Дисертації з теми "Maladies de surcharge lysosomale"

La cystinose appartient au groupe des maladies de surcharge lysosomale (MSL) et est caractérisée par un défaut d'efflux de cystine hors du lysosome. Le gène en cause, CTNS, code la cystinosine, le transporteur lysosomal de la cystine. L'accumulation de cystine va perturber la fonction de la majorité des organes à différents niveaux. La cystéamine, seul traitement actuellement disponible présente des contraintes et des inconvénients majeurs, ce qui nous a conduit à explorer une nouvelle alternative de traitement. La majeure partie de mes travaux de thèse a consisté à apporter la preuve que le transfert de gène est applicable à une MSL due à un transporteur déficient. Nos études réalisées in vivo ciblant le foie de souris Ctns-/- avec un vecteur adénoviral humain (hAd) montrent que la thérapie génique pour la cystinose semble plus préventive que curative des atteintes déjà présentes. Au lieu d'appliquer une thérapie multi-systémique nous avons choisi une approche tissu-spécifique. Pour cela, nous nous sommes orientés vers la caractérisation et le ciblage des anomalies oculaires et neurologiques des souris Ctns-/-. Nous avons montré que les atteintes de ces souris sont similaires à celles des patients. En parallèle, nous avons établi un guide spati-temporel de leurs apparitions, outil indispensable pour nos études de transfert de gène. Ces travaux nous ont permis de démarrer nos études de transfert de gène ciblées dans lesquelles nous évaluons l'efficacité de deux vecteurs plus pertinent au niveau clinique que le vecteur hAd: le vecteur adénoviral canin dépendant d'un virus helper et le vecteur associé à l'adénovirus
Cystinosis is a lysosomal storage disorder characterised by a defective lysosomal cystine efflux. The causative gene, CTNS, encodes the lysosomal cystine transporter, cystinosin. Storage of cystine, which forms crystals at high levels, disrupts the function of different organs at different rates. Cysteamine, the only treatment currently available to reduce lysosomal cystine levels, has dramatically improved the life of patients. However, due to its administration constraints and side effects, we explored the feasibility of viral-mediated CTNS gene therapy to reduce cystine levels in cystinosin-deficient (Ctns-/-) mice. The main part of my PhD was concentrated on in vivo gene transfer studies to the liver using CTNS-expressing human adenovirus vectors (hAd). This work provided for the first time the proof-of-concept that viral-mediated CTNS gene transfer can correct a lysosomal transport defect, but suggests that, in the case of cystinosis, it could be preventive but not curative in some tissues. Rather than attempting a mulisystemic gene therapy to cystinosis, we specifically concentrated on treating the ocular and CNS anomalies, which are incapacitating and have the potential to be life-threatening. Thus, along this line, we characterised these anomalies in Ctns-/- mice : we showed that they mimic those of patients and, in parallel, generated a temporospatial guide to their appearance, an essential tool for testing novel ocular and CNS cystine-depleting therapies. The next step of this work was to begin gene transfer studies in these structures using more clinically relevant vectors than hAd vector: an helper dependant canin adenovirus and an adeno-associated virus

La cystinose (MIM 21980) est une maladie de surcharge lysosomale héréditaire rare caractérisée par un efflux défectueux de cystine hors des lysosomes. Le gène impliqué dans la cystinose code pour une protéine transmembranaire lysosomale, la cystinosine, qui fonctionne comme un co-transporteur de cystine et de protons. De plus, la cystinosine, possède deux motifs d’adressage aux endosomes tardifs et aux lysosomes: un classique, le motif GYDQL dans sa partie C-terminale, et un nouveau signal conformationnel dans la boucle située entre les 5ème et 6ème domains transmembranaires. La première partie de mon projet de thèse vise à caractériser le trafic intracellulaire de la cystinosine. L’adressage des protéines de la membrane lysosomale à ces organelles peut se faire par deux voies, la voie directe (intracellulaire) et la voie indirecte (via la membrane plasmique), médiées par les complexes AP (AP- 1 à AP -4 et probablement récemment décrit AP- 5). Grâce à l’utilisation de la technique du double hybride, nous avons identifié une forte interaction entre le motif GYDQL et la sous-unité μ3 du complexe AP3. Par ailleurs, nous avons montré que la déplétion d'AP-3 dans des cellules HeLa conduit à une augmentation de localisation de la cystinosine-GFP à la membrane plasmique ainsi que à la rétention de la protéine chimère, proteine CD63 dont le signal d’adressage a été remplace par celui de la cystinosine (CD63-Cter-GFP), dans l’appareil de Golgi. Ces résultats confirment l’importance de la voie directe AP-3–dépendante dans l’adressage de la cystinosine au lysosome. La deuxième partie de mon projet a consisté à caractériser un éventuel nouveau rôle de la cystinosine. Grâce à une approche de protéomique, nous avons montré que la cystinosine interagissait avec divers membres de la voie mTORC1: les Rag GTPases RagA et RagC, les composantes du complexe Ragulator et la v -ATPase, pompe à protons couplant l’hydrolyse de l’ATP avec le transport de protons. Lors de la stimulation par des acides aminés, l’hétérodimère actif de Rag GTPases et le complexe pentamérique Ragulator recrutent mTORC1 à la surface des lysosomes, à proximité de son activateur Rheb, déclenchant la cascade de signalisation. En outre, il a été récemment montré que l'interaction, dépendante des acides aminés, entre la v-ATPase et le complexe Ragulator-Rag est nécessaire pour l’activation de mTORC1. Ainsi, nous avons émis l’hypothèse que la cystinosine et la v-ATPase pourraient fonctionner ensemble dans un mécanisme lysosomal de détection d'acides aminés appelé "inside-out". En effet, nous avons montré que l'absence de cystinosine a un impact à la fois sur le recrutement de mTORC1 aux lysosomes et sur le positionnement de ces organelles en réponse à la déprivation puis à l’ajout des acides aminés, ce qui démontre le double rôle de ce transporteur d'acides aminés. Ce rôle nouvellement décrit de la cystinosine pourrait aider à mieux comprendre la physiopathologie de la cystinose, conduisant ainsi à l'amélioration des traitements existants
Pas de résumé en anglais

