Дисертації з теми "Inhibiteurs de pompe à protons"

L'étude de l'ATPase pompe à protons (H#+-atpase) du tonoplaste d'acer pseudoplatanus a nécessité la mise au point d'une nouvelle méthode pour l'isolement des vacuoles. Les vacuoles sont préparées à partir des protoplastes; la rupture du plasmalemme est obtenue par ultracentrifugation des protoplastes à l'intérieur d'un gradient discontinu de densité. Deux populations de vacuoles distinctes par la densité et par la taille sont ainsi séparées. La méthode proposée permet en une seule étape d'isoler les vacuoles avec un rendement élevé (50%) et un bon degré de pureté. La contamination par les autres compartiments cellulaires n'excède pas 5%. Le tonoplaste préparé à partir de ces vacuoles constitue donc un bon matériel pour l'étude de ses constituants et de l'H#+-ATPase en particulier. Les propriétés de l'H#+-ATPase du tonoplaste d'acer ont été caractérisées tant du point de vue de l'hydrolyse de l'ATP que du transport des protons. Comme les autres ATPases tonoplastiques, elle a un PH optimum de 7,3 et MGATP#2# est son substrat. Elle est sensible aux anions: stimulée par CL#, inhibée par NO#3#. Elle se distingue toutefois des autres ATPases tonoplastiques par sa sensibilité au vanadate (inhibiteur non-compétitif; I#5#0=10 M). Le vanadate est un composé décrit comme un inhibateur spécifique de l'ATPase plasmique des plantes et des animaux et des ATPases à intermédiaire phosphorile. Cette propriété de l'ATPase du tonoplaste d'acer suggère que son mécanisme réactionnel pourrait faire intervenir un intermédiaire phosphoryle au cours de l'hydrolyse de l'ATP.

La maladie rénale chronique (MRC) est un problème majeur de santé publique, touchant plus que 10 % de la population adulte mondiale. Les patients avec une MRC ont un risque accru de morbi-mortalité cardiovasculaire, soulignant ainsi l'importance cruciale d'identifier des facteurs de risque associés. Les toxines urémiques (TUs) sont des molécules qui s'accumulent chez les patients avec une MRC, et qui ont été identifiées comme facteurs de risque cardiovasculaires spécifiques à la MRC. Une revue narrative, incluant toutes les études in vitro, in vivo, et observationnelles entre 2002 et 2022 sur le lien entre les TUs et le risque cardiovasculaire, a été réalisée au début de la thèse. Ceci nous a permis de conclure que la kynurénine, une TU liée aux protéines et dérivée du métabolisme du tryptophane, n'a jamais été étudiée chez les patients pré-dialysés. Ainsi le deuxième travail de thèse a permis d'évaluer l'association de la kynurénine avec les évènements cardiovasculaires. En outre, il est essentiel de repérer les facteurs qui peuvent influencer les concentrations sériques en TUs, d'autant plus que les informations disponibles sur ce sujet sont limitées. Or les inhibiteurs de pompes à protons (IPPs), qui sont des médicaments fréquemment prescrits chez les patients avec une MRC, et certaines TUs sont éliminés par les transporteurs d'anions organiques au niveau des reins. L'hypothèse d'une potentielle interaction entre ces deux n'a jamais été évalué dans la littérature. D'où l'intérêt du troisième travail de cette thèse qui a évalué l'association entre les IPPs et les TUs. Ces deux derniers travaux originaux ont été réalisés à partir des données de la cohorte CKD-REIN, qui est une large cohorte prospective représentative réalisée dans 40 consultations de néphrologie en France, incluant des patients avec une MRC modérée-à-avancée. Nous avons mis en évidence qu'une double augmentation des concentrations sériques de kynurénine libre était associée à une augmentation de 19% du rapport de risque instantané d'évènement cardiovasculaire fatal ou non (466 événements, rapport de risque [IC 95 %] : 1,19 [1,03-1,39]), indépendamment du débit de filtration glomérulaire, de la concentration sérique de tryptophane libre ou d'autres TUs, des médicaments cardioprotecteurs et des facteurs de risque cardiovasculaires traditionnels. La kynurénine libre était particulièrement associée aux évènements cardiovasculaires non-athéromateux (rapport de risque [IC 95 %] : 1,31 [1,09-1,6]). Cependant, nous n'avons pas retrouvé d'association significative entre la kynurénine libre et la mortalité toute cause (311 événements, rapport de risque [IC 95 %] : 1,18 [0,9-1,4]). Dans un échantillon tiré au hasard de CKD-REIN, 31 % des patients avaient des prescriptions d'IPPs à l'inclusion. Nous avons montré que les concentrations sériques de l'indoxyl sulfate libre et total, du p-cresyl glucuronide libre et total, et de la phénylacétylglutamine étaient significativement et indépendamment plus élevées chez les patients prenant des IPPs que chez ceux qui n'en prennent pas. Cette thèse souligne la nécessité de mener davantage de recherches pour comprendre les mécanismes sous-jacents de l'effet des TUs sur la santé cardiovasculaire chez les patients atteints de MRC et développer de nouveaux traitements et approches pour réduire leur impact sur la santé de ces patients
