Добірка наукової літератури з теми "Imaging con spettrometria di massa"

Gli epidermoidi intracranici hanno caratteristiche RM che sono utili ad una precoce identificazione e riconoscimento, favorendo le possibilità terapeutiche chirurgiche. In due anni abbiamo raccolto due casi di epidermoidi intradurali della fossa cranica posteriore, entrambi i pazienti sono stati studiati anche dopo iniezione di contrasto paramagnetico (Gd-DTPA, 0,2 ml/kg di peso corporeo). In entrambi si è dimostrata la presenza di una massa extra-assiale, neutra al contrasto, insinuantesi negli spazi subaracnoidei senza significativi segni di massa, l'esame tomografico RM è estremamente informativo non solo per evidenziare la lesione, ma anche per chiarire i rapporti con le altre importanti strutture anatomiche cerebrali.

55 pazienti con encefalopatia da AIDS sono stati esaminati con risonanza magnetica, con apparecchiatura ad alto campo (1,5 tesla). 37 pazienti (67%) presentavano lesioni della sostaza bianca, 23 (41%) atrofia, 7 (12%) avevano neurotoxoplasmosi, 2 (3,5%) criptococcosi e 2 (3,5%) erano affetti da linfoma. Dei 37 pazienti con lesioni della sostanza bianca, 20 (54%) mostravano diffusa iperintensità in DP e T2 e 17 (46%) lesioni focali. Nei 23 pazienti con atrofia, 12 (52%) presentavano atrofia cerebrale corticale, 8 (34%) atrofia cerebellare e del tronco e 7 (30%) atrofia diffusa. Dei 7 pazienti con neurotoxoplasmosi, 5 (72%) presentavano lesioni di tipo nodulare e 2 (28%) un quadro di encefalopatia diffusa. I due pazienti con linfoma presentavano un reperto di massa periventricolare. Nei due pazienti con criptococcosi è stato rilevato un aspetto nodulare a diffusione leptomeningea. Scopo di tale lavoro è quello di correlare le alterazioni encefaliche nei pazienti con AIDS al quadro RM. Tale studio è stato condotto su 55 pazienti esaminati tra il Marzo e l'Ottobre 1991, nei reparto di Risonanza Magnetica della I Clinica Medica, dell'Università degli Studi di Roma ‘La Sapienza».

Descriviamo 3 casi di tumore epidermoide del IV ventricolo, rara localizzazione di una neoplasia congenita the rappresenta circa l'1% di tutti i tumori cerebrali. Dopo alcuni cenni clinici viene trattata la diagnostica strumentale con tomografia computerizzata e tomografia a risonanza magnetica, sottolineando il ruolo di quest'ultima nella diagnosi differenziale con altre patologie della fossa cranica posteriore e la sua superiorità nella diagnosi di natura. I tumori epidermoidi presentano alla RM: 1) un segnale di intensity ridotta rispetto al parenchima nervoso nelle sequenze pesate in T1 ed in densità protonica ed un segnale di intensità aumentata nelle sequenze pesate in T2; 2) un segnale di intensità aumentata rispetto al liquor del IV ventricolo in tutte le sequenze usate, con la possibilità di ben delimitare l'estensione intraventricolare del tumore; 3) una disomogeneità dell'intensità del segnale nell'interno della massa tumorale, elemento utile nella diagnosi differenziale con altre lesioni, soprattutto cisti aracnoidee.

La RM si rivela genericamente più accurata della TC per stabilire l'origine intra o extra-assiale di una formazione neoplastica encefalica; tale scopo può essere raggiunto sia valutando dei segni diretti (presenza di un piano di clivaggio e dislocazione della corteccia per quanto riguarda i tumori estrinseci) che valutando i segni indiretti (per es. compressione dei ventricoli o delle cisterne dell'angolo ponto-cerebellare, angoli che la massa forma con il tessuto adiacente, presenza o meno del segno meningeo). Al fine di poter effettuare tali valutazioni nella maniera più corretta è necessario adottare una tecnica d'esame rigorosa: acquisizione di scansioni secondo tutti i piani necessari per una corretta valutazione della massa neoplastica (assiali, coronali, sagittali e obliqui), uso di spessori di strato sottili (2 o 3 mm) ogni volta che lo si ritenga necessario (es. neurinomi del n. acustico) e infine adozione praticamente routinaria del mdc ev. La RM è estremamente vantaggiosa anche nel tentativo di caratterizzazione istologica del tumore, ma al momento attuale riteniamo che non presenti sufficiente specificità. L'intensità di segnale e il comportamento dopo somministrazione di mdc possono indirizzare nei confronti di un istotipo o di un altro, ma sicuramente non possono essere considerati come categoricamente diagnostici. È opinione degli autori, tuttavia, che il fine più importante da ottenere con la RM sia quello di stabilire l'origine intra o extra-assiale della neoplasia.

