Дисертації з теми "Maladies associées à l’âge"

Le vieillissement s'accompagne d'un déclin des propriétés régénératrices de la plupart des tissus, et l’accumulation de cellules sénescentes au cours de l’âge est associée à ce déclin. La sénescence est une réponse cellulaire dû au raccourcissement des télomères ou à l’exposition aux stress provoquant une accumulation de dommages à l’ADN et / ou un stress oxydant. Cette réponse cellulaire est caractérisée par un arrêt irréversible du cycle cellulaire, une augmentation de l’activité β-galactosidase associée à la sénescence ainsi que la sécrétion du Senescence-Associated Secretory Phenotype ou SASP composé de cytokines, chimiokines, facteurs de croissance et protéases. La composition de ce SASP et par conséquent son rôle, dépendent du type cellulaire et de la nature du stress inducteur de sénescence et contribue aux effets délétères des cellules sénescentes. Parmi les tissus affectés, les muscles du squelette représentent un paradigme pour explorer les stratégies régénératives. Grâce à une population de cellules souches musculaires qui peuvent s'activer, proliférer et se différencier pour former de nouvelles myofibres, le muscle possède une remarquable capacité de régénération après blessure. Au cours du vieillissement et dans certaines dystrophies musculaires, ce potentiel s’épuise en raison de l'entrée progressive des cellules souches musculaires en sénescence. Le développement d’une sénotherapie basée sur l’utilisation de composés sénolytiques, capables d'éliminer les cellules sénescentes constitue donc une stratégie prometteuse. Cependant, les composés actuellement disponibles se caractérisent par un manque de spécificité. Ce travail de thèse a consisté à concevoir, synthétiser et évaluer pour la première fois deux nouveaux types de composés bifonctionnels innovants avec une sélectivité optimisée en ciblant la DPP4, protéase membranaire surexprimée sur la surface des cellules sénescentes. Le premier composé est la conjugaison entre le sénolytique puissant et un ligand de haute affinité de la DPP4 permettant un adressage moléculaire. La seconde est caractérisée, en plus, par un linker immolable, sensible à l’activité β-galactosidase associée à la sénescence permettant la libération spécifique du sénolytique au sein des cellules sénescentes. Les évaluations de ces composés ont été réalisé sur différentes lignées rendues sénescentes par différents stress et comparés à des sénolytiques et sénormorphiques de référence. En conclusion, les molécules bifonctionnelles développées au cours de cette thèse possèdent un pouvoir sénolytique similaire à la Piperlongumine, agent sénolytique utilisé pour la conception avec une sélectivité améliorée vis-à-vis des cellules non-sénescentes comparative aux sénolytiques de référence, Quercetin et Dasatinib par exemple. L’étude du mode d’action de la Piperlongumine a également été étudié, en particulier de l’état métabolique quelques cibles intracellulaires. Nos données constituent ainsi une excellente base pour développer un nouveau format de sénomodulateurs avec une sélectivité améliorée à des fins de régénération musculaire
Ageing is accompanied by a decline in the regenerative properties of most tissues, and the accumulation of senescent cells as we age is associated with this decline. Senescence is a cellular response due to telomere shortening or exposure to stresses causing an accumulation of DNA damage and/or oxidative stress. This cellular response is characterized by an irreversible cell cycle arrest, an increase in the β-galactosidase activity associated with senescence and the secretion of the Senescence-Associated Secretory Phenotype or SASP composed of cytokines, chemokines, growth factors and proteases. The composition of this SASP, and therefore its role, depends on the cell type and the nature of the senescence-inducing stress, and contributes to the deleterious effects of senescent cells. Among the tissues affected, skeletal muscle represents a paradigm for exploring regenerative strategies. Thanks to a population of muscle stem cells that can activate, proliferate and differentiate to form new myofibers, muscle has remarkable capacity for regeneration after injury. During the ageing process and muscular dystrophies, this potential is depleted as muscle stem cells gradually enter senescence. The development of senotherapy based on the use of senolytic compounds capable of eliminating senescent cells is therefore a promising strategy. However, the compounds currently available lack specificity. This thesis involved designing, synthesizing and evaluating for the first time two new types of innovative bifunctional compounds with optimized selectivity targeting DPP4, a membrane protease overexpressed on the surface of senescent cells. The first compound is characterized by a conjugation between a potent senolytic and a high-affinity ligand for DPP4, enabling molecular addressing. The second is additionally characterized by an immolative linker, sensitive to the senescence associated β-galactosidase activity, enabling specific release of the senolytic within senescent cells. These constructs were evaluated on different cell lines rendered senescent by various stresses and compared with reference senolytics and senormorphics. In conclusion, the bifunctional molecules developed during this thesis have a senolytic power similar to that of Piperlongumine, the parent senolytic agent used for design purposes, with improved selectivity towards non-senescent cells compared with reference senolytics such as Quercetin and Dasatinib. The mode of action of Piperlongumine was also studied in particular metabolism disruption, and intracellular targets. Hence, our data constitute an excellent basis to develop a new format of senomodulators with improved selectivity for muscle regeneration strategy purposes

Ce travail porte sur deux projets ayant pour fil conducteur la transmission dopaminergique. Ces projets portent sur deux maladies psychiatriques associées, d’une manière ou d’une autre, à une hyperdopaminergie : la dépendance aux drogues et la schizophrénie. La dépendance aux drogues constitue le projet principal de ma thèse et la schizophrénie est un projet en collaboration avec l’université Américaine de Beyrouth. Dans un premier temps, nous avons étudié chez la souris l’influence d’un environnement qui mime les conditions positives comme l’environnement enrichi durant les premiers stades de vie, sur la vulnérabilité aux drogues comme la cocaïne et l’héroïne ayant des mécanismes d’actions différentes. Nous nous sommes focalisés sur le système dopaminergique mésolimbique qui projette vers le striatum ventral et qui est considéré comme un maillon central de circuit de récompense. Nos résultats montrent que les conditions environnementales positives peuvent protéger contre les effets renforçants de la cocaïne et de l’héroïne. La protection contre les effets de la cocaïne semble être médiée par une réduction de la réactivité des neurones du striatum au niveau post synaptique. Nous avons trouvé aussi une dissociation entre les effets activants et récompensants de l’héroïne reflétant que les effets récompensants de l’héroïne sont, en partie, indépendants du système dopaminergique mésolimbique. Ces études montrent que l’environnement enrichi diminue la vulnérabilité à développer l’addiction aux drogues. Ensuite, nous avons étudié l’influence de l’environnement enrichi sur les effets stimulants et récompensants de la cocaïne après l’installation de la dépendance ainsi que sur la rechute à la cocaïne. Nous avons participé à une étude montrant que les influences de l’environnement enrichi ne sont pas restreintes à son rôle protecteur contre les effets des drogues. L’environnement enrichi est aussi capable d’éliminer les conséquences comportementales et neurochimiques des injections répétées des drogues et empêcher le phénomène de rechute. De ce fait, l’environnement enrichi possède aussi un rôle curatif de l’addiction aux drogues. Concernant le deuxième axe de l’étude, nous avons étudié par hybridation in situ l’expression des gènes des récepteurs dopaminergiques D1 et D2, de la sous unités NR1 et NR2A des récepteurs NMDA glutamatergiques et des neuropeptides (substance P, enképhaline, dynorphine) dans un modèle animal de la schizophrénie. Ce modèle s’agit des rats ayant une lésion néonatale de l’hippocampe ventrale et montrant après la puberté des changements comportementaux associés à une augmentation de l’activité dopaminergique dans le striatum et un dysfonctionnement du cortex préfrontal, consistants avec la schizophrénie. Nous avons montré que l’émergence de ces comportements après la puberté est associée à une diminution de l’expression du récepteur D2 et des neuropeptides (enképhaline et substance P) dans le striatum, et une augmentation de l’expression de NR1 dans le cortex. Ces changements semblent être des mécanismes compensatoires à l’augmentation de l’activité dopaminergique dans le striatum et à l’hypofonctionnement des récepteurs NMDA dans le cortex, qui n’apparaissent, similairement à la schizophrénie, qu’après la puberté.

La dysbiose est une cause importante dans la survenue de maladies, favorisant la prolifération de pathogènes ou induisant l’inflammation. L’étude de ce phénomène est devenue possible grâce aux approches d’analyse génomique (AG) associé avec d’autres techniques. L’entérocolite nécrosante (ECN) et l’infection du pied diabétique (IPD) demeurent deux maladies associées à la dysbiose dans lesquels différents bactéries ont été décrites, notamment C. butyricum dans l’ECN, E. coli et S. aureus dans l’IPD. Dans le cadre de l’ECN, C. butyricum demeure l’espèce la plus fréquente chez les ECN. L’identification clusters liés géographiquement et en fonction du temps. Le portage asymptomatique est suggéré par une similarité génomique des souches patients et contrôles. La prédiction d’un gène de β-hémolysine ainsi leur effet cytotoxique sur les cellules Jurkat avait été observé. De même, sur les cellules Caco-2 malgré le KO du gène de β-hémolysine. En se basant sur l’analyse physico-chimique du surnageant bactérien, nous avons suggéré que la fraction cytotoxique est protéique. La purification de la fraction cytotoxique a permis de trouver une protéine codant pour PspC family possédant un domain conservé commun avec celui de la toxine A/B. L’inactivation du gène codant pour cette protéine n’a pas supprimé l’effet cytotoxique, suggérant la présence d’une combinaison gènes. En parallèle, nous avons ciblé l’impact de C. neonatale par qRPC spécifique rpoB. Cette espèce était plus fréquente chez les patients, ainsi de clones géographiques ont été identifiées. Enfin, des SNPs ont été observés dans des gènes de virulence dans le cas des E. coli et S. aureus isolés de l’IPD
Dysbiosis remains a main cause during the establishment of several diseases, by promoting bacterial translocation, leading to inflammation process. Specific microorganisms were involved in the pathogenesis of dysbiosis-associated diseases, notably necrotizing enterocolitis (NEC) and diabetic foot (DF). This was possible by the implication of whole-genome analysis (WGA) in association with other techniques. In case of NEC, C. butyricum was significantly associated with in NEC; tested on a South-East French cohort. Geographical and/or temporal clusters were identified, thus genomic relationship between NEC-associated isolates and controls, suggesting the presence of asymptomatic carriage. Genes encoding for β-hemolysin was detected and C. butyricum supernatant exhibited cytotoxic effect on Jurkat cells. Cytotoxic effect was also presented on Caco-2 cells. Supernatant of β-hemolysin-mutant C. butyricum showed enterotoxic effect. Basing on physico-chemical data, we assumed that the evaluated fraction was a protein. Proteomics analysis revealed that PspC family was the cytotoxic protein. This protein owned a glucan-binding domain, shared by C. difficile toxin A/B. The KO of PspC gene was enterotoxic, suggesting by this the existence of a combination of genes. In parallel, a specific rpoB-based qPCR was developed to identify C. neonatale. We found that, C. neonatale was more prevalent in NEC than in controls. Although co-identified in association with C. butyricum. C. neonatale clones were distinguished especially in strains isolated from the same hospital. Regarding to DF infection, SNPs were identified within S. aureus and E. coli genomes, especially in virulent genes

Le travail de recherche de cette thèse de doctorat s'inscrit dans le cadre du suivi médical des patients atteints de démences liées à l'âge à l'aide des caméras videos portées par les patients. L'idée est de fournir aux médecins un nouvel outil pour le diagnostic précoce de démences liées à l'âge telles que la maladie d'Alzheimer. Plus précisément, les Activités Instrumentales du Quotidien (IADL: Instrumental Activities of Daily Living en anglais) doivent être indexées automatiquement dans les vidéos enregistrées par un dispositif d'enregistrement portable.Ces vidéos présentent des caractéristiques spécifiques comme de forts mouvements ou de forts changements de luminosité. De plus, la tâche de reconnaissance visée est d'un très haut niveau sémantique. Dans ce contexte difficile, la première étape d'analyse est la définition d'un équivalent à la notion de « plan » dans les contenus vidéos édités. Nous avons ainsi développé une méthode pour le partitionnement d'une vidéo tournée en continu en termes de « points de vue » à partir du mouvement apparent.Pour la reconnaissance des IADL, nous avons développé une solution selon le formalisme des Modèles de Markov Cachés (MMC). Un MMC hiérarchique à deux niveaux a été introduit, modélisant les activités sémantiques ou des états intermédiaires. Un ensemble complexe de descripteurs (dynamiques, statiques, de bas niveau et de niveau intermédiaire) a été exploité et les espaces de description joints optimaux ont été identifiés expérimentalement.Dans le cadre de descripteurs de niveau intermédiaire pour la reconnaissance d'activités nous nous sommes particulièrement intéressés aux objets sémantiques que la personne manipule dans le champ de la caméra. Nous avons proposé un nouveau concept pour la description d'objets ou d'images faisant usage des descripteurs locaux (SURF) et de la structure topologique sous-jacente de graphes locaux. Une approche imbriquée pour la construction des graphes où la même scène peut être décrite par plusieurs niveaux de graphes avec un nombre de nœuds croissant a été introduite. Nous construisons ces graphes par une triangulation de Delaunay sur des points SURF, préservant ainsi les bonnes propriétés des descripteurs locaux c'est-à-dire leur invariance vis-à-vis de transformations affines dans le plan image telles qu'une rotation, une translation ou un changement d'échelle.Nous utilisons ces graphes descripteurs dans le cadre de l'approche Sacs-de-Mots-Visuels. Le problème de définition d'une distance, ou dissimilarité, entre les graphes pour la classification non supervisée et la reconnaissance est nécessairement soulevé. Nous proposons une mesure de dissimilarité par le Noyau Dépendant du Contexte (Context-Dependent Kernel: CDK) proposé par H. Sahbi et montrons sa relation avec la norme classique L2 lors de la comparaison de graphes triviaux (les points SURF).Pour la reconnaissance d'activités par MMC, les expériences sont conduites sur le premier corpus au monde de vidéos avec caméra portée destiné à l'observation des d'IADL et sur des bases de données publiques comme SIVAL et Caltech-101 pour la reconnaissance d'objets
The research of this PhD thesis is fulfilled in the context of wearable video monitoring of patients with aged dementia. The idea is to provide a new tool to medical practitioners for the early diagnosis of elderly dementia such as the Alzheimer disease. More precisely, Instrumental Activities of Daily Living (IADL) have to be indexed in videos recorded with a wearable recording device.Such videos present specific characteristics i.e. strong motion or strong lighting changes. Furthermore, the tackled recognition task is of a very strong semantics. In this difficult context, the first step of analysis is to define an equivalent to the notion of “shots” in edited videos. We therefore developed a method for partitioning continuous video streams into viewpoints according to the observed motion in the image plane.For the recognition of IADLs we developed a solution based on the formalism of Hidden Markov Models (HMM). A hierarchical HMM with two levels modeling semantic activities or intermediate states has been introduced. A complex set of features (dynamic, static, low-level, mid-level) was proposed and the most effective description spaces were identified experimentally.In the mid-level features for activities recognition we focused on the semantic objects the person manipulates in the camera view. We proposed a new concept for object/image description using local features (SURF) and the underlying semi-local connected graphs. We introduced a nested approach for graphs construction when the same scene can be described by levels of graphs with increasing number of nodes. We build these graphs with Delaunay triangulation on SURF points thus preserving good properties of local features i.e. the invariance with regard to affine transformation of image plane: rotation, translation and zoom.We use the graph features in the Bag-of-Visual-Words framework. The problem of distance or dissimilarity definition between graphs for clustering or recognition is obviously arisen. We propose a dissimilarity measure based on the Context Dependent Kernel of H. Sahbi and show its relation with the classical entry-wise norm when comparing trivial graphs (SURF points).The experiments are conducted on the first corpus in the world of wearable videos of IADL for HMM based activities recognition, and on publicly available academic datasets such as SIVAL and Caltech-101 for object recognition

NOUS AVONS ETUDIE L'IMPACT DE LA CONSOMMATION CHRONIQUE D'ALCOOL SUR PLUSIEURS MARQUEURS DE L'IMMUNITE, EN PARTICULIER SUR LA SYNTHESE DE CYTOKINES INFLAMMATOIRES. LA CAPACITE DE SYNTHESE DE L'IL-6 PAR LES MONOCYTES CIRCULANTS DE MALADES ALCOOLIQUES SANS HEPATOPATHIE SEVERE EST SIGNIFICATIVEMENT AUGMENTEE, MAIS PAS CELLE DU TNFα. UNE ATTEINTE DE LA CYTOTOXICITE CELLULAIRE A ETE RECHERCHEE PAR PLUSIEURS METHODES CHEZ DES MALADES SIMILAIRES. IL N'Y A PAS DE DIMINUTION DE SYNTHESE D'IFN-γ QUI SIGNERAIT UNE ATTEINTE DU PROFIL Th1. NOUS PENSONS TOUTEFOIS QU'UNE DIMINUTION DE LA CYTOTOXICITE CELLULAIRE EST TRES PROBABLE COMPTE TENU DES RESULTATS DE DEUX AUTRES ETUDES. TOUT D'ABORD, L'EXPRESSION DE PERFORINE, QUI EST UN COMPOSANT ESSENTIEL DU MECANISME CYTOTOXIQUE, EST DIMINUEE CHEZ CES MALADES. DE PLUS, LA DENSITE D'UN RECEPTEUR A CHIMIOKINE ASSOCIE AU PROFIL Th1, LE CCR5, EST ABAISSEE TANDIS QUE LA DENSITE DE CXCR4 (ASSOCIE AU PROFIL Th2) N'EST PAS MODIFIEE.