Chronic kidney disease (CKD) is a major public health problem, affecting more than 10% of the worldwide adult population. Patients with CKD have an increased risk of cardiovascular morbidity and mortality, highlighting the importance of identifying associated risk factors. Uremic toxins (UTs) are molecules that accumulate in patients with CKD, and which have been identified as cardiovascular risk factors specific to CKD. A narrative review, including all in vitro, in vivo, and observational studies between 2002 and 2022 evaluating the link between UTs and cardiovascular risk, was carried out at the beginning of the thesis. This allowed us to conclude that kynurenine, a protein-bound UT derived from tryptophan metabolism, has never been studied in pre-dialysis patients. Thus the second objective of the thesis evaluated the association between kynurenine and cardiovascular events. Furthermore, it is crucial to identify factors that may influence serum concentrations of UTs, for which available information is limited. Proton pump inhibitors (PPIs), commonly prescribed for patients with CKD, and certain UTs are eliminated by the organic anion transporters in the kidneys. The hypothesis of a potential interaction between PPIs and UTs has never been assessed in the literature. Hence, our last objective was to evaluate their association. The last two objectives of the thesis were conducted using data from the CKD-REIN cohort, a large prospective cohort carried out in 40 nephrology clinics in France, including patients with moderate-to-advanced CKD. We found that a doubling of serum free kynurenine levels was associated with an 19%-increased hazard of cardiovascular events (466 events, HR[95%CI]: 1.19 [1.03-1.39]), independently of glomerular filtration rate, serum free tryptophan level or other UTs, cardioprotective drugs and traditional cardiovascular risk factors. Serum free kynurenine was particularly associated with non-atheromatous cardiovascular events (HR[95%CI]: 1.31 [1.09-1.6]). However, we did not find a significant association between serum free kynurenine and all-cause mortality (311 events,HR[95%CI]: 1.18 [0.9-1.4]). In a randomly selected sub-cohort from CKD-REIN, 31% of patients had PPI prescriptions at baseline. We demonstrated that serum concentrations of free and total indoxyl sulfate, free and total p-cresyl glucuronide, and phenylacetylglutamine were significantly and independently higher in patients taking PPIs compared to those who were not. This thesis highlights the need for further research to understand the underlying mechanisms of the effect of UTs on cardiovascular health in patients with CKD and to develop new treatments and approaches to mitigate their impact on the health of these patients

Les infections infantiles constituent une problématique majeure en termes de morbi-mortalité à l'échelle mondiale, contribuant significativement aux décès infantiles, notamment via les infections respiratoires. Les facteurs de risque d'infection grave chez les nourrissons sont multifactoriels, principalement liés au développement in utero, à la prématurité, au faible poids de naissance, ainsi qu'à des facteurs immunologiques, génétiques et environnementaux. Les données récentes dans la littérature montrent que des modifications du microbiote peuvent avoir des répercussions au niveau immunitaire et potentiellement accroître le risque infectieux. Ainsi des modifications du microbiote materno-foetal pourraient avoir des conséquences chez le nourrisson. La littérature récente suggère l'existence d'associations entre une exposition in utero aux antibiotiques et l'augmentation du risque d'infections graves chez les nourrissons. Ces études ont été rendues possibles notamment grâce au développement de la pharmaco-épidémiologie via l'usage des bases médico-administratives, tel que le Système National des Données de Santé (SNDS), permettant la constitution de cohortes conséquentes de femmes enceintes. L'objectif global de cette thèse consistait en l'évaluation du rôle d'expositions médicamenteuses pendant la grossesse et le risque d'infections graves au cours de la première année de vie. Les travaux ont été centrés sur l'étude de deux classes pharmacologiques en raison de leur usage fréquent au cours de la grossesse et de leur impact sur le microbiote materno-foetal : les antibiotiques et les inhibiteurs de la pompe à protons. Dans un premier temps, une étude de cohorte nationale, incluant 2,8 millions de nourrissons nés à terme, a évalué l'association entre l'exposition in utero aux antibiotiques systémiques et l'apparition d'infections graves au cours de leur première année de vie. Les résultats ont montré une augmentation modérée de l'incidence des infections graves chez les nourrissons exposés in utero aux antibiotiques. Les associations étaient similaires quel que soit le trimestre d'exposition, la classe d'antibiotiques, ainsi que le site d'infection. Néanmoins, les nourrissons exposés à des antibiotiques à large spectre ou à trois cures ou plus au cours de la grossesse semblaient avoir un risque légèrement accru, en faveur d'une relation causale. Dans un second temps, une autre étude, stratifiée sur la consommation d'inhibiteurs de la pompe à protons au cours des trois premiers mois de vie et incluant 2,1 millions de nourrissons nés à terme, a exploré l'impact de l'exposition prénatale aux inhibiteurs de la pompe à protons sur la survenue d'infections graves pendant leur première année de vie. Les résultats ont permis d'éliminer une association importante entre la