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RÉSUMÉ:Des mécanismes moléculaires liant le cancer à la sénescence cellulaire sont présentement explorés. Les télomères (l'extrémité des chromosomes) raccourcissent à chaque division cellulaire et il a été proposé que ce raccourcissement soit l'horloge moléculaire qui déclenche le processus de la sénescence cellulaire. La re-expression de la télomérase, une enzyme qui aide à maintenir la longueur des télomères et à prévenir leur raccourcissement, est un événement fréquemment observé dans les cellules tumorales. Cette re-expression est probablement essentielle à la formation et à la croissance soutenue de la majorité des cancers.

Les Herpèsvirus sont des maîtres incontestés du camouflage. En effet, ces virus utilisent divers moyens pour assurer leur persistance chez l’hôte infecté. Les Herpèsvirus humains-6A et -6B (HHV-6A/B) ont ainsi développé une approche unique, en intégrant l’ensemble de leur génome au sein des extrémités des chromosomes des cellules qu’ils infectent. Cette capacité, propre aux HHV-6A/B parmi les Herpèsvirus humains, requiert des interactions étroites entre les régions télomériques des chromosomes de l’hôte et le génome viral. Dans cette revue, la biologie des télomères et les mécanismes responsables de l’intégration virale seront abordés et les conséquences biologiques de l’intégration des HHV-6A/B au sein de l’ADN chromosomique seront discutées.

Le vieillissement est une altération de nos capacités physiologiques qui s’accompagne d’une susceptibilité accrue à un grand nombre de maladies et qui détermine en grande partie notre longévité. Cependant, son étiologie reste encore mal comprise. Nous discutons ici l’hypothèse que le raccourcissement des télomères, programmé pour débuter en fin d’embryogenèse dans de nombreux tissus, couple développement et vieillissement. Il existe en effet de nombreuses indications que des variations de la structure des télomères régulent dans le temps un ensemble interconnecté de processus essentiels à la maintenance somatique du génome, de l’épigénome, du métabolisme, du rythme circadien et de l’immunité.

ContexteLa stimulation magnétique transcrânienne (rTMS) est un traitement efficace de la dépression résistante. Sa place relative par rapport aux ECT dans la stratégie thérapeutique est questionnée ainsi que leur possible complémentarité.Matériels et méthodesNous avons procédé à une synthèse de la littérature sur Pubmed fin juin 2014 avec la combinaison des mots clés suivants : ECT, mECT, rTMS, versus, adjuvant, add-on, comparative, efficacy, maintenance treatment, relapse, longitudinal follow-up, depression.Résultats et discussionLa rTMS peut être aussi efficace que l’ECT à coût équivalent sous certaines conditions (durée > 4 semaines, plus de 1200 pulses par séance, moins d’échecs médicamenteux antérieurs, et surtout absence de symptômes psychotiques). Les mécanismes d’action sont en partie communs : neurogenèse, sécrétion de facteurs neurotrophiques, transmission monoaminergique, gabaergique et glutamatergique, régulation de l’axe hypothalamo-hypophysaire et régulation de l’activité cérébrale frontal et limbique. L’action rapide de la rTMS sur le risque suicidaire reste à démontrer mais elle présente probablement un meilleur profil de tolérance cognitive en cure initiale, voire un effet procognitif. Dans les deux cas le taux de rechute est estimé entre 40 et 50 % à 3 mois en l’absence de prophylaxie adéquate. Le traitement d’entretien par rTMS consiste le plus souvent en 2 séances sur une journée de façon hebdomadaire sans consensus actuellement sur cette question. Bien que les ECT de maintenance soient bien tolérées, certains patients fragiles du fait de co-morbidités, ou réticents à certains traitements psychotropes, ou craignant les anesthésies, pourraient bénéficier de rTMS en relais des ECT. Plusieurs séries de cas plaident en ce sens.ConclusionDes essais prospectifs longitudinaux avec présence de groupes contrôles sont souhaitables, contrôlant sur la durée les traitements et les aspects cognitifs de façon objective et comparative. La rythmicité, les sous-groupes cliniques éligibles, et les traitements associés restent à préciser.