Les amyotrophies spinales sont un groupe de maladies qui se caractérisent par une dégénérescence progressive des motoneurones de la moelle épinière entrainant une faiblesse et atrophie musculaire de sévérité variable. La forme la plus fréquente est liée à des mutations dans le gène SMN1, pour laquelle un produit de thérapie génique a été approuvé et mis sur le marché. Une autre forme d'amyotrophie spinale avec épilepsie myoclonique progressive, nommée SMA-PME, est due à des mutations dans le gène ASAH1 codant une enzyme lysosomale, la céramidase acide (ACDase). L'espérance de vie des patients atteints de SMA-PME ne dépasse pas l'adolescence. Certaines mutations dans ce même gène peuvent causer la maladie de Farber (MF), avec pour les formes les plus sévères un décès des patients avant l'âge de deux ans en raison d'atteintes multi systémiques sévères. La SMA-PME et la MF sont des maladies de surcharge lysosomale ultra-rares. L'ACDase catalyse le céramide, un lipide bioactif, en sphingosine et acide gras. En raison du déficit de l'activité enzymatique, les céramides s'accumulent à l'intérieur des lysosomes, provoquant de graves dysfonctionnements dans plusieurs organes. Une approche thérapeutique basée sur la transplantation de cellules souches hématopoïétiques a déjà été testée chez des patients Farber mais n'a pas empêché la détérioration neurologique au cours du temps. La génération de modèles murins de déficience en ACDase, notamment le modèle Asah1P361R/P361R récapitulant les symptômes de la forme sévère de la maladie Farber, a permis de mieux comprendre la physiopathologie de la déficience en ACDase et d'évaluer différentes approches thérapeutiques. L'enzymothérapie et la thérapie génique utilisant un vecteur lentiviral ont permis de prolonger la survie des animaux de plusieurs semaines mais la correction des atteintes neurologiques était absente. Puisqu'il n'existe aucun traitement curatif pour ces patients, le but principal de mon projet de thèse a été de développer une approche de thérapie génique en administrant un vecteur recombinant adéno-associé (AAV). L'injection intraveineuse d'un vecteur AAV9-ASAH1 chez des souris Asah1P361R/P361R aux stades pré- et symptomatiques de la maladie a été capable de prolonger la durée de vie des animaux et de corriger l'ensemble du phénotype. Cette approche a apporté la preuve de concept qu'une restauration généralisée de l'expression du gène ASAH1 permet d'obtenir un effet thérapeutique dans un modèle murin sévère de déficience en ACDase. Ces résultats nous ont conduit à réaliser une étude de dose chez le modèle murin Asah1P361R/P361R pour déterminer la dose minimale efficace de ce vecteur. Trois doses d'AAV9-ASAH1 ont été administrées par voie intraveineuse chez les souris mutantes à un stade avancé de la maladie et l'effet a été analysé au niveau clinique, moléculaire et histologique pendant une période de 6 mois. Nous avons identifié une dose de vecteur capable de corriger le phénotype et d'éviter l'infiltration des macrophages dans les tissus, y compris dans le système nerveux central (SNC). L'administration du vecteur AAV9-ASAH1 par voie intracérébroventriculaire (ICV) a également été évaluée chez les souris mutantes à la naissance afin d'investiguer le potentiel thérapeutique de cette voie d'administration directe au SNC. Dans le cas du modèle Asah1P361R/P361R, la correction de l'ensemble du phénotype nécessite une injection systémique du vecteur AAV9-ASAH1, mais des résultats préliminaires indiquent qu'une administration ICV du vecteur permet aussi de prévenir l'apparition des atteintes neurologiques présentes chez les souris mutantes. Ce travail de thèse ouvre la perspective d'un développement clinique de cette thérapie génique pour les patients atteints des maladies de Farber et SMA-PME
Spinal muscular atrophies are a heterogeneous group of disorders characterized by spinal cord α-motor neuron degeneration, leading muscle weakness and atrophy. The most common form is associated to mutations in the SMN1 gene, for which a gene therapy product obtained marketing approval. Another form of spinal muscular atrophy with progressive myoclonic epilepsy (SMA-PME), is due to mutations in the ASAH1 gene encoding a lysosomal enzyme,the acid ceramidase (ACDase). The life expectancy of patients with SMA-PME does not exceed adolescence. Some mutations in this same gene can cause Farber disease (FD), with the most severe forms causing death of patients before the age of 2 years due to severe multisystemic damage. SMA-PME and FD are ultra-rare lysosomal storage diseases. ACDase catalyzes the bioactive lipid ceramide into sphingosine and fatty acid. Due to the deficiency of enzyme activity, ceramides accumulate inside lysosomes causing serious dysfunctions in several organs. A therapeutic approach based on hematopoietic stem cell transplantation was previously tested in Farber patients but did not prevent neurological deterioration over time. The generation of mouse models of ACDase deficiency, in particular the Asah1P361R/P361R model that recapitulates the signs of Farber disease, has allowed a better understanding of the pathophysiology of acid ceramidase deficiency in tissues and the evaluation of different therapeutic approaches. Enzyme replacement therapy and gene therapy using a lentiviral vector extended the survival of mutant animals by several weeks, but did not correct the neurological signs of the disease. Since there is no curative treatment for patients, the main goal of my thesis project was to develop an efficacious gene therapy approach using an AAV vector. Intravenous administration of an AAV9-ASAH1 vector in Asah1P361R/P361R mice at pre- and symptomatic stages of the disease was able to prolong the lifespan and correct the phenotype. This approach provided proof of concept that generalized restoration of ASAH1 gene expression achieves a therapeutic effect in a severe mouse model of acid ceramidase deficiency. These results prompted us to perform a dose escalation study in Asah1P361R/P361R mice to determine the minimum effective dose of this vector. Three doses of AAV9-ASAH1 were administered intravenously in mutant mice at a late stage of the disease and the effect was analyzed at the clinical, molecular and histological level for a 6-month period. We identified a vector dose able to correct the phenotype and to avoid macrophage infiltrates in tissues, including the central nervous system. Intracerebroventricular administration (ICV) of the AAV9-ASAH1 vector in neonatal mutant mice was also evaluated to investigate the efficacy of this direct route of administration in correcting the neurological signs of the disease. The results show that systemic injection of the AAV9-ASAH1 vector was able to correct the whole-body phenotype of Asah1P361R/P361R mutant mice, whereas preliminary results indicate that ICV administration of the vector is efficacious in preventing mainly the neurological signs of the disease. This thesis work paves the way for clinical translation of this gene therapy in patients with Farber and SMA-PME diseases