consommation d'inhibiteurs de la pompe à protons au cours de la grossesse et la survenue d'infections graves chez le nourrisson. Néanmoins, même après la prise en compte de nombreux facteurs de confusion, cette étude n'a pas permis d'exclure un risque résiduel, restreint uniquement aux nourrissons qui ne reçoivent pas d'inhibiteurs de la pompe à protons durant les premiers mois de vie. En conclusion, cette thèse a confirmé les données existantes sur une association entre l'exposition aux antibiotiques au cours de la grossesse, médicaments impactant fortement le microbiote, et la survenue d'infections graves chez le nourrisson. Les résultats sont plus rassurants concernant les inhibiteurs de la pompe à protons même si un risque faible ne peut être exclu. Ces résultats sont à confirmer avec d'autres études. Ils ont contribué à élargir la base de connaissances relatives à la sécurité d'utilisation des médicaments au cours de la grossesse
Infant infections are a major concern in terms of global morbidity and mortality, significantly contributing to infant deaths, particularly through respiratory infections. Risk factors for severe infections in infants are multifactorial, primarily related to in utero development, prematurity, low birth weight, as well as immunological, genetic, and environmental factors. Recent data in the literature suggest that modifications in the microbiome can have immunological implications and potentially increase the risk of infection. Therefore, changes in the maternal-fetal microbiome could have consequences for the infant. Recent literature suggests associations between in utero exposure to antibiotics and an increased risk of serious infections in early childhood. These studies have been made possible, in particular, through the development of pharmacoepidemiology using medical-administrative databases, such as the National Health Data System (SNDS), allowing the creation of substantial cohorts of pregnant women. The overall objective of this thesis was to evaluate the role of medication exposures during pregnancy and the risk of serious infections in the first year of life. The research work focused on two pharmacological classes due to their frequent use during pregnancy and their impact on the maternal-fetal microbiome: antibiotics and proton pump inhibitors. Firstly, a national cohort study, including 2.8 million full-term infants, evaluated the association between in utero exposure to systemic antibiotics and the occurrence of serious infections in full-term infants during their first year of life. The results revealed a moderate increase in the incidence of serious infections in infants exposed in utero to systemic antibiotics. Associations were similar regardless of the trimester of exposure, antibiotic class, and infection sites. However, infants exposed to broad-spectrum antibiotics or three or more antibiotic courses appeared to have a slightly increased risk, supporting a potential causal relationship. Secondly, another study, stratified by the use of proton pump inhibitors during the first three months of life and including 2.1 million full-term infants, explored the impact of prenatal exposure to proton pump inhibitors on the occurrence of serious infections during their first year of life. The results ruled out a significant association between the use of proton pump inhibitors during pregnancy and the occurrence of serious infections in infants. Nevertheless, even after adjusting for several confounding factors, this study did not exclude a limited residual risk, restricted only to infants with proton pump inhibitors use in early life. In conclusion, this thesis confirmed existing data on an association between exposure to antibiotics during pregnancy, which strongly affects the microbiome, and the occurrence of serious infections in infants. The results are more reassuring concerning proton pump inhibitors; although a low risk cannot be completely ruled out. These findings need confirmation through further studies. They have contributed to expanding the knowledge regarding the safety of medication use during pregnancy

La membrane vacuolaire, ou tonoplaste, des cellules isolees d'acer pseudoplatanus renferme une atpase pompe a protons sensible au vanadate, compose considere comme un inhibiteur des atpases de type p fonctionnant avec un intermediaire phosphoryle. Cette observation suggerait que l'atpase du tonoplaste d'acer pseudoplatanus etait soit une atpase de type p, soit une atpase de type v avec un mecanisme catalytique faisant intervenir un intermediaire phosphoryle. L'atpase du tonoplaste d'acer pseudoplatanus a ete purifiee apres solubilisation par le triton x-100 par: 1) chromatographie en gel filtration puis chromatographie d'echanges d'ions; 2) une methode d'electrophorese en conditions non denaturantes que nous avons mis au point. Ces deux preparations d'enzyme purifiee presentent des proprietes enzymatiques identiques a celles de l'enzyme membranaire. La masse moleculaire de l'atpase fonctionnelle, determinee par irradiation-inactivation est de l'ordre de 400 kda; elle est composee d'au moins 7 sous-unites. Ces resultats combines a des etudes immunologiques indiquent que l'atpase du tonoplaste d'acer pseudoplatanus presente des caracteristiques physico-chimiques analogues a celles des autres atpases vacuolaires connues et qu'elle doit etre classee parmi les v-atpases. L'enzyme purifiee est rapidement phosphorylee par g-#3#2p atp, le marquage concernant uniquement le polypeptide catalytique de 66 kda. Une breve chasse par l'atp froid elimine tout marquage et traduit un turnover rapide caracteristique d'un intermediaire phosphoryle. La sensibilite de l'intermediaire phosphoryle a l'hydroxylamine et a des ph alcalins indique que la liaison est de type acylphosphate comme pour les p-atpases. Nos resultats montrent donc que l'atpase du tonoplaste d'acer pseudoplatanus est une atpase de type v avec un mecanisme reactionnel caracteristique des atpases de type p

