Дисертації з теми "Immunologie humaine"

Le suivi, depuis plus de quinze ans, d'une population humaine exposee a leishmania (viannia) panamensis, a permis de distinguer des individus resistants et des individus sensibles a cette espece de leishmanie. Il a ete possible de beneficier de la participation d'individus de ces deux groupes pour comparer : (1) la permissivite de leurs phagocytes mononuclees exposes ou non a de l'ifn- exogene, a l'entree de promastigotes ou d'amastigotes et a leur devenir intracellulaire, (2) la production de cytokines activatrices (ifn-, tnf-) ou de-activatrices (il-10) des phagocytes mononuclees, par les leucocytes mononuclees cultives en presence de parasites morts ou vivants. Les phagocytes mononuclees des patients sensibles/recurrents sont plus permissifs au parasite que ceux des individus resistants. En presence d'ifn- exogene, la permissivite des phagocytes mononuclees au parasite est d'autant plus diminuee que les cellules proviennent des individus sensibles. La production d'ifn- par les leucocytes mononuclees des individus resistants a tendance a etre plus importante que celle des individus sensibles, tandis que celle de tnf- et d'il-10 ne differe pas. Toutefois, il a ete possible d'etablir l'existence d'une correlation positive entre trois cytokines deux a deux, a partir des echantillons des individus resistants. Si la frequence des lymphocytes t cd8+, reactivables par le parasite vivant, a tendance a etre plus elevee dans le groupe des patients resistants, la resistance a la reinfection semble etre associee a la secretion d'ifn-, aussi bien par les lymphocytes cd4+ que cd8+.

La réceptivité de l’endomètre à l’embryon est un point crucial en reproduction. Il semblerait qu’une synchronisation entre l’endomètre maternel et le développement de l’embryon soit nécessaire. Pour se faire, les stéroïdes ovariens préparent le contact de l’endomètre avec l'embryon. De son côté, l’embryon communique avec l’endomètre par l’intermédiaire d’un vaste réseau moléculaire. Dans certains cas d’infertilité, la réceptivité maternelle est altérée, il en résulte alors un échec d’implantation. D’où l’importance d’explorer le côté maternel de l’implantation. C’est pourquoi, en tenant compte des précédents travaux menés au laboratoire, portant sur le système IL (interleukine) 1, la hCG (hormone gonadotrophine chorionique humaine) et les cellules de l’endomètre, nous avons étudié le rôle de ces deux facteurs embryonnaires précoces, dans l’acquisition de la réceptivité endométriale, au début du phénomène d’implantation. Ce projet de recherche sur la physiologie de l’implantation embryonnaire est strictement fondamental et représente la base pour une meilleure compréhension de la fertilité et l’infertilité féminine. Pour se faire, des approches in vitro et in vivo ont été utilisées. Nos résultats semblent indiquer que la famille de l’IL1 est ciblée de façon originale par la hCG. Celle-ci semble favoriser l’effet de l’IL1 par le biais d’un déséquilibre pro-fonctionnel touchant les différents récepteurs. En outre, l’effet de la hCG sur les différentes cibles de l’IL1 apparaît sélectif et semble modérer certains aspects qui pourraient s’avérer néfastes pour l’implantation embryonnaire, tandis qu’elle favorise certaines cibles par effet de coopération. Nos travaux démontrent l’existence d’une dynamique dans l’expression des différents récepteurs de l’IL1 en lien avec la présence du chef de file des facteurs embryonnaires, la hCG.
The endometrium receptivity for embryo is a crucial feature in reproduction. Overall, it seems that synchronization between the maternal endometrium and the developing embryo is necessary. At the maternal side, the appointment with the embryo is carefully prepared by ovarian steroids’ action. An another hand, the embryo communicates with the endometrium through a large molecular network. In some cases of infertility, maternal receptivity is altered, resulting in implantation failure. Moreover, the maternal side of implantation is in question. Therefore, taking into account our previous studies revealing a close cooperation between major and early embryonic signals, hCG (human chorionic gonadotropin) and interleukin1 (IL1), at the feto-maternal interface, we have studied the role of these embryonic factors in the acquisition of endometrial receptivity. This research on the physiology of embryo implantation is strictly fundamental and the basis for a better understanding of female fertility and infertility. Using in vitro and in vivo approaches, our results suggest that the IL1 family is targeted in an original way by hCG. This seems to favor the effect of IL1 through a functional imbalance affecting different IL1 receptors. In addition, the effect of hCG on various targets of IL1 appears to be selective and seems to moderate some aspects that could be detrimental for embryo implantation, while it favors certain targets by synergic cooperation. Our work demonstrates the existence of a dynamic expression of different IL1 receptors in link with the presence of hCG, the leading embryonic factor.

Les épithéliums pluristratifiés muqueux du vagin et de l’exocol utérin abritent les cellules de Langerhans dont le rôle est de détecter et de capturer ces agents pathogènes. Situées au niveau des couches basales de ces épithéliums, les cellules de Langerhans ont cependant besoin d’un signal d’alerte afin de migrer vers les couches superficielles et de capturer l’agent pathogène. Le CCL20, chémokine sécrétée par les cellules épithéliales, semble avoir un rôle majeur dans cette migration au niveau de l’épiderme. Nous avons étudié l’existence d’un tel mécanisme au niveau du tractus génital féminin. Nous avons réalisé un modèle de muqueuse vaginale humaine simplifiée présentant des caractéristiques de différenciation et intégrant des cellules de Langerhans comparables aux tissus in vivo. Nous avons montré la capacité des cellules épithéliales vaginales à sécréter du CCL20 de façon polarisée au cours d’un processus inflammatoire ainsi que son efficacité à attirer des précurseurs des cellules de Langerhans. Nous avons également mis en évidence le rôle du plasma séminal dans l’attraction des précurseurs des cellules de Langerhans, indirectement par la stimulation de la production de CCL20 par les cellules épithéliales vaginales, et directement par la présence de MCP-1. Enfin, nous avons sélectionné les composés capables de stimuler les premiers mécanismes immunitaires du tractus génital féminin. Le DC-Chol et le zymosan sont les molécules les plus efficaces pour respectivement stimuler la production de CCL20 par les cellules épithéliales du tractus génital féminin et induire la maturation des cellules de Langerhans.

Notre travail est consacré à l'étude du rôle de la molécule tolérogène HLA-G en transplantation pulmonaire (TxP) humaine. La principale complication après TxP est la situation de rejet chronique qui traduit une rupture de la tolérance du greffon pulmonaire par le receveur. Parmi les nombreuses voies évoquées amenant une tolérance opérationnelle, l'un des mécanismes impliqués pourrait être lié à l'expression de la molécule tolérogène HLA-G, comme rapporté dans d'autres transplantations d'organes solides. Nous avons montré dans une étude rétrospective transversale une induction possible de l'expression de HLA-G au sein du greffon pulmonaire (notamment de cellules épithéliales bronchiques [CEB]), associée à la stabilité fonctionnelle du greffon. Nous avons montré en parallèle, via l'utilisation de cultures de CEB humaines, une induction de l'expression bronchique de HLA-G sous l'influence du microenvironement. Une seconde étude prospective clinique a montré une valeur prédictive de l'expression bronchique de HLA-G de faible risque de survenue d'un rejet chronique à long terme, permettant l'utilisation de HLA-G comme biomarqueur de stabilité du greffon. Nous avons enfin mis au point un modèle ex-vivo permettant d'investiguer le rôle immunosuppresseur des CEB sur l'alloréactivité T chez un même patient greffé. Nous avons montré une altération, des propriétés immunosuppressives des CEB chez des greffés stables. L'inhibition des CEB semblent impliquer HLA-G. L'association de la perte des propriétés inhibitrices des CEB à une augmentation de l'alloréactivité T chez les greffés stables suggère un possible rôle dans la genèse des lésions de rejet chronique
We studied the role of the tolerogenic molecule HLA-G in human lung transplantation (LTx). The major complication after LTx is chronic rejection, breaking with a tolerance state of the recipient. Among different pathways involved in operational tolerance, one mechanism could involve the expression of the HLA-G molecule, as reported in other solid-organ transplantation. We first showed in a retrospective study a possible induction of HLA-G expression in the lung graft of some stable LTx recipients (notably in bronchial epithelial cells [BEC]), associated with functional stability of LTx recipients. We showed in parallel, via the use of primary culture of human BEC, a possible induction of bronchial expression of HLA-G under influence of factors from bronchial microenvironnement. A second prospective study showed a role of HLA-G as predictive marker of low risk of chronic rejection in lung transplant recipients, suggesting a role for the use of HLA-G as a biomarker of graft stability. Lastly, we performed an ex-vivo model to investigate the immunosuppressive role of BEC on T cell response, studying cells from same LTx recipient. We showed altered inhibitory properties of BEC in stable LTx. The inhibition of CEB seemed to involve HLA-G molecule. The association of the loss of inhibitory properties of BEC with an increased T cell alloresponse in stable LTx recipients suggest a possible role in the mechanisms of chronic rejection in LTx

L'infection de la muqueuse intestinale par le virus de l'immunodeficience humaine (vih) se traduit souvent par un syndrome enteropathique: atrophie villositaire, defaut d'absorption, enterites, diarrhees. Le but de ce travail est d'etudier les mecanismes impliques dans l'infection des cellules de l'epithelium intestinal en utilisant des lignees d'adenocarcinome de colon (ht29, caco 2) comme modeles. La production virale est associee a une hypertrophie de l'appareil de golgi, elle-meme a l'origine d'une differenciation incomplete de la membrane plasmique apicale. Ces perturbations, consecutives a l'infection des cellules intestinales par le vih, pourraient etre a l'origine du syndrome enteropathique associe au vih chez les individus infectes. L'interferon gamma protege les cellules ht29 de l'infection par le vih et le facteur necrotique des tumeurs stimule la replication du virus. L'infection des cellules intestinales par le vih peut se faire aux deux poles de la cellule. Nos travaux ont permis d'identifier un nouveau recepteur du vih dans les cellules intestinales, de nature glycolipidique, le galactosyl ceramide (galcer), cd4 n'etant pas exprime par ces cellules. Nos resultats suggerent que le galcer, qui est un glycolipide majeur des cellules epitheliales de l'intestin grele et du colon chez l'homme est un element fondamental du recepteur du vih dans ces cellules

L'Interleukine-15 (IL-15) est une cytokine qui présente des activités semblables à celles de l'IL-2 in vitro du fait de l'utilisation commune des chaînes réceptrices IL-2Rβ et γc, la spécificité d'action étant conférée par une chaîne réceptrice α. L'IL-15Rα existe sous forme soluble après clivage protéolytique de la forme membranaire. Dans cette étude, nous avons caractérisé les mécanismes moléculaires régulant les activités agonistes et antagonistes des formes solubles de la chaîne IL-15Rα. Nous avons mis en évidence que le domaine du sIL-15Rα codée par l’exon 3 et, située à l'extrémité C-terminale du domaine sushi liant la cytokine, participe à la forte affinité du complexe IL-15/sIL-15Rα et est indispensable à la fonction antagoniste du récepteur soluble. Nous avons également montré le rôle primordial du complexe IL-15/sIL-15Rα dans des pathologies cancéreuses et inflammatoires grâces au pouvoir pro-inflammatoire induit par le sIL-15Rα dans les cancers de la tête et du cou et son implication dans la réponse thérapeutique à l'infliximab (anti-TNF) dans la maladie de Crohn. Ce travail montre que le sIL-15Rα est une composante importante dans la régulation des activités de l'IL-15 et pourrait conduire à différentes applications thérapeutiques
The Interleukin-15 (IL-15) is a cytokine which outlines similar activities as those of IL-2 in vitro because of the common use of IL-2Rβ and γc chains. The specificity of action is conferred by a private α chain (IL-15Rα). The α chain exists in soluble form after proteolytic cleavage of the membrane anchored IL-15Rα. In this study, we characterized the molecular mechanisms regulating the agonistic and antagonistic activities of the soluble forms of IL-15Rα (sIL-15Rα). We highlighted that the exon 3 encoded domain of the sIL-15Rα, located at the C-terminal end of the IL-15 binding domain (sushi) which participates to the high affinity of the IL-15/sIL-15Rα complex and is necessary for the antagonistic function of the soluble receptor. We also showed the vital role of this complex in cancer and inflammatory diseases through the capacity to escape to immunity of tumor with sIL-15Rα in head and neck cancers and it involvement in the therapeutic response to infliximab in Crohn disease. This work shows that the sIL-15Rα is an important component in the regulation of IL-15 and could lead to different therapeutic applications

