Дисертації з теми "Ligand/enzyme interaction"

Indications that existing parameter sets of extended Linear Interaction Energy (LIE) models are transferable between lipases from Rhizomucor Miehei and Thermomyces Lanigunosus in complex with a small set of vinyl esters are demonstrated. By calculat- ing energy terms that represents the cost of forming cavities filled by the ligand and the complex we can add them to a LIE model with en established parameter set. The levels of precision attained will be comparable to those of an optimal fit. It is also demonstrated that the Molecular Mechanics/Poisson Boltzmann Surface Area (MM/PBSA) and Molecular Mechanics/Generalized Born Surface Area (MM/GBSA) methods are in- applicable to the problem of calculating absolute binding energies, even when the largest source of variance has been reduced.

Orientador: Ljubica Tasic
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química
Made available in DSpace on 2018-08-19T12:26:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rodrigues_FabioHenriquedosSantos_M.pdf: 24628982 bytes, checksum: f6b1490bc6bf2bf5497e5cad40a40daa (MD5) Previous issue date: 2011
Resumo: A Adenosina Quinase (ADK) é uma enzima importante (EC 2.7.1.20), cuja ação pode estar relacionada a diversas doenças, tais como inflamações, derrame, infarto, entre outras. Desse modo, a inibição de sua atividade é de grande importância, e desperta interesse científico. Na tentativa de inibir a ação da ADK, houve busca por compostos orgânicos cuja capacidade inibitória seja superior comparando-se com inibidores da ADK existentes. Desse modo, derivados de 4-anilinoquinazolinas mostraram-se alvos interessantes. Foi sintetizada uma série de 22 derivados de 8-metóxi-4-anilinoquinazolinas, substituídas nas posições 3'e 4'do anel anilínico. Os compostos sintetizados foram caracterizados e testados frente à ADK, de forma a verificar seu potencial inibitório, principalmente através da técnica de fluorescência de emissão. Da série de compostos, seis apresentaram-se promissores na inibição da ADK. Ensaios in silico também foram realizados, buscando-se uma melhor compreensão do mecanismo de inibição do sistema compostos/ADK
Abstract: The Adenosine Kinase (ADK) is an important enzyme (EC 2.7.1.20) that might be related to several diseases, such as inflammation, stroke and infarct, and many others. Therefore, its activity inhibition is of great importance, arising significant scientific interest. Aiming ADKs inhibition, a search for suitable organic species was realized, in such way that 4-anilinoquinazoline derivatives showed themselves interesting targets. A serie of 22 8-methoxy-4-anilinequinazoline derivatives, substituted on the aniline ring at 3'and 4'positions, was synthesized. The compounds were characterized and tested in in vitro ADKs inhibition, in order to verify their inhibitory potentials, mainly applying emission fluorescence technique. Six compounds of this serie presented promising properties in ADKs inhibition. In silico assays were also conducted, in order to better explain the inhibitory mechanism of the system compounds/ADK
Mestrado
Quimica Organica
Mestre em Química

L’étude de la structure des protéines présente un intérêt majeur en biochimie pour permettre de comprendre et d'interpréter leur fonctionnement. Dans ce travail, les relations structure/fonction d'enzymes natives et modifiées ont été étudiées par le biais de leurs interactions avec les ions métalliques immobilisés. Notre première exploitation des interactions métaux chélatés - protéines a été l'application de l'électrophorèse d'affinité sur gel avec les ions métalliques immobilisés (IMAGE) comme outil d'étude des changements dans la topographie des résidus histidine dans les ribonucléases microbiennes induits par mutagenèse dirigé, photo oxydation et interaction avec un inhibiteur. L'importance de His 102 dans la barnase et His 101 dans la binase pour l'activité catalytique et la reconnaissance de Cu (II) chélaté a été démontré par l'utilisation de ligand IDA-Cu(II). Dans la deuxième partie, la chromatographie et l'électrophorèse capillaire d'affinité avec les ions métalliques immobilisés (IMAC et IMACE) ont été utilisées afin d'identifier les changements dans la conformation active de l'α-chymotrypsine bovine pancréatique chimiquement glycosylée. Deux populations distinctes ont été obtenues après la glycosylation. Pour la partie majeure de protéine glycosylée, la diminution d'affinité pour IDA-Cu(II) correspondant à une perte d'activité enzymatique a été détectée en conditions d'IMAC et d'IMACE. En même temps, la glycosylation chimique a généré une autre forme active de chymotrypsine avec une plus forte affinité pour les ions Cu (II) immobilisés. Finalement, les systèmes IMA ont été appliqués à l'étude de différentes structures quaternaires de dimères natifs de BS-RNase et des oligomères artificiels de RNase A. L'augmentation de l'affinité pour les ions métalliques immobilisés après l'agrégation in vitro aussi bien qu'in vivo a été démontrée pour ces deux ribonucléases. Cette affinité provenant des résidus histidine de chaque sous-unité permet de supposer que les sites actifs (His 12, His 119, Lys 41) restent disponibles après l'agrégation et que leur action coopérative est un des facteurs déterminant les nouvelles propriétés enzymatiques de ces oligomères.