L'influx net de no#3# a ete etudie chez la racine d'orge (hordeum vulgare, l. ) dans des conditions autorisant divers regimes d'excretion de h#+ par la pompe a protons. Ce modele a ete choisi parce qu'il permet divers types de controles de l'excretion de h#+ (par la nature des cations du milieu, par le statut ionique interne, et par des effecteurs specifiques de la pompe a h#+). Des precautions ont ete prises pour que ni la reduction de no#3#, ni la secretion dans le xyleme, ne faussent les mesures d'absorption nette. Un systeme ph-stat automatique permet de controler le ph du milieu a 0. 02 unites pres tout en mesurant les echanges d'equivalents h#+. Le potentiel de membrane a ete mesure a l'aide de microelectrodes. La teneur en co#2/hco#3# des milieux a ete controlee. Les resultats supportent un modele d'antiport no#3#/hco#3# inductible en presence de no#3# dans le milieu et formellement equivalent a un symport no#3#/h#+. Son fonctionnement depend du metabolisme et de l'activite de l'atpase pompe a protons. Il est independant de la composante electrique de la force protomotrice cree par la pompe a h#+. Par contre, il depend d'une fourniture d'equivalents h#+ a la surface exterieure des racines. L'utilisation d'une sonde moleculaire a ph montre que l'accumulation de h#+ excretes par la pompe a h#+ cree un glissement de ph parietal qui devient inferieur au ph du milieu. Quand la pompe a h#+ est active l'absorption de no#3# ne depend plus du ph du milieu, la fourniture de h#+ pour le cotransport etant assuree par les ions h#+ excretes et accumules au voisinage de la membrane. Ceci a ete verifie en modifiant le ph parietal, soit par la modulation de l'excretion de h#+ par des effecteurs specifiques de la pompe a h#+, soit par la dissipation du gradient de ph grace a des tampons dans le milieu. Ce modele de couplage entre la pompe a h#+ et le trans

Chez les plantes superieures, la membrane vacuolaire ou tonoplaste renferme, au cote d'une h#+-atpase, une h#+-pyrophosphatase (h#+-ppase). Le gradient electrochimique de h#+ mis en place par ces 2 enzymes est la source d'energie pour divers transports secondaires entre le cytoplasme et la vacuole. Notre travail a eu pour objectif d'etudier les proprietes physico-chimiques de la h#+-ppase du tonoplaste de cellules isolees d'acer pseudoplatanus l. , son mode de regulation et ses interactions avec l'h#+-atpase. Des preparations de vesicules de tonoplaste d'un tres haut degre de purete sont obtenues a partir de vacuoles isolees de protoplastes. Le tonoplaste d'acer pseudoplatanus renferme une h#+-ppase qui couple l'hydrolyse du pyrophosphate a un transport de h#+. Le ph optimum, le substrat reel et le km, l'effet des ions et des inhibiteurs, ont ete determines. La masse moleculaire fonctionnelle a ete estimee par la technique d'irradiation inactivation. Apres solubilisation du tonoplaste la ppase a ete purifiee et sa composition polypeptidique determinee. Les proprietes de la ppase du tonoplaste d'a. Pseudoplatanus suggerent que cette enzyme correspond a la ppase du tonoplaste d'arabidopsis thaliana dont l'adnc a ete clone et sequence. Les effets du magnesium et du calcium sur l'activite de l'enzyme ont ete etudies. Les resultats obtenus montrent que ces ions sont certainement impliques dans la regulation de l'h#+-ppase in vivo. Enfin, nous avons montre que le transport de h#+ par la ppase est sous la dependance de l'h#+-atpase du tonoplaste

La surexpression des pompes d’efflux (PE) appartenant à la famille Resistance-Nodulation-Division (RND) est l’un des contributeurs majeurs de la multirésistance (MDR) et la pathogénicité des bactéries Gram-négatives. Ces transporteurs sont capables d'expulser à l’extérieur de la cellule bactérienne différentes classes d'antibiotiques, ce qui contribue de manière significative à l'échec thérapeutique du traitement des maladies infectieuses. Dans ce contexte, les PEs sont des cibles intéressantes pour la découverte de nouveaux antimicrobiens. Afin de combattre ce mécanisme de résistance, des inhibiteurs des pompes d’efflux (EPIs) sont développés comme adjuvants d'antibiotiques dans le but de restaurer ou d'améliorer leur activité. L'archétype AcrAB-TolC est particulièrement répandu chez les espèces d’Enterobacter pertinentes en clinique (pathogènes « ESKAPE »). Cette étude décrit une stratégie basée sur des analogues des fluoroquinolones pour le drug design des EPIs, contre la pompe AcrB chez E. aerogenes. Ainsi, la synthèse et l'évaluation microbiologique des dérivés de quinazoline-4(3H)-one ont été effectuées. Les propriétés structurales et moléculaires des composés testés (i.e. rigidité et flexibilité) ont également été étudiées. Pour cela, de nouveaux scaffolds ont été évaluées. Plusieurs molécules ont montré une augmentation de la sensibilité des bactéries à la norfloxacine et au chloramphénicol. Les résultats obtenus, appuyés par la modélisation moléculaire, suggèrent que la flexibilité moléculaire et la nature des fonctions chimiques des EPIs jouent un rôle essentiel dans l'amélioration de l'activité et la sélectivité vis-à-vis des fluoroquinolones