L'interaction de la capside (ÇA) du VIH-1 avec des protéines cellulaires influence l'infectivité virale. Ainsi, la ÇA lie la cyclophiline A (CypA) et interagit avec le facteur de restriction TRIMSalpha. Au cours de nos travaux, nous avons étudié plusieurs aspects des interactions de la ÇA avec ces protéines. Plusieurs isoformes de TRIM5 existent, dû à un épissage alternatif. Nous avons montré que TRIMSalpha ne représente que 50% des transcrits produits, identifié deux nouveaux isoformes qui ont un effet dominant négatif sur l'activité TRIMSalpha, et montré que leur niveau d'expression peut réduire l'activité de TRIMSalpha dans les cellules humaines. HuTRIMSalpha ne restreint que modestement la réplication des souches VIH-1 de laboratoire. Nous avons montré que des virus exprimant les séquences de ÇA issues d'isolats cliniques peuvent être plus sensibles à huTRIMSalpha, et que cette sensibilité est modulée par la CypA et les formes alléliques de huTRIMSalpha rencontrées. Nous avons montré que la sensibilité à huTRIMSalpha de souches cliniques était due à la présence de mutations d'échappement aux CTL dans des épitopes de la ÇA. L'étude des patients HLA-B57+ qui contrôlent ou pas la réplication virale et des patients non HLA-B57 a montré que les patients HLA-B57+ ont des virus plus sensibles à huTRIMSalpha, que la sensibilité à ce facteur corrèle avec la charge virale des patients et qu'une mutation dans un épitope CTL capsidique était un déterminant important de cette sensibilité. Dans l'ensemble, nos résultats suggèrent que la pression exercée par TRIMSalpha ainsi que la sensibilité du VIH-1 à ce facteur sont des déterminants du contrôle ou non de la réplication virale
The interaction of HIV-1 capsid (ÇA) with cellular proteins influence viral infectivity. The ÇA binds cyclophilin A (CypA) and interacts with the restriction factor TRIMSalpha. Our studies have evaluated several aspects of ÇA interaction with these cellular proteins. Numerous TRIM5 isoforms exist due to alternative splicing. We have demonstrated that TRIMSalpha represents only 50% of total TRIM5 transcripts and have identified two previously uncharacterized isoforms with dominant-negative activity against TRIMSalpha. We have shown that their physiological levels of expression can reduce the TRIMSalpha activity in human cells. HuTRIMSalpha exerts a modest inhibition on the replication of laboratory-adapted HIV-1 strains. We have shown that HIV-1 viruses carrying ÇA sequences from clinical isolates can be more sensitive to huTRIMSalpha and that this sensitivity can be modulated by CypA and the TRIMSalpha alleles expressed by the target cells. We showed that the increased sensitivity to huTRIMSalpha of some clinical strains is due to the presence of CTL escape mutations in capsid epitopes. A study with HLA-B57+ patients who spontaneously control or not the viral replication and HLA-B57 negative patients found that viruses from HLA-B57+ patients are more sensitive to huTRIMSalpha, that the sensitivity to this factor correlates with the plasma viral load of patients and that one CTL escape mutation in ÇA epitope is an important determinant of this sensitivity. Taken together, our results suggest that the immune pressure exerted by huTRIMSalpha and viral sensitivity to this restriction factor are determinants that influence the ability of the host to control viral replication

Le cytomégalovirus humain et le VIH-1 inhibent l'expression membranaire des molécules HLA de classe I classiques pour échapper au système immunitaire. Ainsi, nous avons analysé l'expression de la molécule HLA-G1 après infection par ces deux virus. HLA-G1, exprimée essentiellement au niveau du placenta, est une molécule de classe I non classique qui est décrite pour avoir un rôle important pendant la grossesse. Tout d'abord, nous démontrons que le cytomégalovirus diminue l'expression membranaire de HLA-G1. Cette diminution dépend de la protéine virale US2. Par contre, US11 s'associe à HLA-G1 mais ne la dégrade pas à cause du domaine cytoplasmique court de HLA-G1. Concernant le VIH-1, via la protéine Vpu et indépendamment de Nef, ce virus diminue également l'expression membranaire de HLA-G1
Human cytomegalovirus and HIV-1 down-modulate classical MHC class I molecules cell surface expression to escape to the immune system. In this way, we analysed HLA-G1 cell surface expression after HCMV or HIV-1 infection. HLA-G1 is a non classical MHC class I molecule that play an important role during pregnancy. First, we demonstrate that cytomegalovirus down-modulates HLA-G1 cell surface expression. This decrease depends on the viral protein US2 that induces HLA-G1 degradation. At the opposite, US11 lies HLA-G1 but because of it short cytoplasmic tail HLA-G1 is not degraded by US11. Concerning HIV-1, this virus also down-regulates HLA-G1. This inhibition is Vpu-dependent but Nef-independent

L'immunosuppression générale est utilisée pour traiter les patients transplantés ou greffés avec des cellules souches. Ils ont des effets secondaires graves et sont peu efficaces à long terme. li faut donc développer de nouvelles stratégies thérapeutiques, plus ciblées, pour limiter ces effets secondaires et améliorer la qualité de vie des patients. Le niveau d'expression de la molécule CD45RC permet de distinguer, les cellules CD45RChigh associées au rejet de greffe et à la GVHD, et les cellules CD45RClow qui ont des fonctions régulatrices importantes et inhibent ces maladies. Nous avons étudié le potentiel thérapeutique d'un anti--CD45RC mAb injecté à court terme dans des modèles de greffe et de GVHD. Dans le modèle de greffe cardiaque chez le rat, l'anticorps prévient le rejet de greffe dans 60 à 80% des cas. Dans les modèles de GVHD chez le rat et la souris NSG, l'anti-CD45RC mAb associé à la rapamycine permet de prévenir la GVHD dans 50% des rats el la totalité des souris. Nous avons montré que cet anticorps induit la déplétion transitoire des L Ts CD45RChigh par apoptose. Le nombre de LTs CD45RClow est augmenté au cours du traitement el leur potentiel suppresseur est accru à long terme in vitro et in vivo. En effet le transfert adoptif des cellules, de rats tolérants leur greffon à long terme, à de nouveaux rats greffés cardiaque (même configuration génétique}. prévient le rejet de greffe. Nous avons également montré que les réponses immunitaires naïves et mémoires ne sont pas affectées. Le traitement court avec un anti-CD45RC mAb a donc un potentiel thérapeutique important dans la prévention du rejet de greffe et de la GVHD
General immunosuppressants serve lo treat solid organ or CSH transplanted patients. But they have many side effects and their efficacy is limited at long term. So its necessary lo develop new therapeutic strategies, more specific, to limit these side effects and lo improve patient quality life. The leval of expression of CD45RC distinguishes Iwo different cells types. Cells expressing CD45RChigh are associated with allograft rejection and GVHD, while cells that dont express CD45RC haveregulatory properties and inhibit these diseases. We studied the therapeutic potential of anti-CD45RC mAb as a short treatment in allograft and GVHD models. ln the heart allograft rat model, the antibody prevents rejection in 60 to 80% of the case. ln the GVHD model (rat of NSG mice), association of anti-CD45RC mAb and rapamycin prevents 50% of GVHD in the rat and all in NSG mice. We showed that the antibody induces a transitory depletion of CD45RChigh T cells throughapopolosis, while the number of CD45RClow T cells is increased and their regulatory properties are improved in vitro and in vivo. Indeed, adoptive transfer of tolerant rat lo new irradiated heart grafted rat prevents allograft rejection. We also describe that naive and memory immune responses are not impaired by the treatment Short course treatment with anti--CD45RC mAb hes a great potential lo prevent allograft rejection and GVHD

Un organe est dit immunologiquement privilégié lorsqu’il permet la survie d’allogreffes. Le privilège immun de l’œil a d’abord été décrit pour la chambre antérieure de l’œil puis étendu à l’espace sous-rétinien qui est délimité par les photorécepteurs et les cellules de l’épithélium pigmentaire (EPR). Vers le milieu des années nonante, Janet Liverdsidge a montré que les cellules de l’EPR étaient capables d’inhiber l’activation lymphocytaire (effet immunosuppressif des cellules de l’EPR). Parallèlement, plusieurs équipes ont montré que les uvéites postérieures non infectieuses (UPNI) étaient associées à une activation pathologique des mêmes cellules de l’EPR. Le but de notre travail a été dans un premier temps de préciser les mécanismes responsables de l’effet immunosuppressif des cellules de l’EPR et dans un deuxième temps de mieux caractériser les processus impliqués dans leur activation, afin d’imaginer de nouvelles stratégies pour traiter les UPNI. Nous avons d’abord observé que les cellules de l’EPR étaient incapables d’activer des lymphocytes T naïfs mais au contraire inhibaient la prolifération de lymphocytes T activés et induisaient leur apoptose. Nous avons corrélé cette inhibition à un phénotype de cellules présentatrices d’antigène déviantes puisque si, après stimulation par interféron γ (IFNγ), l’EPR exprimaient des molécules du CMH de classe II et du CD40, elles étaient incapables d’exprimer le B7.1 ou le B7.2, ni de sécréter de l’IL-12, même après stimulation par le CD40 ligand. Ensuite, nous avons pu mettre en évidence que les cellules de l’EPR phagocytaient les lymphocytes T et que cette phagocytose était en partie responsable de l’inhibition de la prolifération lymphocytaire. De plus, cette phagocytose était associée à une diminution de la transcription du gène de l’Il-1β induite par le TNFα. Enfin, nous avons étudié l’effet de la 15-deoxy-delta 12,14-prostaglandin J2 (15 PGJ2), un nouvel immunomodulateur potentiel, sur l’activation des cellules de l’EPR par l’IFNγ. Nous avons ainsi pu démontrer que, indépendamment du PPARγ, la 15 PGJ2 était capable d’inhiber l’induction de l’expression du CMH de class II par l’IFNγ. Parallèlement, nous avons mis en évidence que la stimulation des cellules de l’EPR par l’IFNγ induisait une activation de STAT1, ainsi que la transcription du class II transactivator (CIITA) et de SOCS1. Néanmoins, nos résultats ont aussi montré que l’effet inhibiteur de la 15PGJ2 n’était pas dépendant d’une modulation de l’activité de STAT1 ou de la transcription de SOCS1 ou du CIITA et n’impliquait pas la voie d’ERK1/2 ou de la PKB. Enfin, étant donné le rôle important du TNFα dans l’activation pathologique des cellules de l’EPR et le développement d’UPNI, nous avons analysé l’effet d’une approche thérapeutique anti-TNFα chez des patients atteints d’UPNI. Nos données ont montré que l’inhibition du TNFα par une protéine de fusion du fragment p55 du récepteur au TNFα améliorait l’état clinique de patients souffrant d’UPNI. De plus, nous avons corrélé cet effet bénéfique à une augmentation de la sécrétion intra-cytoplasmique d’IL-10 par les lymphocytes T CD4 + périphériques ainsi qu’à une augmentation du ratio entre les lymphocytes secrétant de l’IL-10 et ceux secrétant de l’IFNγ. En conclusion, nous avons pu observer que les cellules de l’EPR étaient capables d’inhiber la prolifération de lymphocytes T activés par des mécanismes de présentation déviante d’antigène, induction d’apoptose et phagocytose. Néanmoins, nos résultats ont démontré qu’à coté de ces propriétés immunosuppressives, les cellules de l’EPR pouvaient également être activées par l’IFNγ et le TNFα. Différentes approches biologiques ont été investigués pour bloquer cette activation pathologique.
Doctorat en sciences médicales
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La technologie des biopuces à ADN est un outil puissant permettant d'étudier en profondeur le profil transcriptomique d'une population cellulaire donnée. Nous avons mis à profit cette technique pour étudier les changements induits par le VIH-1 chez divers types cellulaires du système immunitaire. Notamment, nous avons déterminé l'influence du VIH-1 sur une population hautement enrichie en lymphocytes T CD4+. Cette étude nous a permis d'identifier des modulations transcriptionnelles dans plusieurs voies cellulaires importantes, dont l'apoptose, le cycle cellulaire, le métabolisme de l'ARN et la réparation du dommage à l'ADN. Nous nous sommes attardés sur la modulation de p53 au niveau de l'ARNm; nous démontrons que cette induction est dépendante d'une réponse interferon de type I. En cours de route, nous avons réalisé que le taux d'infection par le VIH-1 chez les cellules primaires était très faible - les changements décrits ci-haut sont donc susceptibles de survenir dans la population exposée au virus mais non-infectée. Afin de mieux comprendre les facteurs qui influencent l'infection au VIH-1 et les effets de celle-ci sur le transcriptome des cellules infectées, nous avons construit un virus rapporteur permettant l'isolation de cellules infectées. Nous avons utilisé ce virus pour quantifier le profil transcriptomique de lymphocytes T CD4+ infectés à l'aide de puces à ADN de dernière génération. Ces puces contiennent des sondes dirigées vers chaque exon connu, ce qui permet de détecter des changements au niveau de l'épissage alternatif en plus de l'expression génique. Les résultats démontrent qu'une sous-population de lymphocytes est particulièrement susceptible à l'infection. Finalement, nous avons procédé à la quantification transcriptomique à grande échelle des changements induits par un virus portant CD40L à sa surface sur une population de cellules B. Nous démontrons que ce virus est présent dans le plasma de patients infectés et est suffisant pour activer les lymphocytes B de façon polyclonale, ce qui pourrait expliquer en partie les déficiences observées chez ce type cellulaire chez les patients infectés au VIH-1.