Mucopolysaccharidosis type IIIB (MPSIIIB) is a lysosomal storage disease (LSD) characterized by accumulation of heparan sulfate oligosaccharides (HSO), which results in progressive mental retardation, neurodegeneration and premature death in children. The underlying mechanisms are poorly understood. Coming to a better understanding of the pathophysiology of MPSIIIB has become a necessity to assess the efficacy of gene therapy treatment regarding loss of neuronal plasticity, and to define the best conditions for treatment. To address the link between HSO accumulation and downstream pathological events, new cell models of MPSIIIB were created. First, induced pluripotent stem cells (iPSc) were generated from fibroblasts of affected children, followed by differentiation of patient-derived iPSc into a neuronal progeny. Second, a HeLa cell model was created in which expression of shRNAs directed against a-N-acetylglucosaminidase (NAGLU), the deficient enzyme in MPSIIIB, is induced by tetracycline. Success in the isolation of these different models was pointed by the presence of cardinal features of MPSIIIB cell pathology. Studies in these models showed that: I) HSO excreted in the extracellular matrix modifies cell perception of environmental cues, affecting downstream signalling pathways with consequences on the Golgi morphology. II) Accumulation of intracellular storage vesicles, a hallmark of LSDs is due to overexpression of the cis-Golgi protein GM130 and subsequent Golgi alterations. It is likely that these vesicles are abnormal lysosomes formed in the cis- and medial-Golgi which are misrouted at an early step of lysosome biogenesis, giving rise to a dead-end compartment. III) Other cell functions controlled by GM130 are affected, including centrosome morphology and microtubule nucleation. These data point to possible consequences on cell polarization, cell migration and neuritogenesis.

La maladie de Fabry est une maladie héréditaire de surcharge, dont la transmission est liée au chromosome X qui résulte d'un déficit de l'[alpha]-galactosidase A. Le déficit enzymatique mène à une augmentation de glycosphingolipides, notamment le globotriaosylcéramide (Gb[indice inférieur 3]), dans les tissus et fluides biologiques. Le Gb[indice inférieur 3] est donc un biomarqueur ou indicateur de la présence de cette maladie chez les patients Fabry. Nous voulions évaluer la faisabilité de procéder à un projet pilote de recherche en vue d'un dépistage néonatal urinaire de la maladie de Fabry.La variation de l'excrétion du Gb[indice inférieur 3]/créatinine urinaire chez des enfants normaux dans la période néonatale jusqu'à l'âge de 6 mois est inconnue. Cette constatation nous a conduits au questionnement suivant : existe-t-il une variation dans la quantité du Gb[indice inférieur 3]/créatinine urinaire excrétée chez des enfants normaux de 0 à 6 mois de vie? Afin de répondre à cette question, nous avons procédé à une étude permettant de doser le Gb[indice inférieur 3]/créatinine chez des enfants normaux par spectrométrie de masse en tandem et ce, en comptant sur la collaboration des parents à effectuer un total de treize prélèvements d'urine pendant une période de 6 mois. Nous avons d'ailleurs évalué ladite collaboration des parents à nous faire parvenir les échantillons d'urine de leur bébé durant cette période. Nous avons utilisé une méthode par spectrométrie de masse en tandem avec des échantillons d'urine séchée sur papier filtre pour analyser simultanément le Gb[indice inférieur 3] total urinaire et la créatinine à différents temps soit 2, 3, 4, 6, 10, 14, 21, 28 jours, de même qu'à 2, 3, 4, 5 et 6 mois chez 37 filles et 39 garçons normaux. Le traitement quantitatif des données de la créatinine et du Gb[indice inférieur 3] urinaire a été fait par le logiciel QuanLynx (Waters). Nous avons divisé la variable du temps en quatre périodes pour les fins d'analyses statistiques : (1) < 6 jours; (2) 6-29 jours; (3) 30-90 jours; (4) > 90 jours. Nous avons procédé à des analyses statistiques comparatives du rapport Gb[indice inférieur 3]/créatinine de 728 échantillons pour les deux cohortes en fonction du temps. Une analyse de variance a été faite pour évaluer l'effet de l'âge et du sexe sur le rapport du logarithme du Gb[indice inférieur 3]/créatinine urinaire et l'effet de l'âge et du sexe sur la quantité d'excrétion de la créatinine urinaire seulement. Nous avons observé un effet significatif de l'âge sur la créatinine (p < 0.0001). En ce qui concerne les résultats du rapport du Gb[indice inférieur 3]/créatinine, il y a une augmentation non significative de la médiane dans les périodes 1 et 2 pour les garçons (Période 1: Médiane 53.9; Min-Max 0 - 369.3 [micro]g/mmol créatinine; Période 2: Médiane 92.5; Min-Max 0 - 611.1 [micro]g/mmol créatinine ; p = 1.0000). Chez les filles, l'excrétion du Gb[indice inférieur 3]/créatinine est plus élevé à la naissance et présente une tendance à l'accroissement entre les périodes 1 et 2 (Période 1: Médiane 59.5; Min-Max 0 - 669.9 [micro]g/mmol créatinine; Période 2: Médiane 96.1; Min-Max 0 - 456.1 [micro]g/mmol créatinine ; p = 1.0000). Par ailleurs, l'excrétion du Gb[indice inférieur 3]/créatinine chez les garçons diminue de façon significative entre les périodes 2 et 4 (Période 2: Médiane 92.5; Min-Max 0 - 611.1 [micro]g/mmol créatinine; Période 4: Médiane 14.6; Min-Max 0 - 158.5 [micro]g/mmol créatinine ; p < 0.0001); au niveau des filles, il y a une diminution non significative de la médiane de la période 2 à la période 3 (Période 2 : Médiane 96.1; Min-Max 0 - 456.1 [micro]g/mmol créatinine ; Période 3 : Médiane 35.6; Min-Max 0 - 254.4 [micro]g/mmol créatinine p = 0.2290) et une légère augmentation à la période 4 (Période 4 : Médiane 42.7; Min-Max 0 - 617.2 [micro]g/mmol créatinine). Ainsi, nous pouvons constater qu'il existe une grande variabilité de l'excrétion du Gb[indice inférieur 3]