Les anomalies bucco-dentaires et crânio-faciales sont des manifestations phénotypiques des maladies rares. Ce doctorat combine les approches cliniques, précliniques et translationnelles en particulier par l’étude des modèles murins génétiquement modifiés reproduisant les maladies rares étudiées. Ce doctorat vise ainsi à identifier des gènes impliqués dans la morphogenèse et la signalisation inter-cellulaire en s’intéressant aux facteurs environnementaux et génétiques. Une étude détaille les effets d’un facteur d’environnement l’acide rétinoïque en excès sur du développement dentaire et la formation de l’émail. Les anomalies dentaires et de la formation de l'émail sont analysées dans des modèles murins, de maladies rares génétiques, inactivés pour Ltbp3 et Smoc2. Ces résultats permettent une meilleure compréhension du développement dentaire et crânio-facial, pourraient déboucher sur la mise au point et l’amélioration de traitements appropriés et de stratégies thérapeutiques applicables à la prise en charge de patients atteins de maladies rares. L’approche via les modèles murins des maladies rares est tout à fait pertinente pour suivre la régénération osseuse et les pathologies associées
The goal of this thesis is to investigate genetic and environmental factors, both initiating and influencing signaling centers that regulate tooth development and thus producing associated defects. Essentially, my research program utilizes patient-based rare disease phenotypes to create novel mouse models. This study also involved investigating the developmental effects of excess retinoic acid on enamel formation to gain understanding of the mechanisms by which environmental factors can alter enamel development. Other studies investigated enamel and dental anomalies in Ltbp3 and Smoc2 mutant mice. These results advance our understanding of tooth development, and may translate towards optimizing clinical diagnosis, and improving treatment strategies for several human rare diseases. An improved understanding of rare disease models and our testing of clinically relevant approaches using rodent models is a feasible approach to address bone degeneration problems

Les vascularites associées aux anticorps anticytoplasme des polynucléaires neutrophiles constituent un groupe d'affections auto-immunes systémiques rares. Sur le plan pathogénique l'essentiel des travaux s'est longtemps concentré sur les auto-anticorps et les cellules CD4. La démonstration récente de l'efficacité du rituximab montre que les cellules B jouent un rôle clé. Plusieurs arguments suggèrent qu'il soit non seulement lié aux auto-anticorps mais aussi à leur fonction de présentation antigénique aux cellules T. L'impact du rituximab sur les cellules T est cependant mal connu. Enfin, des données récentes suggèrent que les lymphocytes T CD8 participent également à l'entretien de la maladie. L'objectif de ce travail était de mettre à profit les évolutions thérapeutiques actuelles afin de comparer l'impact des traitements conventionnels et du rituximab sur les compartiments T, CD4 effecteur, régulateur (Treg) et CD8. Nous montrons qu'alors que les T CD4 et Treg sont comparables sous immunosuppresseurs et rituximab ces traitements ont des effets opposés sur la réponse CD8. Le rituximab limite l'expansion des cellules hautement différentiées CCR7-CD45RA+, et inhibe la production de cytokines pro-inflammatoires par les cellules CD8. Par ailleurs, nos résultats confirment l'impact de l'infection latente par le CMV sur le phénotype T des patients. Pour autant, celle-ci n'a pas d'influence sur la présentation clinique ni sur l'évolution de la maladie. L'étude de la coopération B/CD8 in vitro permettra de mieux en comprendre les mécanismes et possiblement d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques
Anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis are rare systemic auto-immune diseases. Until recently, research on pathogenesis mostly focused on auto-antibodies and CD4 T cells. However, due to the recent discovery of the efficacy of rituximab B cells have been shown to play a key role. Several clues suggest that these cells are involved not only act as autoantibody producers but also through antigen presentation to T cells. While recent data suggest that CD8 cells also contribute to the perpetuation of the disease, the impact of rituximab on T cells is still unknown. The objective of the present work was to take the advantage of the current therapeutic paradigm shift to compare the impact of conventional immunosuppressants and rituximab on CD4, regulatory and CD8 T cells. Herein we show that whereas CD4 and Treg compartments are comparable under conventional immunosuppressant and rituximab, these drugs have opposite effects on CD8 cells. Rituximab limits late differentiated effector memory CCR7-CD45RA+ cell expansion and pro-inflammatory cytokine production. We also confirm the impact of CMV status on patients' T cell phenotype. However, CMV per se has no impact on disease presentation and outcome. The analysis of B/CD8 cells interactions in vitro will illuminate the pathways that are involved and may point to new therapeutic targets

Une perturbation de la signalisation dopaminergique dans le striatum est à l’origine de troubles moteurs tels que la maladie de Parkinson (MP) ou de Huntington (MH). Une diminution de la signalisation par l’AR a été observée chez les patients atteints de troubles de la voie nigro-striée et dans des modèles de MH et MP. Nos données indiquent que l’AR synthétisé par RALDH1 et se liant au récepteur RARβ dans le striatum est nécessaire au maintien du système nigro-strié. Une perturbation de cette signalisation entraîne une diminution de l’activité mitochondriale qui conduit à une augmentation du stress oxydatif puis à l’entrée en apoptose de la cellule. Il en résulte des troubles moteurs de type MH et MP. Le rétablissement du niveau striatal de l’AR et la stimulation de RARβ par un agoniste spécifique permettent de prévenir ces phénotypes. Nos travaux nous permettent de proposer RARβ comme une nouvelle cible thérapeutique potentielle dans le cadre des neurodégénérescences de type MH et MP
A disturbed dopaminergic signaling in the striatum leads to motor disorders such as Huntington’s (HD) and Parkinson’s (PD) diseases. A decrease of the retinoic acid (RA) signaling is observed in patients presenting disorders of the nogro-striatal pathway as well as in HD and PD models. Our data indicate that RALDH1-synthesized RA that binds the receptor RARβ in the striatum is essential to maintain the nigro-striatal system. A disturbance in this RA signaling leads to a decreased mitochondrial respiration, an increased oxidative stress and an increased apoptosis in the dorso-lateral striatum. This cellular alterations lead to HD-like and PD-like motor disorders A rescue of the striatal RA level or the stimulation of RARβ by a specific agonist prevent this phenotypes. Our work allow us to point at RARβ as a new potential therapeutic target for neurodegenerescences like HD and PD

Cette thèse a pour premier objectif d'obtenir une vision physiologique globale et la plus réaliste possible des différents ichtyosarcotoxismes présents sur le territoire polynésien. En plus de témoigner de la co-évolution d'ichtyosarcotoxismes toxicologiquement distincts, cette étude révèle une forte proportion de signes neurologiques, témoignant dans certains cas, d'une possible action centrale des toxines impliquées, dans d'autres, d'une possible implication de phénomènes auto-immuns. Ainsi, nous proposons par la suite, de considérer les toxines marines comme déclencheurs potentiels d'un processus dysimmunitaire dirigé contre le système nerveux périphérique, ce mécanisme étant susceptible d'expliquer l'apparition, chez certains patients, d'atteintes neurologiques périphériques chroniques. Si la présence de ces dernières fut caractérisée au plan électrophysiologique en revanche, la piste immunologique, à travers la recherche d'auto-anticorps neuronaux, n'a pu être mise en évidence
This thesis has for first aim to obtain a general, realistic and pathophysiological view of the different ichtyosarcotoxisms present on the Polynesian territory. In addition to give evidence of the co-evolution of different ichtyosarcotoxisms toxicologically distinct, this work has permitted to reveal a high proportion of neurological signs, possibly testifying, in some cases, of a central action of implicated toxins and also of immune disturbances in other cases. Therefore, we propose in second part, to consider marine toxins as potential activators of an auto-immune process directed against peripheral nerve system, possibly responsible of chronic neurological disturbances observed in some intoxicated patients. If discreet chronic neurological injuries have been electrophysiologically established, however, the auto-immune hypothesis, explored through the research of neuronal auto-antibodies, has not been confirmed

Les tauopathies, y compris la maladie d'Alzheimer, sont caractérisées par des dépôts de protéine tau anormale, appelés dégénérescences neurofibrillaires (DNF). Bien qu’il y ait une corrélation entre la présence de DNF, la perte neuronale et le déclin cognitif, le rôle exact des filaments de tau reste controversé. Pour comprendre le lien entre DNF et mort neuronale, nous avons développé une méthode d’observation des DNF dans le cerveau vivant de souris à travers une fenêtre crânienne. Nous avons employé la souche rTg4510 qui porte le transgene humain tau P301L, et caractérisée par le développement de DNF et de perte neuronale. Nous proposons un nouveau modèle dans lequel la protéine tau phosphorylée soluble est la forme toxique, l’activation de caspase accélère l’agrégation de tau, tau normale est également recrutée dans les agrégats, et la formation des DNF ne conduit pas à la mort neuronale immediate. Le mécanisme de propagation de la pathologie de tau dans le cerveau est toujours inconnu. Chez les patients Alzheimer, la pathologie de tau apparaît d'abord dans le cortex d'entorhinal, avant de se propager à l’hippocampe puis au cortex entier. Nous avons visé à comprendre la diffusion de la pathologie de tau en développant un modèle de souris transgéniques dans lequel l’expression de tau humain P301L est limitée au cortex entorhinal. Notre modèle recréé la progression des dépôts de façon hiérarchique, du cortex d'entorhinal aux secteurs de la mémoire. La détermination du rapport entre DNF et mort neuronale, et l'identification des mécanismes de propagation de la maladie, engendrent de futures directions pour le développement des stratégies thérapeutiques appropriées.

Le stress oxydant est souvent augmenté dans plusieurs maladies comme des maladies liées à l’âge (maladies cardiovasculaires, maladies oculaires (dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) et cataracte), des maladies neurodégénératives (Maladie d’Alzheimer, sclérose en plaques), des maladies inflammatoires chroniques (maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI)) ainsi que certaines maladies génétiques rares (maladie de Niemann Pick, adrénoleucodystrophie liée à l’X (X-ALD)). Le stress oxydant peut oxyder différentes molécules, notamment le cholestérol présent dans les membranes lipidiques, et conduire à la formation de dérivés oxydés du cholestérol : les oxystérols. Certains d’entre eux, comme le 7-cétocholestérol (7KC), sont toxiques et peuvent être à l’origine d’un type de mort cellulaire, l’oxyapoptophagie, associant une élévation du stress oxydant, une activation de l’apoptose à des critères d’autophagie. En utilisant des oligodendrocytes murins 158N, ce travail a permis de mieux caractériser, l’oxyapoptophagie induite par le 7KC. La toxicité du 7KC sur les organites cellulaires comme la mitochondrie et le lysosome a été confirmée. Ce travail montre aussi que l’oxyapoptophagie est associée à des modifications topographiques, morphologiques et fonctionnelles du peroxysome. Il a été montré que le 7KC induit une diminution de l’expression et de l’activité de certains transporteurs peroxysomaux (ABCD1, ABCD3) et enzymes peroxysomales (ACOX1, MFP2, catalase) et favorise une accumulation d’acides gras à très longue chaine (C24:0, C24:1 et C26:0, C26:1) dégradés au niveau du peroxysome. Il a aussi été démontré que certains lipides (α-tocophérol, acide α-linolénique (ALA), acide éïcosapentaénoïque (EPA), acide docosahéxaénoïque (DHA), acide oléique (AO), huile de Lorenzo (acide oléique + acide érucique (4:1)) et le sulfo-N-succinimdyl oleate (SSO)) sont cytoprotecteurs et atténuent fortement l’oxyapoptophagie induite par le 7KC. Ceci permet d’envisager la prévention ou le traitement les maladies associées à des taux élevés de 7KC, en particulier certaines maladies liées à l’âge qui ne disposent pas de traitements efficaces
Oxidative stress is often increased in several diseases such as age-related diseases (cardiovascular diseases, eye diseases (age-related macular degeneration (AMD) and cataracts), neurodegenerative diseases (Alzheimer's disease, multiple sclerosis), chronic inflammatory diseases (chronic inflammatory bowel disease (IBD)) as well as certain rare genetic diseases (Niemann Pick's disease, X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD)). Oxidative stress can oxidize various molecules, in particular the cholesterol present in lipid membranes, and lead to the formation of oxidized cholesterol derivatives: oxysterols. Some of them, such as 7-ketocholesterol (7KC), are toxic and may be the cause of a type of cell death, oxiapoptophagy, associating an increase in oxidative stress, activation of apoptosis and autophagic criteria. Using 158N murine oligodendrocytes, this work has allowed to better characterize the oxiapoptophagy induced by 7KC. The toxicity of 7KC on cellular organelles such as mitochondria and lysosome was confirmed. This work also shows that oxyapoptophagy is associated with topographic, morphological and functional modifications of the peroxisome. It has been shown that 7KC induces a decrease in the expression and activity of certain peroxisomal transporters (ABCD1, ABCD3) and peroxisomal enzymes (ACOX1, MFP2, catalase) and promotes an accumulation of very long-chain fatty acids (C24:0, C24:1 and C26:0, C26:1) degraded in the peroxisome. It has also been shown that certain lipids (α-tocopherol, α-linolenic acid (ALA), eicosapentaenoic acid (EPA), docosahexaenoic acid (DHA), oleic acid (AO), Lorenzo's oil (oleic acid + erucic acid (4: 1)) and sulfo-N-succinimdyl oleate (SSO)) are cytoprotective and strongly attenuate 7KC-induced oxyaptophagy. This makes it possible to envisage the prevention or treatment of diseases associated with high levels of 7KC, in particular certain age-related diseases for which there are no effective treatments

L'appréciation de l'importance du stress oxydant rend nécessaire l'utilisation de différents marqueurs. Des problèmes de sensibilité et de spécificité rendent ce choix délicat. La quantification des F2-isoprostanes, produits spécifiques de la peroxydation lipidique, représente une avancée importante pour disposer d'un outil clinique dans ce domaine. Nous avons développé des techniques de dosages immunologiques et des techniques de spectrométrie de masse. Ces techniques ont été appliquées pour évaluer la place du stress oxydant dans des situations cliniques. Tout d'abord pour évaluer l'effet d'une supplémentation en extrait hydrosoluble d'huile d'olive riche en hydroxytyrosol (HT) chez des patients diabétiques de type 1 sans complications vasculaires. Nous avons mis en évidence une diminution de la production de TXB2 impliqué dans l'agrégation plaquettaire et par conséquent un intérêt pour la prévention des complications vasculaires. Toutefois le dosage des F2-Isoprostanes ne montre pas d'effet antioxydant. Nous nous sommes ensuite intéressés à la place de l'hyperglycémie chez des patients diabétiques de type 2. La production des F2-Isoprostanes urinaires est corrélée à l'hyperglycémie post prandiale et plus encore aux fluctuations de glucose. Ces résultats suggèrent que la prise en charge de ces patients doit tenir compte à la fois des hyperglycémies chronique et post-prandiale mais aussi des variations de glucose. Dans un deuxième axe, nous nous sommes intéressés aux relations entre le stress oxydant, le vieillissement et la maladie d'Alzheimer. L'Apolipoprotéine E4, facteur de risque de la maladie d'Alzheimer est une cible préférentielle du stress oxydant. Il y a des discordances entre le résultat du génotypage et du phénotypage qui sont en partie attribuées à des dommages oxydatifs. Nous avons ensuite exploré les interactions entre le métabolisme lipidique, les antioxydants lipophiles et le polymorphisme de l'ApoE. Nos résultats montrent la disparition de l'effet hypercholestérolémiant de l'Apo E4 chez le DTA avec conservation du rapport vitamine E/lipides. Cette dysrégulation de l'homéostasie du CT observée au niveau systémique pourrait être présente dans le cerveau. Une supplémentation en antioxydant lipophile peut être envisager pour augmenter les rapports antioxydants lipophiles/lipides et favoriser l'incorporation cérébrale. Dans cette perspective, nous avons développé un projet de supplémentation chez des volontaires sains âgés pour évaluer l'impact d'un traitement antioxydant (vitamine E/C ou Ginkgo biloba) vs placebo. Les résultats de cette étude suggèrent que l'effet d'une supplémentation en antioxydant ne peut être évalué biologiquement qu'en présence d'un stress oxydant.

