Добірка наукової літератури з теми "Marquage en capillaire"

La glycosylation est l'une des principales modifications post-traductionnelles des protéines. La détection de modifications mineures de la glycosylation des protéines peut aider à l’identification de nouveaux biomarqueurs diagnostiques ou au contrôle qualité des produits biothérapeutiques. La cartographie des glycanes est l'une des approches les plus efficaces mais cette stratégie reste encore limitée par les nombreuses et longues étapes de traitement d’échantillon. Ces étapes impliquent la libération, le marquage et l’analyse des glycanes par une technique de séparation. Ces opérations manuelles pouvant induire des interférences provoquent des problèmes de reproductibilité. La miniaturisation et l'automatisation des différentes étapes sont nécessaires mais restent difficiles. Les dispositifs mis au point pour la libération ou le marquage par fluorescence des glycanes concernent davantage les N- que les O-glycanes. A ce jour, aucun microréacteur avec des enzymes immobilisées (IMER) pour la libération de O-glycanes ou aucun marquage en capillaire de glycanes avec l'acide 8-aminopyrène-1,3,6-trisulfonique (APTS) n’a été reporté dans la littérature. Mon projet de thèse vise à contribuer au développement d'un microsystème intégrant la libération des glycanes des glycoprotéines, leur marquage fluorescent en ligne, et leur séparation par électrophorèse capillaire (EC) couplée à la détection par fluorescence induite par laser (LIF).La première partie expérimentale décrit le développement d'un IMER à base d'un monolithe photo-polymérisé pour libérer les O-glycanes des glycoprotéines. Un monolithe à base de poly(méthacrylate de glycidyl-co-poly(diacrylate d'éthylène glycol)) de 10 mm a été synthétisé dans un capillaire après optimisation des proportions monomère/réticulant et porogènes/monomères. Il présente une perméabilité relativement élevée et une bonne stabilité mécanique et chimique. Différentes chimies d'immobilisation, le temps d'immobilisation et la concentration en O-glycosidase ont également été testés. Les O-glycanes libérés de la fétuine ou l'asialofétuine ont ensuite été marqués avec l'APTS en tubes puis analysés par EC-LIF. Pour la première fois, une O-glycosidase active est immobilisée sur un support solide. La digestion in-IMER de l'asialofétuine a montré une efficacité similaire à celle de la digestion en solution (rendement de libération de 56%) mais avec une vitesse plus grande (temps de contact < 20 s). Dans la deuxième partie expérimentale, une stratégie de préconcentration électrocinétique a été étudiée pour augmenter la sensibilité de détection des N- et O-glycanes par EC-LIF. J'ai participé à une étude menée par un autre doctorant du laboratoire en appliquant ces optimisations aux O-glycanes. En utilisant de nouveaux électrolytes combinés à l’injection d’un grand volume d'échantillon par modulation du flux électroosmotique, un facteur d'enrichissement de ~ 200 a été obtenu pour différentes glycoprotéines (IgG, fétuine, érythropoïétine) et quel que soit le type (N-, O-) de glycanes.La troisième partie expérimentale présente le marquage fluorescent en ligne des N-glycanes avec l'APTS suivi de leur analyse par EC-LIF. Une stratégie de mélange basée sur la diffusion transversale des profils d'écoulement laminaire a été exploitée pour réaliser ce marquage à l'intérieur du capillaire de séparation. Après optimisation des paramètres de mélange, l'approche en capillaire a été appliquée avec succès au marquage et à la cartographie des N-glycanes issus de l'immunoglobuline G (IgG) humaine et de l'anticorps monoclonal Rituximab.En conclusion, ce travail de thèse a contribué à développer des méthodes innovantes pour la libération de O-glycanes en microréacteur, le marquage fluorescent en ligne de N-glycanes, leur séparation et leur préconcentration par EC. Toutes les étapes ont été réalisées au sein d'un capillaire en silice et sont donc intégrables pour développer un microsystème dédié à l'analyse des glycanes