Sur la cinquantaine de maladies rares lysosomales, seules 8 peuvent être traitées par enzymothérapie substitutive avec plus ou moins d’efficacité. Il y a donc un réel besoin de développer de nouveaux traitements mais aussi de mieux caractériser les causes de ces maladies. Durant cette thèse nous nous sommes intéressés à la maladie de Pompe qui résulte de l’absence ou de la carence en enzyme lysosomale alpha-glucosidase acide (GAA) responsable de la dégradation du glycogène en glucose dans de nombreux tissus. Actuellement seule la forme infantile de cette maladie peut être traitée alors que la forme juvénile/adulte est faiblement améliorée par le traitement Myozyme®. Cette thèse a eu pour but de développer une nouvelle enzymothérapie qui, à terme, permettrait d’empêcher la progression de la maladie et de soigner, de manière satisfaisante, les formes juvéniles et adultes de la maladie de Pompe. Dans ce but, nous avons utilisé des dérivés monosaccharidiques « Analogues du Mannose-6-phosphate (M6P) Fonctionnalisés sur l’Aglycone (AMFA) », qui sont ensuite greffés sur la GAA recombinante humaine (rhGAA) afin d’améliorer son adressage aux lysosomes obtenant la rhGAA-AMFA.Une première étude in vitro, sur des fibroblastes de patients atteints de la forme adulte de la maladie, a démontré que le greffage des AMFA sur la rhGAA produite en cellules d’insectes Sf9 améliorait significativement l’affinité pour le récepteur du M6P (RM6P), l’internalisation et l’activité de l’enzyme et lui conférait une efficacité sur les souris GAA-/-, modèles de la maladie de Pompe, par rapport au traitement actuel (Article 1). Puis nous avons pu démontrer, pour la première fois, l’efficacité de la rhGAA-AMFA produite en cellules CHO sur des souris GAA-/- âgées. Ces résultats suggèrent, ainsi, la possibilité d’utiliser cette néo-enzyme dans le traitement de la forme adulte de la maladie (Article2). Enfin, le greffage des AMFA permet d’obtenir une maturation intracellulaire complète de la rhGAA sous forme active dans des myoblastes et myotubes de patients adultes et dans les quadriceps de souris âgées modèles Pompe, ce qui n’a pas été observé pour Myozyme® (Article 3). Lors de cette thèse, nous avons également démontré que de nouveaux analogues disaccharidiques, ayant une meilleure affinité que les monosaccharides pour le RM6P, peuvent efficacement cibler la rhGAA pour le traitement de la maladie de Pompe. Un brevet a été déposé sur ces résultats (Brevet PCT/FR2016/052339).En conclusion, ce travail a permis de développer une nouvelle technologie de ciblage plus efficace des enzymes lysosomales par des analogues synthétiques. La désignation de médicament orphelin pour l’alpha glucosidase acide conjuguée aux analogues du mannose-6-phosphate a été obtenue suite à ces travaux auprès de l’Agence Européenne du Médicament pour le traitement de la maladie de Pompe (EMA/OD/098/16).Mots clés: maladies lysosomales, maladie de Pompe, enzymothérapie, récepteur du mannose 6-phosphate
On 53 known rare lysosomal diseases, only 8 can be treated by enzyme replacement therapy with more or less efficiency. There is therefore a need to develop new treatments but also to better characterize these diseases. During this thesis, we focused on Pompe disease which results from the absence or deficiency of the lysosomal enzyme alpha-glucosidase acid (GAA), responsible for the degradation of glycogen in glucose in many tissues. Currently only the infantile form of this disease can be treated while the juvenile/adult form is slightly improved by Myozyme® treatment. This thesis aimed to devel a new enzyme replacement therapy which could prevent the progression of the disease and satisfactorily treat the late onset form of the disease. To do that, we used monosaccharide derivatives “Mannose-6-phosphate analogues (M6P) Functionalized on Aglycone (AMFA)”, which were grafted onto human recombinant GAA (rhGAA) in order to improve its lysosome addressing obtaining the rhGAA-AMFA.A first in vitro study on adult patient fibroblasts showed that the addition of AMFA to rhGAA, produced in Sf9 insect cells, significantly improved its affinity for the M6P receptor (RM6P), its internalization and activity. It was also more efficient on the GAA-/- Pompe mouse model compared to current treatment (Article 1). Then, we demonstrated for the first time the efficiency of rhGAA-AMFA produced in CHO cells in aged mice model. These results suggest the possibility to use this neo-enzyme in the treatment of the adult form that still resists to treatment (Article 2). Finally, the addition of AMFA allows a complete maturation of rhGAA into its active form in myoblasts and myotubes of adult patients and in the quadriceps of aged mice Pompe model. This was not observed for Myozyme® (Article 3). In this thesis we have also demonstrated that novel disaccharide analogues with a better affinity than monosaccharides for RM6P can efficiently target GAA for the treatment of Pompe disease. A patent has been filed on these results (Patent PCT / FR2016 / 052339).In conclusion, this work has led to the development of a new technology more efficient in targeting lysosomal enzymes by mean of new synthetic analogues. An orphan drug designation for the recombinant human acid alpha-glucosidase conjugated with mannose-6-phosphate analogues was obtained on the basis of this work at the European Medicines Agency for the treatment of Pompe disease (EMA/OD/098/16).Key words: lysosomal diseases, Pompe disease, enzyme replacement therapy, mannose 6-phosphate receptor