Les erreurs innées du métabolisme (EIM) constituent un large panel de désordres métaboliques héréditaires. Parmi les EIM, les anomalies de la neurotransmission peuvent affecter, entre autres, la synthèse ou le transport des neurotransmetteurs, notamment les amines biogènes (dopamine et sérotonine) et les folates. La reconnaissance de ces affections est d’une importance capitale pour le diagnostic et le traitement éventuel. L’analyse chimique du liquide céphalo-rachidien (LCR) est incontournable pour le diagnostic de ces pathologies. Or, les méthodes actuelles de dosage ne sont pas simples. Longues et fastidieuses, elles ont été, pendant longtemps, réservées aux laboratoires spécialisés. L’objectif de ce travail était de développer des méthodes simples et rapides de diagnostic des troubles de la neurotransmission et d’établir les valeurs normales fréquentes dans la population française. Le travail réalisé a permis, dans un premier temps, de développer une méthode de dosage directe, en une seule étape, de la tetrahydrobioptérine (BH4), cofacteur des hydroxylases intervenant dans la synthèse des amines biogènes, et des ptérines impliquées dans le cycle de synthèse et de dégradation de ce cofacteur, dans le LCR. Auparavant, le dosage de ces substances nécessitait au moins deux analyses chromatographiques précédées chacune d’une étape propre de préparation de l’échantillon. Par la suite, nous avons développé une méthode de diagnostic rapide, en moins de 10 minutes, par UHPLC (chromatographie liquide à ultra haute performance), couplée à une détection séquentielle par coulométrie et par fluorescence, des troubles dopaminergique et sérotoninergique. Cette méthode permet de doser simultanément, en une seule étape, tous les métabolites de la dopamine, de la sérotonine et de la noradrénaline, ainsi que les ptérines d’intérêt diagnostic, principalement la dihydroneoptérine (NH2) et la dihydrobioptérine (BH2). L’ensemble de ces explorations nécessitait, auparavant, la mise en œuvre d’au moins trois méthodes de dosage par HPLC (chromatographie liquide à haute performance), précédées chacune d’une étape propre de préparation de l’échantillon. Pour compléter l’exploration du métabolisme de la BH4 et du suivi thérapeutique des troubles de la neurotransmission, nous avons également proposé une méthode de dosage rapide, en une seule étape, par UHPLC, de tous les métabolites et de toutes les ptérines, incluant la BH4. Enfin, une méthode rapide de dosage (moins de 2 minutes), par UHPLC, du 5-méthyltetrahydrofolate dans le LCR a été développée, afin de compléter le diagnostic biologique de l’ensemble des troubles neurologiques visés. L’application des outils ainsi développés à plus de 1400 patients nous a permis d’établir des valeurs normales fréquentes dans la population française ainsi que de poser le diagnostic de quelques déficits enzymatiques
Inborn errors of metabolism (IEM) consist of a wide range of hereditary metabolic disorders. Among IEM, neurotransmission anomaly can affect the synthesis or the transport of neurotransmitters, notably biogenic amines (dopamine and serotonin) and folates. Early diagnosis of such affections is of utmost importance especially as some of them can be treated effectively. Chemical analysis of cerebrospinal fluid (CSF) is essential for the diagnosis of neurotransmitter disorders; however, current quantitative methods are tedious and time consuming. For a long time the chemical diagnosis of neurotransmitter disorders has been available only in specialized laboratories. The purpose of this work was to develop simple and fast diagnosis methods of neurotransmitter disorders as well as to establish the reference values in French population. For this purpose, in a first step, we developed a single step direct method of simultaneous quantification of tetrahydrobiopterin (BH4), which is the main cofactor of the hydroxylases involved in biogenic amines syntheses, and the relevant reduced and oxidized forms of pterins involved in the cycle of synthesis – regeneration of BH4. Formerly, the quantification of those compounds required at least two chromatographic methods with two specific sample preparation procedures. Thereafter we developed a method of fast diagnosis in less than 10 minutes of dopaminergic and serotoninergic disorders using UHPLC (ultra high performance liquid chromatography) hyphenated to a sequential coulometric and fluorimetric detection. With only a simple filtration step as sample preparation procedure, this method enables the simultaneous quantification of all dopamine, serotonin and noradrenaline metabolites as well as dihydroneopterin (NH2) and dihydrobiopterin (BH2), the relevant pterin forms for the complete diagnosis. Formerly, at least three HPLC (high performance liquid chromatography) quantification methods preceeded by three tedious specific sample preparation procedures were required for such a diagnosis. To complete the investigation of BH4 metabolism and the follow up of neurotransmission disorders, we also developed a fast UHPLC method of simultaneous quantification of all the cited metabolites and pterins including BH4. In order to complete the rapid diagnosis of all targeted neurological disorders, we finally developed an UHPLC method of 5-methyltetrahydrofolate quantification in CSF. The application of these analytical tools in more than 1400 CSF samples, collected from patients followed in some Neurology centers located in several French areas covering nearly the entirety of the territory, allowed us to establish the reference values in French population as well as to diagnose several cases of enzymatic deficits

La pharmaco-résistance des épilepsies du lobe temporal serait étroitement liée à une perte de neurones dans l’hippocampe qui pourrait résulter d’une inflammation. Chez le rat soumis à une épileptogenèse expérimentale, nous avons caractérisé la réponse inflammatoire de l’hippocampe. Celle-ci précède la mise en place de la neurodégénérescence et consiste en une forte production de cytokines pro-inflammatoires par la microglie activée ainsi qu’en une infiltration de monocytes/ macrophages. La progression des monocytes dans le parenchyme cérébral serait facilitée par la dégradation des chaînes de sulfate d’héparane qu’ils portent à leur surface, sous l’action de l’héparanase, spécifiquement exprimée par les neurones. Il se pourrait que le blocage des sites de liaison de l’héparanase aux chaînes de sulfate d’héparane réduise l’infiltration cérébrale des monocytes, et permette de prévenir la dégénérescence neuronale associée aux épilepsies
Intractable temporal lobe epilepsy may be consecutive to the loss of neurons in the hippocampus. In this brain area, neurodegeneration may be induced by inflammatory processes. Using a rat model of epileptogenesis, we characterized the inflammatory response in the hippocampus, that we show to precede neurodegeneration. We evidenced a high induction of proinflammatory cytokine concentration, mainly in cells corresponding to activated microglia and to monocytes which infiltrated the hippocampal parenchyma. Degradation of heparan sulfate chains present at the surface of monocytes by neuronal heparanase may promote their progression in the brain parenchyma. Blockade of the linkage site of heparanase on heparan sulfate chains could reduce brain infiltration of monocytes and then prevent neurodegeneration associated to epilepsy

Des phénomènes d’oxydo-réduction sont impliqués dans les mécanismes physiologiques et pathologiques touchant la sphère cardiovasculaire. L’objectif de notre travail a été de préciser le rôle potentiel joué par les neurotrophines dans des situations physiopathologiques connues pour être associées à une majoration du stress oxydant. Dans une première partie de notre travail, nous avons abordé l’implication du BDNF et du NGF, dans une situation clinique particulière : la chirurgie cardiaque sous circulations extracorporelles. Ce travail a permis de montrer une forte corrélation entre les niveaux plasmatiques de BDNF et les désordres Redox et inflammatoires rencontrés dans ces situations, suggérant un lien possible entre l’augmentation de production d’espèces radicalaires et l’augmentation des niveaux de BDNF. La seconde partie de notre travail a consisté en une approche expérimentale de l’implication des neurotrophines dans l’installation et le développement cardiovasculaire de maladies chroniques. Notre étude précise que le BDNF et le stress oxydatif sont impliqués dans les réactions cellulaires de la paroi vasculaire des rats SHR avant même l’apparition de l’hypertension chez ces animaux. Ces augmentations sont associées à une libération de MCP-1 marquant l’initiation d’un processus inflammatoire chronique. Restent à préciser les mécanismes cellulaires qui sont susceptibles d’être influencés par des variations en BDNF. Plusieurs cellules de la paroi vasculaire possèdent des récepteurs au BDNF en particulier l’endothélium. Il serait alors intéressant de préciser l’impact de la stimulation de ces récepteurs sur la modulation des facteurs vasorégulateurs issus de l’endothélium
Redox phenomena are involved in mechanisms occurring in cardiovascular system. The aim of this work was to precise potential part played by neurotrophins in pysiopathological situations known to be associated with enhancement of oxidative stress. In a first part of this work, BDNF and NGF involvement was studied in a particular clinical situation: cardiac surgery under cardiopulmonary bypass. This study showed a strong correlation between the plasmatic levels of BDNF and Redox and inflammatory disorders, suggesting a possible link between an increase in radical species production and an increase in BDNF levels. The second part of this work was an experimental study of neurotrophins involvement in cardiovascular installation and development of chronic diseases. This study précised that BDNF and oxidative stress are involved in cellular reactions observed in the vascular wall of the SHR rats, even before hypertension occurs. These increases were associated with MCP-1 release, proof of a chronic inflammatory process. Cellular mechanisms, which may be induced by variations in BDNF levels, are still to be elucidated. Several cells in vascular wall express BDNF receptor, particularly endothelial cells. It would be interesting to precise the impact of these receptors stimulation on vasoregulation factors from endothelium

Le gène RNF213 a été identifié comme un facteur de risque associé au développement de maladies cérébrovasculaires (MCV) notamment, la maladie de Moyamoya (MMM) et les anévrismes intracrâniens (AIC). Malgré une incompréhension des fonctions biologiques exactes, la ring finger protein 213 (RNF213) serait impliquée dans la régulation de la prolifération cellulaire, de l’angiogenèse et de l’inflammation. Les travaux présentés dans cette thèse se concentrent sur le développement de modèles vasculaires in vitro afin de mieux caractériser le rôle de RNF213 dans MCV. L’hypothèse est que l’invalidation de la protéine RNF213 dans des cellules endothéliales (CE) cerébrales pourrait recréer certains phénotypes associés au développement de la MMM et à la formation d’AIC. Des cellules endothéliales microvasculaires humaines de cerveau (hCMEC/D3) invalide en RNF213 (RNF213-/- ) ont été initialement générées par la méthode Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats et la protéine associée Cas9 (CRISPR-Cas9) double nickase. La première partie des travaux porte sur le rôle que jouerait RNF213 dans l’homéostasie de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et dans les étapes précoces de la pathogenèse associée à la MMM. Plus précisément, la perte des jonctions adhérentes provoquée par l’invalidation de RNF213 dans les hCMEC/D3 a été évaluée in vitro sur plusieurs paramètres, tels que la morphologie endothéliale, l’expression génique des protéines de jonctions, la localisation cellulaire, la perméabilité, l’infiltration immunitaire et le sécrétome des cytokines inflammatoires. Les résultats ont démontré que la déficience en RNF213 provoque une diminution de l’expression de la platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (PECAM-1) qui affecte conséquemment la formation adéquate du complexe jonctionnel. De plus, une diminution de l’expression des gènes de la claudine-5, de la b-caténine et de la plakoglobine a été mesurée. La perte de RNF213 est également accompagnée d’un relargage de plusieurs cytokines proinflammatoires. En deuxième lieu, les travaux de cette thèse ont également démontré que RNF213 joue un rôle prépondérant dans le processus angiogénique des hCMEC/D3. Ceci a été étudié sous plusieurs angles d’approches, tels que la prolifération et la migration cellulaire, la formation de micro-capillaires sur un support Matrigel® et dans un modèle tridimensionnel (3D) reconstruit par génie tissulaire, l’expression génique et le sécrétome angiogénique. Les résultats ont démontré une diminution du taux de division cellulaire et une augmentation de la migration. Les études in vitro ont démontré également, pour la première fois, une augmentation significative de la formation de micro-capillaires et de la sécrétion abondante de facteurs pro-angiogénique, tels que le vascular endothelial growth factor (VEGF). Plus précisément, les hCMEC/D3 déficientes en RNF213 forment un réseau plus vaste, dense et étendu de micro-capillaires sur un support de Matrigel®. iii Lorsqu’ensemencées dans un modèle 3D plus complexe structurellement, les hCMEC/D3 forment un réseau pouvant s’apparenter au réseau de capillaires compensatoire retrouvé chez les patients MMM. Dans l’ensemble, l’invalidation du gène RNF213 dans un modèle in vitro 3D de cellules endothéliales cérébrales permet de reproduire certains phénotypes pathologiques de la MMM et devient donc ainsi le 1er modèle in vitro pour l’étude de cette maladie et des autres maladies associées à RNF213. Finalement, nous avons mis au point un nouveau modèle de vaisseaux sanguins de petit calibre reconstruit par génie tissulaire (TEBV) pour son utilisation dans l’étude in vitro de maladies vasculaires et de MCV complexes. L’ensemencement de fibroblastes ou de cellules musculaires lisses (CML) directement sur un mandrin de polyéthylène téréphtalate glycol (PETG) prétraité aux rayons ultraviolets C (UV-C) a permis de former des feuillets circulaires, manipulables et superposables. Avec cette technique, nous avons généré des TEBV complets avec les trois principales couches, soit l’adventitia, la media et l’intima tunica, qui possèdent des propriétés histologiques et mécaniques similaires aux artères humaines natives. Ce modèle optimisé et uniformisé de TEBV permettra de modéliser des pathologies vasculaires complexes, telles que la MMM et les AIC. En effet, la génération de vaisseaux complets à partir de cellules pathologiques ou de cellules éditées génétiquement pourrait faciliter la caractérisation de la pathogenèse et aider au développement de médicaments.
RNF213 has been associated as a susceptibility gene for the development cerebrovascular diseases (CVDs), in particular, moyamoya disease (MMD) and intracranial aneurysms (ICA). While the exact biological functions of RNF213 remain to be demonstrated, it is known to be involved in the regulation of cell proliferation, angiogenesis and inflammation. The work presented in this thesis focuses on the development of vascular models in vitro to better characterize the role of RNF213 in CVDs. The hypothesis is that the complete invalidation of the RNF213 protein in brain endothelial cells (EC) could recreate evident phenotypes associated with the development of MMD and the formation of ICA. We have initially generated human brain microvascular endothelial cells (hCMEC/D3) deficient in RNF213 (RNF213-/- ) using the robust CRISPR-Cas9 double nickase method. At first, our work described the role that RNF213 would play in the homeostasis of the blood-brain barrier (BBB) maintenance and in the early stages of MMD pathogenesis. More specifically, the loss of adherent junctions caused by the invalidation of RNF213 in hCMEC/D3 was evaluated in vitro on several parameters, such as endothelial morphology, gene expression of junctional proteins, cellular localization, permeability, immune infiltration and the secretome of inflammatory cytokines. Our data demonstrated that RNF213 deficiency provokes a significant decrease in the platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (PECAM-1) expression, which consequently affects the proper formation of the junctional complex. A decrease in the expression of the claudin-5, b-catenin and plakoglobin genes was also measured. In addition, RNF213 loss is accompanied with a release of several pro-inflammatory cytokines. Thereafter, the present work also demonstrated that RNF213 plays a preponderant role in the angiogenic process of hCMEC/D3. Angiogenesis has also been characterized on several aspects, such as proliferation, migration, formation of micro-capillaries on a Matrigel®-based support and in a 3D model reconstructed by tissue engineering, gene expression and secretion of angiogenic factors. Our data demonstrates a decrease in cell division rate and an increase in cell migration. In vitro studies have also shown, for the first time, a significant increase in micro-capillary formation and abundant secretion of pro-angiogenic factors, such as the vascular endothelial growth factor (VEGF). More precisely, the hCMEC/D3 deficient in RNF213 forms a wider, denser and more extensive network of micro-capillaries on a Matrigel®-based support. When seeded in a more structurally complex 3D model, hCMEC/D3 form a network that can resemble to the compensatory capillary network found in MMM patients. Overall, the invalidation of the RNF213 gene in a 3D in vitro model of cerebral endothelial cells makes it possible to reproduce certain pathological phenotypes of MMM and v therefore becomes the 1st in vitro model for the study of this disease and other diseases associated with RNF213. Finally, we developed a new model of small-caliber blood vessels reconstructed by tissue engineering (TEBV) to be used to study vascular diseases and complex CVD in vitro. The direct seeding of fibroblasts or smooth muscle cells (CML) onto a polyethylene terephthalate glycol (PETG) mandrel that was pretreated with ultraviolet C (UV-C) radiation facilitate the formation of circular cell sheets, which could be manipulated and stacked in top of each other. Using this novel technique, we were able to successfully generate complete TEBVs with the three main arterial layers: the adventitia, the media and the intima tunica. Taken together, our TEBV model has histological and mechanical properties similar to native human arteries. Furthermore, this optimized and standardized 3D vascular construct will accelerate the scientific progress to modelized complex vascular pathologies, such as MMD and AIC. Indeed, the generation of complete vessels derived from pathological cells or genetically edited cells could facilitate the characterization of pathogenesis and help in the development of drugs.