La recherche de nouveaux composés pour prévenir ou atténuer le vieillissement de la peau est une priorité des recherches actuelles dans les cosmétiques. Dans ce contexte, le venin de frelon asiatique (Vespa velutina nigrithorax) a été étudié comme une source particulière de molécules potentiellement bioactives d’intérêt dermacosmétique. La première étude a tout d’abord porté sur la mise en œuvre d’un protocole fiable d’extraction et récupération du venin. Puis, la fraction peptidique et petites molécules a été sélectionnée afin d’évaluer, en comparaison avec le venin brut, la présence de molécules actives vis-à-vis d’une activité antioxydante, anti-microbienne (C. acnes) et inhibitrice enzymatique (tyrosinase, élastase, collagénase) in-tubo et in-cellulo. Ces études ont conduit à identifier par UHPLC-ESI-QTOF-HRMS/MS, dans le venin brut, une molécule responsable de l’activité anti-oxydante sur kératinocytes HaCaT. Dans une seconde étude, une approche peptidomique basée sur une méthode UHPLC-QTOF-HRMS et MS/MS suivie par un traitement statistique (PCA, PLS-DA) a été appliquée sur l’étude différentielle de profil peptidique du venin, en fonction de la période de collecte, des castes et du comportement. Ces derniers ont pour but d’évaluer l’influence de différents facteurs sur le patrimoine moléculaire de ces venins. Parallèlement, en troisième étude, une approche de criblage d’interaction Ligand/enzyme par spectrométrie de masse sur les enzymes élastase et tyrosinase immobilisées a été développée. Cette méthode a pour objectif de mettre en évidence la présence d’inhibiteurs ou de substrats dans des fractions plus ou moins complexes. On a montré que deux peptides présents dans le venin de frelon étaient capables d’interagir avec l’enzyme élastase en tant que substrat. La séquence peptidique de ces peptides a été partiellement obtenue par séquençage de novo
The search for new compounds to prevent or attenuate skin aging is a priority in current research in cosmetics. In this context, Asian Hornet venom (Vespa velutina nigrithorax) has been studied as a particular source of potentially bioactive molecules for dermacosmetic interest.The first study focused on the implementation of a reliable venom extraction and sampling protocol. Then, the peptide - small molecules fraction was selected to evaluate, in comparison with crude venom, the presence of active molecules with respect to antioxidant, anti-microbial (C. acnes) and enzyme inhibition (tyrosinase, elastase, collagenase) activity in-tubo and in-cellulo. These studies led to the identification in crude venom, by UHPLC-ESI-QTOF-HRMS/MS, of one molecule responsible for antioxidant activity on HaCaT keratinocytes.In a second study, a peptidomic approach based on UHPLC-ESI-QTOF-HRMS/MS followed by statistical processing (PCA, PLS-DA) was applied to the differential study of venom, according to the collection period, castes and behavior. The latter aims at evaluating the influence of these different factors on the venom molecular heritage. At the same time, in a third study, a ligand/enzyme interaction screening approach by mass spectrometry on solid-supported elastase enzymes was developed. The aim of this method is to detect the presence of inhibitors or substrates in more or less complex fractions. Two hornet venom peptides presenting in the hornet venom were identified to be capable of interacting with the enzyme elastase. Their peptide sequences were then partially obtained by de novo sequencing

Les enzymes et leur diversité d’actions sont appréciées dans des domaines d’applications variés allant del’agroalimentaire à la thérapeutique. Ainsi, une attention toute particulière est portée à leur étude afin d’améliorer uneaction (contre le vieillissement de la peau, antivirale, anticancéreuse…) ou un procédé de synthèse. Ce projet derecherche s’inscrit dans une démarche de développement d’outils analytiques basés sur la spectrométrie de masse,permettant le suivi rapide et sensible d’interactions enzyme-ligand.Dans une première étude, l’approche TLC couplée à une détection par UV a été évaluée pour la déterminationde constantes enzymatiques de l’enzyme invertase. Cette approche couplée à un MALDI/TOF MS a permis d’identifierdes substrats spécifiques de l’invertase au sein d’extraits de plantes. Pour preuve de concept, l’interactioncellobiohydrolase II–ligand est présentée dans le cadre de l’identification d’inhibiteur par TLC-MALDI/TOF et TLCENALDIMS.En seconde étude, nos travaux ont porté sur la caractérisation directe de différentes enzymes kinases, puis auxsuivis des réactions de phosphorylation de nucléosides /tides endogènes. Ces études, basées sur des approches « offline» (Flow Injection Analysis, FIA) et « on-line » (Frontal Affinity Chromatography, FAC) couplées à unspectromètre de masse haute résolution, ont été réalisées au moyen de ces kinases libres et immobilisées. Dans le cadrede la recherche de nouveaux candidats médicamenteux antiviraux, le suivi d’une phosphorylation spécifique desmolécules de synthèse, au regard de souches humaine ou virale de kinase, a également été évalué par ces deuxméthodologies
Enzymes are very appreciated and useful in various application fields from agri-business to therapeutic due to theirdiversity of actions. Therefore, their action mechanisms are widely studied in order to enhance an action (anti-aging ofskin, antiviral, antitumorous) or a synthesis process. This research project is part of the approach to propose analyticaltools based on mass spectrometry, allowing rapid and sensitive follow-up of enzyme-ligand interactions.In a first study, the Thin-Layer Chromatography (TLC) approach coupled with UV detection was evaluated forthe determination of invertase kinetic constants. This approach coupled with a MALDI / TOF-MS led to theidentification of invertase substrates in plant extracts. As a proof of concept, the cellobiohydrolase II - ligand interactionwas presented in the framework of the identification of inhibitor by TLC-MALDI / TOF and TLC-ENALDI MS.In the second study, our work aimed at developing a direct method for the determination of kinetic parametersof kinases and following-up the phosphorylation reactions of endogenous nucleosides / tides. These studies, based on“off-line” (Flow Injection Analysis, FIA) and “on-line” (Frontal Affinity Chromatography, FAC) approaches coupledwith a high-resolution mass spectrometer, were carried out using free and immobilized kinases. In the context of thesearch for new antiviral drug candidates, a specific phosphorylation of synthetic molecules regards to human or viralkinase was also evaluated by these both approaches