Scholars have highlighted the role of negative affect as key correlates of Problematic Internet Use (PIU). According to the assumption that Internet-related behaviours can be seen as mechanisms to cope with everyday life (Kardefelt-Winther, 2017), the present study aims to explore the relation between PIU and psychosocial malaise, expecting that adolescents with high levels of social anxiety, negative emotions, and loneliness are more likely to be associated to the problem group of Internet users. Measures of PIU (GPIUS–2), social anxiety (IAS), negative affectivity (PANAS), and loneliness (ILS) were detected in a sample of 766 students attending Year 9–11 (13–19 years old; 47% females) of public high schools in the territory of Lecce (Apulia–Italy). A sub-group of problematic Internet users was identified (n = 185) and a control group was selected (n = 187). A logistic regression was applied to estimate the effect of psychosocial variables on the differentiation between problematic and control Internet users. Results of the present cross-sectional study show that a higher level of social anxiety, negative emotions, and loneliness increases the probability of belonging to the group of problematic Internet users. No significant differences between males and females were found in GPIU levels. The findings show that, for a better understanding of PIU onset and maintenance among adolescents, it is important, to take into account the life problems which may lead young people to overindulge in Internet use.RésuméLes scientifiques ont mis en lumière le rôle de l’affect négatif comme corrélat significatif de la dépendance. Partant de l’hypothèse que les comportements dans Internet peuvent être vus comme des mécanismes d’adaptation à la vie quotidienne (Kardefelt-Winther, 2017), notre étude visait à explorer la relation entre la cyberdépendance et le malaise psychosocial. On s’attendait à ce que les adolescents affichant un degré élevé d’anxiété sociale, d’émotions négatives et de solitude fassent partie du groupe d’internautes à problème. Des indicateurs de la cyberdépendance (GPIUS-2), de l’anxiété sociale (IAS), de l’affect négatif (PANAS) et de la solitude (ILS) ont été relevés dans un échantillon de 766 élèves de la 9e à la 11e année (13 à 19 ans; 47 % de filles) choisi dans des écoles secondaires publiques du territoire de Lecce (Apulia, Italie). Un sous-groupe d’internautes cyberdépendants a été défini (n=185) et un groupe contrôle sélectionné (n=187). Un modèle de régression logistique a été appliqué en vue d’estimer l’effet des variables psychosociales sur la différenciation entre joueurs cyberdépendants et joueurs du groupe contrôle. Les résultats de l’étude transversale montrent qu’un degré plus élevé d’anxiété sociale, d’émotions négatives et de solitude augmentait la probabilité d’appartenir au groupe d’internautes cyberdépendants. Aucune différence notable n’a été constatée entre les hommes et les femmes quant au degré de cyberdépendance. Les résultats indiquent qu’une compréhension plus fine du développement de la cyberdépendance et de sa persistance chez les adolescents devra tenir compte des problèmes vécus dans leur vie personnelle qui les inciteraient à un usage excessif d’Internet.

Les cellules souches de gliomes (CSG), une sous-population de cellules tumorales, seraient en partie responsables de l’échec des traitements des gliomes de par leur résistance et leur capacité régénérative. Le mécanisme alternatif (ALT) de maintenance des télomères, basé sur la recombinaison homologue et non pas sur la télomérase, est détecté dans environ 30% des gliomes humains suggérant que des stratégies thérapeutiques spécifiquement dirigées contre ALT pourraient avoir un intérêt thérapeutique. Dans ce travail, nous avons poursuivi la caractérisation du premier exemple de CSG humaines ayant un phénotype ALT, les cellules TG20. Nous avons montré que malgré leur très fort taux de recombinaison, les télomères de ces cellules continuaient à assurer leur fonction de protection des chromosomes. Nous avons vérifié que les cellules TG20 conservaient leur capacité à générer des tumeurs intracérébrales après des transplantations sériées chez les souris immunodéprimées tout en gardant un phénotype ALT. Ces résultats confirment à la fois les propriétés de cellules souches cancéreuses des cellules TG20 et la capacité de ALT à assurer la maintenance des télomères nécessaire à l’autorenouvellement et au fort taux de prolifération des CSG in vivo. La greffe intracérébrale de cellules TG20 chez des souris immunodéprimées représente donc un bon modèle d’étude préclinique des gliomes ALT. Nous avons ainsi montré qu’un traitement précoce par un ligand des G-quadruplexes télomériques, 360B, juste après la greffe de cellules TG20, était capable d’inhiber le développement tumoral suggérant l’intérêt de l’utilisation de ligands des G-quadruplexes pour cibler spécifiquement les CSG ALT. Une étude des profils d'expression transcriptomique des cellules TG20 et de plusieurs lignées de CSG humaines exprimant la télomérase, nous a conduit à nous intéresser aux rôles de deux lysine acétyl transférases homologues, PCAF (P300/CBP Associated Factor) et GCN5 (General Control Nonderepressible 5) dans la régulation de la recombinaison télomérique des cellules ALT. Nous avons montré que les inhibitions de ces deux protéines ont des effets opposés sur le mécanisme ALT. Nous proposons qu’une balance d’expression de PCAF et GCN5 régule la maintenance des télomères dans les cellules ALT via le contrôle du turnover de TRF1 ce qui pourrait constituer la base d’une nouvelle stratégie thérapeutique vis-à-vis des gliomes ayant un phénotype ALT