Introduction :Les pays à bas et moyens revenus (PBMR) traversent une phase de transition nutritionnelle qui s’accompagne d’un accroissement rapide des pathologies cardio-métaboliques et de leurs facteurs de risque, à l’instar de l’obésité chez l’adulte, alors que la sous-nutrition prédomine encore largement chez l’enfant dans ces régions. Ce double fardeau de malnutrition constitue un problème majeur de santé publique. D’après la théorie des origines développementales des maladies chroniques non transmissibles (MNT), ces 2 fardeaux seraient étroitement liés de manière causale. L’objectif de notre étude était de retracer ses sujets avec antécédents de malnutrition aiguë sévère (MAS) durant l’enfance, d’évaluer leur devenir à long terme sur le plan socio-économique, cognitif et sanitaire, et enfin de rechercher les différents marqueurs cardio-métaboliques des MNT. Tout cela en vue d’établir une association entre MAS durant l’enfance et différentes MNT (Hypertension, diabète, obésité, dyslipidémies et composition corporelle) ainsi qu’avec le statut sociodémographique et économique à l’âge adulte, dans un contexte sans transition nutritionnelle.Méthodologie :Les dossiers de sujets admis pour MAS entre 1988 et 2007 ont été extraits des archives de l'hôpital pédiatrique de Lwiro (HPL), au Sud-Kivu, en République Démocratique du Congo (RDC). Entre décembre 2017 et avril 2019, nous avons entrepris d'identifier ces sujets dans les zones de santé de Miti-Murhesa et Katana. Les sujets d’étude ont été identifiés à partir de la base de données de l'HPL. Ils ont ensuite été recherchés dans leurs villages d’origine. Ils ont alors été répartis en quatre catégories (vivant dans le village ou ses environs, décédé, déplacé ou perdu de vue). Pour chaque ancien malnutri retrouvé, un non-exposé communautaire a été choisi de manière aléatoire pour une comparaison. Nos résultats d’intérêt étaient prioritairement les MNT incluant le syndrome métabolique, l’hypertension artérielle, l’obésité globale, l’obésité viscérale, le diabète sucré, les dyslipidémies ainsi que la composition corporelle évaluées par leurs différents marqueurs cliniques et biologiques et, accessoirement, l’atteinte rénale à travers le taux de créatinine sérique. Secondairement, nous avons évalué le capital humain à travers le niveau socio-économique (déduit à partir de la scolarité, la profession et les conditions de vie), l’estime de soi, les troubles cognitifs ainsi que les incapacités quotidiennes sur le plan relationnel et fonctionnel liés à l’état de santé. Il est signalé cependant qu’au moment de la reconstitution de la cohorte, nous avons récolté des données relatives à la survie (et son corolaire la mortalité et ses causes) ainsi que l’état nutritionnel à long terme.Résultats :Un total de 1981 dossiers des sujets admis pour MAS de 1988 à 2007 a été extrait des archives de l’HPL. L’âge médian à l’admission était de 41 mois. Six cents sujets ont été retrouvés et 201 sujets sont décédés. Soixante-cinq virgule six pourcents des sujets décédés avaient ≤10 ans lors de leur mort. Cinquante-neuf virgule deux pourcents de décès sont survenus dans les 5 ans ayant suivi la sortie de l’hôpital. Les principales causes de décès étaient le paludisme (14,9%), le kwashiorkor (13,9%), les infections respiratoires (10,4%) et les maladies diarrhéiques (8,9%). Comparés aux non exposés, les exposés avaient un faible poids (-1,7 kg, p=0,001), une petite taille [assise (-1,3 cm, p=0,006) et debout (-1,7 cm, p=0,003)], une longueur moindre des jambes (-1,6 cm, p=0,002) et un petit périmètre brachial (-3,2 mm, p= 0,051). Aucune différence n’a été observée en termes d’indice de masse corporelle (IMC), de longueur thoracique, et de périmètre crânien ou thoracique entre les 2 groupes.En termes de composition corporelle, les exposés, comparés aux non exposés, avaient une masse maigre réduite [-1,56 kg (-2,93, -0,20) ;p=0,024] mais cette observation était plus marquée chez les hommes (45,4 5,4 vs. 48,26,9 kg, p=0,01) que chez les femmes. En revanche, aucune différence entre exposés et non exposés n'a été observée en termes de masse grasse. Enfin, en ajustant pour la taille, l’index de masse maigre et l’index de masse grasse n’a montré aucune différence dans les deux groupes indépendamment du sexe.Sur le plan capital humain, comparés aux non exposés communautaires, la proportion avec niveau d’études et niveau socio-économique (NSE) élevés d’anciens malnutris était diminuée [niveau études (35,2 vs 46,4 ;p  0.) ;NSE (3,0 vs 6,7 ;p= 0,007)]. En plus, sur le plan cognitif et estime de soi, comparés aux non-exposés, les anciens malnutris avaient des scores inférieurs aux tests cognitifs [25.6 vs 27.8, p = 0.001 [Mini Mental State Examination (MMSE)] et 22.8 vs 26.3, p < 0.001(MMSE-I)] et avaient une moindre estime d’eux-mêmes (20,3% vs 12,3% ;p = 0.003). Néanmoins, en termes d’incapacités liées à l’état de santé, ces derniers avaient moins d’incapacités au plan relationnel (28,6 vs 31,5 ;p = 0.034) que la population générale, quoiqu’aucune différence n’ait été observée au plan des activités quotidiennes (5,8 vs 9,1 ;p = 0.322)En termes de MNT, comparés aux non exposés communautaires, les anciens malnutris avaient un tour de taille majoré [+1.2 (0.02,2.3) cm, p=0.015] et ratio tour de taille/taille debout supérieur [0.01 (0.01, 0.02) cm; p0.001]. Par contre, ils avaient un tour de hanches diminué [-1.5 (-2.6, -0.5) cm; p=0.021], et une force musculaire réduite. Concernant les marqueurs cardio-métaboliques de MNT, hormis une HbA1c plus élevée [+0.4 (0.2, 0.6)%; p0.001], aucune différence n’a été mise en évidence concernant la pression artérielle, la glycémie à jeun, la créatinine, le profil lipidique et l’albuminémie chez les exposés par rapport aux non exposés. En comparaison des non exposés, les exposés avaient une prévalence accrue de syndrome métabolique [Odds Ratio (OR) 2.35 (1.22, 4.54); p=0.010], d’obésité viscérale [OR ajusté 1.44 (1.09, 1.89); p=0.001] et de maigreur [OR ajusté 1.92 (1.03, 3.57)]. En revanche, la prévalence d’hypertension, de diabète, de surpoids et de dyslipidémie était similaire dans les deux groupes.Conclusion :Une MAS durant l’enfance expose les survivants à un risque élevé de MNT et à une diminution du capital humain à l’âge adulte, même en l’absence de transition nutritionnelle subséquente. Les décideurs politiques et les bailleurs de fonds souhaitant lutter contre l'expansion mondiale des MNT chez l’adulte pourraient considérer le bénéfice à long terme de la réduction de la MAS dans l’enfance en tant que mesure préventive de réduction du fardeau attribuable aux MNT au plan socio-économique.
Introduction: Low- and middle-income countries are going through a nutritional transition phase that is accompanied by a rapid increase in cardio-metabolic diseases and their risk factors, such as obesity in adults, while undernutrition still predominates in children in these regions. This double burden of malnutrition constitutes a major public health problem. According to the theory of developmental origins of chronic noncommunicable diseases (NCDs), these 2 burdens would be closely causally linked. The objective of our study was to trace subjects with a history of severe acute malnutrition (SAM) in childhood, to assess their long-term socioeconomic, cognitive, and health outcomes, and finally to investigate the different cardiometabolic markers of NCDs. All this was done in order to establish an association between SAM during childhood and different chronic non-communicable diseases (hypertension, diabetes, obesity, dyslipidemias and body composition) as well as with socio-demographic and economic status in adulthood, in a context without nutritional transition.Methodology: Records of subjects admitted for SAM between 1988 and 2007 were retrieved from the archives of Lwiro Hospital, South Kivu, Democratic Republic of Congo (DRC). Between December 2017 and April 2019, we undertook to identify these subjects in the Miti-Murhesa and Katana health zones. Study subjects were identified from the Lwiro Pediatric Hospital (LPH) database. They were then traced to their home villages. They were then divided into four categories (living in or near the village, deceased, displaced, or lost to follow-up). For each former malnourished found, a community non-exposed was randomly selected for comparison. Our outcomes of interest were primarily NCDs including primarily metabolic syndrome, arterial hypertension, global obesity, visceral obesity, diabetes mellitus, dyslipidemias as well as body composition assessed by their different clinical and biological markers and, secondarily, renal impairment through serum creatinine level. Secondly, we evaluated the human capital through the socio-economic level (deduced from the education, the profession and the living conditions), the self-esteem, the cognitive disorders as well as the daily disabilities on the relational and functional level related to the health condition. It should be noted, however, that at the time of reconstitution of the cohort, we collected data on survival (and its corollary, mortality and its causes) and long-term nutritional status.Results: A total of 1981 records of subjects admitted for SAM from 1988 to 2007 were retrieved from the archives of the LPH. The median age at admission was 41 months. Six hundred subjects were found and 201 subjects died. 65.6% of the deceased subjects were ≤10 years of age at death. 59.2% of deaths occurred within 5 years of hospital discharge. The leading causes of death were malaria (14.9%), kwashiorkor (13.9%), respiratory infections (10.4%), and diarrheal diseases (8.9%). Compared to the unexposed, the exposed had low weight (-1.7 kg, p=0.001), short stature [sitting (-1.3 cm, p=0.006) and standing (-1.7 cm, p=0.003)], shorter leg length (-1.6 cm, p=0.002), and small brachial circumference (-3.2 mm, p= 0.051). There were no differences in BMI, chest length, and head or chest circumference between the 2 groups.In terms of BC, exposed, compared to unexposed, had a reduced FFM [-1.56 kg (-2.93, -0.20); p=0,024] but this observation was more marked in exposed males (45.4  5.4 vs. 48.2 6.9 kg, p=0.01) than females compared to unexposed. However, no difference between exposed and unexposed was observed in terms of FM. Finally, adjusting for height, FFMI and FMI show no difference in either sex.In terms of human capital, compared to the community unexposed, the proportion with high education and socioeconomic status (SES) of formerly malnourished was decreased [study (35.2 vs. 46.4; p 0.); SES (3.0 vs. 6.7; p= 0.007)]. In addition, in terms of cognition and self-esteem, compared to the non-exposed, the formerly malnourished had lower scores on cognitive tests [25.6 vs 27.8, p = 0.001 (MMSE) and 22.8 vs 26.3, p < 0.001 (MMSE-I)] and had lower self-esteem (20.3% vs 12.3%; p = 0.003) Nevertheless, in terms of health-related disabilities, they had less disability in relationships (28.6 vs. 31.5; p = 0.034) than the general population, although no difference was observed in daily activities (5.8 vs. 9.1; p = 0.322).In terms of NCDs, compared to the community unexposed, the malnourished elders had an increased waist circumference [+1.2 (0.02, 2.3) cm, p=0.015] and a higher waist/standing height ratio [0.01 (0.01, 0.02) cm; p0.001]. On the other hand, they had a decreased hip circumference [-1.5 (-2.6, -0.5) cm; p=0.021], and reduced muscle strength. Regarding cardiometabolic markers of NCDs, apart from a higher HbA1c [+0.4 % (0.2, 0.6); p0.001], no differences were found in blood pressure, fasting blood glucose, creatinine, lipid profile and albumin levels in the exposed compared to the unexposed. Compared to unexposed individuals, exposed individuals had an increased prevalence of metabolic syndrome [Odds Ratio (OR) 2.35 (1.22, 4.54); p=0.010], visceral obesity [adjusted OR 1.44 (1.09, 1.89); p=0.001] and leanness [adjusted OR 1.92 (1.03, 3.57)]. In contrast, the prevalence of hypertension, diabetes, overweight and dyslipidemia was similar in both groups.Conclusion: SAM in childhood puts survivors at high risk for NCDs and reduced human capital in adulthood, even in the absence of subsequent nutritional transition. Policymakers and funders interested in combating the global expansion of NCDs in adults might consider the long-term benefit of reducing SAM in childhood as a preventive measure to reduce the socioeconomic burden attributable to NCDs.
Doctorat en Santé Publique
info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le syndrome de Noonan (SN) est une maladie génétique relativement fréquente (prévalence≈1/2000) associant de multiples défauts développementaux (cardiopathies congénitales, retard de croissance, dysmorphie et prédisposition tumorale). Le SN et des syndromes apparentés, regroupés au sein de famille des Rasopathies, sont causés par des mutations d'acteurs ou de régulateurs de la voie de signalisation Ras-MAPK et partagent l'hyperactivation de cette voie comme origine physiopathologique (Tajan et al., 2018). Au-delà des altérations développementales, de récentes études ont souligné que les Rasopathies pouvaient être associées à des anomalies du métabolisme énergétique (Dard et al., 2018). En effet, les patients atteints de Rasopathies, aussi bien que différents modèles murins de ces maladies, présentent une dépense énergétique augmentée et une réduction de leur indice de masse corporelle et de leur adiposité (Leoni, et al. 2016 ; Oba et al, 2018, Tajan et al, 2014). Cependant, les mécanismes sous-jacents à ces altérations métaboliques sont encore mal compris. Dans cette étude, nous avons tiré parti d'un modèle murin du SN, portant à l'état hétérozygote une mutation du gène codant SHP2 (SHP2D61G/+) fréquemment retrouvée chez les patients SN. Nous avons observé que les souris SN affichaient une augmentation de leur dépense énergétique sans modification majeure de leurs prises hydrique et alimentaire ou de leur activité locomotrice spontanée. De plus, les souris SN ont une réduction de tous leurs dépôts adipeux, sont résistantes à l'obésité lorsque mises en régime riche en graisse, et présentent des modifications fonctionnelles de leurs tissus adipeux. De façon intéressante, nous avons également documenté une augmentation de la densité mitochondriale, de la biogenèse et de la respiration dans le tissu adipeux inguinal des souris SN, suggérant un phénomène de " beigisation ". En accord avec ces résultats, UCP1 est spécifiquement surexprimé dans ce tissu et les souris SN présentent un phénotype de résistance au froid. D'un point de vue mécanistique, l'expression de mutants de SHP2 associés au SN augmente la transdifférenciation de cellules adipeuses souches multipotentes humaines (hMADS) vers un phénotype beige, révélant un processus cellule-autonome. De plus, un traitement chronique des souris SN par un inhibiteur pharmacologique de MEK1 normalise l'expression génique des marqueurs de mitochondriogenèse et d'UCP1, traduisant un phénotype Ras-MAPK dépendant. De manière surprenante, dans certains tissus non adipeux (foie, muscle) de même que dans une lignée cellulaire fibroblastique exprimant des mutants SN, nous avons mesuré une diminution de la fonction et/ou de la biogenèse mitochondriales, en accord avec des travaux antérieurs (Lee et al., 2009). Cette contradiction apparente pourrait être liée aux capacités oxydatives différentes des tissus/cellules considérés. A l'appui de cette hypothèse, les souris SN présentent un décalage plus rapide du quotient respiratoire vers l'utilisation du glucose, soulignant une gestion différentielle de ce substrat. Ainsi, cette étude révèle que le mutant de SHP2 associé au SN promeut des dysfonctions métaboliques complexes, ouvrant de nouvelles perspectives dans la compréhension de la physiopathologie de cette maladie. Au-delà des maladies rares, cela pourrait ouvrir de nouvelles pistes dans l'identification de mécanismes responsables de désordres métaboliques plus fréquents
Noonan syndrome (NS) is a relatively frequent genetic disease (prevalence≈1/2000) associating multiple developmental defects (e.g. cardiopathies, growth delay, dysmorphism, tumor predisposition). NS and related disorders, gathered into the so-called family of Rasopathies, are caused by mutations of actors or regulators of the Ras-MAPK signaling pathway and share Ras-MAPK hyperactivation as a pathophysiological origin (Tajan et al., 2018). Besides developmental defects, recent studies have highlighted that Rasopathies could be associated to energy metabolism dysfunction (Dard et al, 2018). Indeed, patients with Rasopathies, as well as several mouse models, display increased energy expenditure and reduced body mass index and adiposity (Leoni, et al. 2016; Oba et al, 2018, Tajan et al, 2014). However, the mechanisms underlying these metabolic alterations are misunderstood. In this study, we took advantage of a well-established NS mouse model, carrying a SHP2 mutation (SHP2D61G/+) often borne by NS patients. We observed that NS mice displayed increased energy expenditure without significant changes of food and water intake or their spontaneous locomotor activity. Moreover, NS mice have a reduction of all fat deposits. Interestingly, we documented an increase of mitochondrial density, biogenesis and respiration in inguinal adipose tissue of NS mice, suggesting a "beiging" phenomenon. Consistently, UCP1 was specifically overexpressed in this tissue and NS mice displayed a cold resistance phenotype. Expression on NS-causing mutants enhanced the transdifferentiation of human multipotent adipose derived stem cells (hMADs) toward "beiging", highlighting a cell-autonomous process. Intriguingly, when expressed in a fibroblast cell line, NS-causing mutants resulted in decreased mitochondrial function and biogenesis, in accordance with a previous report (Lee et al, 2009). This suggests that NS-associated mutant could have different impacts on mitochondrial function depending on the cell type, which might be linked to different oxidative capacities. This hypothesis is also supported by a faster shift toward the use of glucose of the respiratory quotient of NS mice, highlighting possible changes in the management of this substrate. This study reveals that NS-associated SHP2 mutant promotes complex metabolic dysfunctions, which could help to better understand the pathophysiology of this disease, but can also provide new insights into the knowledge of more frequent metabolic disorders