The use of a surface plasmon biosensor fills a missing link in kinetic studies of enzymes, since it measures directly the interaction between biomolecules and allows determination of parameters that are determined only indirectly in activity assays. The present thesis deals with kinetic and dynamic aspects of ligand binding to two viral enzymes: the human cytomegalovirus (HCMV) protease and the human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase (HIV-1 RT). The improved description of interactions presented herein will contribute to the discovery and development of antiviral drugs. The biosensor method provided new insights into the interaction between serine proteases and a peptide substrate, as well as substrate-induced conformational changes of the enzymes. The direct binding assay served as a tool for characterising the binding mechanism of HCMV protease inhibitors. Kinetic details of the interaction between HIV-1 RT and non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs) were unravelled. The recorded sensorgrams revealed several forms of complexity. A general binding model for the analysis was derived from the data, describing a two-state mechanism for the enzyme and a high- and a low-affinity interaction with the inhibitor. Interaction kinetic constants were determined for the clinically used NNRTIs and several investigational inhibitors. The established method was applied to investigate the mechanism of resistance against NNRTIs. Amino acid substitutions in the NNRTI-binding site resulted in both decreased association rates and increased dissociation rates for the inhibitors. The K103N and the L100I substitution also interfered with the formation of the binding site, thereby facilitating inhibitor binding and unbinding. Finally, thermodynamic analysis revealed that, despite the hydrophobic character of the interaction, NNRTI binding was mainly enthalpy-driven at equilibrium. Large entropy contributions in the association and dissociation indicated that binding is associated with a dynamic effect in the enzyme.

Glucokinase (GK) is an enzyme that catalyzes the ATP-dependent phosphorylation of glucose to form glucose-6-phosphate, and it is a tightly regulated checkpoint in glucose homeostasis. The monomeric enzyme possesses a highly exotic kinetic profile, with a sigmoidal dependence on glucose, which has been the source of vigorous investigation and debate in the last several decades. This unique regulatory behavior can be thought of as a remarkable glucose sensor, which may result in hyperglycemia when it is not active enough and hypoglycemia when it is too active. This interdisciplinary study, which draws on small angle X-ray scattering (SAXS) integrated with atomistic molecular dynamics simulations and experimental glucose binding thermodynamics, I reveal the critical regulation of the glucose sensor is due to a solvent controlled switch. Moreover, this solvent controlled switch manifests a regulatory mechanism of GK; a specific local conformational change that leads to an enzyme structure that has a much more favorable solvation energy than most of the protein ensemble. These findings have direct implications for the design of small molecule GK activators as anti- diabetes therapeutics as well as for understanding how proteins can be designed to have built-in regulatory functions via solvation energy dynamics.