Glycosylation is one of the most critical post-translational modifications of proteins. Detecting minor modifications of protein glycosylation can help identify new diagnosis biomarkers or control the quality of biotherapeutics. The glycan mapping is one of the most efficient approaches to detecting glycosylation modifications but the workflow is still limited by the high number and time-consuming steps required to achieve it. These steps entail the glycan release, labeling, and profiling by a separation technique. These manual operations can induce interferences, provoking reproducibility issues. Miniaturization and automation of the workflow are still needed but remain challenging. For instance, devices developed for glycan release or glycan labeling kits focus more on N- than on O-glycans. Neither the O-glycan release in an immobilized enzyme reactor (IMER) nor the in-capillary labeling of glycans with the 8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonic acid (APTS) has been reported until now. My thesis project aims at contributing to the development of a microsystem, integrating the glycan release, their online fluorescent labeling, and their separation by capillary electrophoresis (CE) coupled with laser-induced fluorescence (LIF) detection.The first experimental part describes the development of an IMER based on a photo-polymerized monolith to release O-glycans from glycoproteins. A 10 mm poly (glycidyl methacrylate-co-poly (ethylene glycol) diacrylate) monolith was synthesized in a capillary after optimizing the monomer/crosslinker and porogens/monomers ratios. The optimized monolith showed a relatively high permeability and good mechanical and chemical stability. Different immobilization chemistries, immobilization time and O-glycosidase enzyme concentration were also tested. The O-glycans released from fetuin or asialofetuin were then offline fluorescently labeled with APTS and analyzed by CE-LIF. For the first time, an active O-glycosidase was immobilized on a solid support. The in-IMER digestion of asialofetuin provided a similar digestion efficiency to the in-solution one (releasing yield of 56%) and brought speed with a residence time for digestion of less than 20 s.In the second experimental part, an electrokinetic preconcentration strategy was investigated to increase the CE-LIF detection sensitivity of N- and O-glycans. I participated in the thesis study conducted by another PhD student in the lab by applying these optimizations to O-glycans. By using new background electrolytes combined with large volume sample injection via electroosmotic flow modulation, an enrichment factor of ~ 200 was obtained for different glycoproteins (IgG, fetuin, erythropoietin) whatever the type (N-, O-) of glycans.The third experimental part reports the online fluorescent labeling of N-glycans with APTS, followed by their subsequent online CE-LIF analysis. A mixing strategy based on the transverse diffusion of laminar flow profiles was exploited to achieve this labeling inside the separation capillary. After an in-depth optimization of the mixing parameters, the in-capillary approach was successfully applied to the labeling and mapping of N-glycans from human immunoglobulin G (IgG) and monoclonal antibody Rituximab.In conclusion, this thesis work contributed to developing innovative methods for O-glycan release, N-glycan online labeling, separation, and preconcentration by CE. All the steps were performed within a silica capillary and are therefore amenable to further integration for developing a microsystem dedicated to glycan analysis

Ces travaux de recherche s’intéressent à la conception de nouvelles méthodologies analytiques destinées à mesurer le bénéfice d’une transplantation hépatique ou bien encore à l’évaluation de nouvelles voies thérapeutiques à l’essai pour des patients atteints de la polyneuropathie amyloïde familiale à transthyrétine (TTR). Cette maladie rare se caractérise par une déstabilisation structurale du tétramère de TTR qui aboutit à l’agrégation de fibrille dans les tissus du système nerveux autonome, au niveau des nerfs périphériques et autour de certains organes dont le cœur. Dans le cadre d’une collaboration entre hospitalo-universitaires, chimistes analystes, électrochimistes, physico-chimistes et technologues, nous nous sommes attachés à développer des séparations en électrophorèse capillaire couplée avec une détection optique de peptides natif et muté qui sont directement associés à une variente de cette maladie rare. La difficulté première de cette recherche concerne le choix même de ces biomarqueurs qui s’est finalement révélé pertinent grâce de la réalisation de cartes peptidiques à partir du sérum. Ensuite deux voies ont été explorées : une séparation électrocinétique avec une détection spectrométrique d’absorbance dans l’ultra-violet