Dans une première étude prospective, nous montrons que Staphylococcus epidermidis est responsable de plus de 80% des infections sur prothèse ostéo-articulaire (IPOA) à staphylocoques à coagulase négative. Toutefois, la prévalence de cette espèce est également très forte parmi les isolats per-opératoires «non significatifs» et nous avons donc cherché à identifier des marqueurs de pathogénicité pertinents, en étudiant le polymorphisme du domaine d’ancrage de l’autolysine/adhésine AtlE et la présence de plusieurs marqueurs (mecA, icaA/D, IS256, « ACME »), en liaison avec le « ST » déterminé par MLST. L’appartenance au clone ST2, la présence de l’allèle 1 d’atlE, des gènes mecA, icaA/D, d’IS256 - mais pas celle de l’élément ACME - étaient significativement associées aux souches d’IPOA. Enfin, nous montrons par MLST et MLVA que les souches de sensibilité anormale aux glycopeptides appartiennent également à un nombre de STs relativement limité mais sont génétiquement diverses
In a first prospective distribution study, we show that Staphylococcus epidermidis accounts for more than 80% cases of prosthetic joint infections (PJIs) associated with coagulase negative staphylococci. However, the prevalence of this species is also very high among per-operative "non-significant" isolates. Thus we tried to identify relevant pathogenicity markers by studying polymorphism of S. Epidermidis autolysin/adhesin AtlE cell wall anchoring domain and the presence of several markers (mecA, icaA/D, IS256, « ACME »), in association with « ST » as determined by MLST. ST2, atle allele 1, mecA, icaA/D, IS256 - but not ACME - were significantly associated with PJIs strains. Finally, we show using MLST and MLVA that strains with abnormal susceptibility to glycopeptides belong to a limited number of STs but are genetically diverse

Les malformations congénitales du rein et du tractus urinaire (CAKUT) sont des maladies pédiatriques rares mais potentiellement graves. Leur physiopathologie est complexe, hétérogène, et fait intervenir des facteurs génétiques et environnementaux non encore complètement élucidés. Le pronostic fonctionnel des enfants CAKUT reste difficile à prédire et aucun traitement n'est disponible. L'étude de la physiopathologie des CAKUT est un domaine de recherche intense visant à identifier des bio-marqueurs diagnostiques/pronostiques qui permettraient d'améliorer la prise en charge des patients. La production de liquide amniotique (LA) étant principalement due à l'excrétion de l'urine fœtale, l'exploration des modifications de sa composition chez les fœtus CAKUT pourrait refléter certaines anomalies rénales et faciliter la compréhension des mécanismes physiopathologiques des CAKUT. L'objectif de ma thèse a été d'identifier des protéines du LA impliquées dans le développement anormal du rein et/ou dans la perte de fonction rénale chez les patients CAKUT. Pour cela nous avons comparé, par LC-MS/MS, le protéome du LA entre 22 fœtus sains, 19 fœtus atteints d'une forme peu sévère de CAKUT et 14 fœtus porteurs d'une forme sévère. Nous avons identifié 8 protéines dont l'abondance était associée à la sévérité du CAKUT indépendamment de l'âge gestationnel. Parmi ces 8 protéines, les protéines NGFR (Nerve Growth Factor Receptor) et Plastine-3 (PLS3) ont été sélectionnées pour une étude plus approfondie. La protéine NGFR (ou p75NTR) présente une abondance dans le LA qui est inversement associée à la sévérité du CAKUT. La présence de NGFR dans le rein humain en développement avait déjà été documentée mais son implication dans le développement rénal restait controversée. Nos travaux ont permis de montrer par immunohistochimie la présence de NGFR dans les reins de fœtus sains/CAKUT chez l'Homme et au cours du développement périnatal chez la souris. De plus, nous avons montré que l'invalidation de NGFR chez le poisson-zèbre à 48h post-fécondation a pour conséquence une altération du développement du pronéphros suggérant une implication de NGFR dans le développement rénal in vivo. Ce travail a été récemment publié dans Biochemical and Biophysical Research Communications. La protéine PLS3 est une protéine de liaison à l'actine, permettant la mise en place de faisceaux parallèles nécessaires aux structures cellulaires comme les microvillosités et les lamellipodes. À ce jour, aucune étude n'avait envisagé le rôle de PLS3 dans le développement ou la fonction rénale. Contrairement à NGFR, l'abondance de PLS3 est positivement associée à la sévérité du CAKUT. La présence rénale de PLS3 a été validée par immunohistochimie chez les fœtus sains/CAKUT et chez la souris. Chez le poisson zèbre, l'invalidation de PLS3 entraine également une altération de fusion glomérulaire révélatrice d'un retard de développement. Chez la souris, l'invalidation de PLS3 n'entraine pas de perturbation majeure du développement rénal en post-natal, à l'exception d'une augmentation de l'aire glomérulaire au prorata de la surface corticale, et d'un épaississement des pédicelles et de la membrane basale glomérulaire. Ces anomalies sont associées à la diminution de l'expression des protéines podocytaires néphrine et podocalyxine, et conduisent à une augmentation significative de l'albuminurie. Ainsi, mon travail démontre pour la première fois un rôle de PLS3 dans le développement et le fonctionnement rénal. Des études complémentaires d'invalidation in-vitro de PLS3 dans des lignées podocytaires (AB8-13) et tubulaires rénales (HK-2) permettront de préciser les mécanismes moléculaires en aval de PLS3. En conclusion, cette thèse montre qu'il est possible d'identifier au sein du LA des protéines qui pourraient être impliquées dans les anomalies de développement et de fonction des reins des enfants atteints de CAKUT
Congenital malformations of the kidney and urinary tract (CAKUT) are relatively rare but potentially serious pediatric diseases. Their pathophysiology is complex, heterogeneous, and involves genetic and environmental factors that have not yet been fully elucidated. The functional prognosis of CAKUT children remains difficult to predict and no treatments are available. The study of the pathophysiology of CAKUT is an area of intense research aiming at identifying diagnostic/prognostic biomarkers that would improve patient care. Since the production of amniotic fluid (AF) is mainly due to the excretion of fetal urine, exploration of changes in its composition in CAKUT fetuses could reflect certain renal abnormalities and facilitate the understanding of the pathophysiological mechanisms of CAKUT. The objective of my thesis was to identify LA proteins that may be involved in abnormal kidney development and/or loss of renal function in CAKUT patients. For this we compared by LC-MS/MS, the LA proteome between 22 healthy fetuses, 19 fetuses with a mild form of CAKUT and 14 fetuses with a severe form. This allowed us to identify 8 proteins whose abundance in LA was associated with the severity of CAKUT regardless of gestational age. Among these 8 proteins, the NGFR (Nerve Growth Factor Receptor) and Plastin-3 (PLS3) proteins were selected for further study. The NGFR protein, better known as p75NTR, exhibits an abundance in LA that is inversely associated with the severity of CAKUT. The presence of NGFR in the developing human kidney had already been documented, but its involvement in renal development remained controversial. Our work has shown by immunohistochemistry the presence of NGFR in kidneys of healthy and CAKUT fetuses in humans and during perinatal development in mice. In addition, we have shown that the invalidation of NGFR in zebrafish at 48h post-fertilization results in an alteration in the development of the pronephros suggesting an involvement of NGFR in renal development in vivo. This work was recently published in Biochemical and Biophysical Research Communications. The PLS3 protein is an actin binding protein involved in the establishment of parallel actin bundles necessary for cellular structures such as microvilli and lamellipodia. To date, no study has considered the role of PLS3 in kidney development or function. Unlike NGFR, the abundance of PLS3 is positively associated with the severity of CAKUT. The presence of PLS3 was validated by immunohistochemistry in kidneys of healthy and CAKUT fetuses in human and during perinatal development in mice. In zebrafish, invalidation of PLS3 results in altered glomerular fusion and proximal tubular augmentation indicative of developmental delay. In mice, the invalidation of PLS3 does not cause any major disruption of postnatal renal development, except for an increase in the glomerular area in proportion to the cortical surface, and a thickening of the pedicels and glomerular basement membrane. These abnormalities are associated with the decrease in the expression of the podocyte proteins nephrin and podocalyxin, and lead to a significant increase in albuminuria. Thus, my work demonstrates for the first time a role of PLS3 in renal development and function. Additional in-vitro invalidation studies of PLS3 in podocyte (AB8-13) and renal tubular (HK-2) lines will allow us to clarify the molecular mechanisms downstream of PLS3. In conclusion, this thesis shows that it is possible to identify amniotic proteins that could be involved in developmental and functional abnormalities observed in the kidneys CAKUT children

L’amélioration du pronostic des pathologies chroniques à début pédiatrique s’est accompagnée d’un nombre grandissant de patients atteignant l’âge adulte. Cependant, l’adolescence et l’entrée dans la vie adulte est une période de multiples changements et de crises, pouvant être à l’origine de rupture avec le système de soins et de complications médicales. Dans cette thèse, j’ai tout d’abord décrit les hospitalisations et la mortalité des jeunes ayant été déclarés en affection de longue durée (ALD) avant 14 ans (N=1752), en comparaison à des jeunes sans pathologie chronique (N=52346). Pour cela, une cohorte rétrospective (2005-2014) a été reconstruite à partir de l’échantillon généraliste des bénéficiaires de l’Assurance maladie. Environ 3% des jeunes de 14 ans avaient déjà été déclarés en ALD. Les profils de mortalité par sexe et les tendances par âge de l’incidence des hospitalisations étaient différents de ceux de la population générale du même âge, en particulier après 18 ans, où l’on observait une chute de l’incidence des hospitalisations. Ensuite, à partir de ces mêmes données, j’ai montré que le pronostic de ces jeunes malades, y compris la mortalité, était associé à la précarité sociale, mesurée par la couverture maladie universelle complémentaire, montrant ainsi que la gratuité des soins à laquelle ces jeunes ont droit dans le système de santé français ne permettait pas de compenser les inégalités sociales dans cette population. Enfin, à un moment ou un autre, ces jeunes sont transférés vers un service d’adultes. Ce passage est un moment crucial dans leur suivi, qui peut être à l’origine d’une discontinuité du suivi médical. Des programmes de transition sont mis en place progressivement pour préparer et accompagner ce transfert. J’ai réalisé une revue systématique de la littérature (23 études) qui a montré qu’il existait deux aspects de la continuité des soins au moment de ce transfert : l’engagement (premier contact) et le maintien dans le suivi en service d’adultes. Cette analyse a également mis en exergue la pauvreté des études existant actuellement pour évaluer les programmes de transition en termes de continuité des soins. Finalement, ces résultats soulèvent de nombreuses questions, notamment les stratégies d’adaptation de ces jeunes vis-à-vis des situations à haut risque et le rôle du transfert en service d’adultes sur le comportement des patients, le pronostic et les pratiques cliniques. Des études incluant largement l’ensemble des jeunes atteints d’une pathologie chronique, intégrant notamment des facteurs liés à l’organisation des soins, liés à la pathologie, individuels et familiaux, devraient être encouragées
The prognosis of childhood-onset chronic conditions has improved, such that more patients now reach adulthood. However, adolescence and entry into adulthood is a critical period that may be associated with poor outcomes, including gaps in care continuity and medical complications. Here, I first described hospitalization and mortality rates in youths registered for a long-term disease (LTD) before the age of 14 (N=1,752), relative to those with no LTD (N=52,346). A retrospective cohort (2005-2014) was built from a sample of the French national health insurance database, called Echantillon généraliste des Bénéficiaires. Approximately 3% of 14-year-old youths had been registered for a LTD. The mortality patterns by gender and the trend in hospitalization rates by age were different from those in the general population of the same age, especially after reaching the age of 18, which was followed by a fall in hospitalization rates. Then, using the same data, I showed that the prognosis of these youths living with a chronic disease, including mortality, was associated with low socio-economic level, as measured by being covered by Couverture Maladie Universelle Complementaire, a public complementary health insurance offering free access to care, delivered on the basis of very low househould incomes. Hence, overcoming financial barriers did not offset social health inequalities in this population. At last, one day, these youths have to be transferred to adult care. Moving to adult care is a critical time in patients’ follow-up that may lead to discontinuity in medical care. Transition programs are being gradually implemented, to prepare and smooth the transfer and support youths during this period. I performed a systematic review of literature (23 studies) that highlighted two aspects of continuity of care during transfer: engagement (first contacts) and retention in adult care once the first contact has been established. This review also emphasized the paucity of knowledge to evaluate transition programs in terms of care continuity. Finally, the results of this PhD raises many issues that need to be addressed, including coping strategies of young patients with high risk situations, and the role of transfer to adult care on patient behavior, prognosis and clinical practices. Studies involving patients with a large spectrum of severe chronic diseases, including factors related to healthcare organization, related to the disease, individual and familial, should be encouraged

Les dystrophies rétiniennes héréditaires forment un groupe génétiquement et cliniquement hétérogène. Ce sont des maladies génétiques mendéliennes évolutives qui entraînent la dysfonction puis la mort cellulaire, notamment des photorécepteurs et des cellules de l’épithélium pigmentaire de la rétine (EPR). La mort de ces cellules s’accompagne de dépôts pigmentaires intra-rétiniens en général localisés dans la périphérie rétinienne, constituant ainsi le sous-groupe majoritaire des rétinites pigmentaires (RP). Plus rarement, des lésions d’aspect varié affectent la macula, région centrale de la rétine, formant le sous-groupe des dystrophies maculaires (DM). Ces dégénérescences conduisent progressivement à une cécité plus ou moins complète sans possibilité thérapeutique actuellement. Malgré l’identification de plus de 90 gènes associés à la RP, les tests génétiques classiques (Sanger, panel) ne permettent pas de déterminer le diagnostic moléculaire chez environ 1/3 des patients. L’identification des nouveaux gènes est d’un intérêt majeur pour la compréhension de la maladie, pour établir des corrélations phénotypes/génotypes, pour l’amélioration du conseil génétique, et enfin pour définir des voies thérapeutiques.Dans cet objectif, l’étude génétique d’une grande famille atteinte de RP autosomique dominante sans diagnostic moléculaire, a été réalisée par séquençage de l’exome. Cette approche a permis d’identifier un variant d’épissage pathogène dans IMPG1, gène jamais décrit dans la RP. Cependant, IMPG1 avait précédemment été associé à la DM vitelliforme (DMV). Une analyse génétique complémentaire sur des cohortes multicentriques de patients atteints de RP ou DMV, a permis d‘identifier six variants pathogènes additionnels (dont cinq nouveaux) dans 10 autres familles avec des formes dominantes ou récessive de RP ou DMV.Ensuite, des analyses fonctionnelles in vivo ont été réalisées chez le poisson medaka puis chez la souris par invalidation du gène orthologue du gène humain IMPG1.L’étude sur le poisson, par utilisation de morpholino, a montré que le produit du gène Impg1 joue un rôle important à la fois dans le développement précoce et dans le maintien des fonctions biologiques de la rétine. La longueur des segments externes des photorécepteurs (bâtonnet et cône), était diminuée de 20% et 90% respectivement. Cependant l’invalidation de l’expression de Impg1 est transitoire chez le poisson, et les analyses phénotypiques très limitées.La réalisation de la souris Impg1-/- a permis de réaliser des etudes fonctionnelles visuelles plus complètes et d’examiner leur évolution sur une longue période. Les souris KO présentent, à partir de 9 mois d’âge, une accumulation anormale de dépôts autofluorescents visible au fondoscope et en tomographie en cohérence optique (OCT). Elles ont un électrorétinogramme (ERG) diminué d’environ 20%. La microscopie électronique des rétines de souris permet de mettre en évidence la localisation précise des anomalies au niveau de la matrice interphotoréceptrice. Le modèle animal murin semble reproduire le phénotype DMV alors que le modèle poisson montre des similitudes avec la RP.En conclusion, ce travail de thèse permet d’étendre le spectre clinique des désordres associés aux mutations du gène IMPG1. Il faut donc ajouter à la DMV, deux nouveaux diagnostics : la RP autosomique dominante et récessive. Les modèles animaux développés permettent de mieux comprendre les mécanismes cellulaires affectés par invalidation du gène IMPG1. Cependant, le mécanisme expliquant l’atteinte maculaire ou périphérique chez l’humain, ainsi que les différents modes de transmission et de variations de pénétrance ne sont pas encore élucidés
Inherited retinal disorders are a clinically and genetically heterogeneous group.They are progressive Mendelian genetic diseases that cause dysfunction then cell death, including photoreceptors and retinal pigment epithelium cells (RPE). Cells death is accompanied by intra-retinal pigment deposits generally located in the retinal periphery, thus constituting the majority subgroup of pigment retinitis (RP). More rarely, lesions of various appearance affecting the macula, central region of the retina, forming the subgroup of macular dystrophies (MD). These neurodegeneration gradually lead to more or less complete blindness, without therapeutic. Despite the identification of over 90 genes associated with RP, conventional genetic testing (Sanger, panel) fails to detect a molecular diagnosis in about one third of RP patients. The identification of new genes is of major interest for understanding the disease, for establishing phenotype / genotype correlations, for improving genetic counseling, and finally for defining therapeutic pathways.For this purpose, the genetic study of a large family with autosomal dominant RP without molecular diagnosis was carried out by exome sequencing. NGS approach made it possible to identify a pathogenic splicing variant in IMPG1, a gene never described in RP. IMPG1 had been previously associated with vitelliform macular dystrophy (VMD). A complementary genetic analysis on multicentric cohorts of patients with RP or DMV, allowed to identify six additional pathogenic variants (including five new variants), in 10 other families with dominant or recessive forms of RP or DMV.We followed our study performing in vivo functional study in medaka fish, then in mice by invalidating the orthologous gene of the human IMPG1. The fish study, the use of morpholino, showed that the Impg1 gene product plays an important role, in the early development and maintenance of the biological functions of the retina. The length of the outer segments of rod and cone photoreceptors were reduced by 20% and 90% respectively. However, the invalidation of Impg1 expression is transient in fish and very limited phenotype analyzes.Impg1-/- mice helped to perform more complete visual functional studies and to examine their evolution over a long period. Impg1-/- mice show an abnormal accumulation of autofluorescent deposits visible with fundoscope and optical coherence tomography (OCT) from 9 months of age. Electroretinogram (ERG) is reduced by about 20%. The electron microscopy of mice retinas makes it possible to highlight the precise localization of the anomalies, within interphotoreceptor matrix. The mouse animal model seems to reproduce DMV phenotype while the fish model shows similarities with RP.To summarize, this thesis work allows us to extend the clinical spectrum of disorders associated with mutations in IMPG1 gene. Two new diagnoses must therefore be added to VMD: autosomal dominant and recessive RP. The animal models developed allow a better understanding of the cellular mechanisms affected by invalidation of the IMPG1 gene. However, the mechanism explaining macular or peripheral involvement in humans, as well as the different modes of transmission and penetrance variations have not yet been elucidated