La thèse contient trois parties principales, la coordination du Cu, l'inhibition par le Zn, et le lointain infrarouge. Les vibrations de complexes de cuivre ont été étudiées en moyen et lointain infrarouge. Les spectres des complexes Cu- poly-L- histidine ont été enregistrés en fonction du pH en moyen et lointain infrarouge. De même, les vibrations métal- ligand ont été observées dans le lointain infrarouge. La coordination du Cu par l'amyloïde- beta16 est une étape déterminante dans l'apparition de la maladie d'Alzheimer. Les complexes cuivre- amyloïde- beta16 ont été étudiés dans le moyen infrarouge à différentes valeurs de pH. L'utilisation d'échantillons marqués isotopiquement pour cette étude a permis de déterminer les modes de coordination du cuivre. Dans la deuxième partie de la thèse, nous avons utilisé le moyen infrarouge pour étudier des protéines de la chaîne respiratoire. Les cations Zn2+ sont connus pour leur pouvoir inhibiteur vis-à-vis du pompage de protons par les enzymes respiratoires. Pour mieux comprendre l'effet de l'inhibition par le Zn sur les complexes III et IV, la spectroscopie différentielle IRTF induite par l'électrochimie a été utilisée. L'étude montre que le chélation du Zn par le complexe III a lieu via le résidu E295. L'inhibition du complexe IV se fait probablement dans deux sites de chélation. On a montré que le résidu E78 de la sous-unité II intervient dans la chélation du Zn. Enfin, le lointain infrarouge a été développé, y compris une approche électrochimique. Le domaine du lointain infrarouge offre un outil pour observer les vibrations métal- ligand, la signature amide VI et la signature des liaisons hydrogène
The thesis is constituted of three main parts, the Cu coordination, the Zn inhibition and the far infrared. The vibrations of the Cu-poly-L-Histidine complexes have been studied in the mid and far infrared ranges as a function of pH. The Cu coordination by the amyloid-beta 16 peptide is a critical step in the development of Alzheimer' s. La coordination du Cu par l'amyloïde- beta16 est une étape déterminante dans l' apparition de la maladie d'Alzheimer. The spectra of the Cu-amyloid-beta16 complexes have been recorded in the mid infrared domain and the use of isotopically labelled samples allowed revealing the coordination sphere of Cu within the amyloid-beta16. Ln the second part, the mid infrared domain was used to study the respiratory chain enzymes. Zn cations are known to inhibit the proton pumping by the respiratory complexes. To better understand the effect of the inhibition by Zn on the complexes III and IV, the FTIR difference spectroscopy was used. The data shows that the chelation of Zn by the complex III takes places via E295 residue. The inhibition of the complex VI takes place via two binding sites, one of theme corresponds to the E78 residuee of the subunit JI. Finally, the far infrared spectroscopy of proteins has been developed. This spectral domain offers a unique tool to observe the metal-ligand vibration, the amide VI band, as weil as the hydrogen bonding signature of proteins

Nous proposons un ensemble de méthodes pour la conception de systèmes moléculaires. Notre stratégie consiste à utiliser comme modèle des machines naturellement optimisées, les protéines. Les protéines peuvent être des briques structurales, des transporteurs d'informations ou des catalyseurs chimiques. Nous utilisons ici des approches computationnelles, complémentaires aux voies expérimentales, pour concevoir de tels systèmes.Nous avons d'abord entièrement redessiné un domaine PDZ impliqué dans des voies métaboliques. Nous utilisons une approche physics-based basée sur la mécanique moléculaire, un modèle de solvant implicite et un échantillonnage Monte Carlo. Parmi plusieurs milliers de variants prédits pour adopter le repliement PDZ, trois ont été sélectionnés et montrent un repliement correct. Deux ont une affinité détectable pour les ligands peptidiques naturels.Nous avons ensuite re-dessiné le site actif de l'enzyme méthionyl-ARNt synthétase (MetRS). En utilisant un algorithme de type Monte Carlo adaptatif, nous avons sélectionné des variants pour l'affinité MetRS/méthionine (Met). Sur 17 variants testés expérimentalement, 17 sont actifs. La méthode a été ensuite appliquée à l'état de transition pour sélectionner des variants directement sur leur efficacité catalytique.Nous avons étudié la possibilité de modifier la MetRS pour étendre son activitéaux acides aminés β, afin d'étendre le code génétique. Ces acides aminésnon-naturels permettraient d'enrichir le répertoire structural des protéines. 20variants MetRS obtenus à partir de prédictions d'affinité MetRS/β-Met ont ététestés. Aucun n'augmente l'activité mais trois ont amélioré la sélectivité enfaveur de la β-Met. Nous avons implémenté une méthode de sélection de positionsd'intérêt et production de variants pour β-Met et β-Val. Une vingtaine deprédictions sont en cours de tests expérimentaux.Enfin, la modification de protéines in vivo pose la question de leur dérive génétique. Nous introduisons ici une méthode de conception de paires de gènes chevauchants pour des domaines PDZ. Ce codage permettrait de limiter la dérive génétique. Nous avons produit près de 2000 paires de domaines PDZ au codage chevauchant, dont une a été validées par 2 microsecondes de dynamique moléculaire. Des tests expérimentaux sont en cours
We propose a set of methods to design molecular systems. We start from naturally optimized components, namely proteins. Proteins can act as structural components, information transporters, or catalysts. We use computational methods to complement experiments and design protein systems.First, we fully redesigned a PDZ domain involved in metabolic pathways. We used a physics-based approach combining molecular mechanics, continuum electrostatics, and Monte Carlo sampling. Thousands of variants predicted to adopt the PDZ fold were selected. Three were validated experimentally. Two showed binding of the natural peptide ligand.Next, we redesigned the active site of the methionyl-tRNA synthetase enzyme (MetRS). We used an adaptive Monte Carlo method to select variants for methionine (Met) binding. Out of 17 predicted variants that were tested experimentally, 17 were found to be active. We extended the method to transition state binding to select mutants directly according to their catalytic power.We redesigned the MetRS binding site to obtain activity towards two β-amino acids, in order to expand the genetic code. These unnatural amino acids can enhance the structural repertoire of proteins. 20 predicted mutants were tested. Although none had increased β-Met activity, three had a gain in selectivity for β-Met. We then implemented a method to select optimal positions for design and applied it to β-Met and β-Val. Around 20 variants are being experimental tested.Finally, in vivo protein modifications raise the question of their eventual drift away from the original design. We introduce here a design approach for overlapping genes coding PDZ domains. This overlap would reduce genetic drift and provide bio-confinement. We computationally produced almost 2000 pairs of overlapping PDZ domains. One was validated by 2 microsecond molecular dynamic simulations. Experiments are underway

