé un système CRISPR/Cas9 ciblant PlsA en profitant d'un test colorimétrique différentiel pour le WT et mutant de délétion plsA. De plus, j'ai identifié un nouveau transporteur putatif de glycérophospholipides et montré qu'il devenait essentiel en absence des protéines AsmA-like, suggérant un rôle dans le transport de ces lipides. J'ai également constaté que les Terrabacteria possédaient souvent une seule copie des protéines AsmA-like, tandis que les Gracilicutes en avaient plusieurs, suggérant l'existence d'autres transporteurs de glycérophospholipides. Le second modèle que j'ai étudié est Deinococcus radiodurans, une bactérie appartenant au phylum Deinococcota, dont l'enveloppe se distingue des modèles didermes classiques. J'ai retracé l'évolution du transporteur Lpt chez les Deinococcota, montrant qu'il s'est dupliqué avec un complexe prédit pour être impliqué dans le transport du lipopolysaccharide (LPS), et l'autre possédant un substrat encore inconnu. J'ai également montré que les Deinococcota ont perdu le LPS trois fois indépendamment. En étudiant les transporteurs Lpt chez D. radiodurans, j'ai découvert que le complexe impliqué autrefois dans le transport des LPS n'était pas important pour cette bactérie, tandis que la suppression du second complexe entraînait des défauts sévères. J'ai proposé que ce dernier soit impliqué dans l'exportation des lipoprotéines, basé sur des analyses de mutations compensatoires, la cryo-EM et la spectrométrie de masse
The bacterial envelope is essential for numerous cellular functions, including maintaining structural integrity, cell division, motility, nutrient uptake, and communication. It also plays a key role in bacterial pathogenicity, making its assembly and maintenance a critical area of research for new antimicrobial development. Bacterial envelopes exhibit a significant dichotomy, unique to the bacterial domain, between monoderm (single membrane) and diderm (double membrane) structures. Traditionally, this divide has been classified as 'Gram-positive' (monoderm) and 'Gram-negative' (diderm). Historically, it was thought that diderm bacteria evolved from monoderms through a gradual increase in complexity. However, recent phylogenomic studies challenge this view, suggesting that the last bacterial common ancestor (LBCA) was already a diderm, and that the shift to a monoderm architecture occurred through multiple independent losses of the outer membrane (OM). Interestingly, all these diderm-to-monoderm transitions are confined to the Terrabacteria subdomain, which includes phyla such as Cyanobacteria, Firmicutes, and Actinobacteria. The reasons for these OM losses specifically in Terrabacteria remain unknown but may be linked to unknown mechanisms unique to the OM biogenesis in this group. In my thesis, I studied the outer membrane biogenesis of two Terrabacteria model. The first model is Veillonella parvula, a diderm from the human microbiome that belongs to the Firmicutes which are better known for their monoderm models (Bacillus, Staphylococcus). I characterized two genes of unknown function (lap1 and lap2) which were previously associated to diderms in a bioinformatical analyses and found that they were involved in OM biogenesis and localized at the cytoplasmic membrane and OM respectively. Surprisingly, the deletions mutant of Lap1-2 was suppressed by lipid biosynthesis genes including a recently identified ether-lipid synthesis enzyme PlsA. While I could not associate the function of plsA in OM biogenesis, I could demonstrate its function in oxidative stress resistance for the first time in Bacteria. I also used a differential colorimetric assay between the WT and plsA deletion mutants to develop CRISPR/Cas9 using plsA as a target. I also identified a putative a new type of glycerophospholipid transporter and obtained preliminary data suggesting it becomes essential in a genomic background devoid of all copies of the recently discovered glycerophospholipid transporter family AsmA-like supporting its putative role. I also showed that AsmA-like proteins have higher copy numbers in Gracilicutes while Terrabacteria often have a single copy or none suggesting the existence of more glycerophospholipid transporters than previously known. Interestingly the newly identified putative transporter was more abundant in Terrabacteria. The second model I studied is Deinococcus radiodurans, a bacterium belonging to the phylum