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Le développement et le remodelage du tissu osseux dépendent d'une étroite coordination entre les cellules ostéoblastiques et ostéoclastiques, responsables de la formation et résorption osseuse respectivement, mais aussi entre les cellules osseuses et les cellules endothéliales présentes dans les vaisseaux sanguins environnants. Le but de ce travail est d'étudier la communication entre les ostéoprogéniteurs issus de la moelle osseuse (human osteoprogenitors : HOPs) et les cellules endothéliales (human ombilical cord endothelial cells : HUVECs). Cette communication ostéo-endothéliale a été analysée dans un modèle de co-culture in vitro en 2D mais aussi en 3D au sein de microsphères d'alginate qui ont été ensuite implantées in vivo dans une lésion osseuse chez la souris nude. Dans un premier temps, nous avons complété la caractérisation des HOPs. Le phénotype de ces cellules est régulé lorsqu'elles sont soumises à des contraintes mécaniques, paramètre fondamental in situ. En co-culture avec les HUVECs, le phénotype ostéoblastique des HOPs est également régulé et le VEGF (vascular endothelial growth factor) participe de façon étroite à cette régulation. Le phénotype endothélial semble lui aussi modifié en co-culture puisque la migration des HUVECs semble être à l'origine d'un réarrangement cellulaire proche de capillaires. Au sein de microsphères d'alginate cultivées in vitro, les HUVECs stimulent le phénotype ostéoblastique des HOPs. De même, la présence des HUVECs active la minéralisation induite par les HOPs dans une lésion osseuse réalisée in vivo. Cette étude montre que ces cellules sont capables de communiquer et pourraient être à la base de nouvelles stratégies d'ingénierie tissulaire
Bone development and remodelling are dependant on a tight cell cooperation between osteoblastic and osteoclastic cell types, responsible for bone formation and degradation, respectively. Angiogenesis is also a key process involved in these mechanisms and cell communication between osseous and endothelial cells is fundamental This work aims to study the cell communication between human osteoprogenitors (HOPs) arising from bone marrow and human endothelial cells (human umbilical cord endothelial cells : HUVECs). This osteo-endothelial communication was analysed using a well defined in vitro co-culture model in 2D but also into a 3D system into alginate microsphères which were then implanted in vivo in a bone defect in nude mice. In a first part, the HOPs were submitted to a mechanical stress which is an important parameter for the physiology of bone. Their ability to regulate their phenotype was demonstrated under shear stress. In co-culture wuth HUVECs, the phenotype was regulated and VEGF (vascular endothelial growth factor seems to be involved in this regulation. The endothelial phenotype was also regulated in co-culture since HUVECs migration led to a tubular-like cell rearrangement. Into alginate microspheres cultured in vitro, the HUVECs stimulated the osteoblastic phenotype of HOPs. Moreover, after implantation in a bone defect in vivo, the HUVECs enhanced the HOP-induced mineralization. This work shows that the cells are able to communicate and seems promising for the development of new tissue engineering strategies

La régénération osseuse guidée (ROG) est une technique couramment utilisée pour la régénération de perte de substance osseuse. Elle repose sur l’utilisation d’une membrane jouant un rôle de « barrière » en isolant le défaut osseux. Afin de pallier les limites des membranes actuellement utilisées, des recherches récentes tentent de développer de nouvelles membranes dites « bio-actives ». Du fait de ses propriétés biologiques, la membrane amniotique humaine (MAH) pourrait être une alternative aux membranes conventionnellement utilisées pour la ROG. L’objectif principal de ce travail était de déterminer les meilleures conditions d’utilisation de la MAH pour la régénération de pertes de substances osseuses. Dans une première partie expérimentale, l’influence des faces de la MAH appliquées au contact du défaut ainsi que l’effet de la cryopréservation ont été étudiés. Dans une seconde partie expérimentale, une nouvelle méthode de décellularisation de la MAH, simple et reproductible a été développée. Dans une troisième partie expérimentale, la réparation osseuse de défauts de taille non-critiques et critiques a été évaluée en présence de la MAH préservée selon différentes méthodes. Les résultats ont montré que ni les cellules souches contenues dans la MAH, ni la face appliquée au contact du défaut n’avaient d’influence sur la régénération osseuse. La MAH décellularisée/lyophilisée semblait être la méthode de préservation la plus prometteuse en vue de son utilisation en régénération osseuse