Accurate predictions of binding free energies from computer simulations are an invaluable resource for understanding biochemical processes and drug action. The primary aim of the work described in the thesis was to predict and understand ligand binding to several proteins of major pharmaceutical importance using computational methods. We report a computational strategy to quantitatively predict the effects of alanine scanning and ligand modifications based on molecular dynamics free energy simulations. A smooth stepwise scheme for free energy perturbation calculations is derived and applied to a series of thirteen alanine mutations of the human neuropeptide Y1 G-protein coupled receptor and a series of eight analogous antagonists. The robustness and accuracy of the method enables univocal interpretation of existing mutagenesis and binding data. We show how these calculations can be used to validate structural models and demonstrate their ability to discriminate against suboptimal ones. Site-directed mutagenesis, homology modelling and docking were further used to characterize agonist binding to the human neuropeptide Y2 receptor, which is important in feeding behavior and an obesity drug target.  In a separate project, homology modelling was also used for rationalization of mutagenesis data for an integron integrase involved in antibiotic resistance. Blockade of the hERG potassium channel by various drug-like compounds, potentially causing serious cardiac side effects, is a major problem in drug development. We have used a homology model of hERG to conduct molecular docking experiments with a series of channel blockers, followed by molecular dynamics simulations of the complexes and evaluation of binding free energies with the linear interaction energy method. The calculations are in good agreement with experimental binding affinities and allow for a rationalization of three-dimensional structure-activity relationships with implications for design of new compounds. Docking, scoring, molecular dynamics, and the linear interaction energy method were also used to predict binding modes and affinities for a large set of inhibitors to HIV-1 reverse transcriptase. Good agreement with experiment was found and the work provides a validation of the methodology as a powerful tool in structure-based drug design. It is also easily scalable for higher throughput of compounds.

Ce travail est consacre a l'etude des mecanismes responsables de la reconnaissance entre la seryl-arnt synthetase d'escherichia coli et son substrat macromoleculaire, l'arnt#s#e#r. La premiere etape de ces travaux a consiste a surexprimer l'arnt#s#e#r#2 et l'arnt#s#e#r ambre suppresseur d'e. Coli. Pour cela, les genes synthetiques des deux arnt#s#e#r ont ete construits par assemblage de sept oligonucleotides chevauchants. L'utilisation d'un plasmide dont le nombre de copies est regule par la temperature permet d'obtenir des cellules bacteriennes contenant un taux d'arnt#s#e#r vingt fois superieur a celui present dans des cellules depourvues de plasmide. Grace a cette surexpression, un protocole de purification comportant deux etapes chromatographiques a pu etre developpe. Les arnt purifies ont ensuite ete utilises pour determiner la contribution du domaine n-terminal de la seryl-arnt synthetase d'e. Coli, a l'efficacite et a la specificite de la reaction d'aminoacylation. Les resultats obtenus, montrent que le domaine n-terminal depourvu de role catalytique lors de la reaction d'activation de l'acide amine, est indispensable, d'une part, au maintien d'une efficacite de catalyse elevee lors du transfert de l'acide amine active sur l'arnt et, d'autre part, a la specificite de reconnaissance des arnt#s#e#r. Parallelement, la mesure des constantes de dissociation de l'arnt#s#e#r#2, revele que la fixation de deux molecules d'arnt sur la seryl-arnt synthetase est regit par un mecanisme de type cooperatif. La derniere partie de ce travail montre que la seryl-arnt synthetase de saccharomyces cerevisiae ne peut etre surexprimee chez e. Coli. Le contexte bacterien ne permettant pas a la seryl-arnt synthetase de s. Cerevisiae d'acquerir une structure tridimensionnelle homogene. Les etudes menees, en parallele sur la seryl-arnt synthetase de s. Cerevisiae surexprimee dans son contexte naturel, revelent une repartition de cette enzyme en deux populations distinctes, et une mobilite electrophoretique, sur sds-page, plus elevee que celle obtenue pour l'enzyme surexprimee chez e. Coli