Deinococcota and whose envelope differs significantly from classical diderm models. I was able to retrace the evolutionary history of the lipopolysaccharide transporter Lpt in Deinococcota as I showed that it duplicated in this phylum with one complex predicted to be involved in LPS transport while the other was predicted to possess an unknown substrate. I showed that Deinococcota have lost LPS three times independently and studied the function of both Lpt transporters in D. radiodurans which has lost LPS. I found that the complex which used to be involved in LPS transport was not crucial to the physiology of D. radiodurans while the other complex led to grave defects in the bacterium when deleted. I suggested that this second complex is involved in lipoprotein export to the surface based on suppressor assays, cryo-EM and mass spectrometry

La membrane externe des bactéries à Qram négatif est composée de deux grandes classes de protéines. Les protéines en forme de tonneau bêta sont chaperonnées dans le périplasme par les protéines SurA, Skp et DegP et adressées à la membrane externe où elles sont insérées par le complexe Bam (beta-barrel assembly machinery). Les lipoprotéines (protéines ancrées dans la bicouche lipidique par trois acides gras) sont acheminées par la machinerie Loi (localisation of outer membrane lipoprotein), dont LolA, la navette périplasmique transmet la lipoprotéine au récepteur membranaire LolB, responsable de l'insertion des acides gras dans la membrane. La sécrétine PulD du système de sécrétion de type II de Klebsiella oxytoca, un multimère de 12 sous-unités et de SOOkDa, fait partie d'une autre famille, celle des protéines les plus proéminentes de la membrane externe. Afin de comprendre le mécanisme d'adressage de PulD dans le périplasme et au niveau de la membrane externe, nous avons dans un premier testé le rôle de la voie générale d'assemblage. Nous avons montré que le processus de multimérisation et d'insertion de PulD dans la membrane externe est indépendant de la machinerie Bam. L'implication des protéines chaperons générales dans le périplasme serait mineure mais reste à définir plus précisément. Dans un deuxième temps, nous avons étudié la relation de PulD avec sa lipoprotéine chaperon spécifique, PulS. Nous avons pour la première fois mis en évidence l'adressage d'une protéine non lipidée et intégrale de la membrane externe par la voie Loi, en identifiant un complexe périplasmique tripartite formé de LolA, d'une lipoprotéine chaperon spécifique, PulS (ou pilotine) et de PulD
The outer membrane of Gram negative bacteria is composed of two main protein classes. Beta-barrel proteins are chaperoned in the periplasm by SurA, Skp and DegP and adressed to the outer membrane where their insertion is dependent on the Bam complex (beta-barrel assembly machinery). Lipoproteins (proteins anchored in the lipid bilayer via three fatty acids) are targeted via the Loi machinery (localisation of outer membrane lipoprotein). The periplasmic shuttle LolA transfers the lipoprotein to the outer membrane receptor LolB, responsible for the fatty acid insertion in the membrane. The secretin PulD, a dodecamer complex of SOOKDa, of the Klebsiella oxytoca type II secretion System, is part of another class of protein: the largest proteins of the outer membrane. In order to understand the targeting and assembly mecanism PulD in the periplasm and at the outer membrane, we first investigated thé général assembly pathway. We showed that multimerisation and the insertion of PulD in the outer membrane is independent of the Bam machinery. The minor role of the general chaperons in the periplasm remain to be further described. Then, we studied the relation between PulD and its specific chaperon lipoprotein, PulS. We could highlight for the first time the targeting of an integral, non-lipidated outer membrane protein by the Loi machinery by identifying a periplasmic complex formed by LolA, PulS (or pilotin) and PulD