Overexpression of Resistance-Nodulation-Division (RND) efflux pumps (EP) is a major contributor in multidrug resistance (MDR) and pathogenicity in Gram-negative bacteria. These transporters are able to expel out of the bacterial cell clinically important antibiotic classes, contributing in a significant manner to the treatment failure of infectious diseases. With the worrying levels of bacterial resistance reported worldwide and the continuous spreading of MDR pathogens, EPs are interesting targets for the discovery of new antimicrobial drugs. Therefore, to overcome this mechanism, efflux pump inhibitors (EPIs) are being developed as adjuvants in order to restore or improve the activity of usual antibiotics. The AcrAB-TolC archetype is particularly widespread in Enterobacter spp. presenting clinical relevance (ESKAPE pathogens). In this study, we described the drug design strategy based on fluoroquinolone antibiotic analogs, against the AcrB pump of E. aerogenes. Thus, synthesis and microbiological evaluation of quinazolin-4(3H)-one derivatives were performed. The structural and molecular properties of the tested compounds (i. e. rigidity and flexibility) were also investigated. In this purpose, a scaffold hopping of the quinazolinone core to homologous benzoquinazolinones and precursors benzamides were carried out. Several molecules increased the bacterial susceptibility towards norfloxacin and chloramphenicol. The obtained results, supported by molecular modeling, suggest that molecular flexibility and the nature of chemical functions play a critical role to improve activity and selectivity on fluoroquinolone potentiation targeting AcrB efflux pump

La surexpression des pompes d’efflux (PE) appartenant à la famille Resistance-Nodulation-Division (RND) est l’un des contributeurs majeurs de la multirésistance (MDR) et la pathogénicité des bactéries Gram-négatives. Ces transporteurs sont capables d'expulser à l’extérieur de la cellule bactérienne différentes classes d'antibiotiques, ce qui contribue de manière significative à l'échec thérapeutique du traitement des maladies infectieuses. Dans ce contexte, les PEs sont des cibles intéressantes pour la découverte de nouveaux antimicrobiens. Afin de combattre ce mécanisme de résistance, des inhibiteurs des pompes d’efflux (EPIs) sont développés comme adjuvants d'antibiotiques dans le but de restaurer ou d'améliorer leur activité. L'archétype AcrAB-TolC est particulièrement répandu chez les espèces d’Enterobacter pertinentes en clinique (pathogènes « ESKAPE »). Cette étude décrit une stratégie basée sur des analogues des fluoroquinolones pour le drug design des EPIs, contre la pompe AcrB chez E. aerogenes. Ainsi, la synthèse et l'évaluation microbiologique des dérivés de quinazoline-4(3H)-one ont été effectuées. Les propriétés structurales et moléculaires des composés testés (i.e. rigidité et flexibilité) ont également été étudiées. Pour cela, de nouveaux scaffolds ont été évaluées. Plusieurs molécules ont montré une augmentation de la sensibilité des bactéries à la norfloxacine et au chloramphénicol. Les résultats obtenus, appuyés par la modélisation moléculaire, suggèrent que la flexibilité moléculaire et la nature des fonctions chimiques des EPIs jouent un rôle essentiel dans l'amélioration de l'activité et la sélectivité vis-à-vis des fluoroquinolones
Overexpression of Resistance-Nodulation-Division (RND) efflux pumps (EP) is a major contributor in multidrug resistance (MDR) and pathogenicity in Gram-negative bacteria. These transporters are able to expel out of the bacterial cell clinically important antibiotic classes, contributing in a significant manner to the treatment failure of infectious diseases. With the worrying levels of bacterial resistance reported worldwide and the continuous spreading of MDR pathogens, EPs are interesting targets for the discovery of new antimicrobial drugs. Therefore, to overcome this mechanism, efflux pump inhibitors (EPIs) are being developed as adjuvants in order to restore or improve the activity of usual antibiotics. The AcrAB-TolC archetype is particularly widespread in Enterobacter spp. presenting clinical relevance (ESKAPE pathogens). In this study, we described the drug design strategy based on fluoroquinolone antibiotic analogs, against the AcrB pump of E. aerogenes. Thus, synthesis and microbiological evaluation of quinazolin-4(3H)-one derivatives were performed. The structural and molecular properties of the tested compounds (i. e. rigidity and flexibility) were also investigated. In this purpose, a scaffold hopping of the quinazolinone core to homologous benzoquinazolinones and precursors benzamides were carried out. Several molecules increased the bacterial susceptibility towards norfloxacin and chloramphenicol. The obtained results, supported by molecular modeling, suggest that molecular flexibility and the nature of chemical functions play a critical role to improve activity and selectivity on fluoroquinolone potentiation targeting AcrB efflux pump