La leucémie lymphoïde chronique (LLC), leucémie la plus fréquente chez l’adulte, est caractérisée par l’accumulation de petits lymphocytes B matures dans la moelle osseuse, les organes lymphoïdes secondaires et le sang périphérique due à une prolifération anormale et à une résistance accrue à l’apoptose des cellules B. La LLC est d’évolution lente et de pronostic variable ; certains patients sont asymptomatiques alors qu’à l’inverse, d’autres présentent une forme agressive de la maladie associée à des complications potentiellement mortelles. Bien que les altérations génétiques jouent un rôle clé dans la pathogénèse de la maladie, elles ne sont pas suffisantes au développement de la maladie. De nombreuses études ont effectivement démontré que les interactions des B-LLC avec les cellules présentes dans l’environnement tumoral sont essentielles pour leur prolifération et promeuvent leur résistance à l’apoptose. Ainsi, les lymphocytes B-LLC migrent dans les ganglions, et rencontrent des lymphocytes T activés qui favorisent leur prolifération et leur résistance à l’apoptose. De plus, un modèle de transfert adoptif de lymphocytes T CD4+ autologues dans des souris a démontré leur capacité à promouvoir la survie et la prolifération des lymphocytes B-LLC in vivo, mettant en avant le rôle des lymphocytes T dans la pathogénèse de la LLC. Différentes sous populations de lymphocytes T CD4+ coexistent, chacune ayant ses propres caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles. Malgré de nombreuses études sur le rôle des LTh dans la LLC, l’implication de chacune des sous-populations dans la pathogénèse de la LLC reste à définir. À titre d’exemple, de grandes quantités plasmatiques d’IFNγ sont détectées dans un modèle murin de LLC, suggérant un rôle des lymphocytes Th1. Par opposition, la progression de la LLC dans un modèle génétique murin, a été démontré comme étant indépendante de cette accumulation de Th1. De plus, de nombreuses études utilisant des modèles murins ou des prélèvements de patients ont également mis en lumière l’implication d’autres sous populations de LTh telles que les lymphocytes Th2 et Th9. Ces résultats controversés peuvent s’expliquer par l’utilisation de différents modèles murins ou d’études chez des patients à différents stades de la maladie, ou sous traitement. Il parait ainsi important d’obtenir une vue d’ensemble du compartiment T chez des patients LLC aux différents stades cliniques de la maladie et de s’affranchir de l’effet des traitements. Pour cela, nous avons réalisé une analyse non supervisée, par cytométrie en flux, sur le sang d’individus contrôles et de patients LLC non traités. Nos résultats ont montré une expansion des lymphocytes T folliculaires helper (Tfh) CXCR5+ qui jouent un rôle critique dans la sélection, la survie et la différenciation des lymphocytes B en cellules B sécrétrices d’anticorps et en lymphocytes B mémoires via leur expression de CD40L et leur production d’IL-21. Ces lymphocytes Tfh de patients LLC sont PD1+IL-21+IFNγ+ et donc orientés vers un phénotype Th1 et activés. L’accumulation des Tfh est positivement corrélée avec le stade clinique de la maladie et négativement corrélée avec les taux sériques d’IgG et d’IgA, l’hypogammaglobulinémie étant un facteur de risque de complications infectieuses. De plus, une corrélation existe entre le nombre de Tfh et la charge tumorale, représentée par le nombre de lymphocytes B malins circulants. Finalement, nous avons montré que les lymphocytes Tfh sont capables d’induire la prolifération des lymphocytes B-LLC in vitro, par un mécanisme dépendant de l’IL-21 mais indépendant de l’IFNγ. Nos données démontrent donc un rôle des lymphocytes Tfh dans la progression de la maladie
Chronic lymphocytic leukemia (CLL), one of the most common adult leukemia, is associated with variable outcomes, ranging from patients who have a stable disease with a nearly normal life expectancy to patients with a progressive disease and severe complications that ultimately lead to a poor survival. CLL is defined by the accumulation and proliferation of mature CD5+ B-lymphocytes in the bone marrow, peripheral lymphoid organs and blood. Although genetic alterations play a key role in CLL pathogenesis and support malignant transformation of B cells, multiple studies have demonstrated that interactions of CLL B cells (B-CLL) with accessory cells are essential for B-CLL proliferation and promote their resistance to apoptosis. Particularly, B-CLL follow chemokine gradients into lymph nodes (LN) where they organize into proliferation centers in which they encounter activated T cells, which further support their growth by increasing their resistance to apoptosis. Moreover, adoptive transfer of autologous CD4+ T cells into mice was demonstrated to promote B-CLL survival and proliferation in vivo highlighting the key role of T cells in B-CLL pathogenesis. Different CD4+ T cell subsets coexist, with each having their own phenotype and functions. Despite numerous studies addressing the role of T helper (Th) cells in CLL, the implication of each individual CD4+ T cell subset in CLL pathogenesis is still under debate. As an example, large amount of IFNγ were detected in the plasma of CLL-bearing animals, suggesting a role of Th1. Conversely, CLL progression in a genetic mouse model of the disease was reported to be independent of Th1 cells. In addition to multiple studies using either patient samples or mouse models of CLL have implicated Th2/Th9 CD4+ T cell subsets in disease progression as well. The conflicting results regarding CD4+ T helper subsets involved in CLL pathogenesis might be due to studies performed in different mouse models of the disease and using patient samples from different disease stages. Therefore, we thus performed an unsupervised study by flow cytometry on peripheral blood from control individuals and untreated CLL patients to get snapshots of the T cell compartment across the disease spectrum. Our results showed an increase in the CXCR5+ T follicular helper cells (Tfh) population, a subset playing a critical role in mediating the selection, survival and differentiation of B cells into antibody secreting cells and memory B cells through the expression of CD40L and IL-21 production. Importantly Tfh from CLL patient were skewed toward an activated Th1-profile as evidenced by their PD1+IL-21+IFNγ+ phenotype. The highest accumulation of Tfh cells was observed in advanced stages of the disease and Th1-like Tfh levels inversely correlated with serum IgG and IgA levels, decreased Ig levels being a risk factor for infectious complications. We were also able to uncover a correlation between the number of Tfh cells and the tumor burden represented by the number of circulating malignant B cells. Finally, we showed that Tfh cells effectively induce B-CLL proliferation in an IL-21 dependent but IFNγ independent mechanism. Our data therefore support the involvement of Tfh cells in CLL disease course

Par rapport à l’adulte, le nouveau-né présente une susceptibilité accrue aux agents infectieux et au développement d’allergies. Une polarisation de l’immunité acquise vers des réponses de type Th2, productrices d’IL-4, d’IL-5 et d’IL-13, et un défaut de réponses immunes de type Th1, sécrétant de l’IFN-γ, peuvent rendre compte de ce statut immunitaire particulier. De plus, un retard de production et de maturation des anticorps, caractéristiques de l’immunité humorale, s’observe en début de vie.

Récemment, de nouveaux lymphocytes T auxiliaires ont été décrits, les lymphocytes Th17, producteurs d’IL-17A, d’IL-17F et d’IL-22, d’une part, et les lymphocytes Tfh, sécrétant de l’IL-21 et exprimant CXCR5, ICOS et PD-1, d’autre part. La différenciation des lymphocytes Th17 dépend de la présence d’IL-6 ou d’IL-21 et de TGF-β, et est inhibée par l’IL-4 ;tandis que les lymphocytes Tfh sont induits en présence d’IL-21, d’IL-6 et du répresseur transcriptionnel Bcl6. Alors que les lymphocytes Th17 sont associés à des réponses inflammatoires par le recrutement de neutrophiles, les lymphocytes Tfh aident les lymphocytes B à produire des anticorps de haute affinité.

L’objectif principal de notre travail est l’étude du développement potentiel de réponses de type Th17 chez le nouveau-né de souris soumis à une stimulation allogénique et au manque d’IL-4. De plus, l’existence potentielle de lymphocytes Tfh induits chez le nouveau-né immunisé avec un vaccin constitué d’ovalbumine de poulet et d’Alum, sera investiguée.

Dans notre modèle de tolérance néonatale, l’immunisation de nouveau-nés BALB/c à l’aide de cellules spléniques semi-allogéniques F1 (AJAX x BALB/c) induit une polarisation de type Th2, associée à l’établissement d’un chimérisme lymphoïde et à l’acceptation d’une greffe de peau présentant les alloantigènes rencontrés à la naissance. Des nouveau-nés soumis à cette immunisation allogénique et à la privation d’IL-4, réalisée par l’utilisation d’anticorps monoclonaux ou de souris IL-4-/-, rejettent de façon aiguë les greffons de peau et présentent une proportion réduite de cellules chimériques. Cette rupture de la tolérance néonatale est associée à l’inhibition de la réponse allospécifique de type Th2 et au développement de lymphocytes Th17 alloréactifs, produisant de l’IL-17A. L’inhibition de la voie Th17 ne conduit toutefois pas à l’acceptation des allogreffes de peau. Par contre, la neutralisation de l’IL-6 ou de l’IL-17A et la réduction du nombre de neutrophiles restaurent la proportion de cellules chimériques présentes dans la rate, démontrant que la réponse de type Th17 allospécifique néonatale contrôle le chimérisme lymphoïde.