Ag43 est une protéine de la membrane externe permettant à E. Coli d'auto-agréger. Elle promeut la formation de biofilms et est impliquée dans la persistance de souches d' E. Coli uropathogènes dans le tractus urinaire. Cette adhésine est régulée par un mécanisme de variation de phase très bien décrit : l'expression d'agn43 résulte de la compétition entre la méthylase Dam (activateur) et du régulateur transcriptionnel OxyR (represseur). C'est pourquoi des cellules clonales peuvent soit exprimer agn43 (phase ON) ou non (phase OFF). A l'heure de l'écriture de cette thèse, ce mécanisme reste le seul connu pour la régulation d'agn43, malgré que le rôle de la variation de phase in vivo soit toujours à l'étude. Bien que le 'switch' de phases d'agn43 conduit à une population hétérogène de bactéries ON et OFF, les études menées sur Ag43 considèrent rarement les biais potentiels associés à la variation de phase. Nous avons donc suivi le status ON / OFF d'agn43 génétiquement et phénotypiquement, et nous montrons que l'utilisation de populations ayant aléatoirement un status ON ou OFF pour agn43 peut entraîner des conclusions erronées sur la fonction ou de la régulation d'Ag43. En particulier, nous démontrons que Lrp et MqsR , précédemment identifiés comme des régulateurs d'agn43, ne régulent pas l'expression ou fréquence de commutation ON / OFF d'agn43. Nous montrons également que la formation de biofilms en conditions de flux dynamique n'influence pas la commutation ON / OFF, mais sélectionne physiquement les cellules agrégeant grâce à Ag43. Cela indique qu'une mauvaise interprétation est possible lorsque l'on étudie l'expression de tels gènes au sein de biofilms. De plus, nous apportons la preuve qu'ignorer l'état agn43 ON / OFF initial d'une population d'E. Con donnée risque de biaiser l'analyse des phénotypes associés à d'autres adhésines d'E. Coli, soulignant ainsi l'importance du suivi de la variation de phase d'Ag43. D'autre part, nous montrons que le système à deux composants CpxAR (ou Cpx), impliqué dans la réponse aux stress périplasmiques, peut moduler la fonction d'auto'-agrégation médiée par Ag43. Nous avons déterminé que le système Cpx ne régule pas directement l'expression d'Ag43 , ni sa stabilité, ni sa translocation à la surface mais plutôt indirectement par un mécanisme de « masquage / démasquage » via l'expression de firnbriae de type 1 (opéronfim), une autre adhésine majeure d'E. Coli également régulée par un mécanisme de variation de phase. De plus, nous avons montré que l'expression defim induit le système Cpx via la lipoprotéine N1pE, un inducteur du système Cpx, qui est impliquée dans la détection des surfaces, fournissant la première preuve d' une rétroaction négative des fimbriae de type 1 sur leur propre expression. En outre, nos résultats tendent à montrer qu'OxyR est aussi un répresseur de l'expression defim faisant de lui un régulateur clé des adhésines 'phase-variablez' d'E. Coli (Ag43 et Fim). Cette étude fournit donc un nouvel aperçu de la régulation d'Ag43 en particulier en ce qui concerne ses interactions avec d'autres adhésines
Ag43 is an outer-membrane protein enabling E. Coli to auto-aggregate. It promotes the formation of biofilms and is implicated in the persistence of uropathogenic E. Coli strains in the urinary tract. This adhesin is regulated by a mechanism of phase variation which is very well-documented : the expression of agn43 results of the competition between the Dam methylase (activator) and the transcriptional regulator OxyR (repressor). Fiente, sister-cells can either express agn43 (phase ON) or not (phase OFF). Up-to-date, this is the only known mechanism of regulation of agn43, although the in vivo role of phase variation is still poorly understood. Although the agn43 regulatory switch leads to a heterogeneous population of ON and OFF bacteria, studies of Ag43 seldom consider potential biases associated with phase variation. We monitored agn43 ON/OFF phase-variation status genetically and phenotypically and we show that the use of populations with random agn43 ON or OFF status could result in misleading conclusions about Ag43 function or regulation. In particular, we demonstrate that Lrp and MqsR, previously identified as agn43 regulators, do not regulate agn43 expression or ON/OFF switch frequency. We also show that biofilm formation in dynamic flow conditions does not influence agn43 ON/OFF switching but physically selects aggregating agn43 ON cells. This indicates that misinterpretation is possible when studying gene expression within biofilms. Moreover, we provide evidence that ignoring the initial agn43 ON/OFF status of the E. Coli populations studied is likely to bias analyses of phenotypes associated with other E. Coli adhesins thereby emphasizing the importance of monitoring Ag43 phase-variation. On another hand, we show that the two-component system CpxAR (or