La revue générale est consacrée au métabolisme des triglycérides et esters de cholestérol cellulaires d'origines exogène et endogène ainsi qu'aux divers systèmes enzymatiques impliques dans leur dégradation. Elle fait également le point sur la myopathie a surcharge lipidique multisystemique, (ou neutral lipid storage disease, nlsd) et sur la maladie de wolman, maladies génétiques présentant respectivement un blocage de la dégradation des triglycérides cytoplasmiques et lysosomiques. Les cellules de ces maladies nous servent de modèle pour les études de compartimentation métabolique. La dégradation des triglycérides et des esters de cholestérol apportes par les hdl dans les fibroblastes semble se produire dans des compartiments subcellulaires extra-lysosomiques similaires a ceux impliques dans la dégradation des triglycérides et esters de cholestérol d'origine endogène. Les triglycérides neosynthetises par la cellule ou apportes par les hdl s'accumulent dans les fibroblastes de nlsd, alors que les esters de cholestérol sont dégrades normalement (febs lett. , 1993, 328, 230-234). Les triglycérides lies aux hdl sont captes sélectivement sans internalisation des apoprotéines (biochem. J. , 1994, 297, 467-473). Il existe deux systèmes enzymatiques différents impliques dans la dégradation des triglycérides endogènes en fonction de la longueur de chaîne des acides gras incorpores. Au dessous de 10 atomes de carbone, les enzymes impliques seraient apparentes a des carboxylesterases (non déficitaire dans la nlsd). Au dessus de 10 atomes de carbone, les triglycérides seraient degrades par la lipase neutre cytoplasmique (déficitaire dans la nlsd). La lipase neutre est transférée du cytosol vers les membranes lors de la charge en acide oléique dans les cellules normales alors que dans les cellules de nlsd elle reste cytosolique. Cette translocation peut être bloquée par des inhibiteurs de la synthèse protéique ainsi que par un inhibiteur de la protéine kinase c. Enfin la dernière partie de notre travail expérimental a consiste en une thérapie génique des cellules de nlsd par transsection avec de l'ADN génomique murin puis sélection des cellules corrigées par photosensibilisation

Les lysosomes sont des organites intracellulaires contenant de nombreuses enzymes qui permettent la dégradation de macromolécules. Longtemps considérés seulement pour leur rôle dans la digestion intracellulaire, ils sont maintenant reconnus comme intervenant dans de nombreux autres processus biologiques tels que la mort cellulaire. En effet, des travaux récents ont mis en évidence le rôle de certaines protéases lysosomales dans la mort cellulaire de type apoptotique. Dans cette étude, nous nous sommes intéressés à l'implication de protéases lysosomales dans l'induction de la mort cellulaire en utilisant des cellules de patients atteints soit d'I-cell disease, un défaut d'adressage des hydrolases néosynthétisées aux lysosomes soit de céroi͏̈de-lipofuscinoses neuronales (déficit en une enzyme lysosomale particulière). Nos travaux semblent indiquer que la Tripeptidyl peptidase 1 (TPP1) et la Palmitoyl-protein thioesterase 1 (PPT1) contribueraient à la signalisation apoptotique du TNFa
Lysosomes are cellular organelles which contain numerous enzymes for degradation of macromolecules. For many years, they have been considered as suicide bags that would release unspecific digestive enzymes after uncontrolled cell damage. However, some lysosomal proteases have been recently suggested to act as cell death mediators. This work aimed at analyzing the role of lysosomal proteases in apoptosis. We investigated the implication of lysosomal proteases in cell death by using fibroblasts isolated from patients with either I-cell disease, a lysosomal targeting defect, or neuronal ceroid lipofuscinoses (due to a single lysosomal defect). We have shown that these fibroblasts are partially resistant to TNF-induced cell death as compared to control cells. Our results indicate that Tripeptidyl peptidase 1 (TPP1) and Palmitoyl-protein thioesterase 1 (PPT1), two lysosomal hydrolases, may contribute to TNF-induced apoptosis