Glioma stem cells (GSC), a subpopulation of tumor cells, are partly responsible for the failure of treatment of gliomas because of their resistance and regenerative capacity. The mechanism of alternative lengthening of telomere (ALT), based on homologous recombination, is detected in approximately 30 % of human gliomas. Therefore, therapeutic strategies directed specifically against ALT may have a therapeutic value. In this work, we further characterized the first model of human ALT GSC, the TG20 cells. We showed that despite their very high rate of recombination, the telomeres were still capable of fulfilling their protective function of chromosomes. We verified that the TG20 cells retained their ability to generate intracerebral tumors after serial transplantations in immunocompromised mice, while preserving an ALT phenotype. These results confirm the cancer stem properties of TG20 cells and the ability of ALT to ensure telomeres maintenance, which is required for the self-renewal and the high proliferation rate of GSC in vivo. Intracerebral grafts of TG20 cells in immunocompromised mice represent thus a good preclinical model for studying ALT gliomas. We have shown that treatment with a ligand of telomeric G-quadruplexes, the 360B, at an early stage of TG20 tumor engraftment, was able to inhibit tumor growth, showing the interest of the use of G-quadruplex ligands to specifically target ALT GSC. Transcriptomic profiling of TG20 cells and several other GSC telomerase-positive lines, incited us to study the roles of two homologous lysine acetyl transferases, PCAF (p300/CBP Associated Factor) and GCN5 (General Control Nonderepressible 5), in the regulation of telomeric recombination in ALT cells. We showed that the inhibition of these two proteins has opposite effects on the ALT mechanism. We propose that a balance of expression of PCAF and GCN5 regulates the telomere maintenance in ALT cells by controlling the turnover of TRF1. This model could serve for the development of new therapeutic strategies targeting ALT gliomas

Les télomères sont des structures nucléoprotéiques particulières conférant une stabilité aux extrémités de chromosomes. La plupart des mécanismes télomériques sont conservée chez les eucaryotes supérieurs notamment chez l'homme. Parmi les fonctions exercées, les télomères développent des stratégies visant à limiter la recombinaison impropre aux télomères afin de préserver l'intégrité chromosomique. Au cours de ma thèse, j'ai étudié les mécanismes de maintenance et de protection des télomères chez l'homme, et plus particulièrement le rôle de la recombinaison homologue et recombinaison illégitime. Je me suis plus particulièrement intéressé au rôle de P53 dans le maintien des télomères, à travers sa fonction dans la recombinaison. Bien que son rôle soit établi dans la maintenance des télomères des cellules ALT, sa fonction est en revanche moins bien décrite dans les cellules présentant une activité télomérase. Dans cette perspective, nous avons établi des clones télomèrase (+) exprimant de manière stable le transgène P53R175H, décrit comme stimulant la RH. Cependant, la surexpression de P53R175H ne modifie pas le profil télomérique des ces cellules, se révélant ainsi incapable de stimuler la recombinaison télomérique. L'absence de phénotype pourrait être en fait la conséquence d'une interférence de la télomérase dans la mise en place d'un processus de recombinaison télomérique. Le deuxième volet de notre étude nous amené à préciser le rôle la recombinaison dans le maintien des télomères. Pour cela, nous avons construit des lignées isogéniques invalidées pour les deux voies majeures de la recombinaison grâce à une nouvelle famille de vecteurs ARNi basée sur des vecteurs EBV (brevet CEA N° 0501483) développé par Biard D. Ce système permet d'obtenir une réduction importante, spécifique et à long terme (plus de 300 jours en culture) de l'expression d'un gène cible. Plusieurs partenaires du NHEJ (DNA-PKcs, XRCC4, LigIV, Ku70), ou de la RH (RAD54, RAD51, RAD52) ou du complexe MRN ont été inhibés dans la lignée HeLa (adénocarcinome cervical). Dès les premiers jours d'invalidation du gène cible, des altérations de la stabilité des télomères sont constatées. Ces altérations se maintiennent au cours de la sélection (de 100 à 300 jours selon les clones). Ainsi, il semble que l'invalidation du NHEJ conduise à une instabilité télomérique associée à un raccourcissement de la taille des télomères dans le cas de XRCC4 et LigaseIVKD. Malgré une instabilité télomérique prononcée, les cellules RHKD se distinguent pourtant des clones NHEJKD par des altérations télomériques particulières. En effet, la dérégulation du RH mène à des signaux hétérogènes au sein du même bras chromosomique. En revanche, les anomalies dites de structure (perte associée à des cassures) sont plus abondantes dans les cellules déficientes pour le NHEJ. Ces résultats suggèrent que le NHEJ jouerait un rôle de protection alors que le RH serait plutôt impliqué dans l'élongation et la réplication des télomères. Cette étude s'est poursuit avec l'examen de clones MRE11KD, RAD50KD, NBS1KD permettant de clarifier dans un premier temps le rôle de du complexe dans les différentes voies de recombinaison puis sur la maintenance des télomères. A l'image des autres protéines de la recombinaison, RAD50 préserverait l'intégrité télomérique. L'invalidation des protéines NBS1 et MRE11 initie une élongation des télomères, probable manifestation de l‘activation de la recombinaison télomérique, absente des cellules RAD50KD. Ainsi, la présence de cercles télomériques extrachromosomiques dans le clone NBS1KD vient étayer cettehypothèse. Le complexe MRE11/RAD50/NBS1 constituerait alors un répresseur de la RH aux télomères.