Cpx), implicated in periplasmic stress response, can modulate the function of Ag43- mediated auto-aggregation. We have determined that the Cpx system is not directly regulating Ag43 expression, stability nor its translocation to the surface but rather indirectly by a `masking/unmasking' mechanism via the expression of type 1 fimbriae (fim operon), another major phase-variable adhesin of E. Coli. Moreover, we have shown that the expression offim induces the Cpx system via the lipoprotein N1pE, inducer of the Cpx system, which is involved in surface sensing, providing the first evidence of a negative feedback of type 1 fimbriae on their own expression. Furthermore, our results tend to show that OxyR is also a repressor offim expression making it a master regulator of the phase-variable adhesins of E. Coli (Ag43 and Fim). This study therefore provides a new insight into Ag43 regulation in particular regarding its interactions with other adhesins

Au niveau de la muqueuse respiratoire, la réponse immunitaire repose sur un réseau de surveillance établi par les cellules dendritiques (DC), localisées au sein de l'épithélium. Les DC sont des cellules présentatrices d'antigènes professionnelles, jouant un rôle central dans le développement et l'orientation de la réponse immune. L'exposition à un agent microbien ou à un allergène entraîne un afflux de DC dans l'épithélium. Afin de déclencher une sensibilisation vis-à-vis de l'antigène au niveau des voies aériennes, l'exposition à un agent activateur simultanément à un antigène est nécessaire impliquant vraisemblablement l'activation des cellules épithéliales bronchiques (CEB). Pour tester cette hypothèse, leur rôle dans la régulation de l'homéostasie et des fonctions des DC a été évalué en réponse à un agent vaccinal d'origine bactérienne : le kpOmpA, et à un pneumallergène : Der p1. Le kpOmpA, protéine membranaire de Klebsiella pneumoniae, active les macrophages et les DC, et possède des propriétés immunomodulatrices. Nos résultats montrent que l'instillation de kpOmpA déclenche une réponse immune innée, via l'épithélium, en recrutant des neutrophiles. Les CEB activées par kpOmpA sont aussi capables de recruter des précurseurs de DC myéloïdes et de favoriser leur processus de différenciation/maturation. Cette étude démontre la participation active des CEB au développement de la réaction immunitaire, et leur rôle dans la transition entre l'immunité innée et l'immunité acquise. Comme Der p1, allergène à activité protéasique de Dermatophagoïdes pteronyssinus, est capable d'induire une sensibilisation par voie aérienne chez les sujets atopiques, nous avons évalué les interactions DC/CEB, en comparant les CEB issues de sujets sains (NA) et de patients allergiques asthmatiques (AA). Les résultats obtenus indiquent que dans les deux groupes, les CEB produisent les chimiokines CCL2, CCL5 et CXCL10 en réponse à Der p1, alors que les AA sécrètent du CCL20 en plus. Chez les AA, ceci a pour conséquences d'induire la migration des cellules de Langerhans en plus de la migration des DC dérivées des monocytes, présentes également chez les NA. Cette action de Der p1 dépend de son activité protéasique sur les CEB et pourrait intervenir dans le processus de sensibilisation responsable de la pathologie asthmatique, par le biais du recrutement sélectif d'une sous-population de DC. Ce travail de thèse a permis de montrer que les CEB participent à l'homéostasie du pool de DC pulmonaires et à leur processus de différenciation/maturation, ce qui pourrait influencer le développement et la polarisation des réponses immunes. Ainsi, l'épithélium bronchique représente une cible potentielle dans les processus de vaccination visant la muqueuse respiratoire
Mucosal immune response depends on the surveillance network established by dendritic cells (DC), located within airway epithelium. DC are professionnal antigen presenting cells, which play a key role in the development and the polarization of immune responses. Exposure to microbial products or allergens increases the number of DC within bronchial epithelium. Moreover, airway sensitization to allergens depends on the presence of pathogen-associated molecular patterns, involving probably bronchial epithelial cell (BEC) activation. To test this hypothesis, we analyzed the crosstalk between BEC and DC in response to a potent vaccinal agent: KpOmpA and to an aeroallergen: Der p1. KpOmpA, an outer membrane protein