Les evenements qui caracterisent la phase de developpement de la jeune racine qui, nourrie sur les reserves de la graines, accede aux ressources minerales du milieu sont etudiees par diverses approches : flux de h**(+) et de k**(+) (**(86)rb), potentiels de membranes, conversion des sucres en acides organiques (malate), charge et chasse de **(14)co::(2), echanges de 0::(2) et de co::(2)

L'étude des plasmas denses et tièdes est un domaine qui suscite aujourd'hui l'intérêt de nombreux groupes de recherche de part son large spectre d'applications. Ce régime de la matière, qui recouvre une densité proche de celle du solide et une température allant de 0.1 à une dizaine d'eV, est encore mal connu et présente une grande complexité de part son caractère partiellement dégénéré (électrons) et partiellement corrélé (ions). Afin d'ex- plorer ce régime, nous proposons de le sonder par spectroscopie d'absorption X près des seuils grâce à une source X ultra-rapide (ps), intense, produite par laser. La spectroscopie d'absorption X près des seuils (XANES, EXAFS) est un diagnostic qui permet l'étude de la structure atomique locale de milieux éventuellement non-cristallins (solides, liquides, plasmas denses et tièdes). Elle nécessite l'utilisation de sources X de large bande spectrale ajustée au seuil d'absorption de l'élément étudié. Ma thèse s'est déroulée en plusieurs étapes. Dans un premier temps, nous nous sommes attachés à développer une source X ultra-brève (quelques picosecondes) créées par laser et adaptée à la spectroscopie d'absorption X de l'aluminium. Nous avons réalisé une telle source X en utilisant le rayonnement de couche M de plasmas d'éléments de Z élevé, produits par une impulsion laser femtoseconde focalisée sur une cible solide : plus particulièrement issu du faisceau de transition 4f −3d. Le spectre d'émission de cette source a été étudié autour du flanc K de l'aluminium, c'est-à-dire dans la gamme de 1.50 à 1.75 keV. Une série d'expériences, consistant en des mesures spectrales et temporelles de l'émission X, a été effectuée avec un laser kHz (5 mJ, 30 fs), focalisé sur différentes cibles solides : Sm, Gd, Dy, Er et Yb. Les résultats ont été comparés avec des simulations Averroès - Transpec (code collisionnel - radiatif hors équilibre thermodynamique local, couplé à un traitement de la physique atomique en superconfigurations). Après optimisation, le rayonnement X étudié présente un spectre large-bande dans la gamme énergétique sou- haitée et une durée d'émission de ∼ 4 ps. Les intensités X atteintes sont de l'ordre de quelques 1e7 photons par tir, par eV et par sr, soit un rendement de 1‰ de l'énergie laser émis dans la gamme 1.50 - 1.75 keV. Dans un second temps, nous avons développé un spectromètre d'absorption X adapté aux caractéristiques des sources X créées par laser. Ce dispositif consiste en la mesure simultanée du spectre transmis par un échantillon d'aluminium et du spectre dit de référence qui consiste à mesurer directement le rayonnement X émis par la source à chaque tir laser. Cette mesure permet ensuite de calculer la transmission et donc l'absorption corrigée des fluctuations tir à tir de la source X. Des spectres d'absorption ont été enregistrés près du seuil K d'un échantillon froid d'aluminium (20°C), en accumulant quelques milliers de tirs laser (soit quelques secondes seulement à 1 kHz). Les structures XANES sont claire- ment identifiées et résolues avec un niveau de bruit inférieur à 1 %. De tels spectres XANES, obtenus sur des installations laser de hautes cadences, ouvrent des perspectives pour la réalisation d'expériences pompe - sonde sur de " petites " installations. Enfin, nous avons réalisé une expérience en collaboration avec le LULI, afin de caracté- riser un échantillon d'aluminium préalablement chauffé de façon isochore par un faisceau de protons issus de l'interaction entre une impulsion laser ultra-intense (∼ 1e19 W/cm2), ultra-courte (fs) et une cible solide d'or. Grâce à cette méthode, l'échantillon est très rapi- dement porté à de relativement hautes températures (jusqu'à une dizaine d'eV). Dans ces conditions, la détente du plasma n'intervenant qu'après quelques dizaines de picosecondes, il est possible de sonder le plasma tiède lorsque sa température est homogène et que sa densité est proche de celle du solide. En accord avec des travaux théoriques, les résultats expérimentaux montrent une disparition des structures XANES lorsque l'alumi- nium atteint une température de l'ordre de 1 eV. On attribue cette disparition à une perte de corrélation ion - ion. En perspective de cette étude, nous nous proposons d'étendre ce travail à l'analyse des plasmas denses et tièdes grâce à des techniques de chauffage diverses comme par exemple le chauffage par laser (fs), par propagation de chocs générés par laser (ns), ou encore par chauffage par rayonnement X ou XUV de type FEL (fs). Il est aussi envisagé d'étendre cette étude à d'autres éléments tels que le Fer.