et l’autre nécessitant le marquage préalable de peptides par des molécules fluorophores ou fluorogènes pour ensuite faire une séparation en électrophorèse couplée LIF (laser induced fluorescence). Dans les deux cas le critère principal de séparation, la résolution, autorise une quantification et surtout les validations analytiques associées montrent une réelle robustesse des méthodologies développées. L’autre signe encourageant pour la transposition des ces méthodes à l’analyse de prélèvements issus de patients, concerne la limite de quantification qui est inférieure à celle couramment mesuré dans le sérum. La spectrométrie de masse, moyen d’investigation physico-chimique puissant à permis de suivre et de comprendre d’un point vue plus fondamental le produit des réactions de chimie organique de dérivation des peptides par trois marqueurs fluorescents : le TAMRA-SE, le NDA et le FQ. La possibilité de proposer un outil d’analyse miniaturisé et simple d’utilisation pour le monde hospitalier a également été étudiée. Un poste d’analyse sur puce microfluidique permettant l’analyse quantitative et qualitative a été installé pour permettre la réalisation de premiers essais expérimentaux de séparations électrocinétiques sur puce microfluidique. Ces travaux jettent les bases d’une nouvelle voie analytique pour séparer et quantifier les différents biomarqueurs caractéristiques de la polyneuropathie amyloïde familliale à TTR
The purpose of our work was the development of new analytical methodologies to measure the benefit of liver transplantation and also the evaluation of new therapeutic approaches under testing on patients with Transtyretin (TTR) familial amyloid polyneuropathy. This rare disease is characterized by a structural destabilization of TTR tetramer leading to it’s aggregation into amyloïd fibrils that accumulate in the tissues of the autonomous nervous system, peripheral nerves and around certain organs, including the heart. As part of a collaboration between university, hospital, analytical chemists, electrochemist, physical chemists and technologists, we are committed to develop separations in capillary electrophoresis coupled with optical detection of native and mutated peptides that are directly associated with a variant of this rare disease. The first challenge of this research is the choice of these biomarkers that ultimately proved relevant with the realization of peptide maps from the serum. Then two approaches have been explored: electrokinetic separation with absorbance spectrometric detection in the ultraviolet and the other requiring the prior labeling peptides with fluorescent molecules and then to a separation on electrophoresis coupled with LIF (Laser induced fluorescence). In both cases the main criterion of separation, resolution, allows quantification and especially analytical validations show actual strength associated methodologies developed. Another encouraging sign for the transposition of these methods to the analysis of samples from patients regarding the quantification limit is lower than commonly measured in serum. Mass spectrometry, using physico-chemical investigation powerful allowed to follow and understand a more fundamental viewpoint the product of organic chemistry reactions bypass peptides by three fluorescent dyes: TAMRA-SE, the NDA and FQ. The ability to provide a miniaturized analysis and easy to use tool for the hospital environment was also studied. A post analysis on microfluidic chip for quantitative and qualitative analysis was installed to allow the realization of the first experimental tests of electrokinetic separations on microfluidic chip. These studies lay the foundation for a new analytical way to separate and quantify the different characteristics biomarkers family TTR amyloid polyneuropathy