from Klebsiella pneumoniae, activates macrophages and DC, and has immunomodulatory properties. Our results show that KpOmpA-activated BEC take part to innate immune response through the recruitment of neutrophils. Moreover, BEC trigger the migration of myeloid DC precursors and favor their differentiation/maturation. This study demonstrates the role of BEC in the development of innate and adaptive immune responses after PAMP exposure. Since Der p1, a cystein protease allergen from Dermatophagoïdes pteronyssinus, is able to induce airway sensitization of atopic patients, we evaluated interactions between BEC from non atopic (NA) and allergic asthmatic (AA) donors and DC. Der p1 triggers CCL2, CCL5 and CXCL10 production in both groups, whereas CCL20 is only induced with AA BEC. Langerhans cell precursors are recruited by AA BEC, in addition to monocyte-derived DC precursors which are recruited in both groups. This mechanism of airway sensitization to Der p1 probably implicate the selective recruitment of a DC sub-population. These data show that BEC participate to the development of the immune response through their capacity to regulate the homeostasis of airway DC, and their differentiation/maturation. Thus, bronchial epithelium targeting and activation could be important in vaccination process via airway mucosa

Les amphipols (APols) sont de petits polymères amphiphiles destinés au maintien en solution aqueuse des protéines membranaires (PMs). Les APols augmentent la stabilité biochimique des PMs solubilisées par rapport à celle observée en présence de détergent. Cette propriété en fait un outil intéressant pour l'étude in vitro des PMs. Dans un premier temps, nous avons examiné l'influence de l'APol A8-35 sur la stabilité, la renaturation et la fonction des PMs. Notre travail est basé principalement sur l'étude d'une PM modèle, la bactériorhodopsine, extraite de la membrane pourpre de l'archébactérie Halobium salinarium. La renaturation des PMs constitue une application particulièrement intéressante des APols, cette étape difficile étant souvent limitante pour l'étude in vitro des PMs. Nous avons pu montrer que les APols permettent la renaturation de plusieurs PMs modèles (BR, MscL, EmrE. . . ), et nous avons entrepris d'étendre cette approche à la renaturation de PMs d'un très grand intérêt pharmacologique, les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs). Nous nous sommes par ailleurs intéressés au développement d'un autre domaine d'application des APols, l'étude structurale des PMs par RMN des solutions. En vue de cette application, nous avons entrepris de développer une nouvelle famille d'APols, solubles à pH acide, les amphipols sulfonatés (SAPols). Nous présentons les différentes molécules étudiées, ainsi que les critères nous ayant conduits à la sélection de SAPols optimisés pour l'étude des PMs par RMN des solutions
Amphipols (APols) are small amphiphatic polymers designed to keep membrane proteins (MPs) water-soluble. APols improve the stability of solubilized MPs beyond that afforded by detergents. This property makes them very interesting tools for in vitro studies of MPs. In a first part, we examine the influence of APols on the stability, renaturation and function of MPs. Our work is mainly based on the study of a model MP, bacteriorhodopsin, extracted from the purple membrane of the archaebacterium Halobium salinarium. Renaturation of MPs is a very interesting application of APols, since it represents a strongly limiting step to their study. We show that several model MPs (BR, MscL, EmrE. . . ) can be renatured using APols, and we have undertaken to extend this approach to the renaturation of MPs of great pharmacologic interest, the G protein coupled receptors (GPCRs). In a second part, we describe some progress in the development of another application of APols, the structural study of MPs by solution-state NMR. We describe the design a new family of amphipols, the sulfonated amphipols (SAPols), which can be used at low pH. We present the different structures of SAPols studied and the tests that led us to the selection of optimized SAPols for MP solution-state NMR studies