Guided bone regeneration (GBR) is commonly used to repair damaged bone. GBR is based on the application of a membrane which will act as a physical barrier to isolate the intended bone-healing space. The development of bioactive membranes has been suggested to overcome some limitations of the currently used membrane. Due to its biological properties, the human amniotic membrane (HAM) is a new biological membrane option for GBR. This study aimed at investigating the most suitable conditions to use HAM for GBR. First, the influence of both HAM sides and the impact of cryopreservation were studied. Then, a new decellularization process of HAM, that is simple and reproducible, has been developed. In a third part, bone regeneration of non-critical and critical sized defects depending on the preservation method of HAM was assessed in rodents. Results showed that neither stem cells found in HAM, nor the HAM layer used to cover the defect had an influence on its potential for bone regeneration. The most promising results were achieved with the decellularized/lyophilized HAM for the field of bone regeneration

Le besoin clinique de nouvelles stratégies pour pallier les limites des techniques actuelles dans le cas de régénération osseuse a permis l’émergence de l’ingénierie tissulaire osseuse. Les stratégies basées sur les techniques d’ingénierie tissulaire semblent être une alternative à l’utilisation de greffes et ainsi de s’affranchir des limites qu’elles présentent. L’approche adoptée dans le cadre de cette thèse consiste en le développement et l’utilisation d’hydrogels comme matériaux d’échafaudage pour le comblement et la régénération de tissus osseux. De nombreuses approches utilisant elles aussi des hydrogels existent, chacune possède ses avantages et limites. Dans ce contexte, nos travaux ont consisté en l’utilisation d’un hydrogel non-polymérique comme matériau de base dans le développement des stratégies. Brièvement, plusieurs types cellulaires sont présents au sein du tissu osseux et vont participer aux processus de formation et de régénération osseuse. L’objectif de nos stratégies a été l’apport de cellules souches exogènes puis leur différenciation en cellules ostéoformatrices, ou le recrutement et la différenciation des cellules de l’hôte en cellules ostéoformatrices. Le gel de GNF a été utilisé comme matrice tridimensionnelle pour ses propriétés d’injectabilité, de gélification en l’absence d’agent de réticulation toxique et son potentiel ostéoinducteur. Ce travail a consisté au développement de stratégies pour l’ingénierie tissulaire osseuse en associant le gel de GNF à une matrice naturelle de collagène cellularisée ou à des molécules bioactives pour promouvoir la régénération de lésions osseuses. Ces travaux ont permis de développer et caractériser des stratégies pertinentes pour la régénération de lésions osseuses basées sur l’utilisation d’hydrogels
New strategies to overcome the clinical limitations of current techniques for bone defect filling and regeneration has led to the involvement of bone tissue engineering. Indeed, strategies based on tissue engineering techniques seem to be an alternative to the use of grafts and thus to defeat their limits. The approach employed in this thesis consists in development and use of hydrogels as scaffold materials for bone defect filling and regeneration. There are many approaches that also use hydrogels, each one with its advantages and limitations. In this context, our work consisted in the use of a non-polymeric hydrogel as basic material in the development of strategies for bone tissue engineering. Briefly, several cell types are present within bone tissue and will participate in the processes of bone formation and regeneration. The objective of our strategies was the contribution of exogenous stem cells and then their differentiation into osteogenic cells or the recruitment and differentiation of the host cells into osteogenic cells within the material. The GNF gel was used as a three-dimensional matrix considering its properties of injectability, gelation in the absence of toxic crosslinking agent and its osteoinductive potential. The goal was to develop strategies for bone tissue engineering by combining the GNF gel with a natural matrix of cellular collagen or bioactive molecules to promote the regeneration of bone lesions. This work allowed to develop and characterize strategies relevant to the regeneration of bone lesions based on the use of hydrogels