Le complexe Shelterin, composé de 6 protéines (POT1 / TRF1 / TRF2 / TIN2 / RAP1 et ACD) joue un rôle majeur au niveau des télomères. Ainsi, il permet la protection de l’extrémité simple brin par la formation de la D-loop, la régulation de la signalisation des voies de dommages à l’ADN ; il participe à la réplication des télomères et contrôle l’accessibilité et la processivité de la télomérase, unique enzyme permettant l’allongement des télomères. Au cours de cette thèse, mon travail s’est organisé autour de 2 principaux axes, le premier, fondamental s’est intéressé aux effets extra-télomériques de la protéine ACD (anciennement appelée TPP1). Le deuxième, plus transversal s’est attardé sur les processus de maintenance des télomères dans le cas des gliomes. Concernant le premier aspect, il est maintenant connu que la protéine ACD fait le lien entre TIN2 et TERT (sous unité catalytique de la télomérase) aux télomères. Ces deux protéines peuvent aussi partiellement se localiser à la mitochondrie et y possèdent alors divers effets sur le métabolisme, la régulation du stress oxydant ou encore la mitophagie. Ainsi, et suite à des prédictions in silico de potentiel MTS pour ACD, nous avons émis l’hypothèse qu’ACD pourrait être le partenaire manquant de TIN2 et TERT à la mitochondrie. Dans ce cas il restait alors à identifier ses fonctions mitochondriales. Après avoir démontré la localisation partielle d’ACD à la mitochondrie par différentes méthodes, nous avons pu mettre en évidence son influence dans la protection contre le stress oxydatif. Ainsi la surexpression d’ACD réduit la production secondaire de radicaux oxygénés mitochondriaux et la perte d’ADN mitochondrial. Le stress oxydatif causant la réduction des foci mitochondriaux d’ACD. Dans un second temps, nous nous sommes intéressés aux mécanismes de maintenance des télomères (TMM) que les cellules cancéreuses acquièrent afin d’outrepasser la sénescence réplicative. Dans ce sens, les tumeurs peuvent réactiver la télomérase (95% des cas) ou utiliser un processus alternatif (ALT) basé sur la recombinaison homologue (5% des cas). Pour les gliomes, jusqu’à 25% des tumeurs utilisent le processus ALT, associé à la perte d’ATRX, les autres gliomes utilisent la télomérase et présentent classiquement une mutation du promoteur de TERT (TERTmt). Ces deux marqueurs moléculaires ont par ailleurs une valeur diagnostique et pronostique et font parties des critères de classification histo-moléculaire de l’OMS . Or, de 4 à 28% des gliomes (selon les sous-types) ne possèdent ni altération d’ATRX ni mutation de TERT suggérant une activation de l’un des TMM par d’autres altérations voire d’autres voies. Dans ce sens, nous avons développé un test mesurant le TMM vrai en nous basant sur la recherche des c-circle (un marqueur du ALT) et proposé un algorithme breveté (TeloDiag) prenant en compte ce TMM, les mutations d’IDH et le grading histologique. Le TeloDiag permet de re-classer 38% des gliomes atypiques (au niveau moléculaire). Il a généré une nouvelle catégorie de tumeurs de haut grade IDHwt et ALT+, n’existant pas dans la classification OMS et montrant une tendance à un meilleur pronostic que les glioblastomes IDHwt (TERTmt). Enfin, nous avons apporté la preuve de concept de la faisabilité de ce test en circulant, pour les astrocytomes IDHmt
The Shelterin complex, made of 6 proteins (POT1 / TRF1 / TRF2 / TIN2 / RAP1 and ACD) plays a major role in telomeres. Thus, it allows the protection of the telomeric single-stranded end by the formation of the D-loop, the regulation of DNA damage signaling pathways; it participates in telomere replication and controls the accessibility and processivity of the telomerase, the unique enzyme allowing telomere lengthening. During this thesis, my work was organized in 2 main axes, the first, fundamental, was interested in the extra-telomeric effects of the ACD protein (also called TPP1). The second, more transversal, focused on the processes of telomere maintenance in gliomas. Concerning the first aspect, it is now known that the ACD protein makes the link between TIN2 and TERT (catalytic subunit of telomerase) in the telomeres. These two proteins can also partially localize to the mitochondria and then have various effects on mitochondrial metabolism, on the oxidative stress regulation or on the mitophagy process. Thus, and following in silico predictions of a putative MTS for ACD, we hypothesized that ACD could be the missing partner of TIN2 and TERT in the mitochondria. In this case, it then remained to identify its mitochondrial functions. After demonstrating the partial localization of ACD in the mitochondria by different methods, we were able to demonstrate its influence in the protection against oxidative stress. Thus overexpression of ACD reduces secondary production of mitochondrial oxygen radicals and loss of mitochondrial DNA. Oxidative stress causing reduction of ACD mitochondrial foci. Secondly, we looked at the telomere maintenance mechanisms (TMM) that cancer cells acquire in