L’obésité est définie comme une accumulation excessive de graisse pouvant conduire à des problèmes de santé et sa prévalence mondiale ne cesse d’augmenter. L’obésité s’accompagne de désordres métaboliques comme la résistance à l’insuline, la stéatose hépatique et le diabète de type 2. REDD1 (Regulated in Development DNA damages responses 1) régule de nombreuses voies de signalisation impliquées dans la modulation de la balance énergétique cellulaire. Dans mon laboratoire d’accueil, nous avons montré que REDD1 est impliqué dans la voie de signalisation de l’insuline. L’objectif de ma thèse est d’étudier l’implication de REDD1 dans les complications métaboliques induites par l’obésité. L’expression de REDD1 est augmentée dans le tissu adipeux épididymaire et le foie de souris contrôles (WT) nourries avec un régime obésogène (HFD). De plus, son expression est augmentée dans le foie de patients obèses atteints de stéatose hépatique et est corrélée avec le degré de la pathologie et la résistance à l’insuline des patients. Afin d’identifier le rôle de REDD1 dans le développement des pathologies induites par l’obésité, nous avons caractérisé le phénotype de souris invalidées pour REDD1 (KO) soumises à un régime HFD. Lors d’un régime HFD, les souris REDD1-KO développent une obésité et une résistance à l’insuline identique aux souris WT. Cependant, les souris REDD1-KO sont protégées du développement de la stéatose hépatique. Aucune modification de l’expression des protéines impliquées dans l’import et l’export hépatiques des acides gras n’a été mise en évidence. Dans le foie des souris REDD1- KO, l’expression des protéines impliquées dans la lipogenèse est diminuée alors que l’expression des protéines qui régulent la β-oxydation des acides gras est augmentée. Dans le foie des souris WT, le développement de la stéatose hépatique s’accompagne d’une augmentation de la taille des mitochondries. Par contre, dans le foie des souris REDD1-KO, le régime HFD n’induit pas d’augmentation de la taille des mitochondries et l’expression des protéines impliquées dans la régulation de la mitophagie est augmentée. Ces résultats suggèrent que lors d’un stress métabolique comme un régime obésogène, le foie des souris invalidées pour REDD1 pourrait être protégé d’un dysfonctionnement mitochondrial grâce à une exacerbation de l’autophagie. Dans la seconde partie de ma thèse, nous avons étudié le phénotype des souris hétérozygotes pour REDD1 (REDD1-He) soumises à un régime HFD. La diminution partielle de REDD1 n’affecte pas le développement de l’obésité par rapport aux souris WT, ni le développement de la stéatose hépatique. Cependant, sous régime HFD, l’intolérance au glucose et la résistance à l’insuline des souris REDD1-He sont augmentées par rapport aux souris WT-HFD. Les souris REDD1-He semblent oxyder difficilement les lipides en période de jeûne et ont une répartition des tissus adipeux différente que les souris WT. En conclusion, mes travaux de thèse ont permis de montrer pour la première fois l’implication de REDD1 dans le développement de la stéatose hépatique lors de l’obésité
Obesity is defined as an abnormal fat accumulation which could lead to health disorders and its prevalence is in constant increase worldwide. Obesity is associated with insulin resistance, hepatic steatosis and type 2 diabetes. REDD1 (Regulated in Development DNA damages responses 1) regulates most of signaling pathways implicated in cell energetic balance. In my host lab, we have demonstrated that REDD1 is implicated in insulin signaling pathway. The goal of my thesis was to study the REDD1 implication in obesity associated metabolic diseases. We observed that REDD1 expression was increased in epidydimal adipose tissue and in liver of control high fat diet (HFD) fed-mice (WT). Furthermore, REDD1 expression was increased in liver biopsies from obese patients with hepatic steatosis and its expression was correlated with the severity of the pathology and insulin resistance. To identify the role of REDD1 in the development of obesity-induced diseases, we have characterized the phenotype of REDD1 knockout mice (REDD1-KO) fed with HFD. Under HFD, the REDD1-KO mice showed a similar weight gain and insulin resistance compared to WT mice. Interestingly, REDD1-KO mice were protected from hepatic steatosis under HFD. In liver of REDD1-KO mice, no modification of protein expression implicated in hepatic lipid flux was observed. In REDD1-KO mice liver, we observed a decrease of protein expression implicated in lipogenesis pathways associated to an increase of the expression of proteins involved in β-oxydation. In WT mice, hepatic steatosis is correlated with an increase of mitochondrial size. In REDD1-KO mice, HFD did not induce an enlargement of mitochondria. Moreover, the expression pattern of proteins involved in autophagy and mitophagy is increased in HFD REDD1-KO livers. Our results suggest that in HFD conditions, liver of REDD1- KO mice could be protected from mitochondrial dysfunction because of an increase of mitophagy. In a second part of my thesis, we have studied the effect of partial decrease of REDD1 expression on obesity-induced complications using REDD1 heterozygous mice (REDD1-He). Partial decrease of REDD1 did not influence weight gain and hepatic steatosis development under HFD compared to WT mice. However, REDD1-He mice have developed an important glucose and insulin resistance under HFD compared to WT mice. This is associated with an impairment of the use of lipid as substrate during fasting. To conclude, my thesis research project allows us to show for the first time that REDD1 is implicated in hepatic steatosis under obesity

Actuellement lorsqu'un patient entre dans la phase active des maladies associees a l'infection par le virus de l'immunodeficience humaine (vih), le traitement clinique qu'il recoit, est base sur l'association ou combinaison de drogues appartenant a la classe des analogues nucleosidiques qui inhibent une enzyme-cle du cycle de replication virale: la transcriptase inverse. Concevoir et realiser la synthese chimique de nouvelles molecules complementaires represente l'objectif majeur des travaux presentes dans ce memoire. Le premier chapitre, concernant les relations entre la structure et l'activite inhibitrice des analogues nucleosidiques, souligne l'importance des heteronucleosides qui incorporent un ou plusieurs heteroatomes dans le cycle ribosyle. De plus, avec l'aide du modele predictif de l'activite anti-vih base sur la modelisation moleculaire qui est propose, les structures de nouveaux analogues nucleosidiques ont pu etre conceptualisees. La synthese d'heterocycles oxathiolanes et thiazolidines 2,5-disubstitues servant de pseudoriboses et la fonctionnalisation des cycles thiazolidines en position 5 par benzoylhydroxylation et par la reaction de pummerer font l'objet du second chapitre. L'importance de la nature du groupement protecteur de l'azote endocyclique lors de la synthese est egalement soulignee. La synthese des analogues nucleosidiques sur la base des heterocycles obtenus et l'etude des reactions de couplage et des activites biologiques sont decrites dans le troisieme chapitre. Aucune activite anti-vih significative n'a ete observee pour les composes synthetises, cependant ces resultats confirmes a posteriori par modelisation moleculaire, ont permis de definir de nouveaux heteronucleosides modeles

Le travail posté est associé à trois ordres de troubles : l'instabilité pondérale, l'ischémie coronarienne et les troubles digestifs. Ces pathologies posent le problème de la relation entre travail posté et alimentation. Nous avons choisi de nous focaliser sur deux aspects : le bilan énergétique du travail posté et les perturbations lipidiques du travail posté. 1) Bilan énergétique du travail posté. Comme de précédentes études avaient montré que l'alimentation des travailleurs postés se caractérisait essentiellement par un changement de la répartition sur le nycthémère. Nous avons étudié l'influence de l'heure du repas sur la réponse énergétique et hormonale. Deux études ont été réalisées : dans la première étude, nous avons comparé la thermogenèse post prandiale après un repas pris soit à 7 heures, soit à 15 heures soit à 23 heures. Cette étude a montré que la thermogenèse post prandiale diminue lorsque l'on progresse dans la journée et la thermogenèse du matin est significativement supérieure à celle de l'après-midi et du soir. Dans la deuxième étude, nous avons comparé la réponse énergétique, mêtabolique et hormonale à un repas donné soit à 13 heures, soit à 1 heure. Dans ce travail, la thermogenèse post prandiale ne différait pas entre les deux moments de la journée. La glycémie et l'insulinémie s'élèvaient davantage après le repas nocturne. 2) Travail posté et métabolisme lipidique. Dans un premier travail, nous avons comparé les valeurs de triglycérides, cholestérol et HDI cholestérol chez des travailleurs postés et des travailleurs de jour appariés pour l'âge et le niveau socioculturel, l'apport alimentaire était évalué par carnet de trois jours. Nous avons trouvé que le travail posté était associé à une valeur plus élevée de triglycérides indépendamment des autres facteurs. Nous avons complété ce travail par un travail expérimental comparant la lipémie post prandiale après un repas pris soit à 13 heures, soit à 1 heure, et trouvé après le repas nocturne des niveaux plus élevés de triglycérides et des concentrations plus faibles des lipoprotéines riches en cholestérol. L'ensemble de ces résultats montre que la réponse métabolique à un repas est modifiée par l'heure de prise alimentaire. Ces modifications sont faibles, et leurs conséquences sur l'état de santé des travailleurs postés ne peut s'envisager que dans une approche multifactorielle.

Dans de nombreuses maladies héréditaires monogéniques, les bases moléculaires du mode de transmission (dominant vs récessif) et l'origine de nombreux phénotypes associés restent obscurs. C'est le cas pour les ataxies épisodiques (EA) et progressives liées au canal calcique Cav2.1. La plupart des mutations présentes dans ces ataxies génèrent une protéine mal repliée retenue et dégradée dans le réticulum endoplasmique. J'ai exploré plusieurs approches afin d'associer les phénotypes dues à la présence des mutants et ceux dues à une « pure » perte de fonction. A l'aide de vecteurs viraux codants pour des ARNs interférents de Cav2.1, j'ai montré que la réduction chez la souris adulte du canal récapitulait de nombreux symptômes de l'EA2.J'étudie également un nouveau modèle murin knock-In pour l'EA2 produisant une forme tronquée mal repliée. L'étude de ces modèles permettra une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques et l'exploration de nouvelles voies thérapeutiques
Voltage-gated calcium channels (VGCC) regulate an array of physiological process. The P/Q-type VGCC is principally expressed in the cerebellum and at the neuromuscular junction, where it plays an essential role at the presynaptic neuronal nerve. Interestingly, mutations in a1 subunit (Cav2.1) of P/Q-type VGCC gene have been found to be linked for three autosomal dominant human disorders, familial hemiplegic migraine type 1 (FHM1), spinocerebellar ataxia 6 (SCA6) and episodic ataxia type 2 (EA2). Mutations causing EA2 lead to loss-of-function of Cav2.1 channels and are principally non-sense. The origin of dominant transmission and the heterogeneity of the symptoms are not known. Recent data from different groups have shown a dominant-negative effect of Cav2.1 mutants in cultured cell lines. Indeed, the molecular mechanism of this dominant-negative effect appears to be due to the interference of EA2 mutants with the folding of the wildtype subunit, thereby abolishing channel activity. This destructive interaction mechanism promoted by the EA2 mutants is likely to occur in the disease.The first part of my thesis was to monitor the effect of a “pure” silincing of P/Q-type channel in adult mice. Suppression of Cav2.1 channel by RNAi lentiviral based-vector approaches has produced episodic as well as permanent ataxia without signs of progressive ataxia. As a direct approach to understanding the physiologicalcontributions of misfolded truncated mutants in EA2 phenotypes, a Cav2.1 knock-inmutant, CACNA1AR1479x has been generated. This is a fundamental issue to understand the pathogenic mechanisms of EA2 and more generally to the other neuronal and neuromuscular diseases

Les défauts génétiques du métabolisme de la vitamine B12 ou cobalamine (cbl) conduisent à une diminution de l’activité de la méthionine synthase, de la synthèse de la SAM et de l’index de méthylation SAM/SAH, qui pourraient être responsables d’altérations de la méthylation de nombreux substrats. Les patients présentent généralement un large spectre de pathologies suggérant que divers processus cellulaires pourraient être affectés. Cependant les mécanismes moléculaires à l’origine de leur développement ne sont pas connus. Afin de mieux comprendre ces mécanismes, nous avons utilisé des fibroblastes de patients atteints des troubles héréditaires cblC et cblG pour caractériser les modifications du transcriptome, l’épigénome et le protéome. Nos données montrent une modification de l’expression de nombreux gènes impliqués dans des processus développementaux, neurologiques, ophtalmologiques et cardiovasculaires. Ces associations sont cohérentes avec la présentation clinique des patients. Nous avons également mis en évidence des modifications de l’épissage alternatif de gènes ayant un rôle dans l'organisation du cytosquelette, de la réponse au stress, la méthylation et la liaison à l'ARN. L’étude des gènes différentiellement exprimés ou épissés a permis d’identifier un certain nombre de protéines de liaison aux ARN (RBP) notamment HuR et HNRNPL qui sont impliquées dans ces modifications. L’analyse de la méthylation de l’ADN a également révélé des modifications concernant des gènes impliqués dans des processus développementaux et neurologiques mais aucune variation de la méthylation des histones et de l’ARNm n’a été détectée. L’étude du protéome a confirmé que l’épissage alternatif était particulièrement affecté et a suggéré un dysfonctionnement du métabolisme mitochondrial. Nos résultats permettent de mieux comprendre les mécanismes moléculaires à l’origine des pathologies associées aux défauts génétiques cblC et cblG et soulignent l’importance des RBP dans ces processus
Genetic defects of vitamin B12 or cobalamin (cbl) metabolism lead to a decrease of methionine synthase activity that could result in a decrease of S-adenosyl methionine (SAM) synthesis and in the methylation index SAM / SAH that could be responsible for methylation alterations of various substrates. Patients with inherited disorders of cbl metabolism generally have a wide spectrum of pathologies suggesting that various cellular processes may be affected. However, the molecular mechanisms responsible for the development of these disorders are not well known. In order to better understand these mechanisms, we have used fibroblasts of patients with cblC and cblG genetic defects to characterize the modifications of their transcriptome, methylome and proteome. Our data show a modification in the expression of many genes involved in developmental, neurological, ophthalmologic and cardiovascular processes. These associations are consistent with the clinical presentation of the patients. We have also provided evidence of abnormal splicing of genes important for cytoskeleton organization, stress response, methylation and RNA binding. The study of differentially expressed or spliced genes has allowed us to identify various RNA binding proteins (RBP) such as HuR and HNRNPL that are involved in these modifications. The study of DNA methylation also revealed modifications in genes playing a role in developmental and neurological pathologies. No variation in methylation of histones or mRNA has been detected. The proteome study has confirmed that alternative splicing was affected and has suggested that mitochondrial metabolism was also altered. Our results contribute to a better understanding of the molecular mechanisms at the origin of the pathologies associated with the cblC and cblG defects and highlight the crucial role of RBP in these processes