En réponse au vaccin OVA-Alum, les nouveau-nés présentent une proportion accrue de lymphocytes Tfh CXCR5+ PD-1+, bien que cette proportion lymphocytaire soit significativement diminuée par rapport aux adultes. Les lymphocytes Tfh néonataux expriment en outre des taux moindres des ARNm d’IL-21, d’IL-4 et de Bcl6, suggérant que la génération de lymphocytes Tfh est altérée en début de vie. En parallèle, les titres et la maturation des anticorps produits suite à la vaccination sont réduits chez les nouveau-nés, en comparaison avec les adultes. Cependant, qu’ils soient déficients en IL-4 ou non, des lymphocytes T CD4+ néonataux activés in vitro en présence d’IL-6 induisent une production d’anticorps par des lymphocytes B compétents, suggérant qu’il n’y a pas de défaut intrinsèque des lymphocytes T du nouveau-né à développer une capacité d’aide aux lymphocytes B.

En conclusion, nous avons montré que la polarisation de type Th2 néonatale inhibe la différenciation de lymphocytes Th17 alloréactifs contrôlant le rejet de cellules allogéniques, un mécanisme pouvant intervenir dans la relation immunitaire entre la mère et l’enfant. Nos résultats indiquent également que le nouveau-né est capable de différencier des lymphocytes Tfh, bien que le développement de ces derniers semble réduit. \
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La plupart des lymphocytes T régulateurs CD4+ Foxp3+ (Tregs) sont générés dans le thymus. Plusieurs études suggèrent fortement que le développement des Tregs est dû à la forte affinité de leur TCR pour le soi (complexes " peptide du soi-CMH II ") présenté dans le thymus. Après avoir migré à la périphérie, les Tregs continuent d'interagir avec le soi et l'expression de Foxp3 est considérée comme nécessaire et suffisante pour maintenir le programme de transcription nécessaire aux fonctions suppressives de ces cellules en périphérie. En utilisant deux models expérimentaux chez la souris, notre étude démontre l'importance des interactions continues avec le soi pour maintenir les capacités suppressives des Tregs à la périphérie. L'absence d'interactions avec le soi aboutit rapidement à une altération du phénotype des Tregs, de leur capacité à produire certaines cytokines et modifie également leur signature transcriptionnelle. De façon intéressante, nous avons observé que l'absence d'interaction avec le soi n'affecte pas le niveau d'expression de Foxp3 mais que la reconnaissance du soi induit une signature transcriptionnelle unique et des caractéristiques fonctionnelles qui ne sont pas liées à Foxp3. Dans une seconde étude, nous avons mis en évidence que, chez la souris jeune adulte, l'expression de Ly-6C permet d'identifier deux sous-populations de Tregs distinctes présentant des différences phénotypiques et fonctionnelles. En particulier, nous avons observé que les Tregs Ly-6C- présentent un phénotype plus activé et régulateur que leurs homologues Ly-6C+ et que seules les premières sont fonctionnelles in vitro et in vivo. Nous avons également montré un lien étroit entre expression de Ly-6C et autoréactivité, les Tregs Ly-6C- recevant plus de signaux du TCR que les Tregs Ly-6C+. Finalement, nous avons observé que seuls les Tregs Ly-6C- se maintiennent à la périphérie avec le temps, suggérant l'existence d'une sélection périphérique permettant la survie préférentielle des Tregs les plus fonctionnels. Au cours de ma thèse, nous avons ainsi pu démontrer que les interactions avec le soi étaient indispensables et nécessaires pour la fonctionnalité, le phénotype et l'homéostasie des Tregs.

Les cellules dendritiques (DC) sont spécialisées dans la capture, l'apprêtement et la présentation des antigènes. Elles ont développé une voie spécifique de présentation, la présentation croisée, leur permettant d'internaliser des antigènes exogènes, de les digérer et de les associer aux molécules du CMH de classe I afin de les présenter aux lymphocytes T CD8+. La présentation croisée est essentielle à la présentation d'antigènes qui ne sont pas synthétisés directement dans les DC (antigènes du soi, de tumeurs, de microorganismes n'infectant pas les DC) et donc à l'établissement de réponses T CD8+ anti‐infectieuses ou anti-tumorales. Son étude est donc primordiale pour la vaccination et pour l'immunothérapie mettant en jeu une présentation par les DC. Notre équipe a montré qu'à l'instar des cellules apoptotiques, les cellules vivantes sont une source d'antigènes efficace pour la présentation croisée par les DC in vitro et in vivo. Elle a ainsi montré que l'immunisation de souris avec des DC ayant capturé du matériel provenant de cellules vivantes permettait de protéger efficacement contre une tumeur dérivée de cellules de mélanome (B16) dans un protocole de type prophylactique. Durant ma thèse, j'ai pu montrer que cette immunisation était également très efficace dans un protocole de type thérapeutique. De façon surprenante, la protection et la réponse T CD8+ obtenues en utilisant des cellules vivantes comme source d'antigènes sont meilleures que celles obtenues avec des cellules apoptotiques. Les DC cultivées avec des cellules donneuses d'antigènes, vivantes ou apoptotiques, expriment des niveaux équivalents de molécules de costimulation. En revanche, les DC cultivées avec des cellules apoptotiques sécrètent plus d'IL--‐10, leur conférant un phénotype plus tolérogène. De plus, nous avons également montré que les antigènes tumoraux étaient mieux préservés au sein des cellules vivantes que des cellules apoptotiques, et que la quantité de complexes CMH--‐I/peptide à la surface des DC après culture avec des cellules vivantes était plus importante qu'après culture avec des cellules apoptotiques. Dans une seconde partie de ma thèse, je me suis attachée à caractériser les récepteurs et mécanismes impliqués dans le transfert d'antigènes provenant de cellules vivantes aux DC. J'ai pu montrer que ce transfert ne dépend ni de la sécrétion d'exosomes, ni du " cross-dressing ". En revanche, il est initié après un contact étroit avec les DC qui semble dépendre au moins en partie des récepteurs de type scavenger (SR) et de la calréticuline. Les images obtenues en microscopie suggèrent le passage de molécules de grande taille au sein d'une structure qui pourrait s'apparenter aux jonctions annulaires (Annular Gap Junctions). En effet, nous observons le passage de connexine 43 (Cx3) et de matériel cellulaire sous une conformation native (protéine GFP de 70kDa) provenant de la cellule vivante et colocalisant partiellement avec le marqueur d'endosomes précoces EEA-1 dans la DC. Cependant, l'utilisation de shRNA spécifique de la Cx43 indique que la présentation croisée ne nécessite pas son expression. Nos résultats suggèrent donc l'existence d'un mécanisme de communication intercellulaire permettant le passage d'antigènes de grande taille, qui pourraient ensuite être apprêtés par la DC.

La fonction des molecules du complexe majeur d'histocompatibilite (cmh) est de presenter les peptides antigeniques aux lymphocytes t. La fixation des peptides sur les molecules du cmh est la premiere etape essentielle mais la presence d'un recepteur t approprie capable de reconnaitre le complexe est aussi necessaire pour initier la reponse immunitaire. Dans cette these, les capacites de liaison de 96 peptides du vih derives des proteines gag p18 et p25, gp120 et nef sur les molecules hla-dr1 et dr103 ont ete etudiees. Ces deux molecules dr ne different que par trois acides amines situes aux positions 67, 70 et 71 de la chaine beta 1 au niveau du site de liaison des peptides et du site de reconnaissance par le recepteur de la cellule t (tcr). Parmi les peptides positifs, onze peptides ayant une bonne affinite pour hla-dr1 et/ou dr103 ont ete choisis pour essayer d'induire in vitro des lignees t cd4#+ a partir des cellules du sang peripherique de donneurs non infectes par le vih et homozygotes pour dr1 ou dr103. Seuls trois de ces peptides montrant une bonne affinite pour les deux alleles dr ont induit la proliferation de lignees t cd4#+. Dans plusieurs cas, nous avons observe egalement une forte proliferation de ces effecteurs contre les cellules lymphoblastoides autologues. Nous avons particulierement etudie la reactivite d'un clone t restreint par dr103 specifique du peptide du vih p25(263-277) qui possede une reaction croisee avec des complexes dr/peptides impliquant d'autres alleles dr et exprimes sur des cellules lymphoblastoides. Un seul recepteur semble implique dans ces differents types de reactivites. Ces reactions croisees pourraient etre causees par une similarite entre ce peptide du vih et des peptides du soi ou derives de l'ebv. Nous avons recherche des homologies entre le peptide du vih p25(263-277) et des peptides derives de proteines nucleaires de l'ebv et en avons trouve une avec le peptide ebna-3c(169-184). De telles similarites entre des complexes impliquant differentes molecules hla-dr et de peptides issus de proteines variees pourraient expliquer certains phenomenes auto-immuns observes pendant la progression du sida. Enfin, pour une therapeutique vaccinale anti-vih, le choix des peptides devrait donc se faire en fonction non seulement de leur affinite de liaison avec les molecules de classe ii les plus communes et de leur immunogenicite mais aussi de la faible frequence de ces reactivites croisees multiples

L’infection par le virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) entraîne le dysfonctionnement du système immunitaire menant à la déplétion de lymphocytes TCD4 (LTCD4) dans les tissus lymphoïdes. Cette diminution cellulaire est causée par la lyse cellulaire virale, par la cytotoxicité dépendante des lymphocytes TCD8 (LTCD8), par l’apoptose des LTCD4 bystanders et par un effet cytopathique des facteurs solubles libérés pendant l’infection. Les exosomes, des vésicules (30-100 nm) d’origine endosomale, ont également été impliqués dans la déplétion des cellules bystanders. En effet, ils portent des molécules participant à la mort cellulaire (Nef, Apaf-1, Dap-3) dérivées de cellules infectées par le VIH-1. Les exosomes et les particules de VIH-1 ont plusieurs similitudes de forme, de composition protéique et lipidique, ainsi que de contenu en acide nucléique. La biogenèse des exosomes converge avec le bourgeonnement des particules virales dans les endosomes de cellules dendritiques (CDs). De même, ces vésicules sont libérées conjointement avec les particules virales vers les LTCD4. Le DCIR (dendritic cell immunoreceptor), une lectine membranaire de type C, agit comme un facteur d’attachement et d’internalisation du VIH-1. Le DCIR augmente donc la production virale sur les LTCD4 et les CDs. Nous avons montré précédemment que l’infection virale des CDs favorise la libération des exosomes dans le milieu extracellulaire. Par ce travail, nous avons montré que le DCIR et ses voies de signalisation étaient impliqués dans la libération ou l’accumulation des exosomes dans les milieux extracellulaires après le contact avec le VIH-1. Nous avons aussi observé que l’inhibition extracellulaire du DCIR sur les CDs a affecté la sécrétion des exosomes induite par le VIH-1. Enfin, nos résultats ont également affirmé que les exosomes dérivés de cellules infectées par le VIH-1 induisaient l’apoptose des LTCD4 Th17, alors qu’ils protègent les neutrophiles. L’ensemble des résultats nous permet d’améliorer la compréhension de la pathogenèse du VIH-1 en mettant en évidence le rôle que joue le DCIR dans la sécrétion des exosomes.