Ces travaux de recherche s'intéressent à la conception de nouvelles méthodologies analytiques destinées à mesurer le bénéfice d'une transplantation hépatique ou bien encore à l'évaluation de nouvelles voies thérapeutiques à l'essai pour des patients atteints de la polyneuropathie amyloïde familiale à transthyrétine (TTR). Cette maladie rare se caractérise par une déstabilisation structurale du tétramère de TTR qui aboutit à l'agrégation de fibrille dans les tissus du système nerveux autonome, au niveau des nerfs périphériques et autour de certains organes dont le cœur. Dans le cadre d'une collaboration entre hospitalo-universitaires, chimistes analystes, électrochimistes, physico-chimistes et technologues, nous nous sommes attachés à développer des séparations en électrophorèse capillaire couplée avec une détection optique de peptides natif et muté qui sont directement associés à une variente de cette maladie rare. La difficulté première de cette recherche concerne le choix même de ces biomarqueurs qui s'est finalement révélé pertinent grâce de la réalisation de cartes peptidiques à partir du sérum. Ensuite deux voies ont été explorées : une séparation électrocinétique avec une détection spectrométrique d'absorbance dans l'ultra-violet et l'autre nécessitant le marquage préalable de peptides par des molécules fluorophores ou fluorogènes pour ensuite faire une séparation en électrophorèse couplée LIF (laser induced fluorescence). Dans les deux cas le critère principal de séparation, la résolution, autorise une quantification et surtout les validations analytiques associées montrent une réelle robustesse des méthodologies développées. L'autre signe encourageant pour la transposition des ces méthodes à l'analyse de prélèvements issus de patients, concerne la limite de quantification qui est inférieure à celle couramment mesuré dans le sérum. La spectrométrie de masse, moyen d'investigation physico-chimique puissant à permis de suivre et de comprendre d'un point vue plus fondamental le produit des réactions de chimie organique de dérivation des peptides par trois marqueurs fluorescents : le TAMRA-SE, le NDA et le FQ. La possibilité de proposer un outil d'analyse miniaturisé et simple d'utilisation pour le monde hospitalier a également été étudiée. Un poste d'analyse sur puce microfluidique permettant l'analyse quantitative et qualitative a été installé pour permettre la réalisation de premiers essais expérimentaux de séparations électrocinétiques sur puce microfluidique. Ces travaux jettent les bases d'une nouvelle voie analytique pour séparer et quantifier les différents biomarqueurs caractéristiques de la polyneuropathie amyloïde familliale à TTR.

The discoveries, implementations and developments of NMR and MRI have had a major impact in medical imaging. Compared to other imaging modalities (PET, SPECT, CT), current MRI research helps to further and better understand the inner mechanisms of the human body in a less invasive manner. In clinical neuroimaging, perfusion MRI is of spectacular importance to study cerebrovascular diseases and cancer. However, at the moment, there is no perfusion MRI sequence that allows for a complete, non-invasive and precise quantification of microvascular flow dynamics. This work focuses on the use of the recently introduced Flow Enhanced Signal Intensity method (FENSI) to characterize and quantify vasculature at capillary level, at high and ultra high magnetic field (7 and 17.2 tesla). For that purpose, the possible quantification of blood flux with FENSI is explored in vivo. The combination of flux quantification and flow-enhanced signal (compared to Arterial Spin Labeling) can make of FENSI an ideal method to characterize in a complete non-invasive way the brain microvasculature. After removal of magnetization transfer (MT) effects, the blood flow dynamics are studied with FENSI in a very aggressive and propagative rat brain tumor model: the 9L gliosarcoma. The objective is to assess whether FENSI is suitable for a longitudinal non-invasive characterization of microvascular changes associated with tumor growth. The results obtained with FENSI are compared with literature on 9L perfusion and immuno-histochemistry. In the first paper published on FENSI, a first glance was also casted on the potential of the flow enhanced technique when applied to fMRI. The results obtained at the time were contaminated by MT effects. With the implementation of a new MT-free FENSI technique, the possibility to map the brain cerebral functioning based on a quantitative physiological parameter (CBFlux) more directly related to neuronal activity than the usual BOLD signal is within reach. At ultra high field, the influence of different anesthetics on the rat brain microvascular network and BOLD contrast is also considered. After many developments around the FENSI technique, the method is compared to classical ASL and DSC perfusion MRI sequences. The strengths and weaknesses of the FENSI method, its characteristics, 'precautions for use', and potential main applications are detailed and discussed.