"Le syndrome de Noonan (SN) est une maladie génétique autosomique dominante relativement fréquente (environ 1/2000), caractérisée par l'association d'une dysmorphie faciale, d'un retard statural et d'une cardiopathie. Le syndrome LEOPARD (SL) est une maladie génétique plus rare, phénotypiquement très proche du SN, s'en distinguant essentiellement par l'existence d'une surdité et d'anomalies cutanées. Ces deux syndromes appartiennent à la famille des syndromes " Neuro-Cardio-Facio-Cutanés ", un groupe de maladies du développement en rapport avec des mutations germinales de gènes codant pour des molécules impliquées dans la voie Ras/Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK). Au moins 50% des patients SN et plus de 80% des patients SL ont des mutations germinales du gène PTPN11, codant pour la tyrosine phosphatase Shp2. Les études biochimiques ont montré que les mutations de PTPN11 ont des effets opposés sur l'activité de la phosphatase, gain de fonction dans le SN et perte de fonction dans le SL. Comment des mutations aux effets opposés peuvent être à l'origine de phénotypes similaires est à ce jour incompris. Ce travail nous a permis d'observer, qu'en réponse à l'EGF, la voie PI3K/Akt est hyperactivée dans les cellules de patients SL comparées à celles des patients SN ou des contrôles. Cet effet dominant positif des mutants SL de Shp2 est du à une diminution de la déphosphorylation des sites de liaison de PI3K sur Gab1, augmentant ainsi l'association PI3K/Gab1 et l'activation de la voie PI3K/Akt. Nous avons également observés dans les cellules de patients SL que cette hyperactivation de PI3K/Akt entraîne une augmentation de l'inactivation de GSK3-beta et par conséquent une régulation positive des marqueurs d'hypertrophie cardiaque. Ces données suggèrent que l'hyperactivation de PI3K/Akt pourrait participer à l'hypertrophie cardiaque souvent observée dans le SL. "
Noonan syndrome (NS) is a relatively frequent (about 1/2000 births) autosomal dominant disease primarily characterized by facial dysmorphism, heart defects and short stature. LEOPARD syndrome (LS) is a rarer but related disorder that associates, roughly, NS symptoms with deafness and cutaneous abnormalities. Both NS and LS belong to the family of "neuro-cardio-facial-cutaneous" (NCFC) syndromes, a group of developmental disorders, which display different combinations of the above-mentioned symptoms with mental retardation and tumor predisposition. At least 80% of LS and 50% of NS patients carry germline missense mutations in PTPN11, the gene encoding Shp2. Shp2 is a widely expressed protein tyrosine phosphatase (PTP) that contains Src homology 2 (SH2) domains and promotes Ras-MAPK activation through different molecular mechanisms. Biochemical studies have shown that NS mutations are located at contact points between the catalytic and the SH2 domains and therefore disrupt Shp2 autoinhibitory conformation, stimulating Shp2 catalytic activity (gain-of-function mutations). Conversely, LS mutations are confined within the catalytic domain and repress Shp2 activity. Although genetic studies provided essential advances, how PTPN11 mutations cause the diseases' symptoms remains an open question. We assessed whether LS mutations could influence PI3K activation. To this aim we generated primary and immortalized fibroblast cell lines from LS patient and healthy controls and showed that, in response to EGF stimulation, PI3K/Akt was upregulated in LS cells. This deregulation was due to impaired dephosphorylation of Gab1 PI3K-binding sites by LS mutants. Furthermore, LS mutant promoted PI3K-dependent upregulation of hypertrophy genes in cardiomyocytes, suggesting that this deregulation is involved in LS pathophysiology

La Broncho-Pneumopathie chronique obstructive (BPCO) est un problème majeur en santé publique puisque ce sera la 3ème cause de mortalité en 2020. Il s'agit d'une maladie inflammatoire chronique du poumon se traduisant par une obstruction progressive des bronches, partiellement ou non réversible, incluant bronchite chronique, hypersécrétion de mucus et emphysème. L'atteinte ne se limite pas au poumon et affecte d'autres organes dont le tube digestif en favorisant la maladie de Crohn. Le premier facteur de risque impliqué dans le développement de cette maladie est l’exposition à la fumée de cigarette qui induit un stress oxydatif au sein du poumon responsable d'une inflammation chronique et du développement de la BPCO. L'interleukine-17 joue un rôle essentiel dans ce processus en contrôlant l'inflammation et l'altération de la fonction respiratoire. L'objectif de cette thèse est de comprendre les facteurs contrôlant cette réponse IL-17 afin de proposer ensuite de nouvelles voies thérapeutiques. Dans la première partie, nous nous sommes focalisés sur le stress oxydatif et à son impact sur les cellules de l’immunité innée. Ensuite, nous abordons le rôle d'un facteur immunorégulateur, l'IL-10, et à son interférence avec le microbiote digestif. Cela nous a amené à nous intéresser aux lésions digestives associées au tabagisme. Un modèle murin d’exposition chronique à la fumée de cigarette a été développé afin de reproduire la physiopathologie de la BPCO. Concernant l'impact du stress oxydatif, nous avons étudié le rôle des cellules iNKT (cellules ayant un puissant potentiel dans l’immunorégulation et dans l’inflammation) qui sont activées par ce type de stress. Les cellules iNKT sont rapidement recrutées et activées au sein du poumon suite à l’exposition à la fumée de cigarette. En utilisant des souris déficientes, nous avons montré l’importance de ces cellules dans la physiopathologie de la BPCO. Cette pathogénicité est dépendante de la production de l’interleukine-17 par ces cellules et est initiée par le stress oxydatif sur les cellules épithéliales pulmonaires et les cellules dendritiques qui activent les cellules iNKT.Dans la seconde partie du projet, l’IL-10 intervient notamment dans le contrôle de l'inflammation afin d’éviter le développement de réponses immunologiques exacerbées dans certains contextes. Dans les poumons exposés à la fumée de cigarette, la production d’IL-10 est augmentée et la déficience pour cette cytokine entraîne une augmentation de la réponse Th17 et du déclin de la fonction pulmonaire. Une dysbiose (altération du microbiote) est observée avec la fumée de cigarette et la déficience à l'IL-10. De plus, une déplétion des bactéries Gram+ par antibiothérapie permet de limiter le développement de la réponse IL-17 et de l'atteinte pulmonaire soulignant l'importance du microbiote. En conclusion, nous avons identifié le stress oxydatif et l'IL-10 comme facteurs intervenant dans la réponse IL-17 associé à la BPCO. Ce travail souligne également le rôle du microbiome comme un organe à part entière et la modulation de ce dernier pourrait aboutir à l'identification de nouvelles voies thérapeutiques
Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) is a major health problem which is going to become the third leading cause of death worldwide by 2020. COPD is characterized by a chronic inflammation of the airways causing progressive bronchial obstruction, with no completely reversible airflow limitation, including chronic bronchitis, mucus hypersecretion and emphysema. The pathology is not limited to the airways and can affect others organs including the gastro-intestinal tract promoting Crohn disease. Cigarette smoke exposure is the most important risk factor for developing COPD. Exposure to cigarette smoke induces a strong burden of reactives oxygen species and this oxidative stress is responsible for a chronic inflammation and the development of COPD. Interleukin (IL)-17 plays a critical role in controlling process of inflammation and lung function decline.The aim of this thesis is the understanding which factors are controlling the IL-17 response in order to propose new therapeutic approaches.In the first part, we focused on oxidative stress and its impact on innate immune cells. Then we addressed the role of an immunoregulatory factor, the interleukin (IL)-10, and its interference with intestinal microbiota. This part lead us to study intestinal damages linked to cigarette smoking.To mimic the physiopathology of COPD, we set up a mouse model of chronic exposure to cigarette smoke. Concerning the impact of oxidative stress, we investigated the role of iNKT cells (cells with a crucial potent role in immunoregulation and inflammation) activated by this type of stress. iNKT cells rapidly accumulate and be activated within the lungs of cigarette smoke exposed mice. Using deficient mice, we demonstrated that these cells strongly contribute to the COPD pathogenesis. This pathogenicity is iNKT cells-produced IL-17 dependant and initiated by the effect of oxidative stress on airway epithelial cells and dendritic cells activating iNKT.In the second part of the work, IL-10 interferes notably in the inflammation control in order to avoid exacerbated immunological responses development in some contexts. In cigarette smoke exposed lungs, IL-10 production is up-regulated and the deficiency for this cytokine leads to an increased Th17 response and to lung function decline. An altered microbiota (named dysbiosis) is observed with cigarette smoke exposure and IL-10 deficiency. Moreover, Gram+ bacteria depletion using antibiotics is able to limit the IL-17 response development and the lung function decline highlighting the crucial role for microbiota.To conclude, we identified two factors, oxidative stress and IL-10, implicated in IL-17 response linked to COPD. This work also underlines the role of microbioma as a whole organ and the modulation of this microbioma could result in new therapeutic ways identification in COPD

Le but de ces travaux de these etait de synthetiser et d'evaluer les proprietes biologiques de nouvelles molecules antivirales anti-vih et anti-vhb. La premiere partie de ces travaux fait le point sur les moyens de lutte existants contre le vih et le vhb, et plus particulierement sur les differentes voies chimiotherapeutiques. La seconde partie de ces travaux decrit les differentes voies de synthese d'un nouveau compose nucleosidique, la 2',3'-didesoxy-3'-thiacytidine, ainsi que l'ensemble des travaux effectues sur cette molecule a travers le monde. Ce produit a suscite depuis sa premiere presentation par b. Belleau et coll. Au v#e#m#e congres international sur le sida a montreal un interet croissant: il est actuellement en essais cliniques phase iii pour le vih et phase ii pour le vhb. Dans la troisieme partie, sur la base du concept de prodrogue, nous avons elabore des methodologies de synthese d'une nouvelle generation de composes bipharmacophores. Ces prototypes sont formes de deux entites, l'une nucleosidique et l'autre phosphoree, possedant des proprietes d'inhibition du vih et du vhb. Onze nouveaux composes ont ete synthetises a partir de la 2',3'-didesoxy-3'-thiacytidine et de l'acide phosphonoformique ou de l'acide phosphonoacetique. Les proprietes antivirales de ces produits sont presentees et des mecanismes d'actions sont proposes. Enfin, la synthese des composes rapportes dans la quatrieme partie de ces travaux avait pour but de modifier les proprietes physico-chimiques de la 2'-3'-didesoxy-3'-thiacytidine, afin d'essayer d'ameliorer sa penetration et d'augmenter sa concentration dans les cellules cibles du vih. Pour cela, nous avons mis au point des methodologies de synthese de derives issus du couplage d'entites alkyles avec le groupement amine de la 2',3'-didesoxy-3'-thiacytidine. Ces produits ont ete testes sur l'inhibition de la replication virale en culture cellulaire. La conclusion de ce travail met en relief la mise au point de nouvelles molecules actives contre les virus vih et vhb

Chez l'homme, l'hypoxie correspond à une inadéquation entre les besoins tissulaires et les apports en oxygène. Cet état est une caractéristique commune à l'exposition à l'altitude et au syndrome d'apnées obstructives du sommeil (SAOS), bien que celle-ci soit continue dans le premier cas et intermittente et nocturne dans le second.L'hypoxie d'altitude entraine une altération des performances cognitives et motrices. La réduction de la performance à l'exercice en altitude a longtemps été attribuée à une altération du métabolisme musculaire du fait d'une réduction de l'apport en oxygène. Les perturbations cérébrales induites par l'hypoxie pourraient également avoir un rôle majeur dans cette limitation.Le SAOS, véritable enjeu de santé publique, est associé à des troubles cognitifs pouvant ainsi influencer le fonctionnement quotidien des patients souffrant de ce syndrome et résulter en une somnolence diurne excessive, une baisse de la qualité de vie ou encore une réduction de la productivité au travail et des performances scolaires. Le fait que ces altérations cérébrales puissent influencer les capacités motrices et à l'effort des patients atteints d’apnées obstructives du sommeil reste en revanche à investiguer.Au cours de ce travail de thèse, nous nous sommes intéressés à deux modèles d’exposition hypoxique et à leurs conséquences cérébrales et neuromusculaires. Nous avons tout d’abord étudié l'effet d'une exposition à l'hypoxie d'altitude aigue (quelques heures) et prolongée (plusieurs jours) sur la fonction neuromusculaire et ses répercussions à l'exercice chez le sujet sain. Nous avons ensuite étudié l'influence du modèle d'hypoxie intermittente associé au SAOS sur la fonction neuromusculaire et la tolérance à l'exercice de ces patients. Nous avons ainsi cherché à caractériser les altérations cérébrales à l'exercice en lien avec ce syndrome et leur réversibilité suite à un traitement en ventilation par pression positive continue.Chez le sujet sain, nous avons démontré que la performance à l'exercice impliquant une masse musculaire réduite (fléchisseurs du coude) n'était pas limitée par une fatigue centrale accrue après 1 et 5 jours d'exposition à une altitude de 4350 m. Nous avons mis en évidence que la dysfonction musculaire (force et endurance réduites) observée chez le patient SAOS est associée à un déficit d'activation supraspinal et une augmentation de l'inhibition intracorticale. De plus, nos résultats suggèrent qu'une altération de la réponse cérébrovasculaire à l'exercice puissent impacter négativement la tolérance à l'exercice des patients souffrant d'un SAOS sévère. Ces altérations neuromusculaires et cérébrovasculaires n'étaient pas corrigées après un traitement de huit semaines par ventilation nocturne en pression positive continue soulignant la nature persistante de ces altérations cérébrales
In humans, hypoxia is defined as the mismatch between tissue requirement and oxygen delivery. This condition is a common feature between high-altitude exposure and obstructive sleep apnea syndrome (OSA), although it is continuous in the first instance and intermittent and nocturnal in the second one.High-altitude exposure causes an impairment in cognitive and motor performance. The reduction in exercise performance observed under hypoxic condition has been mainly attributed to altered muscle metabolism due to impaired oxygen delivery. However, hypoxia-induced cerebral perturbations may also play a major role in exercise limitation.OSA, a major public health concern, is associated with cognitive impairment that can alter patients' daytime functioning and result in excessive daytime sleepiness, reduced quality of life and lowered work productivity and school performance. The fact that these cerebral alterations can influence motor and exercise performance in patients with obstructive sleep apnea remains to be investigated.In this thesis, we investigated two different models of hypoxic exposure and their cerebral and neuromuscular consequences. First, we assessed the effect of acute (several hours) and prolonged (several days) high-altitude exposure on the neuromuscular function and its repercussions during exercise in healthy subject. Then, we then investigated the model of intermittent hypoxia associated with OSA and its influence on the neuromuscular function and exercise tolerance in these patients. We seeked to characterize cerebral alterations during exercise associated with this syndrome and their reversibility following continuous positive airway pressure treatment.In healthy subject, we showed that exercise performance involving a small muscle mass (elbow flexors) was not limited by an exacerbated amount of central fatigue after 1 and 5 days of high-altitude exposure (4,350 m). We highlighted that muscle dysfunction (reduced strength and endurance) was associated with a supraspinal activation deficit and an increase in intracortical inhibition. Moreover, our results suggest that an alteration in cerebrovascular response during exercise may contribute to reduced exercise tolerance observed in patients with severe OSA syndrome. The neuromuscular and cerebrovascular abnormalities were not reversed following an eight-week continuous positive airway pressure treatment, highlighting the persistent nature of the cerebral alterations

Les variations du nombre de copies (CNVs) incluent les délétions et les duplications de régions chromosomiques d’une taille variant de 50 pb à plusieurs Mb. Depuis 2005, les études d’association pangénomiques (GWAS) ont permis d’associer certains larges CNVs à des maladies syndromiques associées à la déficience intellectuelle incluant les syndromes de DiGeorge, Williams, Angelman, etc. En fonction de la densité génique de la région d’intérêt et de la variabilité des phénotypes associés, l’étude de la physiopathologie des syndromes peut être extrêmement complexe. La modélisation murine offre de nombreux avantages pour l’identification des gènes candidats et la compréhension des mécanismes moléculaires associés à ces pathologies.Les travaux présentés dans ce manuscrit consistent en la caractérisation des modèles murins pour cinq maladies syndromiques associées aux CNVs : la monosomie 21 partielle ainsi que les réarrangements des régions 16p11.1 et 17q21.31. Les caractérisations anatomiques, métaboliques et comportementales des animaux nous ont permis d’évaluer un grand nombre de paramètres associés à la symptomatique humaine. Nous avons également réalisé des analyses électrophysiologiques et transcriptomiques en ciblant nos investigations sur l’hippocampe, structure cérébrale qui joue un rôle central dans les processus de mémoire et d’apprentissage. Ce projet de recherche s’inscrit dans une perspective plus large qui est l’identification des gènes candidats pour les phénotypes observés et le développement de premières stratégies thérapeutiques pouvant potentiellement aboutir à l’amélioration des capacités cognitives des patients
Copy number variations (CNVs) include deletions and duplications of chromosomal regions ranging in size from 50bp to several Mb. Since 2005, genome-wide association studies (GWAS) have associated some large CNVs to syndromic diseases linked to intellectual disability including DiGeorge, Williams, Angelman syndroms, etc. Depending on the gene density of the region of interest and the variability of symptoms, the study of the pathophysiology of syndromes can be extremely complex. Mouse modeling show many advantages for the identification of candidate genes and the understanding of molecular mechanisms associated with these diseases.The work presented in this manuscript consists of the characterization of mouse models of five syndromic diseases associated with CNVs: partial monosomy 21 and rearrangements of 16p11.2 and 17q21.31 regions. Anatomical, metabolic and behavioral characterizations of animals allowed us to evaluate a broad number of parameters associated with human phenotypes. We also performed electrophysiological and transcriptomic analysis focusing our investigation on the hippocampus which has a major role in learning and memory processes. This project is part of a wider perspective which is the identification of candidate genes for the different phenotypes we observe in the mouse and the development of first treatment strategies which can potentially lead to the improvement of cognitive capacity of patients