Le virus de l’immunodéficience humaine de type-1 (VIH-1) a été identifié comme étant l’agent responsable de la pandémie qui frappe actuellement notre civilisation. En une trentaine d’années le virus à causé la mort de plus de 35 millions de personnes. Une telle épidémie dans l’histoire de l’humanité n’est pas une première; rappelons-nous dans le passé, la peste noire ou encore la grippe espagnole qui ont fait elles aussi des millions de morts. Cependant, pour la première fois dans l’ère moderne, nous avons la possibilité de lutter contre ce fléau grâce à l’étude approfondie de la biologie du virus qui a permis, entre autres, l’avènement de la trithérapie. Le VIH-1 acquiert un nombre impressionnant de molécules cellulaires tout au long de son cycle réplicatif. En dépit de tous les efforts consacrés à l’étude des molécules de l’hôte, le(s) mécanisme(s) exact par lequel toutes ces molécules sont acquises n'est toujours pas connu. Néanmoins, dans le cas d'ICAM-1, une des molécules transmembranaires les plus étudié il apparaît que le précurseur viral Pr55Gag est un candidat potentiel d'interaction avec ICAM-1. Par conséquent, nous avons étudié et caractérisé au niveau moléculaire le processus d'incorporation d'ICAM-1 en utilisant dans un premier temps un modèle de pseudo particules virales (VLPs) dérivé de Pr55Gag. La substitution de plusieurs domaines de Pr55Gag tels que la nucléocapside, SP2 et p6 n'ont pas eu d'effet sur son acquisition. Par la suite, nous avons démontré que la protéine de matrice (MA) est nécessaire à son incorporation. Nous avons confirmé ces résultats préliminaires en générant le mutant de matrice dans un clone moléculaire couramment utilisé en laboratoire (NL4.3). Des études complémentaires suggèrent que les deux tiers C-terminal de la MA sont importants et en particulier treize acides aminés présents dans l'hélice-α 5. De plus, en se basant sur la modélisation 3D des interactions protéines-protéines et en validant par la suite ces prédictions par immunocapture, nous avons trouvé qu'une série d'acides aminés acides de la MA interagit avec des acides aminés basiques présents sur le domaine cytoplasmique d'ICAM-1 et sont responsables de son incorporation. En résumé, nos résultats apportent de nouvelles connaissances dans le mécanisme moléculaire régissant l'acquisition d'ICAM-1, une molécule de l'hôte connu pour renforcer l'infectiosité virale et moduler la pathogénèse du VIH-1.

Le système immunitaire néonatal est caractérisé par une susceptibilité accrue aux infections par des pathogènes intracellulaires et des réponses vaccinales altérées. Ces caractéristiques soulignent la capacité limitée du nouveau-né à développer des réponses immunes à médiation cellulaire.

Les LTγδ représentent le prototype des lymphocytes T non-conventionnels :ils sont capables de réagir très rapidement après activation et sont caractérisés par une activité qui n’est pas restreinte aux molécules du CMH. Les LTγδ qui expriment le TCR Vγ9Vδ2 constituent la population majoritaire (60-90%) de LTγδ dans le sang périphérique humain adulte. Ces cellules reconnaissent spécifiquement les phosphoantigènes, des molécules non-peptidiques de faible poids moléculaire tel que l’HMB-PP. Cet activateur naturel est un intermédiaire de la voie non-mévalonate de biosynthèse des isoprénoïdes, essentielle à de nombreux agents pathogènes. Ces cellules sont également capables de réagir aux aminobisphosphonates, drogues couramment utilisées en thérapie du cancer. Le zolédronate (Zometa) est le plus puissant des aminobisphosphonates. Grâce à leur capacité à sécréter rapidement des cytokines comme l’IFN-γ et le TNF-α ainsi qu’à leur puissante activité cytotoxique, les LT Vγ9Vδ2 jouent un rôle important dans le contrôle des infections et des cancers.

Au contraire des LTγδ de l’adulte, la fonction des LTγδ du nouveau-né est peu connue. Cependant, des évidences suggèrent que ces lymphocytes pourraient jouer un rôle particulièrement important en début de vie. Dans ce contexte, nous avons caractérisé en détail la réponse des LTγδ du sang de cordon ombilical humain après stimulation avec l’HMB-PP et le zolédronate. Contrairement à l’HMB-PP, le zolédronate induit la prolifération et la production d’IFN-γ par les LT Vγ9 du nouveau-né. L’IL-23 étant une cytokine produite de façon optimale par les DCs en début de vie, nous avons choisi d’étudier son influence sur le profil d’activation de ces cellules. L’ajout d’IL-23 au zolédronate augmente l’expression d’IFN-γ et génère une population distincte de LT Vγ9 négatifs pour l’IFN-γ et produisant de l’IL-17. De plus, l’IL-23 favorise la synthèse de plusieurs médiateurs cytotoxiques (perforine, granzymes A et B, granulysine) induits par le zolédronate. Alors que l’effet co-stimulateur de l’IL-23 sur la production d’IFN-γ et de molécules cytotoxiques est également observé au sein des LT Vγ9 de l’adulte, l’induction d’une sous-population IL-17+ IFN-γ- est unique aux LT Vγ9 du nouveau-né.

Afin de mieux définir les conditions requises pour induire la polarisation des LT Vγ9 du nouveau-né en cellules productrices d’IL-17, nous avons évalué l’effet de diverses cytokines ainsi que celui de dérivés microbiens sur l’activation de ces cellules au zolédronate. Le zolédronate en présence d’IL-1β ou de LPS génère une population distincte de LT Vγ9 IL-17+ IFN-γ-. De plus, l’ajout d’IL-1β au zolédronate n’augmente pas le pourcentage de LT Vγ9 producteurs d’IFN-γ. Nous avons ensuite comparé le phénotype des LT Vγ9 IL-17+ à celui des LT Vγ9 IFN-γ+. Nos résultats indiquent qu’une fraction des LT Vγ9 sécrétant l’IL-17 exprime sélectivement CCR6 contrairement aux LT Vγ9 producteurs d’IFN-γ.

En conclusion, ce travail a permis de révéler la capacité des LT Vγ9 du nouveau-né humain à se différencier en cellules productrices d’IFN-γ, d’IL-17 et de molécules cytotoxiques. Ces cellules pourraient donc constituer une première ligne de défense capable d’orchestrer une réponse immune efficace à l’encontre de dérivés microbiens ou de signaux endogènes de danger.
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Étude du dimorphisme de Fonsecaea pedrosoi, agent de la chromycose. Étude de la phase saprophytique du point de vue morphologique et physiologique par l'étude de la croissance, des protéines et des activités enzymatiques. Implication du dimorphisme dans le processus immunitaire. Caractérisation des antigènes des phases saprophytique et parasitaire.

Le vieillissement s’accompagne d’une altération globale des fonctions physiologiques notamment celles de l’immunité :on parle « d’immunosénescence ». Ce processus se traduit entre autre par l’installation d’un état inflammatoire chronique caractérisé par une augmentation des taux sériques de cytokines telles que l’interleukine(IL)-6 et des protéines de la phase aigüe. Cet état proinflammatoire serait incriminé dans le déclin des fonctions physiologiques, la fragilité et les syndromes gériatriques. Par ailleurs, les maladies cardiovasculaires, la dépression et l’infection chronique par le Cytomégalovirus (CMV) sont également associés à un état inflammatoire chronique. La prévalence de ces comorbidités étant importante chez les patients gériatriques, ces maladies pourraient donc contribuer à l’association observée entre marqueurs de l’inflammation et les syndromes gériatriques.

Les infections représentent un problème majeur en gériatrie. Les cellules du système immunitaire inné jouent un rôle important dans les défenses contre les agents pathogènes. La reconnaissance de ceux-ci par les cellules dendritiques, les macrophages ou les monocytes fait intervenir une série de molécules telles que les récepteurs de la famille Toll (TLR). Certains travaux suggèrent que la fonction des cellules de l’immunité innée pourrait être perturbée chez les individus âgés mais ces données restent controversées.

Dans ce travail, nous souhaitons aborder les hypothèses suivantes :

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Chez les individus infectés par le VIH on observe une augmentation de l’inflammation et de l’activation immunitaire (AI) qui est associée à la progression vers le SIDA. Même en présence de traitements antirétroviraux, les niveaux d’AI restent élevés et sont associés à une morbidité et une mortalité accrues. Les mécanismes moléculaires derrière l’AI ne sont pas bien caractérisés. L’activation des macrophages (Mφ ) et monocytes et la translocation bactérienne peuvent jouer un rôle important. Contraire aux humains, et au model pathogène de l’infection (macaques, MAC), les hôtes naturels du SIV (Singes vertes d’Afrique, AGM), résoudraient l’inflammation aiguë, ils montrent un niveau plus bas de cytokines inflammatoires comme l’IL-1β et l’IL-18 et l’IA chronique est absente. L’IL-1β et l’IL-18 sont produits par le Mφ et les cellules épithéliales de l’intestine (IEC) auprès l’activation de l’inflammasome. Nous avons étudié l’activation de l’inflammasome chez les hôtes naturels, dans quel tissues ceci peut avoir lieu et s’il existe des différences entre les deux modelés d’infection. Pour cela, nous avons mesuré les niveaux plasmatiques de l’IL-1β et l’IL-18 au cours de l’infection ; nous avons analysé le marquage des Mφ , IEC et IL-18 par microscopie confocale; nous avons mis en place des essaies fonctionnels pour l’activation in vitro de l’inflammasome et nous avons développé les outils pour le phenotypage et l’isolation de Mφ et IEC du sang, du poumon, du LAB, des ganglions et de l’intestine. Nous avons montré que l’inflammasome est activé lors de l’infection par SIV dans les modèles pathogène et non-pathogène, en particulier dans l’intestine grêle. Notre étude indique une production plus notable d’IL-18 dans le jéjunum des MAC infectés en comparaison avec des AGM. Nous avons montré que l’inflammasome peut être activé dans les macrophages par des signaux de l’environnement présent lors de la translocation bactérienne et le stress cellulaire, comme le LPS et l’ATP. Nous avons montré de différences au niveau de régulation de la réponse liée à l’inflammasome. Les niveaux d’IL-18BP et l’IL-1RA, les antagonistes de l’IL-18 et l’IL-1β respectivement, sont été plus élevés chez les AGM que chez les MAC. On a trouvé une corrélation entre les niveaux de IL-18BP/IL-1Ra et les niveaux plasmatiques des agonistes chez les hôtes naturelles mais pas chez les MAC, ce qui est indicative de une régulation potentiellement plus efficace chez les AGM
Chronic immune activation drives progression toward AIDS in HIV infection and still remains in low levels in antiretroviral-treated patients increasing the risk of non-communicable diseases. Such non-AIDS co-mobility and mortality is associated with markers of monocyte/macrophage (Mφ ) activation and microbial translocation, but the molecular bases of this phenomenon remain unknown. In contrast to humans and pathogenic animal models of HIV (i.e. macaques, MAC), natural hosts of SIV (i.e. African Green Monkeys, AGM) quickly resolve SIV-induced inflammation and display lower levels of IL-1β and IL-18. IL-1β and IL-18 can be produced by Mφ or intestinal epithelial cells (IEC) upon inflammasome activation with potential multiple roles. Therefore, we studied whether the inflammasome activation upon SIV-infection occurs in natural hosts, in which tissues it might take place and if it differs between models. To do so, we measured plasmatic IL-1β and IL-18 levels along SIV-infection; we performed microscopy staining of Mφ , IEC and IL-18 in tissues, we set-up functional assays for inflammasome activation in-vitro and we developed tools for phenotyping and isolating Mφ and IEC from blood, lung, BAL, LN and gut. We showed inflammasome activation in vivo during pathogenic and non-pathogenic SIV infection evaluated by IL-18 in the gut of MAC and AGM, particularly in the small intestine, as well as by the levels of IL-18 and IL-1β in plasma. Our study indicated higher IL-18 production in the jejunum of SIV-infected MAC as compared to SIV-infected AGM. We showed that signals that might be in the environment during pathogenic SIVmac infection, in particular LPS and ATP as a result of microbial translocation and stress activate the inflammasome of MAC and AGM macrophages. We revealed differences at the level of the regulation between both models, observed by higher levels of IL-18BP and IL-1RA in AGM compared to MAC and correlations between IL-18, IL-1β and their respective antagonists only in AGM but not in MAC