L'hypertrophie et l'insuffisance myocardique constituent les stades évolutifs et terminaux de presque toutes les pathologies cardiovasculaires. Le myocarde s'adapte à une surcharge hémodynamique de travail par une modification de l'expression de son génome. Mes travaux ont été axés sur l'étude de l'expression différentielle de familles multigéniques (actine, myosine) et de la modulation de l'expression de gènes uniques (Ca2+ ATPase du reticulum sarcoplasmique [RS], Facteur Atrial Natriurétique [FAN]) dans l'hypertrophie cardiaque humaine et expérimentale : -Chez l'homme : dans l'oreillette et le ventricule hypertrophiés, il y a diminution de la forme alpha de la myosine, à forte activité ATPasique, et augmentation de la forme béta de faible activité. Cette redistribution, minime dans le ventricule mais importante dans l'oreillette, est corrélée à l'ancienneté et à la sévérité de la surcharge. -Dans un modèle expérimental d'hypertrophie cardiaque (sténose de l 'aorte chez le rat), la phase d'adaptation du myocarde à la surcharge hémodynamique est caractérisée par: 1/ une augmentation précoce des ARNs totaux et messagers [ARNm]; il n'y a ni réduction, ni amplification brutale d'aucune des trois classes d'abondance de la population d'ARNm du cœur normal, ce qui suggère une augmentation harmonieuse de l'ensemble des ARNm, 2/ une accumulation transitoire et précoce des ARNm codant pour l'actine squelettique qui démontre l'existence d'une modification du filament fin du sarcomère, indépendante de celle du filament épais, 3/ une accumulation des ARNm codant pour le FAN; le ventricule participerait donc au pool circulant de FAN et à la régulation de ses propres conditions de charge, 4/ une diminution de l'activité du RS qui n'est pas due à un changement d'isoforme de la Ca2+ ATPase car nous avons montré l'existence d'un seul type d'ARNm codant pour la Ca2+ ATPase du RS, mais à une diminution relative de l'expression du gène. Par ailleurs nous avons mis en évidence un iso-ARNm codant pour la Ca2+ ATPase du réticulum spécifique des muscles lisses et des tissus non musculaires.

Le réseau lymphatique permet le drainage des liquides interstitiels, le transport des cellules immunitaires et intervient dans le métabolisme lipidique. La dérégulation de ce système est impliquée dans de nombreuses pathologies comme les lymphœdèmes, le rejet de greffe ou encore l'échappement tumoral. Le cœur est pourvu d'un réseau lymphatique abondant dont l'importance n'est apparue que très récemment dans les pathologies ischémiques. En effet, suite à un infarctus du myocarde, la dysfonction lymphatique observée favorise l'œdème et l'inflammation tissulaire, révélant le réseau lymphatique comme un acteur majeur du développement de cette pathologie. Les processus régulant la formation de vaisseaux lymphatiques chez l'adulte sont largement dépendants de facteurs de croissance aux effets pro- ou anti- lymphangiogéniques. Les cellules immunes et plus particulièrement les macrophages sécrètent un grand nombre de ces facteurs et leur importance dans la réponse lymphangiogénique a été montrée dans différentes conditions physio-pathologiques, telles que la lymphangiogenèse tumorale et inflammatoire. Il a longtemps été admis que les macrophages tissulaires provenaient exclusivement de la différenciation de monocytes sanguins. Cependant, l'existence de macrophages provenant de progéniteurs embryonnaires a été récemment mise en évidence. Dorénavant, les macrophages tissulaires résidents sont perçus comme des populations hétérogènes pouvant prétendre à des différences fonctionnelles. A ce jour, les modifications du réseau lymphatique et les mécanismes permettant sa régulation, au cours de pathologies non ischémiques, n'ont pas été abordées. Ainsi, nous avons entrepris d'identifier et de caractériser les différentes populations de macrophages cardiaques participant à la régulation du réseau lymphatique suite à une surcharge barométrique. Nos résultats ont montré une diminution précoce du réseau lymphatique cardiaque dans le cœur murin hypertrophié au cours d'une surcharge de pression induite par constriction de l'aorte transverse. Cette réduction du réseau est associée à la perte d'une population majoritaire de macrophages cardiaques portant le récepteur 1 à l'acide hyaluronique (Lyve-1). Cette population résidente diminue dans le cœur insuffisant, au profit de macrophages infiltrants dérivés de monocytes sanguins. Par ailleurs, en plus d'être corrélée à la baisse du réseau lymphatique cardiaque, la diminution du nombre de macrophages Lyve-1 est proportionnelle à la détérioration de la fonction cardiaque. La prévention de l'infiltration monocytaire a permis de maintenir le pool de macrophages exprimant Lyve-1, le réseau lymphatique et la fonction cardiaques lors d'une surcharge de pression. La caractérisation par RT-PCR des différentes populations de macrophages récupérés par tri cellulaire nous a permis de montrer que les macrophages Lyve-1 présentent des caractéristiques particulières, avec une forte expression de VEGFR3 et NRP2, molécules de signalisation lymphangiogène. De plus, ces macrophages Lyve-1 à la polarisation mixte et à l'activité phagocytaire importante, expriment de nombreux facteurs pro-lymphangiogéniques (VEGFc, VEGFd, IGF1). Ils ont montré une activité pro-lymphangiogène in vitro sur des explants de canal thoracique et sur des cellules endothéliales lymphatiques et in vivo avec la formation de vaisseaux lymphatiques naissants lors de l'injection de ces macrophages Lyve-1 dans le cœur. Leur localisation à proximité des vaisseaux lymphatiques et leur capacité pro-lymphangiogène leurs confèrent un rôle évident dans le maintien du réseau lymphatique lors d'un remodelage cardiaque de surcharge de pression. Ces travaux ont permis l'identification d'une population originale de macrophages cardiaques pouvant entrer dans la régulation du système lymphatique au cours d'une surcharge de pression
The lymphatic system has recently emerged as an important regulator of the cardiac interstitial fluid compartment and function. Experimental obstruction of lymphatic vessel leads to cardiac œdema, myocardial stiffness, fibrosis and ventricle dysfunction. Following myocardial infarction, stimulation of lymphangiogenesis was found to reduce fibrosis and inflammation and to improve cardiac function. Macrophages have been largely described as important contributors of lymphangiogenesis in inflammatory situations such as cancer. Recently, genetic fate mapping demonstrated that distinct populations of macrophages coexist in the adult heart. In addition to monocyte derived-macrophages that massively colonize injured heart, a subpopulation of tissue-resident macrophages that originates from embryonic precursors persists into adulthood by means of local self- renewal. To date the distinct involvement of cardiac macrophage subpopulations in cardiac lymphatic remodeling and heart failure progression induced by pressure overload is largely unknown. In our study, we observed that expression of Lyve-1 identifies a resident macrophage subset abundant in mouse heart. This Lyve-1 positive macrophage subset decreased rapidly in cardiac remodeling induced by chronic pressure overload. In addition, the number of cells found in heart was positively correlated with the preservation of cardiac lymphatic network and function after transverse aortic constriction (TAC). Blocking recruitment of monocyte derived macrophages expanded Lyve-1 positive macrophages, attenuated cardiac lymphatic remodeling and contractile dysfunction of pressure overloaded heart. Lyve-1 positive macrophages express pro-lymphangiogenic factors and sustain lymphangiogenesis in vitro and in vivo. In conclusion, resident macrophage subset expressing the Lyve-1 receptor participates to maintain cardiac function after chronic pressure overload by mechanisms that may involve the preservation of cardiac lymphatic system. These results provide insight into the regulation of lymphatic homeostasis by tissue resident macrophage during heart failure induced by pressure overload