Les syndromes Neuro-Cardio-Facio-Cutanés (NCFC) regroupent quatre syndromes polymalformatifs apparentés : les syndromes de Noonan (NS), LEOPARD (LS), Cardio-Facio-Cutané (CFC) et Costello (CS). La découverte de mutations de PTPNll codant la phosphatase SHP-2 dans le NS a été la clef de l'implication de nombreux acteurs de la voie Ras-MAPK dans les syndromes NCFG. Alors que les mutants de SHP-2 associés au NS montrent une activité phosphatasique augmentée in vitro, nous avons montré que les mutants LS présentent une activité phosphatasique basale effondrée entraînant in cellulo une augmentation de l'interaction Gabl/PI3K. D'autre part, nous avons réalisé une étude des corrélations génotype/phénotype sur une grande cohorte de patients présentant un syndrome NCFC. Chacune des mutations des gènes de la voie Ras-MAPK, par ses conséquences fonctionnelles et par le niveau de la voie touché, détermine une symptomatologie particulière qui s'inscrit dans le spectre phénotypique de ces syndromes
Neuro-Cardio-Facio-Cutaneous (NCFC) syndromes groups four clinically related developmental disorders: Noonan (NS), LEOPARD (LS), Cardio-Facio-Cutaneous (CFC) and Costello (CS) syndromes. Discovery of PTPNll mutations, coding the phosphatase SHP-2, in NS was the key of the identification of mutations of numerous actors of the Ras-MAPK pathway in the NCFC syndromes. Whereas NS mutations enhance SHP-2 in vitro catalytic activity, we showed that activity of LS mutants is decreased and promote in cellulo Gabl/PI3K binding. How these apparently opposite behaviours of SHP-2 mutants lead to clinically overlapped syndromes still remain to be explained. On the other hand, we performed a genotype/phenotype correlation study in a large NCFC patients cohort. Each of the mutations affecting the Ras-MAPK pathway, by its functional consequences and by the level of the pathway affected, determines a particular symptomatology demonstrating a phenotypic continuum between the clinical entities

L’obésité prédispose à un ensemble de pathologies sévères telles que le diabète de type 2 et les NAFLD (Non Alcoholic Fatty Liver Disease). Ces pathologies sont caractérisées par une insulino-résistance et une inflammation systémique de bas grade. Récemment, des éléments ont suggéré que ces pathologies sont associées à une dysbiose du microbiote intestinal. En effet, il a été montré que l’administration d’antibiotiques, de probiotiques ou de prébiotiques entraîne une diminution de cette inflammation et une amélioration des paramètres métaboliques. Par ailleurs, il a été constaté que les souris dépourvues de microbiote intestinal (axéniques) sont protégées contre le développement de l’obésité et de l’insulino-résistance. L’objectif de ce travail a donc été i) d’étudier dans quelle mesure l’absence de microbiote intestinal conditionne la réponse métabolique à un régime hyper-lipidique par rapport à un régime standard, ii) de déterminer s’il est possible de transférer la prédisposition aux troubles métaboliques associés à l’obésité par un transfert (transplantation de microbiote intestinal). Nous avons dans un premier temps comparé la réponse à un régime hyper-lipidique de souris conventionelles et de souris axéniques, dépourvues de microbiote intestinal. Nous avons constaté que les souris axéniques sont effectivement résistantes à l’obésité et l’insulinorésistance induites par un régime hyper-lipidiques. Toutefois, elles ne sont que partiellement protégées contre le développement d’une stéatose hépatique, c’est-à-dire une accumulation de triglycérides dans les hépatocytes. Chez les souris conventionelles, ce régime induit une augmentation de l’expression hépatique de gènes impliqués dans la lipogenèse et sa régulation, tandis que le phénomène inverse est observé chez les souris axéniques. Concernant la réponse du système immunitaire, tout comme chez les souris conventionelles, le régime hyperlipidique a induit chez les souris axéniques une augmentation de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires par les macrophages hépatiques. Les macrophages des souris axéniques demeurent sensibles à la stimulation au LPS sous régime hyper-lipidique, contrairement à ce qui est observé chez les souris conventionelles. Ces résultats permettent de conclure que la réponse à un régime obésogène est profondément modifiée par l’absence de microbiote intestinal. Des différences de composition du microbiote pourraient donc potentiellement expliquer des différences de susceptibilité à l’insulino-résistance et aux NAFLD, ce qui fait l’objet de la deuxième partie de cette étude. Nous avons dans un deuxième temps colonisé des souris axéniques avec le microbiote de deux souris conventionelles ayant présenté des réponses métaboliques différentes à un régime hyper-lipidique. Les deux souris sélectionnées pour le transfert de microbiote présentaient une glycémie à jeun et un indice d’insulino-résistance (HOMA-IR) différents à poids égal. Les deux groupes de souris colonisées ont développé une obésité comparable mais des paramètres métaboliques différents. En effet, les différences de niveaux de glycémie et d’insulinorésistance des souris donneuses se retrouvent chez les deux groupes de souris colonisées. De même, les niveaux de stéatose et d’expression de gènes impliqués dans la lipogenèse sont différents chez les deux groupes de souris colonisées. Nous avons ainsi démontré qu’il était possible de transmettre la susceptibilité aux atteintes métaboliques et hépatiques induites par un régime hyper-lipidique par un transfert de microbiote. Ceci démontre que le microbiote intestinal est à l’origine des différences de prédisposition aux troubles métaboliques observés chez une partie des personnes atteintes d’obésité. ... (suite et fin du résumé dans la thèse)
Obesity predisposes people to several severe pathologies, including type 2 diabetes and NAFLD (Non Alcoholic Fatty Liver Disease). Such pathologies are characterized by insulin resistance and systemic low grade inflammation. Recently, it has been established that such pathologies are associated to a gut microbiota dysbiosis. Moreover, recent studies in mice and human indicate that modulation of gut microbiota composition has beneficial effects on people suffering type 2 diabetes and/or NAFLD. Otherwise, it has been showed that germ-free mice remain lean, normo-glycemic and sensitive to insulin when fed a high-fat diet.The aim of this study was i) to decipher to what extent the pathogenesis of insulin resistance and NAFLD depends on the presence or absence of gut microbiota, ii) to determine if the predisposition to metabolic disorders in an obesity context can be transferred via gut microbiota transplantation.We first compared the response of germ-free and conventional mice to high fat diet. Indeed, germ-free mice appeared to be resistant to high-fat diet-induced obesity and insulin resistance. However, germ-freeness only partially protects against diet-induced steatosis, that is to say accumulation of triglycerides in hepatocytes. In conventional mice, high-fat diet induced an increase of the hepatic expression of genes involved in lipogenesis. The inverse phenomenon was observed in germ-free mice. In order to study the liver inflammation, we isolated and cultivated liver macrophages from the two groups of mice. As in conventional mice, high-fat diet induced an increased secretion of pro-inflammatory cytokines by germ-free mice liver macrophages. However, germ-free mice macrophages remained sensitive to LPS stimulation, which was not observed in the conventional mice group. This results demonstrates that being devoid of gut microbiota deeply alters the immunological and metabolic responses to high-fat diet. Therefore, differences in gut microbiota composition could explain the differences of susceptibility in diet-induced insulin-resistance and NAFLD.Then, we colonised two groups of germ-free mice with the gut microbiota of two conventional mice the responses of which to high-fat diet were discrepant. The two donors mice presented different levels of fasting glycemia and HOMA-IR index despite a similar body weight. Both groups of colonised mice developped comparable obesity but different degrees of fasting glycemia and insulin resistance. Levels of steatosis and hepatic expression of genes involved in lipogenesis were as well different in the two groups of colonised mice. Hence the results clearly show that the gut microbiota is the cause of the predisposition to diet-induced insulin resistance and hepatic steatosis. Gut microbiota analysis revealed a higher proportion of lactic acid bacteria, Atopobium, Bacteroides and Akkermansia muciniphila in receiver mice resistant to diet-induced insulin resistance and steatosis, which allow us to hypothesize a protective effect of these bacteria in diet-induced metabolic disorders

Avec l’augmentation continuelle de l’espérance de vie, un grand nombre de pathologies associées au vieillissement émergent. Elles sont étroitement liées à l'accumulation de cellules sénescentes dans les tissus sans que l’on sache précisément comment et pourquoi cela est possible. L’apparition des cellules sénescentes joue un rôle physiologique important dans le développement, dans la cicatrisation mais elles peuvent être également associées à des pathologies liées à l’âge. Comprendre comment les cellules sénescentes sont éliminées ou non dans les tissus représente donc un enjeu majeur pour établir de nouvelles stratégies thérapeutiques contre ses maladies. L’influence positive de leur élimination expérimentale sur la durée de vie et les maladies liées à l'âge a été prouvée très récemment dans des modèles murins où le système immunitaire semble y jouer un rôle majeur. Cependant, les mécanismes qui contrôlent le destin des cellules sénescentes, appelé collectivement « immunosurveillance des cellules sénescentes » sont encore très mal compris. Au cours de ma thèse, je me suis donc attachée à comprendre l’intéraction entre cellules immunitaires et cellules sénescentes et l’impact de ces interactions au cours du vieillissement.Le raccourcissement progressif de l'ADN télomérique à chaque cycle cellulaire joue un rôle clef dans le vieillissement. La dégradation par le protéasome de la protéine télomérique TRF2 favorise l’activation des voies de réparation de l’ADN conduisant à la sénescence. La situation est inverse dans les cellules cancéreuses où TRF2 est très souvent surexprimé. J’ai montré que la surexpression de TRF2 observée dans les tumeurs inhibe l’immunosurveillance médiée par les Natural Killer (NK) en bloquant leur recrutement et leur activité. Cette inhibition est médiée par les Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC), recrutées et activées dans le microenvironnement tumoral par un ensemble de gènes liés au glycocalyx dont l’expression est modulée positivement par TRF2. Puisque TRF2 régule l’immunosurveillance des cellules tumorales en remodelant le glycocalyx et que TRF2 est naturellement dégradé à la sénescence, j’ai émis l’hypothèse que le glycocalyx de la cellule sénescente pourrait avoir des fonctions immunorégulatrices.J’ai identifié une très forte expression d’un ganglioside et de son enzyme de synthèse à la sénescence réplicative. Cette surexpression est également observée dans la sénescence induite par irradiation, par lésion de l’ADN et par remodelage matriciel à l’exception de la sénescence induite par l’oncogène Ras (OIS). De manière cohérente avec les fortes capacités immunomodulatrices des gangliosides, en particulier sur les cellules NK, j’ai observé une forte fonction immunosuppressive des cellules sénescentes avec une capacité à inhiber fonctionnellement in vivo et in vitro les cellules NK, sauf dans le cas de l’OIS. Cette inhibition de fonctionnalité est strictement dépendante de l’expression de ce ganglioside puisqu’en invalidant son expression l’activité cytotoxique des NK est restaurée, par shARN, en éliminant son expression de surface par traitement enzymatique ou bien en bloquant son interaction avec son récepteur par un anticorps monoclonal. Dans un modèle de fibrose pulmonaire chez la souris, où comme chez l’homme, les cellules sénescentes jouent un rôle dans l’étiologie de la maladie, j’ai également montré que les cellules sénescentes expriment également ce ganglioside et que sa présence favorise localement l’inhibition des cellules NK, les rendant non fonctionnelles ex-vivo face à des cellules tumorales.Dans leur ensemble, mes résultats montrent que les cellules sénescentes humaines et murines peuvent être immunosuppressives grâce à la surexpression de ce ganglioside, suggérant un programme cellulaire d’échappement au système immunitaire pouvant favoriser leur accumulation et le développement de la fibrose pulmonaire
As life expectancy continues to increase, a large number of diseases associated with aging are emerging. They are closely linked to the accumulation of senescent cells in tissues without it being precisely known how and why this is possible. The appearance of senescent cells plays an important physiological role in development and healing, but they can also be associated with age-related diseases. Understanding how senescent cells are or are not eliminated in tissues is therefore a major challenge in order to establish new therapeutic strategies against age-related diseases. The positive influence of their experimental elimination on lifespan and age-related diseases has been demonstrated very recently in mouse models where the immune system seems to play a major role. However, the mechanisms that control the fate of senescent cells, collectively referred to as "senescent cell immunosurveillance", are still very poorly understood. During my thesis, I focused on understanding the interaction between immune cells and senescent cells and the impact of these interactions during aging.The progressive shortening of telomeric DNA at each cell cycle plays a key role in aging. Proteasome degradation of the telomeric protein TRF2 promotes the activation of DNA repair pathways leading to senescence. The situation is reversed in cancer cells where TRF2 is very often overexpressed. I have shown that the overexpression of TRF2 observed in tumors inhibits Natural Killer (NK) mediated immunosurveillance by blocking their recruitment and activity. This inhibition is mediated by Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSCs), recruited and activated in the tumor microenvironment by a set of glycocalyx-linked genes whose expression is positively modulated by TRF2. Since TRF2 regulates tumor cell immunosurveillance by remodeling glycocalyx and TRF2 is naturally degraded at senescence, I hypothesized that the glycocalyx of the senescent cell may have immunoregulatory functions.I identified a very high expression of a ganglioside and its synthetic enzyme at replicative senescence. This over-expression is also observed in senescence induced by irradiation, DNA damage and matrix remodeling with the exception of senescence induced by the Ras oncogene (OIS). Consistent with the strong immunomodulatory capacities of gangliosides, particularly on NK cells, I observed a strong immunosuppressive function of senescent cells with an ability to functionally inhibit NK cells in vivo and in vitro, except in the case of OIS. This inhibition of functionality is strictly dependent on the expression of this ganglioside since by disabling its expression the cytotoxic activity of NK cells is restored, by shRNA, by eliminating its surface expression by enzymatic treatment or by blocking its interaction with its receptor by a monoclonal antibody. In a mouse model of pulmonary fibrosis in which, as in humans, senescent cells play a role in the etiology of the disease, I have also shown that senescent cells also express this ganglioside and that its presence locally promotes the inhibition of NK cells, rendering them non-functional ex vivo against tumor cells.Overall, my results show that human and mouse senescent cells can be immunosuppressive through overexpression of this ganglioside, suggesting a cellular escape program to the immune system that may promote their accumulation and the development of pulmonary fibrosis

Le couplage excitation-contraction (EC) du muscle squelettique correspond à l’efflux de Ca2+ par le réticulum sarcoplasmique (RS) suite à une dépolarisation sarcolemmale. Des mutations dans les gènes MTM1 et DNM2 sont responsables respectivement de la forme sévère et modérée de la myopathie centronucléaire (CNM). Chez la souris Mtm1 KO, l’absence de la (PtdInsP) 3-phosphatase MTM1 est associée à une altération du couplage EC, propablement la cause majeure de la faiblesse musculaire. Le rôle du PdtIns(4,5)P2 dans la régulation du couplage EC a été étudié dans des fibres musculaires exprimant une PtdInsP phosphatase sensible au potentiel. Grâce à une combinaison d’électrophysiologie et d’imagerie confocale, nous avons montré une altération de l’efflux calcique en réponse à de fortes dépolarisations déplétant les stocks de PdtIns(4,5)P2 à la membrane.Dans un deuxième temps, une caractérisation complète des défauts de signalisation calcique et du couplage EC a été réalisée dans les fibres musculaires isolées de souris Mtm1 KO. Nos résultats indiquent que l’efflux calcique est d’amplitude réduite, est retardé et est spatialement hétérogène. L’inhibition pharmacologique de l’activité PtdInsP 3-kinase améliore ces défauts in vitro et la survie des souris in vivo, suggérant que l’accumulation des substrats de MTM1 participe au défaut du couplage EC. Ces résultats montrent le bénéfice thérapeutique d’une approche pharmacologique aux inhibiteurs d’activité PtdInsP 3-kinase.Enfin, nous avons montré que les fibres musculaires d’un modèle murin de la forme modérée de CNM (KI-Dnm2R465W) partagent certaines altérations du couplage EC avec le modèle Mtm1 KO (retard de l’efflux calcique) pouvant contribuer à la faiblesse musculaire. Cependant, d’autres défauts (altérations structurales, réduction de l’efflux calcique) affectent plus sévèrement le modèle Mtm1 KO, et pourraient être déterminants dans la différence de sévérité entre les deux formes de CNM
Excitation-contraction (EC) coupling is the process whereby a membrane depolarization leads to an increased cytosolic Ca2+ content, allowing contraction. Mutations in the genes MTM1 and DNM2 are responsible respectively for severe and moderate forms of centronuclear myopathy (CNM). In Mtm1 KO mouse model, MTM deficiency is associated with defective EC coupling, which makes probably the major contribution to muscle meakness.PdtIns(4,5)P2 involvement in regulating EC coupling has been investigated in muscle fibers expressing a voltage sensing PtdInsP phosphatase. Thanks to a combination of electrophysiology and confocal imaging techniques, we showed a reduction of SR Ca2+ release amplitude in response to strong depolarizations activating PdtIns(4,5)P2 depletion at plasma membrane.Secondly, we made a complete characterization of calcium signaling and EC coupling properties in isolated muscle fibers from Mtm1 KO mice. Our results demonstrate that SR Ca2+ release is depressed, delayed and spatially heterogeneous in diseased fibers. Moreover, we showed that pharmacological inhibition of PtdInsP 3-kinase activity improves these defects in vitro and mice survival in vivo, suggesting that accumulation of MTM1 substrates may participate to defective EC coupling. Overall, these results provide proof of concept for the use of PtdIns 3-kinase inhibitors in severe form of CNM.Finally, we showed that muscle fibers from murine model of moderate CNM form (KI-Dnm2R465W) share some of EC coupling defects with Mtm1 KO model (delayed SR Ca2+ release) that may contribute to muscle weakness. However, other defects (structural alterations, depressed SR Ca2+ release) affect more severely Mtm1 KO model, and may be critical in determining the severity of CNM