La variabilite de l'expression de l'infection a human t-cell leukemia virus (htlv-i) a ete etudiee sur un ensemble de serums provenant de sujets d'origine geographique et de groupes a risque differents. Les profils sero-immunologiques (elisa, anti-p24, immunoblot) ont ete discutes avec ceux obtenus lors d'enquetes epidemiologiques. Les patients atteints de leucemies a cellules t avaient les reactivites les plus intenses et les profils les plus complets. Les toxicomanes presentaient des profils a reactivite p24 predominante et les sujets sains avaient la reactivite p19 la plus forte. Les serums americains et japonais etaient beaucoup plus reactifs que ceux des caraibes. Le profil sero-immunologique median etait plus reactif a mesure que l'age augmentait. Pour l'etude genomique (region de l'enveloppe) du virus de l'immunodeficience humaine (vih-1) sur des echantillons zairois, nous avons mis au point deux protocoles d'amplification genique suivi d'un protocole de stringences variables permettant la selection rapide de variants. Une estimation du degre de mauvais appariement du fragment etudie par rapport au fragment correspondant a la souche iiib a ete calcule relativement a la sonde bh10 (genome vih-1 entier). Clonage et sequencage effectues directement sur les fragments amplifies ont montre des variabilites comparables par rapport aux souches prototypes americaines. La region v3, situe dans une zone hypervariable de la gp120, avait une structure peptidique relativement bien conservee. Une representation bi-dimensionnelle (hydrophobic cluster analysis) de cette region revelait une relative conservation des residus cysteine et proline, et de nombreux residus glycine. Ces resultats suggerent l'enchainement d'un brin beta, d'un segment gpgr et d'une helice. Les variations observees dans ces structures ne semblent pas avoir de retentissement sur la structure generale de la boucle v3, connue pour etre un epitope immunodominant

L'adnc codant pour l'asnrs cytosolique humaine (548 acides amines) a ete isole, sequence et exprime dans un systeme d'expression bacterien. La sequence proteique humaine obtenue est comparee a celles d'asnrs de d'autres organismes (procaryotes et eucaryotes) afin d'etudier la conservation ou non des differents domaines. Apres la mise au point d'un protocole de purification, la proteine humaine a pu etre utilisee pour des analyses biochimiques et immunologiques. La proteine humaine a ete utilisee pour des caracterisations biochimiques, en particulier pour sa specificite de reconnaissance pour le substrat arnt a s n de differents organismes. L'enzyme humaine montre une plus grande specificite pour l'arnt de foie de veau compare a l'arnt de levure de de bacterie. Ces etudes montrent aussi que la synthetase humaine fixe l'arnt bacterien mais n'est pas capable de l'aminoacyler. Le role des extensions n-terminales des synthetases eucaryotes reste encore tres contreverse. L'asnrs humaine est une enzyme libre ne rentrant pas dans la composition du complexe multi-enzymatique. L'analyse comparative de l'asnrs humaine et de quelques mutants suggere la presence d'interactions stabilisatrices entre l'extension n-terminale eucaryote et le substrat arnt. Un aspect particulier de l'asnrs humaine est d'etre specifiquement reconnue et neutralisee par un groupe d'auto-anticorps impliques dans le developpement de maladies auto-immunitaires (syndrome anti-synthetase). L'inhibition s'effectue lors de la deuxieme etape de la reaction d'aminoacylation via une augmentation d'affinite, induite par l'auto-anticorps, entre la proteine et son arnt. Deux epitopes ont ete localises au sein de l'asnrs humaine : un epitope reagissant en western-blot dans la partie n-terminale, et un epitope conformationnel immunodominant, responsable de la neutralisation d'activite, dans la partie catalytique de la proteine. Enfin, pour cloturer ce travail, des essais de cristallogenese de l'asnrs humaine entiere ont ete entrepris afin d'obtenir un complement structural capable de nous renseigner sur la partie immunogenique de l'asnrs et sur l'organisation structurale et fonctionnelle de l'extension n-terminale eucaryote. Les premiers cristaux ont recemment ete obtenus. Les conditions sont en cours d'amelioration.

Malgré l'incidence élevée de la transmission rectale du viras de l’immunodéficience humaine (VIH), nos connaissances de la physiopathologie de cette infection sont très limitées. Ma thèse a contribué à mieux définir les événements initiaux de cette infection chez le macaque rhésus infecté par le viras de l’immunodéficience simienne (SIV). J'ai d'abord mis en évidence un passage extrêmement rapide et massif du virus à travers l'épithélium rectal, 4 heures post-inoculation, avec majoritairement des lymphocytes T comme cellules cibles initiales. La dissémination du viras est extrêmement rapide : il est retrouvé dès 4 heures post-inoculation dans les ganglions lymphatiques drainant le site d'inoculation puis dans l'ensemble de l'organisme. Cette dissémination virale dépendrait de l'expression de chimiokines. J'ai ensuite montré une augmentation du réseau des cellules dendritiques interdigitées dans la muqueuse colorectale dès 4 heures post-inoculation, puis dans les ganglions lymphatiques drainant cette muqueuse et enfin dans la muqueuse de l'intestin grêle. Ces perturbations seraient liées à l'arrivée du viras dans ces différents sites et aux modifications de l'expression de chimiokines. Finalement, j'ai montré un défaut d'activation des cellules dendritiques interdigitées des ganglions lymphatiques drainants dès la fin de la deuxième semaine d'infection. Ce travail apporte des connaissances essentielles sur des événements virologiques et immunologiques se déroulant dès 4 heures post-inoculation rectale par SIV. Il permettra peut-être de mieux cibler les stratégies visant à prévenir l'infection VIH par cette voie
Despite the high incidence of human immunodeficiency virus (HIV) rectal transmission, our knowledge of the physiopathology of this infection is very limited My thesis work contributes to better define the initial events of this infection in the simian immunodeficiency virus (SIV)-infected rhesus macaque model. First, I highlighted an extremety fast and massive entry of SFV through the rectal epithelium with mainly T lymphocytes as initial target cells, as early as 4 hours post-inoculation. Viral dissemination is a rapid process: from 4 hours post-inoculation the virus is found in lymph nodes draining the site of inoculation then in the whole body. This viral dissemination would depend cm the expression of chemokines. Secondly, I showed as early as 4 hours post-inoculation an increase in the network of interdigitated dendritic cells in recto-colic mucosa, then in draining lymph nodes and last in small intestine mucosa. These alterations would be connected to virus arrival in these various sites and to the variation in chemokine expression. Finally, I showed a failure of activation of the interdigitated dendritic cells of the draining lymph nodes at the end of the second week of infection. This work provides important knowledge on virologic and immunologic events taking place from 4 hours after rectal infection with SIV. It could help to improve the strategies to prevent HIV infection by this route

Bien que la plupart des études se focalisent sur les lymphocytes T CD4+ régulateurs, il a été observé que les lymphocytes T CD8+ régulateurs peuvent jouer un rôle important dans l’induction et le maintien de la tolérance immunitaire. Le transfert adoptif chez la souris et l’induction chez l’homme de lymphocytes T CD8+ régulateurs peuvent inhiber le rejet d’allogreffes et le développement de pathologies autoimmunes. Ces observations suggèrent que l’induction de ces populations peut avoir un potentiel thérapeutique. Des études supplémentaires sont encore nécessaires pour définir les conditions optimales de leur induction.

Tant les nouveaux nés humains que murins ont une plus forte capacité que l’adulte à développer des lymphocytes T CD4+ régulateurs induits par une reconnaissance antigénique. La période néonatale serait donc particulièrement appropriée à l’induction de circuits régulateurs.

Dans le cadre de ce travail, nous avons étudié le rôle des lymphocytes T CD8+, induits à la naissance, dans le contrôle de la réponse des lymphocytes T CD4+ de type Th2.

Des souris BALB/c sont immunisées à la naissance à l’aide de cellules spléniques semi-allogéniques hybrides F1 (AJAX x BALB/c). Ces cellules persistent dans l’animal, au sein des organes lymphoïdes et stimulent ainsi de manière chronique les lymphocytes T CD4+ et T CD8+ du receveur et induisent une réponse de type Th2. Suite à l’injection des cellules spléniques semi-allogéniques au nouveau né de souris, nous avons observé l’expansion d’une population de lymphocytes T CD8+CD25+, dont le phénotype se caractérise par l’expression de Foxp3 et la production conjointe d’IFN-&61543; et l’IL-10. Nous avons pu observer que ces cellules sont capables d’inhiber la production de cytokines Th2 produites par les lymphocytes T CD4+ allospécifiques activés. Par contre, ces cellules régulatrices aggravent des réponses Th2 non apparentées. En effet, suite à une sensibilisation à l’ovalbumine, à l’âge adulte, ces souris développent de plus fortes réponses asthmatiques.

D’autre part, les nouveaux nés de souris BALB/c ont été immunisés à la naissance à l’aide de cellules dendritiques semi-allogéniques hybrides F1 (AJAX x BALB/c) qui activent de manière aigüe leurs lymphocytes T. Ces souris présentent une forte réponse Th1 et Tc1/Tc2 spécifique de l’alloantigène et sont protégées contre le développement d’un asthme induit. Il a aussi été montré dans ce travail que suite à l’immunisation néonatale à l’aide de cellules dendritiques semi-allogéniques, le nombre de lymphocytes T CD8+CD44high, CD8+CD62Lhigh et CD8+CD25+ producteurs d’IFN-&61543; augmente significativement. L’IFN-&
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Le travail présenté ici porte sur la réponse migratoire et adaptative à l'infection par le virus de rimmunodéficience Humaine (VIH). En analysant les réponses chimiotactiques chez les patients infectés, nous avons observé un défaut de migration à CCL19, un ligand de CCR7, chez les patients virémiques. Ce défaut est indépendant de l'expression de CCR7, suggérant une perturbation de la signalisation en aval du récepteur. L'altération de la réponse chimiotactique via CCR7 risque de limiter la migration des lymphocytes T dans les ganglions lymphatiques, ce qui pourrait contribuer à enrayer la réponse immune adaptative chez ces patients. Nous avons également étudié les réponses T CD4+ spécifiques du VIH chez les rares patients qui contrôlent spontanément l'infection, désignés de ce fait comme « HIV controllers ». Nous observons que les cellules T CD4+ des HIV controllers se caractérisent par un compartiment "mémoire centrale" préservé, avec une augmentation de l'expression de CCR7, ce qui pourrait conférer un avantage de survie et une migration plus efficace dans les ganglions, avec en conséquence une meilleure réponse immune adaptative. De plus, les T CD4+ "effecteur mémoires" des Controllers présentent des signes d'activation et des réponses antigéniques polyfonctionnelles, ce qui pourrait être lié à un contrôle antiviral plus efficace. Enfin, notre travail montre que les cellules T CD4+ des patients HIV controllers présentent une forte avidité pour un épitope p24 Gag du VIH, ce qui pourrait expliquer leur capacité à répondre et à proliférer en présence de faibles concentrations d'antigènes viraux circulants. Du fait de cette forte avidité, les cellules T CD4+ des patients HIV controllers pourraient réagir plus rapidement à un pic de réplication virale, limitant ainsi la destruction progressive du système immunitaire par le VIH
Our work analyses the migratory and adaptative immune response to Human Immunodeficiency Virus (HIV). By analyzing the chemotactic responses of T lymphocytes in HIV infected patients, we found a CCR7-dependent migration defect in T lymphocytes from viremic patients. This defect is independent of their CCR7 expression suggesting the signalling cascade of CCR7 is disturbed. An altered chemotactic response could perturb lymphocyte migration into lymph nodes, thus disturbing adaptative immune response of T cells in these patients. We also studied specific T CD4+ responses from those rare HIV infected patients able to spontaneously control viral replication, thus called HIV controllers. We observed that T CD4+ cells of Controller patients have a preserved T CD4+ Central Memory compartment with an overexpression of CCR7, which could enhance their migration to lymph nodes and confer them with a more effective adaptative immune response. On the other hand, T CD4+ Effector Memory cells from HIV controllers present a moderated activation and polyfunctional antigenic responses, which could be related to an effective viral control. Finally, our work shows that HIV controllers present specific T CD4+ cells with increased antigen avidity to an HIV p24-Gag epitope. This might explain their effective response and proliferation in the presence of very low levels of circulating viral antigens. The presence of high avidity specific T CD4+ cells could allow HIV controllers to react early to a burst of viral replication thus limiting HIV related progressive damage to the immune System

Amongst respiratory diseases, inflammatory lung diseases constitute a major part of public

health problem. As a consequence, investigating the immune mechanisms that contribute to

the pathogenesis of these diseases is essential to identify candidate targets for the

development of new therapeutic drugs. Furthermore, over the past 20 years, the growing awareness

that purinergic signalling events shape the immune and inflammatory responses to infection and

allergic reactions warranted the development of animal models to assess their importance in vivo in

acute lung injury and chronic airway diseases. The field of purinergic inflammation formulated the

unifying concept that ATP is released as a «danger signal» to induce inflammatory responses upon

binding purinergic receptors.