Afin de relier l'activite biologique du motif actif des xyloglucanes a la reconnaissance par des proteines membranaires, nous avons adopte une approche biochimique de detection basee sur l'utilisation de tests immunoenzymatiques. Nous avons utilise le dimere -l-fuc (12), d-gal marque avec de la digoxigenine ou de la biotine et des proteines solubilisees provenant de fractions enrichies en plasmalemme isolees de protoplastes de rubus, pour modeliser les interactions ligand-recepteur. Les resultats obtenus ont montre qu'une proteine membranaire de 62 kda est capable de fixer le dimere fuc-gal et que cette fixation est saturable et reversible. Par ailleurs, le deplacement competitif de la fixation montre une inhibition de l'activite de liaison a la fois par des analogues structuraux (xxfg, fuc-gal-glc, fuc-gal-xyl) et par des phytohormones (2,4-d, kinetine, ga#3, acide abscissique). Cependant, a ce stade de nos travaux, il n'est a pas encore etabli que ces structures proteiques correspondent a des recepteurs de xyloglucane. Une technique de determination de l'activite xyloglucane endotransglycosylase par tests immunoenzymatiques a ete mise au point et a permis de mettre en evidence une activite induite par differents signaux. Le polymere de xyloglucane marque avec de la digoxigenine et l'oligomere xxlgbsa sont utilises comme substrats pour la reaction enzymatique. Les solutions enzymatiques testees sont extraites a partir de fractions microsomales provenant de protoplastes de rubus temoins ou traites. Grace a une sequence d'anticorps (primaire, secondaire et tertiaire), l'activite transferase est suivie en mesurant l'activite peroxydase. Les avantages de cette nouvelle methode sont la sensibilite de la detection et la possibilite d'analyser plusieurs echantillons simultanement.

La modification des protéines par SUMO joue un rôle important dans de nombreuses fonctions cellulaires. Le travail présenté dans cette thèse vise à analyser l'action des protéines PIAS, régulateurs transcriptionnels et SUMO E3 ligases, et en particulier de PIASy dans le contexte de l'oncogenèse. Nous avons montré que PIASy induit la sénescence des fibroblastes primaires, en activant les voies Rb et p53, ou l'apoptose si la voie Rb est déficiente. Nous avons parallèlement identifié de nouveaux partenaires protéiques de PIASy. PIASy induit l'accumulation de FIP200 dans le noyau, ce qui inhibe l'action de FIP200 dans la voie mTOR. FIP200 coopère avec PIASy pour activer l'expression du gène p21. Par ailleurs, la modification de PARP-1 par SUMO stimulée par PIASy régule la réponse au choc thermique. Ainsi, ce travail a mis en évidence un rôle important de PIASy dans le contrôle de la prolifération cellulaire et la réponse aux dommages, et a précisé son action au niveau moléculaire

碩士
國立臺灣大學
分子醫學研究所
97
Neural precursor cell expressed, developmentally down-regulated 8 (Nedd8) is a highly conserved eukaryotic ubiquitin-like protein. It is conjugated to its substrates in a process known as NEDDylation which comprises an E1-E2-E3 enzymatic cascade similar to ubiquitination. Dysregulated NEDDylation is implicated in the pathogenesis of many human diseases and the components of the NEDDylation pathway may accordingly be of potential therapeutic importance. Cullin–RING ubiquitin E3 ligases (CRLs) are the most prominent class of ubiquitin-ligases. Rbx1/Roc1, a RING finger protein, functions as an important component of CRLs. Modification of cullins by Nedd8 has been shown to activate CRLs and it was suggested that Rbx1 acts as the E3 for cullin NEDDylation. In other words, Rbx1 interacts first with Ubc12, the NEDDylation E2, to neddylate cullins and activate CRLs. Rbx1 then, in the context of activated CRL holo-enzyme, interacts with the ubiquitination E2s to promote substrates ubiqutination. Rbx1 is thus a dual - functioning E3 and switches its role in the processes of CRLs NEDDylation and the following substrates ubiquitination. The role-switching mechanism of Rbx1 as a dual- functioning E3 remains elusive. To answer this question, deciphering the precise surfaces of Rbx1/ubiquitination E2 versus Rbx1/NEDDylation E2 interactions is a top priority. Here we report that His88, Pro121, Val122, and the unique N-terminal extension of Ubc12 are implicated in the interaction with Rbx1 in yeast two-hybrid system. Ile54, Pro95, and Leu96 of Rbx1 are also shown to be important for the interaction between Ubc12 and Rbx1 in yeast two-hybrid system. The implications of Rbx1 I54 / P95 / L96 in cullin NEDDylation were further demonstrated in baculovirus-insect cell system. More work is necessary to reveal the full picture of both Rbx1/ubiquitination E2 and Rbx1/NEDDylation E2 interaction surfaces.

Noncovalent interactions are vital for functioning of biological systems. For instance, they facilitate DNA base pairing or protein folding. Recently, in addition to classical noncovalent interactions such as hydrogen bond, nonclassical noncovalent interactions have been discovered. An example of these interactions is halogen bond belonging to the class of σ-hole interactions, the knowledge of which is already being useful for medical compound design. The aim of this work is to find out if the chalcogen bond, also a σ-hole interaction, plays a role in the binding of existing viral inhibitors, too. Following that, we are also interested whether or to what extent can these existing chalcogen bonds be optimized for a greater affinity of the inhibitor binding. Several protein-ligand crystal structures exhibiting geometrical properties favoring a chalcogen bond have been found in the PDB database. We examined the interaction energies and the interaction energy geometrical dependencies of model systems derived from these crystal structures by means of quantum chemical calculations. Further we have optimized their strength by a series of substitutions. We thus propose that chalcogen bond can become a player in rational design of inhibitors of viral enzymes and their protein target. Keywords: Noncovalent...