La découverte de molécules antibiotiques au XXe siècle a permis de traiter plusieurs maladies infectieuses bactériennes, auparavant mortelles. Cependant, cette avancée thérapeutique s'est suivie d'une utilisation massive, répétée et inadéquate des antibiotiques, conduisant à la montée de l'antibiorésistance. Ce phénomène est alarmant puisqu'on estime à 4,95 millions le nombre de décès associés à la résistance aux antibiotiques en 2019. L'un des mécanismes de résistance mis en place par les Enterobacterales et les bactéries à Gram négatif en général est la (sur)expression des pompes d'efflux. Ces pompes sont capables de prendre en charge plusieurs classes d'antibiotiques différentes, diminuant ainsi leur concentration intrabactérienne et les rendant inefficaces. Une des stratégies envisagées pour contourner ce phénomène de résistance est le développement d'inhibiteurs de pompes d'efflux qui, en combinaison avec un antibiotique, pourront offrir une nouvelle alternative thérapeutique pour traiter les infections bactériennes résistantes.AcrAB-TolC est une pompe d'efflux de la superfamille RND exprimée chez les Enterobacterales telles qu'Escherichia coli et Klebsiella pneumoniae. Afin d'identifier des inhibiteurs de cette pompe, une chimiothèque de 1280 fragments a été criblée sur E. coli en combinaison avec un antibiotique modèle substrat de cette pompe, permettant la sélection d'un composé hit appartenant à la famille des pyridylpipérazines. Ce hit n'a pas d'activité antibactérienne intrinsèque, mais il est capable de potentialiser l'activité d'un panel d'antibiotiques par inhibition directe de la protéine AcrB. Des premières études de relations structure-activité ont permis d'identifier deux séries chimiques, la série quinoléine/quinoxaline et la série pyridine. Des modifications structurales autour de ces trois noyaux ont été réalisées grâce à un design rationnel basé sur les structures co-cristallographiques obtenues avec AcrB. 80 composés ont ainsi été synthétisés afin d'identifier des analogues plus puissants et d'établir de nouvelles relations structure-activité. L'introduction de différents substituants possédant une fonction amine a notamment permis de créer de nouvelles interactions avec des résidus acides de la poche d'AcrB. Les paramètres physicochimiques et pharmacocinétiques in vitro des composés les plus prometteurs ont ensuite été mesurés, ce qui a permis la sélection d'un composé pour une étude de pharmacocinétique chez la souris. Afin de sonder plus largement la diversité chimique des substituants introduits sur les noyaux quinoléine et pyridine, une chimiothèque de 672 triazoles a été synthétisée via une réaction de cycloaddition catalysée au cuivre. Le but était d'augmenter la puissance des composés en créant de nouvelles interactions avec la poche d'AcrB tout en diminuant la cytotoxicité et l'activité antibactérienne intrinsèque des composés. Ceci a permis d'identifier de nouveaux composés ayant des activités prometteuses et qui seront prochainement resynthétisés afin de caractériser leur effet biologique et de mesurer leurs propriétés ADME
The discovery of antibiotics in the 20th century allowed to treat a number of previously fatal bacterial infectious diseases. However, this therapeutic progress was followed by a massive, repeated and inappropriate use of antibiotics, leading to the rise of antimicrobial resistance. This phenomenon is alarming, with an estimated 4.95 million deaths associated with antibiotic resistance in 2019. One of the resistance mechanisms developed by Enterobacterales and overall Gram-negative bacteria is the (over)expression of efflux pumps. These bacterial pumps are able to extrude several classes of antibiotics, thereby reducing their intrabacterial concentration and rendering them ineffective. One strategy being considered to circumvent this phenomenon is the development of efflux pump inhibitors which, in combination with an antibiotic, could offer a new therapeutic alternative to treat resistant bacterial infections.AcrAB-TolC is an efflux pump of the RND superfamily found in Enterobacterales such as Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae. In order to identify inhibitors of this pump, a chemical library of 1280 fragments was screened on E. coli in combination with a model antibiotic substrate of this pump, leading to the selection of a hit compound belonging to the pyridylpiperazine family. This hit has no intrinsic antibacterial activity, but is able to potentiate the activity of a range of antibiotics by direct inhibition of the AcrB protein. Initial studies of structure-activity relationships have allowed the identification of two chemical series, the quinoline/quinoxaline series and the pyridine series. Structural modifications around these three cores were carried out using a rational design based on the co-crystallographic structures obtained with AcrB. 80 compounds were therefore synthesised in order to identify more potent analogues and establish new structure-activity relationships. In particular, the introduction of different substituents with an amine function allowed to create new interactions with acidic residues in the AcrB binding pocket. The physicochemical and in vitro pharmacokinetic parameters of the most promising compounds were then measured, leading to the selection of one compound for a pharmacokinetic study in mice. In order to enrich the chemical diversity of substituents introduced on the quinoline and pyridine rings, a chemical library of 672 triazoles was synthesised via a copper-catalysed cycloaddition reaction. The aim was to increase the potency of the compounds by creating new interactions with AcrB while reducing the cytotoxicity and intrinsic antibacterial activity of the compounds. This led to the identification of new compounds with promising activities, which will soon be resynthesised in order to characterise their biological effect and measure their ADME properties