La cartographie peptidique est une méthode qui permet entre autre d’identifier les modifications post-traductionnelles des protéines. Elle comprend trois étapes : 1) la protéolyse enzymatique, 2) la séparation par électrophorèse capillaire (CE) ou chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) des fragments peptidiques et 3) l’identification de ces derniers. Cette dernière étape peut se faire par des méthodes photométriques ou par spectrométrie de masse (MS). Au cours de la dernière décennie, les enzymes protéolytiques immobilisées ont acquis une grande popularité parce qu’elles peuvent être réutilisées et permettent une digestion rapide des protéines due à un rapport élevé d’enzyme/substrat. Pour étudier les nouvelles techniques d’immobilisation qui ont été développées dans le laboratoire du Professeur Waldron, la cartographie peptidique par CE est souvent utilisée pour déterminer le nombre total de peptides détectés et leurs abondances. La CE nous permet d’avoir des séparations très efficaces et lorsque couplée à la fluorescence induite par laser (LIF), elle donne des limites de détection qui sont 1000 fois plus basses que celles obtenues avec l’absorbance UV-Vis. Dans la méthode typique, les peptides venant de l’étape 1) sont marqués avec un fluorophore avant l’analyse par CE-LIF. Bien que la sensibilité de détection LIF puisse approcher 10-12 M pour un fluorophore, la réaction de marquage nécessite un analyte dont la concentration est d’au moins 10-7 M, ce qui représente son principal désavantage. Donc, il n’est pas facile d’étudier les enzymes des peptides dérivés après la protéolyse en utilisant la technique CE-LIF si la concentration du substrat protéique initial est inférieure à 10-7 M. Ceci est attribué à la dilution supplémentaire lors de la protéolyse. Alors, afin d’utiliser le CE-LIF pour évaluer l’efficacité de la digestion par enzyme immobilisée à faible concentration de substrat,nous proposons d’utiliser des substrats protéiques marqués de fluorophores pouvant être purifiés et dilués. Trois méthodes de marquage fluorescent de protéine sont décrites dans ce mémoire pour étudier les enzymes solubles et immobilisées. Les fluorophores étudiés pour le marquage de protéine standard incluent le naphtalène-2,3-dicarboxaldéhyde (NDA), la fluorescéine-5-isothiocyanate (FITC) et l’ester de 6-carboxyfluorescéine N-succinimidyl (FAMSE). Le FAMSE est un excellent réactif puisqu’il se conjugue rapidement avec les amines primaires des peptides. Aussi, le substrat marqué est stable dans le temps. Les protéines étudiées étaient l’-lactalbumine (LACT), l’anhydrase carbonique (CA) et l’insuline chaîne B (INB). Les protéines sont digérées à l’aide de la trypsine (T), la chymotrypsine (CT) ou la pepsine (PEP) dans leurs formes solubles ou insolubles. La forme soluble est plus active que celle immobilisée. Cela nous a permis de vérifier que les protéines marquées sont encore reconnues par chaque enzyme. Nous avons comparé les digestions des protéines par différentes enzymes telles la chymotrypsine libre (i.e., soluble), la chymotrypsine immobilisée (i.e., insoluble) par réticulation avec le glutaraldéhyde (GACT) et la chymotrypsine immobilisée sur billes d’agarose en gel (GELCT). Cette dernière était disponible sur le marché. Selon la chymotrypsine utilisée, nos études ont démontré que les cartes peptidiques avaient des différences significatives selon le nombre de pics et leurs intensités correspondantes. De plus, ces études nous ont permis de constater que les digestions effectuées avec l’enzyme immobilisée avaient une bonne reproductibilité. Plusieurs paramètres quantitatifs ont été étudiés afin d’évaluer l’efficacité des méthodes développées. La limite de détection par CE-LIF obtenue était de 3,010-10 M (S/N = 2,7) pour la CA-FAM digérée par GACT et de 2,010-10 M (S/N = 4,3) pour la CA-FAM digérée par la chymotrypsine libre. Nos études ont aussi démontrées que la courbe d’étalonnage était linéaire dans la région de travail (1,0×10-9-1,0×10-6 M) avec un coefficient de corrélation (R2) de 0,9991.