Dans différentes situations cliniques, la mise en place d'implants dentaires est parfois impossible du fait d'un volume osseux limité. Les méthodes actuelles de régénération de l'os alvéolaire ne sont pas toujours satisfaisantes et la mise au point de méthodes alternatives est nécessaire pour les cas les plus complexes. De nombreux matériaux de substitution osseuse sont disponibles. Cependant ils ne possèdent pas toutes les propriétés nécessaires pour une régénération osseuse complète, du fait de leur faible potentiel ostéoinducteur et ostéogénique.L’ingénierie tissulaire peut apporter des solutions aux problèmes actuellement rencontrés en reconstruction osseuse. Ces stratégies de régénération tissulaire reposent sur la combinaison d’un biomatériau macroporeux (scaffold) avec des cellules et des biomolécules utilisées pour stimuler la formation tissulaire. Pour fabriquer le scaffold plusieurs techniques existent. Ces dernières années les technologies de prototypage rapide ont gagné en intérêt, car elles offrent une bonne reproductibilité et une grande résolution. Il subsiste la problématique du « chargement » des cellules dans le scaffold macroporeux. L’approche conventionnelle implique de déposer les cellules sur le scaffold et d’espérer sa colonisation par les cellules pour former une construction tissulaire. Plusieurs limites ont été observées dans ce modèle : une faible vascularisation, une diffusion limitée des nutriments et une densité cellulaire faible et inhomogène.L'objectif de ce projet de thèse est de résoudre une partie des limites des biomatériaux macroporeux, en organisant l'ensemencement de cellules ostéoprogénitrices au sein du biomatériau. Basé sur de précédents résultats, nous avons choisi d’adopter une approche d'assemblage couche par couche également appelée « sandwich ». Cette approche devrait permettre de favoriser les interactions entre cellules et de faciliter la maturation des constructions tissulaires. Finalement la qualité et la quantité des tissus produits devraient être améliorées.La première partie du projet a consisté à fabriquer des membranes poreuses. Nous avons développé un nouveau matériau imprimable, fait d’acide poly(lactique-co-glycolique) (PLGA) mixé avec des nanoparticules d’hydroxyapatite (nHA). Le matériau fabriqué sous forme de filament a pu être utilisé pour l’impression 3D par extrusion à chaud (Fused Deposition Modeling = FDM). Le PLGA a été choisi pour son temps de dégradation adapté à la reconstruction osseuse et ses propriétés mécaniques qui sont proches de celles de l’os humain cortical. Les nanoparticules d’HA ont été incluses afin d’améliorer la bioactivité du matériau pour des applications en ingénierie tissulaire osseuse. Ensuite, ces matériaux ont été caractérisés d’un point de vue mécanique et physicochimique, avant les études in vitro et in vivo. Pour ces parties, nous avons travaillé avec la fraction vasculaire stromale issue du tissu adipeux, pour se rapprocher d’une potentielle application clinique. La survie, la prolifération et la différenciation des cellules a été évaluée. Enfin, la régénération osseuse a été observée après implantation des scaffolds dans un défaut de calvaria chez le rat
In several clinical cases, dental implant placement can be hindered if the alveolar bone volume is limited. Current surgical methods for alveolar bone regeneration are not fully satisfying, and more reliable methods to regenerate bone is needed. Several biomaterials for bone substitution are available. However, they do not possess all the necessary properties for complete bone regeneration, as they lack osteoinductive and osteogenic potential.Tissue engineering can provide solutions for current issues in bone reconstruction. Tissue engineering strategies combine engineered scaffold with cells and suitable biochemical soluble factors. To produce the scaffold several techniques are available. These last years rapid prototyping technologies gained a huge interest, as they offer reproducibility and important resolution. The current issues remaining to produce living tissue constructs by bone tissue engineering techniques are related to cell seeding inside the macroporous scaffold. The conventional approach involves seeding cells onto a macroporous scaffold and expects cell colonization to form composite tissue