This thesis is an investigation of novel mono-ADP-ribosylating toxins. In the current data-rich era, making the leap from sequence data to knowledge is a task that requires an elegant bioinformatics toolset to pinpoint questions. A strategy to expand important protein-family knowledge is required, particularly in cases in which primary sequence identity is low but structural conservation is high. For example, the mono-ADP-ribosylating toxins fit these criteria and several approaches have been used to accelerate the discovery of new family members. A newly developed tactic for detecting remote members of this family -- in which fold recognition dominates -- reduces reliance on sequence similarity and advances us toward a true structure-based protein-family expansion methodology. Chelt, a cholera-like toxin from Vibrio cholerae, and Certhrax, an anthrax-like toxin from Bacillus cereus, are among six new bacterial protein toxins identified and characterized using in silico and cell-based techniques. Medically relevant toxins from Mycobacterium avium and Enterococcus faecalis were also uncovered. Agriculturally relevant toxins were found in Photorhabdus luminescens and Vibrio splendidus. Computer software was used to build models and analyze each new toxin to understand features including: structure, secretion, cell entry, activation, NAD+ substrate binding, intracellular target binding and the reaction mechanism. Yeast-based activity tests have since confirmed activity. Vibrio cholerae produces cholix – a potent protein toxin of particular interest that has diphthamide-specific ADP-ribosyltransferase activity against eukaryotic elongation factor 2. Here we present a 2.1Å apo X-ray structure as well as a 1.8Å X-ray structure of cholix in complex with its natural substrate, nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+). Hallmark catalytic residues were substituted and analyzed both for NAD+ binding and ADP-ribosyltransferase activity using a fluorescence-based assay. These new toxins serve as a reference for ongoing inhibitor development for this important class of virulence factors. In addition to using toxins as targets for antivirulence compounds, they can be used to make vaccines and new cancer therapies.
Natural Sciences and Engineering Research Council (CGS-D), Canadian Institutes of Health Research, Cystic Fibrosis Canada, Human Frontier Science Program, Ontario government (OGSST), University of Guelph (Graduate Research Scholarship)

L’adaptation des cellules à leur environnement externe repose sur la transduction adéquate de signaux régulés par une pléthore d'événements moléculaires. Parmi ces événements moléculaires, les modifications post-traductionnelles (MPT) de protéines aident à intégrer, à traduire et à organiser de façon spatiotemporelle ces signaux pour que les cellules puissent réagir aux stimuli externes. Parmi les modifications post-traductionnelles, les petites protéines de la famille de l’Ubiquitine (Ublps, Ubiquitin-like proteins) jouent un rôle majeur dans presque toutes les voies de signalisation. Cette thèse rapporte des études fonctionnelles et structurales des interactions covalentes et non covalentes entre SUMO (Small Ubiquitin related MOdifier), un membre de la famille des Ublps, et trois protéines d'échafaudage, TIF1beta, le corépresseur universel des protéines KRAB-multidoigt de zinc, PIAS1, une ligase E3 pour SUMO et PML, un suppresseur de tumeur. La première étude rapporte l'identification et la caractérisation biochimique des sites de SUMOylation de TIF1beta. Nous avons déterminé que la modification covalente de six résidus lysine par SUMO est essentielle à l’activité de répression de la transcription induit par TIF1beta. En outre, nous présentons des évidences indiquant que la SUMOylation de TIF1 exige non seulement sa capacité à homo-oligomériser, mais est aussi positivement régulée par son interaction avec le domaine KRAB des protéines à doigts de zinc. Partant de ce constat, nous postulons que les protéines KRAB-multidoigt de zinc recrutent leur corépresseur TIF1betaà des gènes cibles, mais aussi accentuent son activité répressive grâce à l'augmentation de sa SUMOylation. Notre seconde étude révèle qu’en plus de réprimer la transcription en tant que MPT covalente, SUMO joue aussi un rôle important dans la répression en tant que partenaire non covalent d’interactions protéine-protéine. Nous avons montré que SUMO interagit simultanément avec deux enzymes de la machinerie de SUMOylation, l’unique enzyme de conjugaison E2, UBC9, et la ligase E3 PIAS1 au sein d’un complexe ternaire répresseur. En outre, nous révélons que la formation du complexe ternaire PIAS1:SUMO:UBC9 est modulée par le niveau de phosphorylation de résidus sérine juxtaposés à un motif d’interaction avec SUMO (SIM) dans PIAS1. Ainsi, SUMO agit comme un adaptateur spécifique qui stabilise les interactions UBC9 E2: E3 PIAS1. Partant de ce constat, nous proposons que les enzymes E2 et E3 des autres systèmes Ublps exploitent des mécanismes similaires dans le cadre de leur fonction Enfin, notre troisième étude explore la régulation des interactions non covalentes de SUMO par la phosphorylation. En utilisant une combinaison d'études in vivo et in vitro, nous démontrons que l'interaction entre SUMO1 et PML est régi par la phosphorylation dépendant de CK2 sur quatre résidus sérine de PML. Les structures cristallographiques des complexes PML-SIM:SUMO1 révèlent que les phospho-sérines de PML contactent des résidus de la région basique de SUMO1. Sachant que la kinase CK2 peut être induite par des kinases activables par le stress, ces résultats suggèrent que les interactions non-covalentes avec SUMO sont modulées par le stress cellulaire. Sur la base de cette constatation, nous postulons que des événements analogues affectent des protéines contenant des séquences SIM ciblées par CK2. En résumé, cette étude révèle qu’en plus de son rôle de MPT, SUMO peut fonctionner comme un adaptateur permettant des interactions spécifiques entre protéines tel que pour les enzymes E3 et E2.
Cell adaption to the external environment relies on proper signal transduction that is orchestrated by a plethora of molecular events. Among these molecular events, post-translational modifications (PTMs) of proteins help to spatiotemporally integrate, translate and dispatch signals so cells can respond to external stimuli. Among these post-translational modifications, the Ubiquitin-like proteins (Ublps) play a major role in almost all signaling pathways. This thesis reports functional and structural studies of the covalent and non-covalent interactions between the Small Ubiquitin-related MOdifier (SUMO), a member of the Ublps family, and three scaffold proteins, TIF1beta, the corepressor of KRAB-Multifinger proteins, PIAS1, a SUMO E3 ligase and the Promyleocytic leukemia (PML) tumor suppressor protein. The first study reports the identification and the biochemical characterization of TIF1betaSUMOylation sites. We mapped six SUMOylation sites in TIF1beta and determined that the covalent modification of these sites by SUMO is essential for its transcriptional repression activity. In addition, we present evidence indicating that SUMOylation of TIF1beta requires not only its ability to homo-oligomerize, but is positively regulated through its interaction with KRAB domains found in zinc-finger proteins. Based on this finding, we postulate that these KRAB domain containing multifinger proteins not only recruit TIF1beta co-repressor to target genes but also increase its repressive activity through enhancement of its SUMOylation. The work in the second study reveals that in addition to suppressing transcription as a covalent PTM, SUMO plays an important role in repression as a non-covalent protein-protein interaction partner. We determine that SUMO can form a repressive complex by simultaneously forming non-covalent interactions with UBC9 and PIAS1, the E2 and E3 enzymes in the SUMOylation system. In addition, we report that the formation of the PIAS1:SUMO:UBC9 ternary complex is modulated by the phosphorylation of serine residues juxtaposed to a SUMO-Interacting Motif (SIM) found in PIAS1. Thus SUMO acts as a specific adaptor that stabilizes UBC9 E2: PIAS1 E3 interactions. Based on this finding, we propose that the E2 and E3 enzymes from other Ublps systems exploit similar mechanisms as part of their function Finally, our third study explores the regulation of SUMO non-covalent interactions by phosphorylation. Using a combination of in vivo and in vitro studies we demonstrate that the interaction between SUMO1 and PML is governed by CK2-dependent phosphorylation of four serine residues in PML. Crystal structures of PML-SIM:SUMO1 complexes reveal that these PML phospho-serine specifically contact SUMO1 basic patch residues. Since CK2 kinase is induced by stress activated kinases pathways, this indicates that SUMO non-covalent interactions are regulated by cellular stress. Based on this finding, we postulated that analogous events influence other CK2-targeted SIM-containing proteins. In summary, this study reveals that in addition to its well described function as PTM, SUMO can function as an adaptor enabling specific proteins interactions such as functional E3:E2 enzymes pairs.