I paragangliomi rappresentano un sistema multicentrico con funzione chemo e barocettrice costituito da numerose strutture sostanzialmente ubiquitarie situate in stretta relazione anatomica con vasi e nervi. La patologia dei paragangliomi è essenzialmente tumorale. Nella maggior parte dei casi si tratta di tumori benigni non secernenti che si manifestano per l'effetto massa e per la compressione di organi adiacenti. Risultano più frequenti nel sesso femminile e nella 3a e 4a decade di vita. Per quanto riguarda il distretto cranio-cervicale, si riconoscono quattro sedi principali: in ordine di frequenza, carotidea, giugulare, timpanica e vagale. Questi tumori si presentano sia sporadicamente, sia nel 10% dei casi in forme famigliari con meccanismo di trasmissione autosomico dominante. Il protocollo diagnostico si basa sulla RM, sulla TC e sull'angiografia digitale, che con il ricorso all'embolizzazione preoperatoria può rappresentare anche l'inizio del programma terapeutico.

La leucoencefalopatia multifocale progressiva (PML) è una malattia caratterizzata da demielinizzazione progressiva della sostanza bianca cerebrale; essa rientra nel gruppo dell'encefalopatie sostenute da virus lenti a DNA ed è secondaria ad infezione con papovavirus nei soggetti immunodepressi. Da una casistica personale di 351 pazienti affetti da sieropositività per l'HIV con o senza AIDS, presentanti sintomatologia neurologica e/o neuropsicologica, sono stati selezionati 10 pazienti affetti da PML (percentuale del 3,5% sul totale dei casi e del 18,9% sui casi con AIDS conclamato). In 4 pazienti il tipo di reperti riconduceva ad una forma diffusa con esordio peritrigonale ed estensione controlaterale attraverso il corpo calloso, anteriore e caudale lungo le vie bianche. In 4 pazienti l'esordio era regionale lobare o sublobare (generalmente parietale), con comparsa sincrona o metacrona di altre lesioni in sedi distanti. In 2 pazienti le lesioni erano di medio numero, di medie e piccole dimensioni, a configurazione ovalare o rotonda. In RM le aree colpite, generalmente asimmetriche, hanno forme e dimensioni variabili da piccole aree ovalari a zone piu' estese a localizzazione lobare o translobare, fino alle forme diffuse con passaggio interemisferico. Le lesioni, senza effetto massa, sono dotate di lungo T1 e T2, con segnale ipointenso nelle sequenze a breve TR e iperintenso nelle sequenze a lungo TR, in rapporto all'estensione della necrosi indotta dai papovavirus. L'impregnazione marginale delle lesioni dopo somministrazione di mdc è rarissima. In pazienti non AIDS questi aspetti sono suggestivi per la diagnosi di PML, mentre nei pazienti AIDS la diagnosi differenziale con l'encefalopatia da HIV pone notevoli problemi per la similarità di aspetti neuroradiologici.

La compressione midollare dovuta ad un focolaio di metaplasia mieloide (ematopoiesi extramidollare) è una rara complicanza che si riscontra principalmente nel corso di affezioni ematologiche croniche. Riportiamo un caso relativo ad una paziente di 64 anni con poliglobulia dal 1963, splenectomizzata, che ha presentato una sindrome da compressione midollare dorsale, progressiva, di livello T9. La RM eseguita con scansioni sagittali pesate in T1 e T2, evidenzia una massa di notevoli dimensioni a livello dello spazio epidurale dorsale posteriore, omogenea, estesa da T2-T3 a T9-T10, che mostra una modesta iperintensità di segnale in T1 ed una iperintensità di segnale in T2 rispetto al midollo, che è compresso e schiacciato. La lesione è ben delimitata anteriormente da una linea caratterizzata da assenza di segnale, che corrisponde alla guaina durale. Non esiste evidenza di lesione ossea. Questo aspetto è caratteristico di un focolaio di metaplasia mieloide nel contesto clinico di una affezione ematologica cronica di cui la talassemia è la più frequente. Pochi casi finora sono stati sottoposti alla RM.