constructs. Many limitations have been observed using this approach, due to slow vascularization, limited diffusion of nutrients, low cell density and non-uniform cell distribution.This project aims to address the limitations of scaffold-based bone tissue engineering, by organizing osteoprogenitor cells inside the scaffold. Based on previous results, we choose to use a layer-by-layer approach. This layer-by-layer fabrication method, also called “sandwich” in this work, should favor cell-material interaction and facilitate the maturation of these constructs. Finally, the amount and quality of tissue regenerated should be enhanced.The first part of the project consisted in the fabrication of scaffolds membranes. We have developed a new material, made of medical-grade poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA) mixed with hydroxyapatite nanoparticles (nHA), in the shape of a filament for 3D printing by Fused Deposition Modelling (FDM). PLGA was chosen for its biodegradation rate and its mechanical properties close to human cortical bone. Nanoparticles of HA were included to improve the bioactivity of the material for bone tissue engineering applications. Then, these materials were characterized for mechanical and physico-chemical properties before in vitro and in vivo studies. In these parts, we used the stromal vascular fraction of adipose tissue, to be closer to a potential clinical translation. The survival, proliferation and differentiation of the cells were evaluated. Finally, bone regeneration was observed after implantation of the constructs in a rat bone calvaria defect model

L'ingénierie tissulaire osseuse est un domaine multidisciplinaire qui vise à produire des substituts tissulaires pour la médecine régénératrice. Ce travail visait à produire des substituts osseux structurés tridimensionnels grâce à un système d'impression d'éléments biologiques par laser développé au laboratoire Inserm U577 (Projet LASIT: LASer pour L'Ingénierie Tissulaire). Les étapes de la thèse ont consisté tout d'abord à préparer des matériaux adaptés à l'impression par laser et à les caractériser au niveau physico-chimique et biologique. Il s'agissait d'hydroxyapatite nano-cristalline, de cellules humaines et d'hydrogels (alginate, matrigel). Ensuite des impressions structurées combinant ces matériaux ont été réalisées en 3 dimensions avant d'être implantés in vivo chez la souris. Les résultats ont montré que l'impression par laser d'éléments biologiques est une méthode efficace pour organiser des matériaux tridimensionnels à plusieurs composants pour l'ingénierie tissulaire
Bone Tissue Engineering is a multidisciplinary field which aims to produce artificial tissues for regenerative medicine. The purpose of this work was to produce three-dimensional bone substitute using a laser-assisted bioprinting (LAB) workstation developped in the laboratory INSERM U577 (TEAL Project: Tissue Engineering Assisted by Laser). The first step of the work consisted in the synthesis of specific materials for LAB and in the characterization of their biological and physico-chemical properties. We have prepared a nano-hydroxyapatite bioink, human cells bioinks and hydrogels bioinks. Then, three-dimensional materials have been prepared using LAB and have been implanted in vivo in mice. The results have shown that Laser Assisted Bioprinting is an efficient method fo patterning 3-D materials using biolgical elements

L’ingénierie tissulaire osseuse est un nouveau domaine visant à restaurer, à maintenir ou à améliorer la fonction tissulaire. Elle implique la présence de trois éléments : des cellules souches, des molécules de signalisation (facteurs de croissance) et un matériau de support tridimensionnel. L’utilisation de produits autologues est de plus en plus favorisée afin d’éliminer tout risque lié à l’utilisation de produits allogènes ou xénogènes. Les extraits sanguins représentent une source autologue potentielle de facteurs de croissance et d’autres molécules qui peuvent être utilisés en ingénierie tissulaire. Notre objectif était d’évaluer, in vitro, les effets de deux extraits sanguins sur le comportement des cellules ostéogéniques de calvaria de rat. Dans la première partie, nous nous sommes intéressés à étudier les effets d’un sérum homologue sur la prolifération et la différenciation ostéoblastique. Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons évalué, in vitro, les effets d’un nouveau matériau de support d’origine sanguine, la globine, sur les cellules ostéogéniques. L’ensemble des résultats montre que ces 2 extraits sanguins sont capables de stimuler la prolifération et la différenciation ostéoblastique, et donc pourraient trouver des applications dans le domaine de l’ingénierie tissulaire du tissu osseux chez l’humain