La bactérie psychrotrophe Pseudomonas fluorescens MF0 est plus sensible à la mezlocilline (β-lactamine) à basse température de culture (8°C) qu'à la température optimum de croissance (28°C). Cette modification de la résistance bactérienne serait due à une modulation de la pénétration de l'antibiotique à travers la membrane externe en fonction de la température de culture, via des protéines canaux appelées porines. Après avoir montré que la composition protéique des membranes externes ne présentait aucune différence significative pour des bactéries issues de cultures à 8°C et 28°C, un changement de la structure et de la fonction de la porine majoritaire de la membrane externe a été envisagé pour expliquer ce phénomène. La protéine majoritaire de 32 kDa de P. Fluorescens MF0 a donc été extraite et purifiée à partir de cultures à différentes températures afin de la reconstituer dans les bicouches lipidiques planes. Les résultats montrent que la diminution de la température de croissance bactérienne entraîne une diminution des valeurs de conductances unitaires de cette protéine (250 pS dans NaCl 1 M pour des cultures à 28°C et 80 pS pour des cultures à 8°C). Ce travail a été étendu à une autre bactérie psychrotrophe P. Fluorescens OE 28. 3 isolée du sol et a conduit aux mêmes résultats après reconstitution de la protéine majoritaire OprF extraite de cultures à 8°C et 28°C. La comparaison des porines OprF de P. Fluorescens MF0 et OE 28. 3 (séquences N-terminales, amplification PCR du gène OprF, réactions immunologiques) montrent : 1) une forte homologie de séquence (94% d'identité) pour ces protéines 2) qu'elles sont exprimées à partir d'un seul gène OprF en fonction de la température de culture. Des modifications de structure (ex : interactions avec le LPS) de cette protéine sont envisagées pour expliquer la variation de la taille du canal en fonction de la température de croissance bactérienne.

Chez les bactéries à Gram négatif, les ferri-sidérophores, le fer de ferri-protéines, Thème ou la vitamine B12 sont transportés à travers la membrane externe par des récepteurs spécifiques. Cette activité de transport a besoin de l'énergie produite par le complexe de la membrane interne TonB/ExbB/ExbD. La protéine TonB interagit avec ces récepteurs de membrane externe par l'intermédiaire d'une séquence peptidique localisée près de leur extrémité N-terminale. Cette séquence consensus DTLWTA, bien conservée, est appelée TonB box. Serratia marcescens possède 2 paralogues de TonB fonctionnels, TonB et HasB. TonB est capable de transmettre l'énergie du complexe TonB /exbB/ExbD à des récepteurs impliqués dans le transport du fer ou de Thème chez Serratia marcescens ou chez Escherichia coll. Par contre HasB, dont le gène est situé dans un opéron impliqué dans l'acquisition de Thème (opéron has), est fonctionnel pour l'acquisition de Thème via le récepteur HasR mais ne peut pas se substituer à TonB pour les transporteurs de ferri-sidérophores d3Escherichia coli ou de Serratia marcescens. Ceci pose la question du niveau de spécificité de HasB: est-ce une spécificité vis-à-vis des différents systèmes système de transport de Thème de Serratia marcescens ou bien une spécificité stricte vis-à-vis de HasR ? Pour répondre à cette question, le deuxième récepteur à hème (HemR) de S. Marcescens a été clone et son activité caractérisée chez Escherichia coli. HemR est actif en présence de TonB, mais pas de HasB. Cette étude démontre ainsi que HasB et HasR forment une paire spécifique. A l'aide de mutants nous avons étudié, la contribution des différents systèmes au processus de transport de Thème chez Serratia marcescens. Les systèmes Has et Hem sont les. Seuls transporteurs de Thème fonctionnels. Le système Has est plus efficace mais nécessite une carence en fer plus importante. En absence de HasA, le système Has est inopérant. L'activité du système Has est presque complètement abolie en absence de HasB. La quantité de récepteur HasR est fortement diminuée dans des mutants hasA ou hasB de Serratia marcescens. A l'aide d'une fusion entre le promoteur de Topéron has et le gène lacZ, nous avons montré que le niveau d'expression de Topéron has est fortement diminué dans un mutant hasB. L'absence d'activité de transport de Thème par le système dans les mutants hasA et hasB, est donc corrélée à une forte diminution de Topéron has. Nous proposons le scénario suivant pour le transport de Thème chez Serratia marcescens. Dans un milieu non carence en fer, les gènes de structure des opérons has et hem ne sont pas exprimés. En cas de carence en fer le système Hem peu transporter Thème. En cas de carence en fer, et quand la concentration en hème est très faible, le système Has, prend le relais grâce à l'activité de Thèmophore HasA