Gli autori riportano il caso di un paziente giunto alla loro osservazione per una bolla di enfisema sottogaleale occipitale destra. L'esame TC del basicranio e della cerniera cranio-cervicale evidenziò un'estesa pneumatizzazione della rocca, mastoide ed occipitale di destra. Tale processo si estendeva anche al condilo ed alla massa laterale dell'atlante; fu inoltre evidenziata una bolla di enfisema all'interno del canale spinale lateralmente al dente dell'epistrofeo. Gli autori ritengono che alla base di tale abnorme pneumatizzazione sia un'eccessiva crescita dell'epitelio di rivestimento dell'antro timpanico all'interno delle strutture del basicranio, tale pneumatizzazione potrebbe in seguito diventare evolutiva mediante un meccanismo a valvola. Gli autori concludono sottolineando come la malformazione descritta possa essere alla base di un pneumocefalo iperteso con conseguente comparsa di sintomatologia neurologica acuta.

Gli autori presentano una casistica di 103 pazienti studiati alla RMN con Gadolinio-DTPA. In 88 casi lo studio era indicato per lesione espansiva endocranica e in 15 spinale. Nel caso dei tumori endocranici il Gadolinio-DTPA ha permesso una migliore definizione della massa neoplastica ed una più chiara dimostrazione dei suoi rapporti con l'edema circostante, il parenchima encefalico ed i vasi cerebrali. Ciò è stato molto utile nei tumori extraassiali e particolarmente nei meningiomi e neurinomi. L'utilità del Gadolinio-DTPA è stata meno evidente nel caso delle lesioni intraassiali. In questi casi comunque, è stato utile nel dimostrare la parte di tumore ove si formava l'accentuazione di contrasto (enhancement) a causa dell'alterazione della barriera emato-encefalica. Dato particolarmente utile per caratterizzare le lesioni ed effettuare biopsie accurate. Nella patologia intraspinale i vantaggi del gadolinio-DTPA sono stati evidenti nei meningiomi e neurinomi. Nei tumori intramidollari l'enhancement ha permesso la distinzione tra parti solide e cistiche delle lesioni ed in qualche caso di contribuire a caratterizzarle.

Scopo del presente studio è stata la verifica dell'apporto diagnostico della Angiografia a Risonanza Magnetica (Angio-RM) nella valutazione pre-operatoria dei meningiomi intracranici. Sono stati esaminati 15 pazienti (portatori di 16 meningiomi), sottoposti ad esame RM di base e ad Angio-RM dei vasi arteriosi e venosi (impiegando sequenze TOF, rispettivamente FISP-3D e FISP-2D), anche dopo somministrazione ev di Gadolinio (Gd-DTPA). L'Angio-RM, nel corso dello studio del comparto venoso, ha permesso una accurata valutazione della invasione dei seni e della dislocazione delle vene corticali. Lo studio dei vasi arteriosi ha permesso di rilevare stenosi del segmento cavernoso della arteria carotide interna (nei meningiomi a sede latero-sellare), effetto massa sui vasi adiacenti, ed, in alcuni casi, le più grosse afferenze arteriose. L'Angio-RM è in grado di fornire un soddisfacente bilancio diagnostico dei meningiomi, con particolare riferimento ai loro rapporti con le strutture vascolari adiacenti, limitando il ricorso a successive valutazioni angiografiche tradizionali a casi selezionati, o nei quali si reputi necessario un trattamento embolico pre-chirurgico.