Tissue engineering is a new domain developed in the aim of restoring, replacing or maintaining biological functions and tissue integrity. H implies the seeding of stem cells on 3D scaffolds in the presence of proper signaling molecules to promote cellular activity. The use of autologous products is preferred, when possible, in order to avoid ail risk associated with the use of allogenous or xenogenous products. Blood derivatives represent a potential autologous source for growth factors as well as other moiecules that couid be used in tissue engineering. Our objective was to evaluate, in an in vitro model, the effects of 2 blood derivatives on the behavior of rat calvaria osteoblastic cells. In the first part, we evaluated the effects of a homologous serum on osteoblastic ce11 proliferation and differentiation. In the second part of this work, we studied the in vitro effects of a new 3D scaffold of blood origin, globin, on osteoblastic cells. Our results show that these 2 blood derivatives are capable of stimulating osteoblastic cell activity and could find, in the future, clinical applications in the field of human bone tissue engineering

Le traitement de l'os est un enjeu majeur en vue des difficultés de l'os à se réparer seul. Plusieurs situations chirurgicales exige l'utilisation d'auto- et/ou allogreffes. Le traitement par autogreffe est celui choisi par prédilection pour la reconstruction osseuse, car elle permet la croissance osteoinductive, fournit les cellules osteogéniques et le scaffold osteoconductif. Cependant cette voie présente de nombreuses limitations telles que la morbidité du site donneur, le temps d'opération allongé, l'insufficance en quantité... Il est ainsi nécessaire de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques capables d'exploiter le pouvoir naturel régénérant de l'os et d'être délivré de manière moins invasive. Parmi les matériaux étudiés pour le développement de nouveaux scaffolds, les ciments phosphocalciques fournissent de larges avantages concernant les perfomances biologiques : biocompatibilité, ostéoconduction, biorésorption, bioactivité... L'idée de ce projet est de développer et caractériser un nouveau ciment phosphocalcique pour la régénération osseuse. Le but est d'aboutir sur un procédé original pour obtenir un scaffold injectable, chargé en principe actif pour ensuite être délivré localement. L'atout majeur de cette structure est sa similarité avec la composition de l'os et ses propriétés mécaniques
The treatment of bone is a challenge due to the difficulty that has the bone to repair itself. Several surgical situations sometimes require the application of auto- and allografts. Autologous bone grafting is the gold-standard treatment for bone reconstruction as it is the only that can provide osteoinductive growth factors, osteogenic cells and osteoconductive scaffold. These procedures present many limitations including donor site morbidity, increased operative time and providing insufficient quantity or quality. There is therefore a need to develop novel therapeutic strategies able to exploit the natural regenerative potential of bone and that can be delivered in a less invasive manner. Among the materials studied for the development of novel scaffolds, calcium phosphate cements provide many advantages due to its biological performances, including their biocompatibility, osteoconductivity, osteoinductivity, biodegradability, bioactivity, and interactions with cells. The aim of this thesis is the development and characterization of novel calcium phosphate based cements for bone regeneration. Our goal is to develop new original processes for the development of injectable scaffolds. The major advantage of such structures lies in the perfect biocompatibility with the mechanical properties similar to those of bone