order to override replicative senescence. In this sense, tumors can reactivate telomerase (95% of cancer) or use an alternative process (ALT) based on homologous recombination (5% of cancer). In the case of gliomas, up to 25% of tumors use the ALT process, associated with the loss of ATRX, the other gliomas use telomerase and typically have a mutation of the TERT promoter (TERTmt). These two molecular markers also have diagnostic and prognostic value and are part of the WHO histo-molecular classification criteria. But, 4 to 28% of gliomas (depending on the subtypes) do not have an ATRX alteration or TERT mutation suggesting activation of one of the TMM by other alterations or even other pathways. In this sense, we have developed a test measuring the true TMM based on the detection of c-circles (a marker of ALT) and proposed a patented algorithm (TeloDiag) taking into account this TMM, IDH mutations and the histological grading. The TeloDiag makes it possible to re-classify 38% of atypical gliomas (at the molecular level). It generated a new category of high grade IDHwt and ALT + tumors, not found in the WHO classification and showing a tendency for a better prognosis than IDHwt glioblastomas (TERTmt). Finally, we provided the proof of concept of the feasibility of this circulating test for IDHmt astrocytomas

Certaines cellules cancéreuses peuvent utiliser un mécanisme indépendant de la télomérase, connu sous le nom ALT (Alternative Lengthening of Telomeres) pour allonger leurs télomères. Les cellules ALT sont caractérisées par des télomères hétérogènes extrêmement longs et d’autres très courts voire indétectables qui co-localisent avec les corps PML pour former des structures nucléaires appelées APB (ALT-associated PML Bodies), et une fréquence élevée d'échange entre les télomères des chromatides sœurs appelées T- SCE (Telomeric Sister Chromatid Exchange). Bien qu'il soit concevable que la recombinaison homologue soit le mécanisme clé pour le maintien des télomères par la voie ALT, les acteurs moléculaires ne sont pas très bien connus. Nous avons identifié de nouveaux régulateurs potentiellement impliqués dans le mécanisme ALT: PCAF (P300/CBP-associated factor) et GCN5 (General Control Non-derepressible 5), deux lysines acétyl transférases homologues. Elles représentent généralement des facteurs de transcription, cependant, elles peuvent aussi acétyler des protéines non histones. Elles sont mutuellement exclusives dans de multiples complexes y compris le complexe SAGA. Nous avons montré que l’inhibition de ces deux protéines induit des effets opposés sur le phénotype ALT. Bien que l’absence de GCN5 augmentait l'instabilité des télomères et la fréquence des T-SCE et, la sous-expression de PCAF diminuait les T-SCE, la formation des APB et l'instabilité des télomères. Nos résultats suggèrent que dans les cellules ALT GCN5 est présent au niveau de l’ADN télomérique il inhibe la recombinaison entre les télomères et n’affecte pas la formation des APB, contrairement à PCAF qui peut indirectement les favoriser et stimuler aussi la formation des APB. Ensuite, nous avons cherché les mécanismes par lesquels PCAF et GCN5 contribuent au maintien des télomères dans les cellules ALT. Nous avons proposé que la participation de ces deux protéines consiste à réguler le turnover de la protéine télomérique TRF1 via USP22, une déubiquitinase identifiée pour la première fois comme un constituant des APB. En outre, l'intérêt de cibler l’activité de ces lysines acétyl transférase dans les cellules ALT a été testé in vitro en utilisant des inhibiteurs seuls ou combinés à l’irradiation. Nous avons montré que les cellules ALT sont particulièrement sensibles à l'inhibition de l'activité lysine acétyl transférase par l'acide anacardique (AA). Le traitement par cette molécule récapitule l'effet de la sous-expression de PCAF sur le phénotype ALT, suggérant que l’AA défavorise le mécanisme ALT en inhibant l'activité lysine acétyl transférase de PCAF, et non pas celle du GCN5. De plus, l'AA sensibilise spécifiquement les cellules ALT humaines à l’irradiation en comparant aux cellules télomérase-positives, prouvant que l'inhibition de l'activité des lysines acétyl transférases peut être un outil pour traiter les cellules ALT en augmentant l'efficacité de la radiothérapie