Mass spectrometry imaging (MSI) is a MS-based technique. It provides a way of ascertaining both spatial distribution and relative abundance of a large variety of analytes from various biological sample surfaces. MSI is able to generate distribution maps of multiple analytes simultaneously without any labeling and does not require a prior knowledge of the target analytes, thus it has become an attractive molecular histology tool. MSI has been widely used in medicine and pharmaceutical fields, while its application in plants is recent although information regarding the spatial organization of metabolic processes in plants is of great value for understanding biological questions such as plant development, plant environment interactions, gene function and regulatory processes. The application of MSI to these studies, however, is not straightforward due to the inherent complexity of the technique. In this thesis, the issues of plant sample preparation, surface properties heterogeneity, fast MSI analysis for spatially resolved population studies and data analysis are addressed. More specifically, two MSI approaches, namely matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) imaging and desorption electrospray ionization (DESI) imaging, have been evaluated and compared by mapping the localization of a range of secondary and primary metabolites in apple and grapes, respectively. The work based on MALDI has been focused on the optimization of sample preparation for apple tissues to preserve the true quantitative localization of metabolites and on the development of specific data analysis tool to enhance the chemical identification in untargeted MSI (chapter 3). MALDI imaging allows high-spatial localization analysis of metabolites, but it is not suitable for applications where rapid and high throughput analysis is required when the absolute quantitative information is not necessary as in the case of screening a large number of lines in genomic or plant breeding programs. DESI imaging, in contrast, is suitable for high throughput applications with the potential of obtaining statistically robust results. However, DESI is still in its infancy and there are several fundamental aspects which have to be investigated before using it as a reliable technique in extensive imaging applications. With this in mind, we investigated how DESI imaging can be used to map the distribution of the major organic acids in different grapevine tissue parts, aiming at statistically comparing their distribution differences among various grapevine tissues and gaining insights into their metabolic pathways in grapevine. Our study demonstrated that this class of molecules can be successfully detected in grapevine stem sections, but the surface property differences within the structurally heterogeneous grapevine tissues can strongly affect their semi-quantitative detection in DESI, thereby masking their true distribution. Then we decided to investigate this phenomenon in details, in a series of dedicated imaging studies, and the results have been presented in chapter 4. At the same time, during DESI experiments we have observed the production of the dianions of small dicarboxylates acids. We further studied the mechanism of formation of such species in the ion source proposing the use of doubly charged anions as a possible proxy to visualize the distributions of organic acid salts directly in plant tissues (chapter 5). The structural organization of the PhD thesis is as below: Chapter one and Chapter two describe the general MSI principle, compare the most widely used MSI ion sources, and discuss the current status in MSI data pre-processing and statistical methods. Due to the importance of sample preparation in MSI, sample handling for plant samples is independently reviewed in chapter two, with all the essential steps being fully discussed. The first two chapters describe the comprehensive picture regarding to MSI in plants. Chapter three presents high spatial and high mass resolution MALDI imaging of flavonols and dihydrochalcones in apple. Besides its importance in plant research, our results demonstrate that how data analysis as such Intensity Correlation Analysis could benefit untargeted MSI analysis. Chapter four discusses how sample surface property differences in a structurally/biologically heterogeneous sample affect the quantitative mapping of analytes in the DESI imaging of organic acids in grapevine tissue sections. Chapter five discusses the mechanism of formation of dicarboxylate dianions in DESI and ESI Chapter six summarizes the work in the thesis and discusses the future perspectives.