In Gram-negative bacteria, molecules, including ferri-siderophores, iron, vitamin B 12 or heme, are transported through the outer membrane by specific receptor. This transportation activity requires the energy provided by the inner membrane complex TonB/ExbB/ExbD. Two components, ExbB, and ExbD use the proton motive force to produce energy. The third component, TonB, which transmit energy, interacts with the outer membrane receptors by peptide sequence located near their N-terminus end. This preserved consensus sequence DTLWTA, is named TonB box. Serratia marcescens has 2 functional TonB paralogs, TonB and HasB. TonB is able to transmit the energy of the complex TonB/ExbB/ExbD to receptors involved in the transport of iron or heme in Serratia marcescens or Escherichia coll. On the other hand HasB, whose gene is located in an operon encoding for the component of the Has heme uptake System (has operon), is functional for the heme acquisition via the HasR receptor but cannot substitute TonB for the transporter the ferrisiderophores in Escherichia coli and Serratia marcescens. This raises the question of the level of the HasB specificity: is this a specificity with respect to the various heme transport Systems of Serratia marcescens or a strict specificity with respect to HasR? To answer this question, the second heme receptor (HemR) of S. Marcescens, was cloned and its activity characterized in Escherichia coli. HemR was shown to be active in the presence of TonB, but not with HasB. This result shows that HasB and HasR form a specific pair. Using mutants we studied, the contribution of the various Systems to the heme uptake process in Serratia marcescens. The Has and Hem Systems are the only functional heme transporter in Serratia marcescens. The Has System is more efficient but requires a higher iron deficiency. In absence its cognate hemophore, the heme uptake activity of the HasA System is dramatically, decreased. The Has System activity is almost completely abolished in absence of HasB. The quantity of HasR receptor in Serratia marcescens is strongly decreased in hasB mutant similarly with a hasA mutant. Using a transcriptional fusion between the has operon promoter and the lacZ gene, we showed that the has operon expression level is strongly decreased in a hasB mutant. The absence of activity of heme transport activity of the Has System in hasA and hasB mutants, is correlated with a sharp decrease of the has operon expression level. We propose the following scénario for the heme transport in Serratia marcescens. In an iron containing medium has, and hem operons are not expressed. In the presence of iron depletion, the Hem System can transport heme. In the presence of iron deficiency, and when the heme concentration is very low, the Has System transports heme thanks to thé activity of the hemophore HasA

La découverte de molécules antibiotiques au XXe siècle a permis de traiter plusieurs maladies infectieuses bactériennes, auparavant mortelles. Cependant, cette avancée thérapeutique s'est suivie d'une utilisation massive, répétée et inadéquate des antibiotiques, conduisant à la montée de l'antibiorésistance. Ce phénomène est alarmant puisqu'on estime à 4,95 millions le nombre de décès associés à la résistance aux antibiotiques en 2019. L'un des mécanismes de résistance mis en place par les Enterobacterales et les bactéries à Gram négatif en général est la (sur)expression des pompes d'efflux. Ces pompes sont capables de prendre en charge plusieurs classes d'antibiotiques différentes, diminuant ainsi leur concentration intrabactérienne et les rendant inefficaces. Une des stratégies envisagées pour contourner ce phénomène de résistance est le développement d'inhibiteurs de pompes d'efflux qui, en combinaison avec un antibiotique, pourront offrir une nouvelle alternative thérapeutique pour traiter les infections bactériennes résistantes.AcrAB-TolC est une pompe d'efflux de la superfamille RND exprimée chez les Enterobacterales telles qu'Escherichia coli et Klebsiella pneumoniae. Afin d'identifier des inhibiteurs de cette pompe, une chimiothèque de 1280 fragments a été criblée sur E. coli en combinaison avec un antibiotique modèle substrat de cette pompe, permettant la sélection d'un composé hit appartenant à la famille des pyridylpipérazines. Ce hit n'a pas d'activité antibactérienne intrinsèque, mais il est