Resveratrol is a polyphenolic phytoestrogen that has been shown to exhibit potent anti-oxidant, anti-inflammatory, and anti-catabolic properties. Increased osteoclastic and decreased osteoblastic activities result in bone resorption and loss of bone mass. These changes have been implicated in pathological processes in rheumatoid arthritis and osteoporosis. Receptor activator of NF-kappaB ligand (RANKL), a member of the TNF superfamily, is a major mediator of bone loss. In this study, we investigated the effects of resveratrol on RANKL during bone morphogenesis in high density bone cultures in vitro. Untreated bone-derived cell cultures produced well organized bone-like structures with a bone-specific matrix. Treatment with RANKL induced formation of tartrate-resistant acid phosphatase-positive multinucleated cells that exhibited morphological features of osteoclasts. RANKL induced NF-kappaB activation, whereas pretreatment with resveratrol completely inhibited this activation and suppressed the activation of IkappaBalpha kinase and IkappaBalpha phosphorylation and degradation. RANKL up-regulated p300 (a histone acetyltransferase) expression, which, in turn, promoted acetylation of NF-kappaB. Resveratrol inhibited RANKL-induced acetylation and nuclear translocation of NF-kappaB in a time- and concentration-dependent manner. In addition, activation of Sirt-1 (a histone deacetylase) by resveratrol induced Sirt-1-p300 association in bone-derived and preosteoblastic cells, leading to deacetylation of RANKL-induced NF-kappaB, inhibition of NF-kappaB transcriptional activation, and osteoclastogenesis. Co-treatment with resveratrol activated the bone transcription factors Cbfa-1 and Sirt-1 and induced the formation of Sirt-1-Cbfa-1 complexes. Overall, these results demonstrate that resveratrol-activated Sirt-1 plays pivotal roles in regulating the balance between the osteoclastic versus osteoblastic activity result in bone formation in vitro thereby highlighting its therapeutic potential for treating osteoporosis and rheumatoid arthritis-related bone loss.