Some cancer cells can use a telomerase-independent mechanism, known as alternative lengthening of telomeres (ALT), to elongate their telomeres. ALT cells present unusual characteristics: extremely long and heterogeneous telomeres that colocalize with PML bodies to form nuclear structures called ALT-associated PML Bodies (APB), and high frequency of exchange events between sisters chromatid telomere referred to as Telomeric Sister Chromatid Exchange (T-SCE). Although it is agreed that homologous recombination is the key mechanism allowing the maintenance of the telomeres of ALT cells, the molecular actors involved are not yet known. We identified new actors potentially involved in the ALT mechanism: general control non-derepressible 5 (GCN5) and P300/CBP-associated factor (PCAF). Although they represent transcription factors, they can also acetylate non-histone proteins. They are mutually exclusive subunits in SAGA-like complexes. Here, we reveal that down regulation of GCN5 and PCAF had differential effects on some phenotypic characteristics of ALT cells. While GCN5 knockdown increased T-SCE and telomere instability, PCAF knockdown decreased T-SCE, APBs formation and telomere instability. GCN5 and PCAF knockdowns had thus differential effects on ALT, up-regulating it or down-regulating it respectively. Our results suggest that in ALT cells GCN5 is present at telomeres and opposes telomere recombination and does not affect the formation of APBs, unlike PCAF which may indirectly favour them and stimulate the APB formation. Then we evaluate the mechanisms by which PCAF and GCN5 contribute to the maintenance of telomeres in ALT cells. We have proposed that the participation of these two proteins should involve regulating the turnover of the telomeric protein TRF1 via USP22, a deubiquitinase identified for the first time as a component of APBs. In addition, the interest of targeting lysine acetyl transferase activities in ALT cells to oppose the maintenance of telomeres was subsequently tested in vitro using inhibitors alone or combined to irradiation. We have shown that ALT cells are particularly sensitive to the inhibition of acetyltransferases activities using Anacardic Acid (AA). AA treatment recapitulates the effect of PCAF knockdown on several ALT features, suggesting that AA decreased the ALT mechanism through the inhibition of lysine transferase activity of PCAF, but not that of GCN5. Furthermore, AA specifically sensitizes human ALT cells to radiation as compared to telomerase-positive cells suggesting that the inhibition of lysine acetyltransferases activity may be used to increase the radiotherapy efficiency against ALT cancers

La protéine INT6/EIF3E codée par le gène mammalien correspondant au site d’intégration du rétrovirus Mouse Mammary tumor virus (MMTV) n°6 (int-6), a été impliquée dans le cancer du sein chez la souris et l’homme. Malgré qu’INT6 soit une sous-unité du facteur d’initiation de la traduction eIF3, elle n’est pas essentielle pour la traduction générale mais pour l’expression d’ARNm spécifiques tel qu’il a été montré pour la traduction d’ARNm histones. Elle a aussi été impliquée dans la réplication d’ADN en stabilisant le facteur de licence de la réplication MCM7, dans la réponse aux dommages à l’ADN (DDR) et dans la voie du “nonsense-mediated mRNA decay“ (NMD). Par rapport à cette dernière activité j’ai étudié si INT6 pouvait spécifiquement intervenir au niveau de l’homéostasie des télomères en agissant sur les transcrits TERRA. La délétion d’INT6 par une approche d’ARN interférence révèle une augmentation des niveaux des ARN télomériques TERRA qui est dépendante du chromosome et du type cellulaire. Malgré qu’INT6 soit un facteur du NMD, elle n’agit pas sur la demi-vie des TERRA. Les expériences de DNA-FISH ont montré une augmentation des dommages aux télomères (TIF) dans les cellules en absence d’INT6. Les aberrations observées correspondent à des pertes de télomères (TFE) et des signaux multi-télomériques (MTS). Par la technique de digestion de la chromatine à la nucléase micrococcale, nous avons retrouvé une plus rapide accumulation des mono-nucléosomes aux télomères en absence d’INT6, suggérant un rôle dans la conformation de la chromatine télomérique. Ces résultats mettent en évidence INT6 comme un nouveau facteur régulateur de la stabilité des télomères
The INT6/EIF3E protein encoded by the mammalian integration site 6 (int-6) gene, has been implicated in mouse and human breast carcinogenesis. Although, INT6 is a subunit of the eIF3 translation initiation factor, it is not essential for bulk translation but for specific mRNAs expression as histone mRNA translation. It has also been implicated in DNA replication by stabilizing the DNA replication licensing factor MCM7, in DNA Damage Response (DDR) and in the Nonsense mRNA Decay (NMD) pathway. Relative to the latter activity, I investigated whether INT6 can specifically meddle in telomere homeostasis by acting on TERRA transcripts. Deletion of INT6 by RNA interference approach revealed an increase in the telomeric RNA TERRA levels which is depending on the chromosome and cellular type. Although INT6 is a NMD factor, it doesn’t change TERRA steady-state. DNA-FISH experiments showed an increase in Telomere Induced Foci (TIFs) in INT6 depleted cells. These aberrations correspond to Telomere Free Ends (TFE) and Multi-Telomeric signals (MTS) which implicate INT6 in DDR. By means of Microccocal Nuclease (MNase) mapping assay, we found a rapid accumulation of telomeric mono-nucleosomes in INT6-depleted cells, suggesting a role in telomeric chromatin structure. These findings evidenced that INT6 is a novel key player in telomere stability