Les nanotopographies de surface présentant des dimensions comparables à celles des éléments de la matrice extracellulaire offrent la possibilité de réguler le comportement cellulaire. L’étude de l’impact de la nanotopographie sur la réponse cellulaire a été toujours limitée compte tenu des précisions limitées sur les géométries produites, en particulier sur les plus grandes surfaces. Des matériaux base silicium présentant des nanopiliers avec des géométries parfaitement contrôlées ont été fabriqués et leur impact sur la différentiation ostéogénique de cellules souches mésenchymateuses humaines (hMCSs) a été étudié. Des matériaux avec des nanopiliers de dimensions critiques comprises entre 40 et 200 nm et des écarts types inférieurs à 15% sur un wafer de silicium, ont été réalisés en profitant de la capacité d’auto-assemblage des copolymères à blocs. Pour mettre en évidence si des modifications de la chimie de la surface des nanopiliers pourraient favoriser la différenciation des MSCs, des peptides mimétiques ont été greffés sur les matériaux fabriqués. Un peptide connu pour sa capacité d’améliorer l'adhésion cellulaire (peptide RGD), un peptide synthétique capable d'améliorer l'ostéogenèse (peptide mimétique BMP-2) et une combinaison de ces deux peptides ont été immobilisés de manière covalente sur les matériaux silicium présentant des nanopiliers de différentes géométries (diamètre, espacement et hauteur).Les essais d'immunofluorescence et de réaction en chaîne de la polymérase quantitative (RT-qPCR) révèlent un impact des nanotopographies sur la différenciation ostéogénique des hMSCs. De plus, il a été constaté que la différenciation des cellules dépendait de l'âge du donneur. La fonctionnalisation de surface a permis une augmentation supplémentaire de l'expression des marqueurs ostéogéniques, en particulier lorsque le peptide RGD et le peptide mimétique BMP-2 sont co-immobilisés en surface. Cette étude met clairement en évidence l’impact de nanostructures avec différentes bioactivités sur la différentiation de MSCs. Ces matériaux pourront trouver leur place dans des cultures in vitro, dans l’élaboration de nouveaux biomatériaux osseux et dans de nouveaux produits d’ingénierie tissulaire
Nanotopography with length scales of the order of extracellular matrix elements offers the possibility of regulating cell behavior. Investigation of the impact of nanotopography on cell response has been limited by inability to precisely control geometries, especially at high spatial resolutions, and across practically large areas. This work allowed the fabrication of well-controlled and periodic nanopillar arrays of silicon to investigate their impact on osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells (hMSCs). Silicon nanopillar arrays with critical dimensions in the range of 40-200 nm, exhibiting standard deviations below 15% across full wafers were realized using self-assembly of block copolymer colloids. To investigate if modifications of surface chemistry could further improve the modulation of hMSC differentiation, mimetic peptides were grafted on the fabricated nanoarrays. A peptide known for its ability to ameliorate cell adhesion (RGD peptide), a synthetic peptide able to enhance osteogenesis (BMP-2 mimetic peptide), and a combination or both molecules were covalently grafted on the nanostructures.Immunofluorescence and quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) measurements reveal clear dependence of osteogenic differentiation of hMSCs on the diameter and periodicity of the arrays. Moreover, the differentiation of hMSCs was found to be dependent on the age of the donor. Surface functionalization allowed additional enhancement of the expression of osteogenic markers, in particular when RGD peptide and BMP-2 mimetic peptide were co-immobilized. These findings can contribute for the development of personalized treatments of bone diseases, namely novel implant nanostructuring depending on patient age

Le tissu osseux est caractérisé par sa matrice minéralisée qui est soumise à des activités de formation et de résorption assurant son renouvellement et son remaniement tout au long de la vie. En cas de lésions, l’os est capable de se réparer naturellement de façon à rétablir son intégrité et ses propriétés physiques. Cependant, certaines pathologies ou interventions chirurgicales peuvent aboutir à des pertes massives de substance osseuse et le processus naturel d’autoréparation est alors insuffisant. En première intention, la greffe osseuse est envisagée (autogreffe et allogreffe), néanmoins, du fait d’une disponibilité réduite et des risques de rejet et de transmission d’agents infectieux, cette technique n’est pas réalisable dans toutes les situations cliniques. Le chirurgien peut alors avoir recours à des biomatériaux ostéoconducteurs mais ceux-ci ne sont utilisables que dans le cas de comblement de défauts de petite taille car ils sont simplement un support passif à la néoformation osseuse. Ces limites pourraient être