According to these elements, we began in 2007 to evaluate lung inflammation in mice deficient for

the P2Y2 purinergic receptor in TH2 and TH1 models. The most convincing evidence that the P2Y2

receptor is engaged during alarm situations comes from studies related to cystic fibrosis and asthma.

Indeed, chronic respiratory diseases are commonly associated with elevated airway ATP

concentrations, as reported in cystic fibrosis, but also in idiopathic pulmonary fibrosis and chronic

obstructive pulmonary disease (COPD) patients, and they are raised by allergens in asthmatic

patients.

First, we demonstrated a significant role of the P2Y2R in a TH2-ovalbumin(OVA)-induced asthma

model. We observed that eosinophil accumulation, a distinctive feature of lung allergic inflammation,

was defective in OVA-treated P2Y2-deficient mice compared with OVA-treated wild type animals.

Interestingly, the upregulation of VCAM-1 was lower on lung endothelial cells of OVA-treated P2Y2

knockout mice compared with OVA-treated wild type animals. Adhesion assays demonstrated that

the action of UTP on leukocyte adhesion through the regulation of endothelial VCAM-1 was

abolished in P2Y2-deficient lung endothelial cells. Additionally, the level of soluble VCAM-1, reported

as an inducer of eosinophil chemotaxis, was strongly reduced in the bronchoalveolar lavage fluid of

P2Y2-deficient mice.

Secondly, we studied the consequences of P2Y2R loss in lung inflammation initiated after pneumonia

virus of mice (PVM) infection in collaboration with the group of Pr. Daniel Desmecht (ULg). We

demonstrated here that P2Y2

-/-

mice display a severe increase in morbidity and mortality rate in

response to PVM. Lower survival of P2Y2

-/-

mice was not correlated with excessive inflammation

despite the higher level of neutrophil recruiters in their broncho-alveolar fluids. Interestingly, we

observed lower numbers of dendritic cells, CD4

+

T cells and CD8

+

T cells in P2Y2

-/-

mice compared to

P2Y2

+/+

infected lungs. Lower level of IL-12 and higher level of IL-6 in broncho-alveolar fluid support

an inhibition of Th1 response in P2Y2

-/-

mice. Quantification of DC recruiter expression revealed

comparable IP-10 and MIP-3&
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Cardiac transplantation is governed by complex immunological mechanisms contributing to different types of allograft rejection. Early non-specific graft failure and chronic rejection (cardiac allograft vasculopathy) represent the main limitations for the recipients’ short- and long-term survival respectively. To date, the pathogenesis of both rejection types remains ill-defined. However, it is believed that they are related to an immunologically mediated potent inflammatory process, occurring whether early after transplantation (acute), or lasting for the lifetime of the graft (chronic).

The initiating mechanisms of chronic rejection in solid organ transplantation remain ill-defined. Emerging evidence sustains that graft vasculopathy is primarily driven by alloreactive CD4+ T lymphocytes sensitized by the indirect pathway of allorecognition. To date, whereas the nature of APCs involved in this particular pathway has yet to be identified, it appears challenging to speculate that recipient-derived endothelial cells (ECs) repopulating the graft may represent the main cell targets recognized by indirectly primed alloreactive CD4+ T cells to mediate the rejection of cardiac transplants. In the first part of this thesis, we specifically studied the indirect pathway of allorecognition with a transgenic mice (Marilyn mice) model that expresses a T cell receptor (TCR) transgene which recognizes the male antigen H-Y in an I-Ab-restricted fashion. Our results provide evidence that graft endothelium replacement by recipient-type cells expressing MHC Class II molecules is required for the chronic rejection of vascularized cardiac transplants mediated by indirect pathway alloreactive CD4+ T cells.

The purpose of the second part of the thesis was to investigate the potential implication of interleukin-22 (IL-22), an early phase secreted proinflammatory cytokine of the IL-10 family, in the acute rejection of cardiac allografts. IL-22 was recently described as an effector key modulator of the inflammatory process produced mainly by differentiated CD4+ T cells of the Th17 lineage. As being closely related to IL-10 and IL-17, both involved in the rejection process of vascularized heart allografts, we attempted to determine the precise role of IL-22 in this process. Experiments were conducted with a recently developed murine model deficient for the IL-22 gene (IL-22KO). The results of the second part of the thesis show that IL-22 is not an effector cytokine in cardiac allograft rejection. In contrast, as being early expressed into the allograft, likely IL-22 plays a protective role in the inflammation leading to acute cardiac rejection, probably depending on a neutrophil-related mechanism.

In conjunction with current understanding of inflammatory and antigen-specific events in allografts, overall, our results provide new insights into the mechanisms of chronic and acute cardiac rejection, thus prompting to further interrogations and appealing novel therapeutic strategies. Pharmacologic manipulation of endothelium is challenging. Given their capacity to sense and rapidly respond to the local environment, ECs are the ideal targets for rapid systemic delivery of therapeutic agents. Combination therapy is required to reduce inflammatory reaction and endothelial activation, to modulate endothelial dysfunction and promote endothelial survival. Also, given that IL-22 may alleviate tissue destruction during inflammatory responses, therapies that enhance its production and protective action in the transplanted organs seem attractive to specifically affect tissue responses, without exerting direct effects on the immune response.

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Le Rejet Chronique Vasculaire (RCV) est la principale cause de perte tardive du greffon chez des transplantés d’organe malgré les progrès effectués dans le domaine des traitements par immunosuppresseurs. La pathogénie du RCV est encore mal élucidée. Il est caractérisé par une infiltration de lymphocytes et de macrophages dans la paroi vasculaire ainsi que par une importante prolifération néointimale de cellules musculaires lisses. Ceci entraîne une oblitération progressive de la lumière vasculaire aboutissant à une ischémie du greffon. Le système immunitaire joue un rôle crucial dans le RCV mais des facteurs métaboliques et physiques sont également impliqués. L'objectif de ma thèse est double: 1/ l’étude du rôle de la cytokine IL6 dans la polarisation Th1/Th2 de l’alloréponse et le développement du RCV dans un modèle d’athérosclérose. 2/ la mise au point d’un modèle préclinique pour l’étude du RCV dans des conditions d’allogreffe humaine. Nous avons choisi d’effectuer des allogreffes aortiques entre des souris donneuses DBA/2 et receveuses C57BL/6, sauvages ou invalidées pour les gènes IL6 et/ou ApoE. Nous avons constaté que la déficience en IL6 permet la manifestation d’une alloréponse rapide de type Th1 et retarde l’alloréponse Th2 chez les souris greffées. Ceci est associé à des lésions de RCV plus importantes suggérant que l’IL6 pourrait jouer un rôle protecteur dans le RCV. Les lésions sont aggravées dans une situation d’athérosclérose (souris ApoE déficientes). .
Chronic vascular rejection (CVR) is the principal cause of late graft loss after clinical organ transplantation in spite of the progress in immunosuppressive therapy. The pathogenesis of CVR is still ill defined. It is characterised by an infiltration of lymphocytes and macrophages into the vascular wall as well as a hyperproliferation of smooth muscle cells in the neointima. This causes a progressive obliteration of the vascular lumen leading to graft ischemia. The immune system plays an important role for the CVR but metabolic and physical factors are also implied. The objectives of my thesis are double: 1/ the study of the role of the cytokine IL6 in the alloresponse and the development of CVR in a model of atherosclerosis, 2/ the setting up of a preclinical model for the study of CVR under human allograft conditions. .