Peptide mapping is a routine method for identifying post-translational modifications of proteins. It involves three steps: 1) enzymatic proteolysis, 2) separation of the peptide fragments by capillary electrophoresis (CE) or high performance liquid chromatography (HPLC), 3) identification of the peptide fragments by photometric methods or mass spectrometry (MS). During the past decade, immobilized enzymes for proteolysis have been gaining in popularity because they can be reused and they provide fast protein digestion due to the high ratio of enzyme-to-substrate. In order to study new immobilization techniques developed in the Waldron laboratory, peptide mapping by CE is frequently used, where the total number of peptides detected and their abundance are related to enzymatic activity. CE allows very high resolution separations and, when coupled to laser-induced fluorescence (LIF), provides excellent detection limits that are 1000 times lower than with UV-Vis absorbance. In the typical method, the peptides produced in step 1) above are derivatized with a fluorophore before separation by CE-LIF. Although the detection sensitivity of LIF can approach 10 12 M for a highly efficient fluorophore, a major disadvantage is that the derivatization reaction requires analyte concentrations to be approx. 10 7 M or higher. Therefore, it is not feasible to study enzymes using CE-LIF of the peptides derivatized after proteolysis if the initial protein substrate concentration is <10-7 M because additional dilution occurs during proteolysis. Instead, to take advantage of CE-LIF to evaluate the efficiency of immobilized enzyme digestion of low concentrations of substrate, we propose using fluorescently derivatized protein substrates that can be purified then diluted. Three methods for conjugating fluorophore to protein were investigated in this work as a means to study both soluble and immobilized enzymes. The fluorophores studied for derivatization of protein standards included naphthalene-2,3-dicarboxaldehyde (NDA), fluoresceine-5-isothiocyanate (FITC) and 6-carboxyfluorescein N-succinimide ester (FAMSE). The FAMSE was found to be an excellent reagent that conjugates quickly with primary amines and the derivatized substrate was stable over time. The studied substrates were -lactalbumin (LACT), carbonic anhydrase (CA) and insulin chain-B (INB). The CE-LIF peptide maps were generated from digestion of the fluorescently derivatized substrates by trypsin (T), chymotrypsin (CT) or pepsin (PEP), either in soluble or insoluble forms. The soluble form of an enzyme is more active than the immobilized form and this allowed us to verify that the conjugated proteins were still recognized as substrates by each enzyme. The digestion of the derivatized substrates with different types of chymotrypsin (CT) was compared: free (i.e., soluble) chymotrypsin, chymotrypsin cross-linked with glutaraldehyde (GACT) and chymotrypsin immobilized on agarose gel particles (GELCT), which was available commercially. The study showed that, according to the chymotrypsin used, the peptide map would vary in the number of peaks and their intensities. It also showed that the digestion by immobilized enzymes was quite reproducible. Several quantitative parameters were studied to evaluate the efficacy of the methods. The detection limit of the overall method (CE-LIF peptide mapping of FAM-derivatized protein digested by chymotrypsin) was 3.010-10 M (S/N = 2.7) carbonic anhydrase using insoluble GACT and 2.010-10 M (S/N = 4.3) CA using free chymotrypsin. Our studies also showed that the standard curve was linear in the working region (1.0×10-9-1.0×10-6 M) with a correlation coefficient (R2) of 0.9991.