dépassées grâce au concept d’ingénierie tissulaire, en concevant des biomatériaux innovants ayant un fort pouvoir ostéogène conféré notamment par des facteurs de croissance ou des cellules ostéoprogénitrices. Dans notre travail, nous avons cherché à mettre au point un nouveau produit d’ingénierie tissulaire permettant la réparation de défauts osseux. La stratégie envisagée repose sur l’association d’un support tridimensionnel et de cellules souches adultes dérivées du tissu adipeux humain (ASC). L’originalité du système provient de la matrice tridimensionnelle, qui est un hydrogel thermosensible composé de monomère synthétique Glycosyl-Nucléoside-Fluoré (GNF) de faible poids moléculaire. Dans le domaine de la régénération osseuse, les hydrogels cellularisés sont généralement utilisés comme matrice associée à des molécules ostéogéniques (BMP2, Béta-Glycérophosphate) ou à des ions (Calcium : Ca2+, Phosphate : PO42-) pour permettre la differenciation ostéoblastique des cellules encapsulées dans le gel. Cependant, dans notre travail, nous n’avons pas fait appel à ces facteurs ostéogéniques. Notre étude a révélé que l’hydrogel de GNF possède les critères essentiels pour être utilisé en clinique : la non-toxicité, la biocompatibilité, la biodégradabilité, l’injectabilité et la biointégration. Des injections de complexe gel/ASC réalisées en site ectopique chez l’animal ont démontré que le gel se forme in situ en moins de 20 minutes et que les cellules encapsulées ont survécu pendant plusieurs mois. In situ, les ASC se sont différerenciées en ostéoblastes matures, exprimant la phosphatase alcaline et l’ostéocalcine et synthétisant une matrice extracellulaire riche en phosphate de calcium. Ces travaux ont donc permis de développer un produit d’ingénierie tissulaire innovant, associant un support tridimensionnel, l’hydrogel de GNF, à une composante cellulaire, les ASC. Cette matrice cellularisée apparaît prometteuse comme système injectable pour des applications cliniques de régénération osseuse
Bone tissue is characterized by its mineralized matrix which is subject to formation and resorption activities ensuring its renewal and remodeling throughout the life. In case of damage, the bone can repair itself naturally to restore its integrity and its physical properties. Nevertheless, some pathologies or surgical procedures can lead to massive loss of bone and the natural process of self-repair is insufficient. First line, the bone graft is considered (autograft and allograft), however, due to reduced availability and risks of rejection and transmission of infectious agents, this technique is not feasible in all clinical situations. The surgeon can then make use of osteoconductive biomaterials but these are only usable in the case of filling of small defects because they are simply passive scaffold for bone formation. These limits may be exceeded through the concept of tissue enginee- ring, designing innovative biomaterials with high osteogenic power conferred by particular growth factors or osteoprogenitor cells. In our work we seek to develop a new product of tissue engineering to repair bone defects. The proposed strategy is based on the combination of a three-dimensional scaffold and adult stem cells derived from human adipose tissue (ASC). The originality of this system comes from the three-dimensional matrix, which is a thermosensitive hydrogel composed of synthetic monomeric Glycosyl-Nucleoside-Fluorinated (GNF) low molecular weight. In the field of bone regeneration, hydrogels are generally used as cellularized matrix molecules associated with osteogenic (BMP2, Beta-Glycerophosphate) or ions (Calcium : Ca2+, Phosphate : PO42-) to allow osteoblast differentiation of cells encapsulated in the gel. However, in our work, we have not used these osteogenic factors. Our study revealed that the hydrogel of GNF has the essential criteria to be used in clinical practice : non-toxicity, biocompatibility, biodegradability, injectability and biointegration. Injections of gel/ASC complex performed in animal ectopic site have showed that the gel is formed in situ within 20 minutes and encapsulated cells survived and proliferated for several months. In situ, ASC were differentiated into mature osteoblasts expressing alkaline phosphatase and osteocalcin and synthesizing an extracellular matrix rich in calcium phosphate. So, this work has allowed the development of an innovative product for tissue engineering, combining a three-dimensional scaffold, the GNF based hydrogel, a cellular component, the ASC. This cellularized matrix appears promising as injection system for clinical applications of bone regeneration