capable de potentialiser l'activité d'un panel d'antibiotiques par inhibition directe de la protéine AcrB. Des premières études de relations structure-activité ont permis d'identifier deux séries chimiques, la série quinoléine/quinoxaline et la série pyridine. Des modifications structurales autour de ces trois noyaux ont été réalisées grâce à un design rationnel basé sur les structures co-cristallographiques obtenues avec AcrB. 80 composés ont ainsi été synthétisés afin d'identifier des analogues plus puissants et d'établir de nouvelles relations structure-activité. L'introduction de différents substituants possédant une fonction amine a notamment permis de créer de nouvelles interactions avec des résidus acides de la poche d'AcrB. Les paramètres physicochimiques et pharmacocinétiques in vitro des composés les plus prometteurs ont ensuite été mesurés, ce qui a permis la sélection d'un composé pour une étude de pharmacocinétique chez la souris. Afin de sonder plus largement la diversité chimique des substituants introduits sur les noyaux quinoléine et pyridine, une chimiothèque de 672 triazoles a été synthétisée via une réaction de cycloaddition catalysée au cuivre. Le but était d'augmenter la puissance des composés en créant de nouvelles interactions avec la poche d'AcrB tout en diminuant la cytotoxicité et l'activité antibactérienne intrinsèque des composés. Ceci a permis d'identifier de nouveaux composés ayant des activités prometteuses et qui seront prochainement resynthétisés afin de caractériser leur effet biologique et de mesurer leurs propriétés ADME
The discovery of antibiotics in the 20th century allowed to treat a number of previously fatal bacterial infectious diseases. However, this therapeutic progress was followed by a massive, repeated and inappropriate use of antibiotics, leading to the rise of antimicrobial resistance. This phenomenon is alarming, with an estimated 4.95 million deaths associated with antibiotic resistance in 2019. One of the resistance mechanisms developed by Enterobacterales and overall Gram-negative bacteria is the (over)expression of efflux pumps. These bacterial pumps are able to extrude several classes of antibiotics, thereby reducing their intrabacterial concentration and rendering them ineffective. One strategy being considered to circumvent this phenomenon is the development of efflux pump inhibitors which, in combination with an antibiotic, could offer a new therapeutic alternative to treat resistant bacterial infections.AcrAB-TolC is an efflux pump of the RND superfamily found in Enterobacterales such as Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae. In order to identify inhibitors of this pump, a chemical library of 1280 fragments was screened on E. coli in combination with a model antibiotic substrate of this pump, leading to the selection of a hit compound belonging to the pyridylpiperazine family. This hit has no intrinsic antibacterial activity, but is able to potentiate the activity of a range of antibiotics by direct inhibition of the AcrB protein. Initial studies of structure-activity relationships have allowed the identification of two chemical series, the quinoline/quinoxaline series and the pyridine series. Structural modifications around these three cores were carried out using a rational design based on the co-crystallographic structures obtained with AcrB. 80 compounds were therefore synthesised in order to identify more potent analogues and establish new structure-activity relationships. In particular, the introduction of different substituents with an amine function allowed to create new interactions with acidic residues in the AcrB binding pocket. The physicochemical and in vitro pharmacokinetic parameters of the most promising compounds were then measured, leading to the selection of one compound for a pharmacokinetic study in mice. In order to enrich the chemical diversity of substituents introduced on the quinoline and pyridine rings, a chemical library of 672 triazoles was synthesised via a copper-catalysed cycloaddition reaction. The aim was to increase the potency of the compounds by creating new interactions with AcrB while reducing the cytotoxicity and intrinsic antibacterial activity of the compounds. This led to the identification of new compounds with promising activities, which will soon be resynthesised in order to characterise their biological effect and measure their ADME properties