Le pronostic à long terme de certaines cardiopathies congénitales se complique de dysfonction ventriculaire droite (VD) sévère répondant peu au traitement classique de l’insuffisance cardiaque. La thérapie cellulaire pourrait être une solution thérapeutique. Les buts de cette étude ont été 1 / de créer un modèle expérimental de dysfonction VD par surcharge telle qu’on l’observe dans les cardiopathies congénitales, 2/ d’appliquer sur cette dysfonction VD une thérapie cellulaire par progéniteurs cardiaques issus de cellules souches embryonnaires humaines. Nous avons caractérisé chez le gros animal un modèle de dysfonction VD par surcharge chronique combinée en reproduisant chirurgicalement les lésions de la voie d’éjection droite de la tétralogie de Fallot réparée. Après 4 mois d’évolution, nous avons retrouvé les différents aspects d’une dysfonction VD : sur le plan hémodynamique une altération de la contractilité, sur le plan électro-physiologique un allongement de la durée du complexe QRS et des potentiels d’action, sur le plan structural un remodelage myocardique débutant. Sur ce modèle de dysfonction VD, nous avons testé les effets d’injections multiples intra-myocardiques directes de progéniteurs cardiaques issus de cellules souches embryonnaires humaines. Nous avons constaté une amélioration de la contractilité myocardique, une stabilisation des effets délétères de la surcharge chronique sur la fonction cardiaque ainsi que l’absence d’arythmie ventriculaire et de tératome. Ce premier essai encourageant de thérapie cellulaire par progéniteurs cardiaques apparait comme une nouvelle approche thérapeutique intéressante de la dysfonction VD par surcharge chronique
The long term prognosis of some congenital heart diseases may be impaired related to severe right ventricular (RV) dysfunction and conventional therapies give poor results. Cell therapy may be an alternative therapeutic approach. The aims of this study were 1/ to create an experimental model of RV dysfunction secondary to chronic overload as observed in congenital heart diseases, 2/ to apply on this failed RV a cell therapy using cardiac progenitors derived from human embryonic stem cells. We have characterized in a large animal a model of RV dysfunction secondary to a combined chronic overload using a surgical procedure reproducing the RV outflow tract diseases as observed after repair in tetralogy of Fallot. After 4 months, we have observed the various aspects of RV dysfunction: hemodynamic with an impairment of myocardial contractility, electrophysiological with an increasing of duration of both QRS and action potential and histological with a myocardial remodelling at the first stage. In this model of RV dysfunction, we have applied cell therapy and injected into multiple sites of RV myocardium cardiac progenitors derived from human embryonic stem cells. We have observed an improvement of myocardial contractility and a stabilization of the deleterious effects of the chronic overload on cardiac function. No ventricular arrhythmia occurred and no teratoma was detected. This first attempt of cell therapy using cardiac progenitors is encouraging and may be an interesting innovative approach to treat RV dysfunction secondary to chronic overload