Les télomères sont les extrémités des chromosomes linéaires. Leur structure nucléoprotéique particulière, constituée de séquences d’ADN répétées associées à des protéines spécialisées, permet à la cellule de les différencier d’une cassure double brin. Chez les Eucaryotes, ils sont maintenus grâce à une transcriptase inverse cellulaire spécialisée, la télomérase. En absence de télomérase, les télomères raccourcissent progressivement jusqu’à induire un arrêt des divisions cellulaires, appelé sénescence réplicative. Cet arrêt dépend de la voie de signalisation des dommages à l’ADN. Au cours de mes travaux de thèse, j’ai exploré les particularités de la structure télomérique au cours du raccourcissement menant à la sénescence. J’ai ainsi pu découvrir que la voie de tolérance aux dommages à l’ADN en réplication est impliquée aux télomères. J’ai aussi montré que les télomères les plus courts accumulent une longue région d’ADN simple brin 3’, expliquant le type de signalisation menant à l’arrêt des divisions. Ces télomères très courts sont aussi soumis à l’action des facteurs de recombinaison homologue. J’ai trouvé que ces facteurs agissent par un processus qui préserve la structure des télomères courts sans pour autant les rallonger, sauvegardant ainsi le potentiel prolifératif des cellules en absence de télomérase
Telomeres are the ends of linear chromosomes. Their specific nucleoprotein structure, consisting in repeated DNA sequences associated with specialized proteins, allows cells to distinguish them from DNA double-strand breaks. In Eukaryotes, they are maintained by a specialized cellular reverse-transcriptase, the telomerase. In the absence of telomerase, telomeres progressively shorten with each round of DNA replication until they promote a cycle arrest, termed replicative senescence. This arrest involves the DNA damage signalling pathway. During my PhD, I explored the specificities of the telomeric structure during the shortening process leading to replicative senescence. I discovered that the DNA damage tolerance pathway is involved at telomeres. I also showed that short telomeres accumulate long 3’-single-stranded DNA tails, providing an explanation for the type of signalling and subsequent cell cycle arrest. These short telomeres are also subject to the action of the homologous recombination factors. I found that these factors act in a process that preserves the structure of short telomeres without elongating them, thus ensuring cell proliferation potential after the loss of telomerase

Les télomères sont constitués de répétitions de courtes séquences dont un des brins est riche en guanine (G) et l'autre riche en cytosine (C).Les télomères de Saccharomyces cerevisiae sont répliqués par la télomérase qui ajoute des répétitions nouvelles au brin G-riche. Lors de la réplication des télomères de levure, les extrémités des chromosomes acquièrent de longues extensions simple-brin 3' riche en G. Ces extensions 3' sont générées à la fin de la phase S. Le candidat idéal pour la génération de ces queues G-riche était la télomérase. Toutefois, dans une souche de levure dépourvue de la télomérase, nous avons aussi retrouvé des extensions 3' télomériques durant la phase S. Ces résultats démontrent l'existence d'une activité indépendante de la télomérase pour la génération de ces queues riche en G. Cette activité pourrait être une exonucléase 5'-3' nécessaire pour générer une structure uniforme à tous les télomères puisque suite à la réplication semi-conservative, une extrémité du chromosome va comporter une courte extension 3' et l'autre extrémité, un bout franc. Pour déterminer si cette activité de dégradation du brin C-riche était dépendante du passage de la machinerie de réplication, nous avons utilisé un plasmide linéaire comportant des télomères à chacune de ses extrémités et qui ne peut se répliquer. Dans un tel cas, les télomères n'acquièrent pas d'extensions simple-brin riche en G contrairement à un plasmide correspondant comportant une origine de réplication. Ceci nous permettait de proposer un lien entre la machinerie de réplication conventionnelle et le maintien des télomères. Pour confirmer le lien pouvant exister entre la réplication des télomères et la machinerie de réplication conventionnelle, nous avons examiné les télomères d'une souche de levure possédant une mutation dans la sous-unité catalytique de l'ADN polymérase [alpha]. En plus de posséder des télomères allongés par rapport à une souche de type sauvage, un tel mutant démontre une augmentation de la quantité de simple-brin télomérique G-riche. Cette augmentation du simple-brin terminal est probablement causée par une synthèse inefficace du brin C-riche par la machinerie du brin retardé puisque ce simple-brin télomérique est généré durant la phase S. L'augmentation de la taille des télomères étant dépendante de la télomérase, nous proposons donc un couplage de la synthèse du brin G-riche par la télomérase avec la synthèse du brin C-roche par la machinerie de réplication conventionnelle pour permettre une régulation de la taille des télomères.