La culture tridimensionnelle (3D) et l'ingénierie du tissu osseux sont deux thématiques basées sur l'utilisation de matrices permettant de véhiculer des cellules ostéogéniques dans le but d'obtenir une formation osseuse in vitro et in vivo respectivement. La culture 3D est un enjeu important en biologie car elle permet de restaurer certaines propriétés tissulaires perdues en culture bidimensionnelle (2D) sur plastique. De nombreux travaux sont actuellement dédiés à la mise au point de matrices utilisables comme support de culture 3D des cellules osseuses. Sur la base d'une matrice constituée de particules de phosphate de calcium biphasé (BCP) j'ai mis au point un modèle original de culture 3D qui permet le développement d’un tissu ostéoïde et la différenciation spontanée d'ostéoblastes humains en ostéocytes. Ce modèle 3D ouvre une nouvelle voie d’étude des ostéocytes qui sont les cellules majoritaires du tissu osseux mais les plus mal connues du fait de leur accessibilité difficile et du manque de modèles d'étude disponibles. L'ingénierie tissulaire osseuse a pour but de reconstruire le stock osseux grâce à l'association de matrices, de facteurs ostéoinducteurs et/ou de cellules ostéogéniques. La majorité des travaux menés actuellement dans ce domaine préconisent l’utilisation de cellules stromales mésenchymateuses (MSC) pour améliorer les performances de ces matrices. Cependant le mécanisme d’action de ces cellules est encore peu documenté. Basé sur l'utilisation des mêmes particules de BCP, j'ai participé à la mise au point d'un nouveau biomatériau développé et breveté au laboratoire et à son utilisation comme véhicule de MSC de souris pour l'étude de la formation osseuse en site ectopique. La mise au point d'une méthode de suivi quantitatif de la survie des cellules implantées a permis de montrer que ces MSC disparaissaient très rapidement, laissant la place aux cellules de l'hôte qui sont à l'origine du tissu osseux. Nous avons conclu que, dans ce modèle, les MSC implantées jouent très probablement un rôle chimiotactique pour les cellules de l'organisme receveur. Une étude préliminaire des molécules impliquées dans ce rôle chimiotactique à été effectuée, permettant de proposer une nouvelle approche pour l’ingénierie tissulaire osseuse
Three-dimensional culture (3D) of bone cells and bone tissue engineering are both based on the use of scaffolds to convey osteogenic cells and obtain in vitro and in vivo bone formation respectively. 3D culture is an important field in cell biology, dedicated to reduce the gap between two-dimensional culture and complex tissue architecture. Many works have described various scaffolds as support for the 3D culture of bone cells but in two studies only the presence of osteocyte-like cells have been detected after very long periods of culture. I have engineered an original model of 3D culture in which human primary osteoblasts are seeded within the interspace of calibrated biphasic calcium phosphate particles (BCP). This system results, after one week, in the development of an osteoid matrix and the spontaneous differentiation of the osteoblasts in osteocytes. This model of primary osteocyte differentiation in 3D is a new tool to gain insights into the biology of osteocytes, which compose over 90-95% of bone cells but are difficult to study due to their accessibility and the very rare models available in vitro. The aim of bone tissue engineering is to regenerate the bone stock through a combination of scaffolds, osteogenic factors and / or osteogenic cells. The majority of the studied in this field advocates the use of mesenchymal stromal cells (MSC) but the mechanism of action of these cells is still poorly documented. Based on the use of BCP particles, I have participated to the development of a new bone substitute, which has been patented in our laboratory. I have used this new biomaterial as a vehicle for mouse MSC in a model of ectopic bone formation. Using a method of quantitative tracking of the implanted cells, I have shown that the implanted MSC disappeared very quickly from the implants whereas host cells were progressively recruited suggesting that host cells are responsible for the bone formation. We have concluded that, in this model, MSC play a chemotactic function towards host cells. A preliminary study of the putative molecules involved in this phenomenon was performed with the aim of proposing a new