L’incidence des maladies cardiovasculaires diffère entre les hommes et les femmes. Les symptômes, l’évolution de la maladie, la réponse aux traitements et même la prise en charge sont différents selon le sexe. L’hypertrophie cardiaque (HC) est la réponse du cœur à une surcharge hémodynamique maintenue et significative. L’HC peut être de type concentrique (épaississement des parois) ou de type excentrique (dilatation de la chambre). Les mécanismes impliqués dans le dimorphisme sexuel de l’HC sont toujours mal compris. Notre équipe s’intéresse à un modèle de régurgitation de la valve aortique (RA) chez le rat. Nous avons déjà montré que les femelles RA ont un remodelage plus concentrique, une meilleure densité capillaire et un profil génique de la fonction mitochondriale et du métabolisme énergétique plus près de la normale que les mâles. Nous nous sommes d’abord intéressés à l’implication des hormones sexuelles dans ce dimorphisme sexuel. Les analyses échocardiographiques et tissulaires montrent que la déficience en androgènes chez les mâles RA réduit la réponse hypertrophique, améliore la fonction cardiaque et tend à améliorer la survie. La perte des estrogènes n’est pas associée à d’importants changements chez les femelles RA. Nous avons ensuite étudié l’effet du valsartan, un traitement ciblant le système rénine angiotensine (RAAS), une voie hormonale fortement activée en HC. La réduction de l’activité du RAAS empêche le remodelage concentrique hypertrophique féminin dans les premières semaines de RA, alors qu’elle a peu d’effet chez les mâles RA. Finalement, nous nous sommes intéressés à l’évolution morphologique et fonctionnelle du cœur chez les rats RA. L’analyse échocardiographique montre que le ventricule gauche des femelles RA perd rapidement de la fonction contractile, de la capacité de déformation en circonférentiel et modifie sa forme elliptique normale, comparativement aux mâles. Les résultats présentés dans ce mémoire améliorent notre compréhension des différences sexuelles en HC.
The incidence of cardiovascular disease differs between men and women. Symptoms, disease’s evolution, response to treatment and even care are different depending on the sex. Cardiac hypertrophy (HC) is the heart's response to sustained and significant hemodynamic overload. HC can be concentric (thickening of the walls) or eccentric (dilation of the chamber). Mechanisms involved in the sexual dimorphism of HC are still poorly understood. Our team is interested in a model of severe aortic valve regurgitation (RA) in rats. We have already shown that women’s heart has a more concentric remodeling, a better capillary density and a gene profile of mitochondrial function and energy metabolism closer to normal, compared to males. We were first interested in the involvement of sex hormones in this sexual dimorphism. Echocardiographic data and tissue analyze show that androgen deficiency in RA males reduces hypertrophic response, improves cardiac function and tends to improve survival. Estrogen loss is not associated with significant hypertrophic changes in RA females. We then studied the effect of valsartan, a treatment targeting the renin angiotensin system (RAAS), a highly activated hormonal pathway in HC. Inhibition of RAAS activity prevents concentric hypertrophy in female’s heart in the early weeks of RA, whereas it has little effect in RA males. Finally, we were interested in the morphological and functional evolution of the heart in RA rats. Echocardiographic analysis shows that RA females’ left ventricle rapidly loses contractile function, circumferential deformation capacity, and changes its normal elliptical shape, compared to males. The results presented here improve our understanding of sexual differences in HC.

"Nous montrons que la surcharge chronique en magnésium freine le développement de l'hypertension minéralocorticoi͏̈de et réduit de manière importante le taux de la mortalité des rats hypertendus DOCA (désoxycorticostérone) + NaCl. (. . . ) Dans la dernière partie de notre étude, nous avons constaté in vitro et ex vivo que l'effet vasorelaxant du magnésium sur la contractilité à la noradrénaline d'aortes isolées de rats hypertendus DOCA + NaCl nécessite l'intégrité de l'endothélium vasculaire et est accompagné d'une augmentation de la production endothéliale de prostacycline. " (extr. Résumé)

La capacité des cœurs hypertrophiés à la suite d'une surcharge volémique (rat porteur d'une fistule aorto-cave de 3 mois) à utiliser les acides gras exogènes a été approchée par les mesures de la production du 14CO2 à partir du U-14C-palmitate et du l-14C­octanoate. Les cœurs ont été isolés et perfusés sous les conditions de travail modéré et élevé. Leurs turnover énergétiques et leurs performances mécaniques ont été évalués à partir de la consommation d'oxygène et du travail de pression. Selon nos résultats, la production de 14CO2 à partir du palmitate exogène est abaissée de 30% chez les coeurs hypertrophiés. La consommation d'oxygène et les performances mécaniques sont diminuées dans les mêmes proportions. Quand l'octanoate constitue le principal substrat exogène, la consommation d'oxygène et la production du 14CO2 des cœurs hypertrophiés deviennent comparables à celles des coeurs normaux. De même, les performances mécaniques des cœurs hypertrophiés semblent être rétablies au cours des perfusions avec l'octanoate exogène. Ces résultats suggèrent qu'une partie de la défaillance mécanique observée chez les cœurs hypertrophiés perfusés avec les acides gras à longues chaînes est secondaire à la dysfonction de la carnitine-acyl carnitine translocase, qui serait elle-même secondaire à une déplétion de la L-carnitine tissulaire. Cette dernière serait la conséquence de la diminution de l'affinité du transporteur membranaire pour la L-carnitine circulante. Une diminution significative du Km a été en effet constatée dans notre étude du transport actif de la L-14C-carnitine dans les cœurs hypertrophiés.

Les glycosidases sont des enzymes impliquées dans de nombreux processus biologiques. Entre autres, elles sont responsables de la dégradation des déchets polysaccharidiques de nos cellules. Lorsqu'une modification génétique touche un gène qui code pour une de ces enzymes, des pathologies graves regroupées sous l'appellation de " maladies lysosomales " peuvent être déclenchées. L'objectif de ce projet a été de proposer une méthode de synthèse efficace de molécules potentiellement actives spécifiquement sur l'une ou l'autre de ces maladies. Les molécules ciblées sont des inhibiteurs de glycosidases de la famille des aminocyclitols, utilisés dans une stratégie thérapeutique émergente " par molécules chaperonnes ". La méthode de synthèse développée s'appuie sur une étape enzymatique clé utilisant les aldolases comme catalyseurs et répondant aux contraintes environnementales actuelles de la chimie verte. Nous avons atteint nos objectifs grâce à l'utilisation de trois aldolases différentes, produites et purifiées pour la première fois au sein de notre laboratoire. Il s'agit de la fuculose-1-phosphate aldolase F1PA, de la rhamnulose-1-phosphate aldolase R1PA et de la nouvellement découverte fructose-6-phosphate aldolase FSA. La formation d'une quarantaine de nitrocyclitols, de stéréochimies définies, précurseurs des aminocyclitols correspondant, a ainsi été réalisée avec de très bons rendements de synthèse.