La v-ATPase est une pompe à protons. Elle permet l’acidification d’organelles, ce qui est indispensable à de nombreux processus cellulaires. Cette enzyme est composée de 14 sous-unités différentes, organisées en deux domaines, le domaine catalytique V1 et le domaine membranaire V0. La sous-unité a du domaine V0 est essentielle au transport des protons. Il en existe 4 isoformes (a1 à a4) et des variants d’épissage (a1-I à a1-IV pour a1) permettant à la v-ATPase d’être adressée vers différents compartiments et donc d’être impliquée dans différents processus. Deux projets visant à étudier cette sous-unité ont été réalisés.En plus de son rôle dans le transport des protons, il a été montré que le domaine V0 de la v-ATPase est impliqué dans des évènements de trafic membranaire, tel que l’exocytose de vésicules de sécrétion. Ce rôle semble nécessiter des interactions avec les protéines SNAREs. J’ai montré, pendant la première partie de ma thèse, que les sous-unités flag-a1-I et flag-a1-IV sont toutes deux adressées aux granules de sécrétion de cellules neurosécrétrices et interagissent avec les protéines SNAREs VAMP2 et syntaxine-1. De façon intéressante la syntaxine-1 semble interagir préférentiellement avec la sous-unité a1-I qui dans les neurones est l’isoforme adressée aux terminaisons nerveuses. Les sous-unités a1-IV ne diffèrent d’a1-I que par l’ajout de 7 acides aminés dans sa moitié N-terminale. Le domaine d’interaction de la sous-unité a avec la syntaxine-1 semble donc être localisé dans cette région.Dans la deuxième partie de ma thèse, j’ai mis en évidence et étudié l’expression de la sous-unité rénale a4 dans des gliomes humains. Ces tumeurs sont les tumeurs cérébrales les plus fréquentes et sont en général associées à un mauvais pronostic. L’OMS distingue, en fonction de paramètres histologiques, les astrocytomes (de grade I à IV), les oligodendrogliomes et les gliomes mixtes (chacun de grade II ou III). Cette classification est controversée, notamment à cause de son manque de reproductibilité, et la prise en compte de marqueurs moléculaires semble s’imposer comme une solution pour la renforcer.J’ai quantifié par RT-PCR quantitative l’expression du gène ATP6V0A4 (codant la sous-unité a4) dans 188 prélèvements de gliomes humains. Nous avons ainsi montré que l’expression de la sous-unité a4 peut être utilisée comme marqueur diagnostique des oligodendrogliomes anaplasiques (35 % l’expriment). Dans un prélèvement, la présence de la codélétion 1p/19q et l’expression de a4, tout deux marqueurs indépendants des oligodendrogliomes, permettra le renforcement du diagnostique oligodendrogliome anaplasique. De plus a4 est fréquemment exprimée par les astrocytomes pilocytiques (70%), où elle est associée à la duplication en tandem de la région chromosomique 7q34 située à proximité directe du gène ATP6V0A4. Enfin une observation prometteuse est que l’expression de a4 pourrait être un marqueur de mauvais pronostic pour les patients atteints d’oligodendrogliome anaplasique ne présentant pas la co-délétion 1p/19q, observation qui devra être confirmée sur une plus grande cohorte de patients
Vacuolar type H+-ATPase is a proton pump, which acidifies numerous organelles, crucial for many cellular processes. This enzyme is composed of 14 different subunits organized in two domains, a catalytic V1 domain and a V0 membrane domain. The a-subunit of V0 is essential for proton transport. There are 4 isoforms of a (a1 to a4) and splicing variants (a1-I to a1-IV for the a1 subunit). v-ATPases containing different a-subunit isoforms are localized in different compartments allowing v-ATPase to participate in different processes. The a-subunits were studied in this work in two distinct projects.Besides its role in proton pumping, V0 domain of v-ATPase is implicated in organelles trafficking events, like vesicles exocytosis. This role seems to require interactions of V0 with SNARE proteins. During my thesis work, I showed that flag-a1-I and flag-a1-IV are both targeted to secretion granules in PC12 neurosecretory cells. These subunits interact with the SNARE proteins VAMP2 and syntaxin-1. Interestingly, syntaxin-1 seems to preferentially interact with the a1-I subunit, isoform which in neurons is sorted to nerve terminals. The only difference between a1-I and a1-IV subunits is the addition of 7 amino acids in the N-terminal half of a1-IV. So syntaxin-1 probably interacts with a1-I at this location. In a second project, I studied the expression of the renal a4-subunit in human gliomas. These tumors are the most frequent brain tumors and are generally associated with a poor prognosis. Based on histological parameters,WHO distinguishes, astrocytomas (grade I to IV), oligodendrogliomas and oligoastrogliomas (each of grade II or III). This classification suffers of a lack of reproducibility, which could be overcome by the identification of specific molecular markers.In the present work, by real time quantitative PCR, ATP6V0A4 gene (encoding the renal a4) expression was quantified in 188 human glioma biopsies. We established a4 expression as a new marker of grade III oligodendrogliomas (35 % express it), independent of the 1p/19q codeletion, an established marker of oligodendrogliomas. Moreover, a4 is expressed in 70% of pilocytic astrocytomas, in which it is associated with the tandem duplication of 7q34, localized at direct proximity of the ATP6V0A4 gene. Of promising interest is the observation that a4 expression could be considered as a bad prognostic marker for patients with 1p/19q non-deleted oligodendrogliomas, an observation that should be confirmed on larger cohorts of patients