Rtel1 est une hélicase qui a été identifiée comme un facteur essentiel pour maintenir les télomères longs et le génome stable chez la souris. Chez l'homme, des mutations germinales dans RTEL1 ont été trouvées chez les patients atteints du syndrome de Hoyeraal-Hreidarsson (HHS), une forme grave de la dyskératose congénitale. Cependant, le mécanisme selon lequel cette protéine agit dans les cellules humaines reste en grande partie inconnu. Pour étudier la fonction de RTEL1 sur le métabolisme des télomères nous avons réduit l'expression de RTEL1 par ARN interférent dans plusieurs lignées de cellules humaines et analysé la longueur des télomères par quantitative-FISH. Nos résultats montrent que la dérégulation de RTEL1 induit un raccourcissement des télomères uniquement dans les cellules avec de très longs télomères et surexprimant la télomérase. Nous démontrons également que l'absence de RTEL1 provoque une altération du complexe de shelterin au télomères: l'augmentation des niveaux de TRF2 et la diminution de POT1. La surexpression de la portion OB fold de POT1 peut restaurer le raccourcissement des télomères causé par le knockdown de RTEL1. Ceci indique que RTEL1 peut jouer un rôle important dans la stabilité du 3' sortant et l'accessibilité de la télomérase. Nous constatons également un impact de RTEL1 sur le métabolisme de l'ARN non codant télomérique TERRA. En effet, la diminution de RTEL1 réduit la quantité totale de TERRA présente dans le noyau et en particulier de TERRA associé aux télomères. Nous constatons que ce nombre réduit de TERRA est causé par sa dégradation, donc nous proposons que RTEL1 a un rôle dans la stabilisation de TERRA aux télomères
Rtel1, regulator of telomere elongation helicase 1, was discovered as an essential factor for telomere length maintenance and genomic stability in mice. In humans, germline mutations in RTEL1 have been found in patients with Hoyeraal-Hreidarsson syndrome (HHS), a severe form of dyskeratosis congenita. However, the precise mechanism of action of the protein in human cells remains largely unknown. To investigate the function of RTEL1 in human telomere metabolism we used a knockdown approach by specific siRNAs and quantitative-FISH to measure telomere length after depletion of RTEL1 in different cancer cell lines. Our results show that down-regulation of RTEL1 induces shortening of telomeres only in cells with very long telomeres and high telomerase activity. We also demonstrate that upon depletion of RTEL1 there is a different stochiometry of shelterin proteins at telomeres: increased levels of TRF2 and decreased levels of POT1. Importantly, the overexpression of the POT1 OB fold can rescue the shortening of telomeres caused by the knockdown of RTEL1 indicating that RTEL1 may play an important role in the stability of the overhang and in its accessibility to telomerase. We also find an affect of RTEL1 on Telomeric non-coding RNA (TERRA) metabolism. Indeed, depletion of RTEL1 in human cell lines reduces the total amount of TERRA present in the nucleus and in particular of telomere-associated TERRA. Moreover, we find that this reduced number of UUAGGG repeats is caused by TERRA degradation, therefore we propose that RTEL1 has a role in stabilizing TERRA at telomeres

La chromatine est le support de l'information génétique tout le long du cycle cellulaire. Elle est soumise à des modifications diverses et rigoureusement coordonnées par les complexes CDK-Cyclines, sous le contrôle de mécanismes de surveillance. En mitose, la kinase Aurora est un acteur clé qui contrôle la ségrégation correcte des chromosomes. Aurora participe à la bi-orientation des centromères, à la condensation des chromosomes et à la cytocinèse. Le dysfonctionnement de cette kinase conduit alors à une instabilité chromosomique et à l'aneuploïdie, un phénotype observé dans la majorité des cancers solides. Les travaux réalisés au cours de cette thèse démontrent un nouveau rôle pour cette kinase dans la dispersion et la disjonction des télomères en mitose chez la levure S. Pombe. La dispersion des télomères s'accompagne en métaphase de la dissociation aux télomères des protéines Swi6/HP1 et cohésine Rad21. Tandis que la disjonction a lieu en anaphase après la phosphorylation de la sous-unité de condensine Cnd2. L'inhibition d'Aurora induit la formation de ponts chromosomiques anaphasiques qui révèle des défauts de séparation des télomères. La délétion d'une protéine spécifique aux télomères, Ccq1, protège la cellule de la formation de ces ponts chromosomiques en favorisant le chargement de la condensine en anaphase malgré l'inhibition d'Aurora
Chromatin is the support of the genetic information throughout the cell cycle. It is subject to various modifications that occur with precise coordination. This coordination is led by CDK-cyclins under the control of cell cycle checkpoints. In mitosis, correct chromosome segregation is ensured by Aurora kinases. Aurora participates to centromere bi-orientation, chromosome condensation and cytokinesis. A dysfunction in the activity of this kinase leads to chromosomal instability and aneuploidy, phenotypes frequently observed in cancer. The results obtained during this thesis reveal a new function for fission yeast Aurora kinase during mitosis in telomere dispersion and disjunction. Telomere dispersion is triggered in metaphase by the dissociation of Swi6/HP1 and cohesion Rad21 from telomeres. Then, during anaphase, the phosphorylation of the condensin subunit Cnd2 is required for telomere disjunction. Aurora inhibition leads to anaphase chromosome bridges with unseparated telomeres. Deletion of a specific telomeric protein, Ccq1, prevents the formation of anaphase chromosome bridges by favoring condensin loading despite Aurora inhibition

Le vieillissement cellulaire se caractérise par un épuisement de la capacité proliférative des cellules et entraîne une entrée irréversible en sénescence. Dans une première partie, nous montrons que ce processus altère le programme myogénique des cellules satellites. La seconde partie consistait à déterminer les voies impliquées dans l’induction du mécanisme de sénescence. Nous montrons que la sénescence des cellules satellites est induite par les voies p53 et p16. L’inactivation de ces 2 voies bloque le processus de sénescence et permet leur immortalisation. Enfin dans certaines pathologies musculaires un arrêt prolifératif précoce des cellules satellites a été observé. C’est le cas de la dystrophie myotonique de Steinert (DM1), pathologie dans laquelle une expansion anormale d’un triplet CTG a été observée dans le gène de la DMPK. Nous montrons que cet arrêt n’est pas dû à un épuisement de la capacité proliférative des myoblastes mais est induit pas un mécanisme de sénescence prématurée. Les expansions CTG induisent l’activation précoce de la voie p16 et entraînent une dérégulation de l’homéostasie des télomères.