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) infecte et se réplique dans les cellules du système immunitaire. À sa sortie de la cellule, le virus s’enveloppe d’une partie de la membrane cellulaire et acquiert alors certaines des protéines membranaires de la cellule hôte. C’est le cas de la protéine HLA-DR du complexe majeur d’histocompatibilité de classe II (CMH-II) nécessaire à la présentation antigénique. Son incorporation par le virus augmente le potentiel infectieux et contribue à la persistance du virus. Vpu est une protéine du VIH-1 qui contribue au bourgeonnement viral. Une étude récente a montré que Vpu pourrait diminuer l’expression de HLA-DR mature à la surface des cellules infectées. Toutefois, il est aussi reconnu que Vpu module l’acquisition de HLA-DR mature par le VIH-1. Ces résultats pouvaient être expliqués par un contrôle de la localisation intracellulaire de HLA-DR et/ou des protéines structurales du VIH-1 par Vpu. En somme, Vpu pourrait favoriser les interactions spécifiques entre HLA-DR mature et le VIH-1 tout en diminuant l’expression générale de HLA-DR mature à la surface de la cellule. Nous avons souhaité confirmer ce double rôle de Vpu qui est important dans la pathogénèse du virus puisqu’il bénéficie ainsi des avantages de l’incorporation du HLA-DR mature tout en court-circuitant son rôle dans la réponse antigénique normale. Il est également admis que le virus bourgeonne à partir des microdomaines (radeaux lipidiques) de la cellule hôte. Ces régions de la membrane sont riches en cholestérol et constituent le lieu d’expression préférentiel des molécules de HLA-DR mature. Lors d’un traitement avec de la Simvastatin™, les radeaux lipidiques sont affectés car cette drogue inhibe la synthèse du cholestérol et de surcroit, diminue l’expression de HLA-DR mature à la surface cellulaire. L’usage de la Simvastatin™ nous a renseigné sur l’endroit où le virion pouvait interagir et éventuellement incorporer la molécule de l’hôte HLA-DR dans son enveloppe. Ce projet de recherche à permis de caractériser les interactions entre Vpu et HLA-DR et ainsi de mieux comprendre les mécanismes par lesquels Vpu module à la fois l’expression de HLA-DR à la surface des cellules infectées ainsi que son incorporation sur les virions. Les études conduites en microscopie confocale par co-marquage fluorescent de Vpu et HLA-DR ont conduit à la mise en évidence de l’existence d’une interaction entre Vpu et HLA-DR au sein de la cellule infectée. Les mesures de l’expression de HLA-DR à la surface de cellules infectées et de son incorporation à la surface des virions à l’aide des techniques de cytométrie en flux et d’immunocapture ont également permis de confirmer la modulation de l’expression de HLA-DR par Vpu. Enfin, le traitement des cellules infectées avec la Simvastatin™ nous a permis d’émettre l’hypothèse que l’acquisition de HLA-DR s’effectuait à une étape antérieure au bourgeonnement viral. Pour finir, nous avons tenté de corréler les différences observées dans la pathogénèse de certains sous-types viraux avec la variabilité de la séquence de Vpu entre ceux-ci, en lien avec une différence de localisation subcellulaire de Vpu. Les études conduites dans le cadre de mon projet de maîtrise ont contribués à une meilleure compréhension des mécanismes d’acquisition des molécules de l’hôte et de leur possible répercussion sur la pathogénèse du VIH-1 par différents sous-types viraux. Elles renseignent également de manière substantielle sur le rôle de Vpu, protéine dont le rôle est demeuré relativement méconnu dans la pathogénèse du VIH-1 ainsi que sur les mécanismes d’acquisition des molécules de l’hôte par le VIH-1. Les résultats présentés dans ce mémoire devraient susciter un regain d’intérêt pour cette protéine ainsi que pour les mécanismes d’incorporation des molécules de l’hôte par le VIH-1.
The type-1 human immunodeficiency virus (HIV-1) infects and replicates itself in the immune system cells. When it buds out, the virus covers itself with a part of the plasma membrane and then acquires some of the host membrane proteins. It is the case for the HLA-DR protein from the major histocompatibility complex class II (MHC-II) necessary for antigen presentation. Its viral incorporation increases the infectious potential and contributes to viral persistence. Vpu is an HIV-1 protein which contributes to the viral budding process. A recent study showed that Vpu could decrease the mature HLA-DR expression at the infected cell surface. Nevertheless, it is also known that Vpu modulates the mature HLA-DR acquisition by HIV-1. Those results could be explained by a control of the intracellular localization of HLA-DR and/or some HIV-1 structural protein by Vpu. In summary, Vpu could promote specific interactions between mature HLA-DR and HIV-1 while decreasing the general expression of mature HLA-DR at the cell surface. We wished to confirm the dual role of Vpu which is important in the viral pathogenesis by getting the mature HLA-DR incorporation advantages while short-circuiting its role in the normal antigen response. It is also accepted that the virus buds out from the infected cell lipid raft. These region are highly enriched with cholesterol and the preferential expression location of mature HLA-DR. With a Simvastatin™ treatment, the lipid raft are disrupt because this drug inhibit the synthesis of cholesterol, therefore down-modulating the mature HLA-DR expression at the cell surface. Using Simvastatin™ inform us on where the virus could possibly acquire the mature host molecule HLA-DR in its envelop. This research project allowed us to characterise the possible interactions between Vpu and HLA-DR that led to a better understanding of the mechanism by which Vpu modulates HLA-DR at the infected cell surface and its viral incorporation. The study conducted by confocal microscopy using multiple fluorescent tagging of Vpu and HLA-DR has led to the evidence of an interaction between Vpu and mature HLA-DR in an infected cell. The measurement of the cell surface expression of HLA-DR and its viral incorporation by flow cytometer and immunocapture techniques also allowed the confirmation of the Vpu modulation on HLA-DR expression. Finally, the Simvastatin™ treatment on infected cells allowed us to hypothesis that the mature HLA-DR acquisition was done at an earlier stage that the viral budding. To conclude, we also attempted to correlate the difference in the pathogenesis of some HIV-1 subtype with the sequence variability of Vpu between them: a link with a different subcellular localization of Vpu. The studies that have been performed in order to complete my master diploma have contributed to a better understanding of the acquisition mechanism of certain host molecules and their impact on different sub-types of HIV-1 pathogenesis. They also give substantial information on the roles of Vpu, a virus-encoded protein whose involvement in HIV-1 pathogenesis remains to be defined and on the acquisition mechanism of some host molecule by HIV-1. The results presented in this thesis will probably arouse an interest renewal for this protein and for the host molecule incorporation mechanism used by HIV-1.

Onchocerciasis, or river blindness, is a parasitic disease that affects more than 20 million people globally. The induction of pathology is directly related to the presence and destruction of the microfilarial stages (mf) of this filarial nematode. The disease presents clinically with a wide spectrum of dermal and ocular manifestations, the basis of the variation is believed to involve the immune system. The clinical presentations of infected hosts relate to the intensity of the reactions against the parasite. Anti-microfilarial drugs are also thought to somehow involve the immune system in their pharmacological action. In this study we have investigated some of the factors that might contribute to the pathogenesis, with the aim of gaining a better understanding of the role of immune response in these host inflammatory reactions to Onchocerca volvulus parasite. In the first study we have highlighted the clinically most severe form of dermal onchocerciasis, known as reactive onchocercal dermatitis (ROD), one that is often ignored and has not been properly identified. This form has special characteristics and important biological information that could greatly assist the general understanding of the disease as a whole. Amongst the three major foci of the disease in the study country, Sudan, the prevalence of ROD was found to be associated with different environmental and epidemiological characteristics; strikingly higher in the hypo-endemic areas. Including ROD cases in the prevalence will upgrade the level of endemicity of a locality, and often bring patients much in need of treatment into mass treatment programs that currently only treat localities with medium to high levels of endemicity. In the following research studies, we tried to address the immunological characteristics of the clinically different onchocerciasis patients. Then we also investigated the role of genetic polymorphism in the gene encoding receptor that links innate and adaptive immunity, namely, FcγRIIa.

Patients with either of two major forms of the clinical spectrum-mild and severe dermatopathology were studied by assaying the antigen-driven proliferation of peripheral blood mononuclear cells and the ability of patients’ serum antibodies to promote cytoadherence activity to mf in vitro. Immune responses of those with severe skin disease were found to be stronger compared with the mild dermatopathology group. Mectizan® treatment was followed by an increase in immune responsiveness in those with initially poor responses. Thus the degree of dermatopathology is related to the host’s immune response against mf and immunocompetence may be necessary for Mectizan® to clear the infection efficiently.

The infection has also been associated with increased levels of circulating immune complexes (CIC) containing parasite antigens and a cytokine response that involves both pro-and anti-inflammatory cytokines. Our fourth paper investigated the effect of IC from the O. volvulus infected patients on the production of pro-and anti-inflammatory cytokines. CIC were increased in all patients studied. The precipitate from plasma treated with polyethylene glycol (PEG) were added to peripheral blood mononuclear cell (PBMC) cultures, and the levels of IL-10, tumor necrosis factor TNF-α, IL-1β and their endogenous antagonists soluble TNF-Rp75 and IL-1-receptor antagonist (IL-1ra) were measured. A significant induction of all cytokines measured occurred in the onchocerciasis patients compared to healthy controls. However, the IL-1ra level was suppressed. The suppression of the production of IL-1ra suggests that the IC containing antigens may have a selectively suppressive effect on the production of this anti-inflammatory cytokine; thus implicating its possible role in counteracting inflammatory responses associated with the disease, and suggesting a potential therapeutic significance.

FcgRIIa receptors are involved in many important biological responses, and considered as important mediators of inflammation. A polymorphism in the gene encoding this receptor, that is either arginine (R) or histidine (H) at position 131, affects the binding to the different IgG subclasses. We therefore hypothesized that this polymorphism might be one of the underlying mechanisms to the varied clinical presentations seen in this disease. FcgRIIa genotyping was carried out by gene specific polymerase chain reaction (PCR) and allele-specific restriction enzyme digestion of DNA from clinically characterized patients. The genotype R/R frequencies were found to be significantly higher among patients with the severe form of the disease (including ROD), and it was particularly associated with one tribe (Masaleet) compared to Fulani. Moreover, the H allele was found to be associated with lower risk of developing the severe form. As no significant difference was seen between onchocerciasis cases and controls, the study also implies that this polymorphism influences protection from developing the severe form rather than being related to protection from the infection.

Immunology plays an important role in many ocular disorders. With Evolution, some major organs are able to hide from the immune system. Ocular immune privilege (OIP) can be defined as the ability to raise immune tolerance against an antigen (Ag) when this Ag is placed in specific areas of the eye. Despite the presence of OIP, RPE cells transplanted to the subretinal space (SRS) encounter immune rejection. Specifically, posterior segment autoimmune uveitis (AIU) is a sight-threatening disorder affecting the working-age population. It could be defined as the alteration of OIP that allows retinal auto-antigen recognition by the immune system. Blood-retinal barrier (BRB) breakdown plays a central role in AIU, leading to invasion of leukocytes to the eye. Animal models of experimental autoimmune uveitis (EAU) play a major place in the comprehension of AIU, with correlations to human clinic. Using anti-inflammatory gene transfer to the eye with secreted proteins, different groups significantly reduced EAU development. SOCS1, being a natural intracellular down-regulator of IFNγ pathway and interacting on other cascades, appeared to be an interesting candidate.

We herein propose to study different therapeutical paradigms for intraocular inflammation using anti-inflammatory gene transfer to the retina.

Transfer of immuno-modulatory genes in RPE cells prior to their transplantation into the subretinal space could be useful to reduce immune rejection. We thus compared in vitro adeno-associated viral (AAV) gene transfer to a human immortalised RPE cell-line (ARPE-19) and primary cells (hRPE), to modify their genetic properties. We investigated 3 different serotypes and promoters in vitro, before evaluating a SOCS1 gene transfer to decrease immunogenicity of ARPE-19 cells in a xenograft rat model. We showed that AAV2 efficiently transduced at least 60% of ARPE-19 and hRPE cells, by comparison with the AAV1 and 5. In dividing ARPE-19 cells, mean-fluorescent intensity of CMV-driven gene expression was higher as compared to chicken beta-actin (CAG) and tetracycline inducible (TetON) promoters, but quickly decreased with time whereas CAG was more stable. AAV2-CAG-SOCS1 infection of ARPE-19 cells significantly decreased IFNγ-induced MHC II expression. In a last experiment, we infected in vitro ARPE-19 cells, using AAV2-CAG-SOCS1, prior to their delivery into the SRS of Lewis rats, and compared it with AAV2-CAG-eGFP-infected cells or non-infected cells. Since our preliminary results were not conclusive due to technical limitations, more extended investigations are necessary.

In another part, we developed a clinical grading system (CGS) to efficiently score EAU development in mice fundus. Particularly, we introduced the concept of active and inactive inflammation. However, some differences between CGS and histological (HGS) grading systems were pointed out to better characterise weaknesses of each method. We thus enhanced our CGS to reduce discrepancies with HGS but will need further investigations to obtain comparable grading systems.

Finally, we examined in vivo effects of a SOCS1 overexpression on EAU development, following AAV2-CAG-SOCS1 intravitreal (IVit) delivery in right eyes. We first tried two different intraocular routes of injections in this inflammatory model and showed IVit delivery to be the less traumatic. Due to important animal variabilities in EAU, SOCS1 overexpression did not lead to a significant reduction of inflammation when compared to GFP as a whole. However, our design study, allowing to compare injected versus non injected eyes, furthermore revealed IVit injection side effects with pro-inflammatory reaction due to the injection of AAV2-CAG-eGFP itself. In order to reduce the impact of inter-animal variability, we standardized the data by comparing the mean of ratios of injected over non-injected eyes (I/NI) for each animal rather than absolute values. We showed a significant reduction of the clinical and histological scores of the SOCS1 group as compared to the GFP group that was even stronger in the AAV2-targeted parts of the eyes. However, we missed a saline control to corroborate using our GFP group as a control and will need to introduce in a close future some bilateral injections to validate the use of the mean of grading ratios of I/NI in our experiments. Particularly, we showed a different pattern of MHC II positive invading cells in the ciliary body between SOCS1 treated and non-treated eyes. Further investigations are necessary to confirm and characterise SOCS1 protective mechanism in EAU.
Doctorat en Sciences médicales
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