BACKGROUND Cardiovascular diseases are the world’s number one death cause, accounting for 17.1 million deaths a year. There is still much unknown about cardiovascular diseases and their physiological underlying mechanism. Understanding the nature of complex biological processes occurring in both healthy and diseased heart tissue requires identifying the compounds involved and determining where they are located. Summary METHODS We have investigated a complementary mass spectrometry imaging (MSI) approach using matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) and secondary ion mass spectrometry (SIMS) on the major areas of rat heart: the pericardium, the myocardium, the endocardium, and the great vessels to study the native distribution and identity of atomics, lipids, peptides and proteins in rat heart sections. 40 layers of horizontal tissue slices were acquired and reconstructed into a 3 D dataset. RESULTS Surface rastering of heart tissue sections generated multiple secondary ions in a mass range up to 1500 m/z. In the negative spectra we identified cholesterol related ions that show high intensity in both atrias, the aorta, the pulmonary artery and the outline both ventricles. The m/z 105 (choline) signal localizes in both atrias, aorta, pulmonary artery, in the atrioventricular valves and semilunar valves but is not present in ventricles surface. DAG species with probable identifications as Oleic, Linoleic [OL]+ at m/z 602 and [OO]+ (Oleic, Oleic) at m/z 604, can be detected. The images of 3D reconstruction show a highly complementary localization between Na+, K+, ion at m/z 145 and ion at m/z 667. Na+ is localized to tissue regions corresponding to atrias, while K+ is strongly localized to tissue regions corresponding to ventricles surface.The ion at m/z 667 localized very precisely within the aortic wall and the ion at m/z 145 is primarily located to the atria regions. CONCLUSIONS To promote further research with cardiovascular disease, we report the identification of characteristic molecules that map the spatial organization in a rat heart’s structure. A series of images obtained from successive sections of animal heart could, in principle, be used to produce a molecular atlas. Such tissue atlases (based optical images) are widely used for anatomical and physiological reference. The specific aim of this project is to optimize the data obtained from Heart SIMS a analysis and the 3-D reconstructive techniques developed to aid in investigating and visualizing differential molecular localizations in heart rat structures. The results reported here represent the first 3D molecular reconstruction of rat heart by SIMS imaging.
Introduzione Le malattie cardiovascolari rappresentano nel mondo la prima causa di morte, contando 17.1 milioni di morti ogni anno. Attualmente i meccanismi fisiopatologici alla base delle patologie sono in larga parte ancora sconosciuti. Capire la natura dei complessi processi biologici in atto sia nel miocardio cardiaco sano che malato richiede l’identificazione e la localizzazione degli stessi elementi molecolari coinvolti. METODO Utilizzando tecniche complementari di spettrometria di massa d’immagine (SMI) quali la spettrometria di massa a ioni secondari (Secondary Ion Mass Spectrometry, SIMS) e la spettrometria di massa a desorbimento /ionizzazione laser assistita da matrice (Matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI) abbiamo analizzato le principali componenti del cuore del ratto: il pericardio, il miocardio, l’endocardio, le valvole e i grandi vasi al fine di studiare ed identificare l’originale distribuzione di atomi, lipidi, peptici e proteine nel tessuto cardiaco normale. Quaranta sezioni di tessuto cardiaco sono state acquisite e ricostruite ottenendo un database tridimensionale. RISULTATI L’analisi della superficie delle sezione di tessuto cardiaco ha generato molteplici ioni secondari con un intervallo di massa che raggiunge i 1500 m/z. Utilizzando la modalita’ negativa abbiamo identificato il colesterolo e gli ioni relativi ad esso che mostrato un alta intensita’ in entrambi gli atri, l’aorta, l’arteria polmonare e pericardio. La colina corrispondente a 105 m/z di massa molecolare risulta essere localizzata in entrambi gli atri, aorta, arteria polmonare, valvole atrioventricolari e valvole semilunari ma non risulta essere presente sulla superficie ventricolare. Sono state identificate molecole appartenenti al diacilglicerolo come acido Oleico, Linoleico [OL]+ corrispondenti alla massa molecolare di 602 m/z e [OO]+ (Oleico,Oleico) con massa molecolare di 604 m/z. Le immagini ottenute dalla ricostruzione tridimensionale mostrano una specifica localizzazione complementare tra il sodio, il potassio e gli ioni con massa molecolare di 145 m/z e 667 m/z. Il sodio e’maggiormente localizzato nelle regioni cardiache corrispondenti agli atri, mentre il potassio e’ maggiormente localizzato nelle regioni corrispondenti alla superficie ventricolari. Lo ione con massa molecolare di 667 m/z e’ localizzato con molta precisione all’interno della parete dell’aorta e lo ione con massa molecolare di 145 m/z e’ localizzato a livello delle regioni atriali. CONCLUSIONI Al fine di promuovere un’ulteriore ricerca in patologia cardiovascolare, riportiamo l’identificazione delle caratteristiche molecole che mappano l’organizzazione spaziale delle strutture cardiache del cuore del ratto. Una serie di immagini ottenute da sezioni successive del cuore potrebbero inizialmente essere utilizzate come un atlante molecolare e similmente, ad un atlante basato sulle immagini ottiche, essere ampiamente utilizzato come referente sia dal punto di vista fisiologico che anatomico. L’aiuto apportato da questo progetto e’ l’ottimizzazione dei dati ottenuti dall’analisi SIMS e lo sviluppo della tecnica per la ricostruzione tridimensionale al fine di investigare e visualizzare le differenti molecole localizzate nelle strutture del cuore di ratto. I risultati qui riportati rappresentano la prima ricostruzione tridimensionale ottenuta con immagini SIMS, del cuore di ratto.

The PhD thesis is focused on the evaluation of different Mass Spectrometry approaches for the study of the proteome of biological fluids and tissues. In detail, the ClinProt technology has been applied to amniotic fluids and urines respectively, to evaluate potential biomarkers for the preterm premature rupture of the membranes (pPROM) and to invetsigate molecular mechanisms of kidney adaptation to hypobaric hypoxia conditions at high and very high altitude. MALDI Imaging Mass Spectrometry (IMS) has been applied for the study of tissues. In detail, this part of the work evaluated the use of the detergents to enhance sensitivity and number of peaks detected for protein IMS analysis.

Gli acidi grassi volatili (VFA) sono importanti intermedi di reazione nel processo di digestione anaerobica, costituendo uno dei migliori parametri per il monitoraggio dei digestori nella produzione di biogas. Diversi metodi sono stati sviluppati per la determinazione della concentrazione dei singoli VFA, e la tecnica più largamente diffusa è quella della iniezione diretta in fase acquosa abbinata a gascromatografia in ionizzazione di fiamma (GC-FID). In questa tesi è stato sviluppato un metodo alternativo basato sulla estrazione dei VFA dal digestato con il solvente dimetilcarbonato (DMC). La procedura sviluppata prevede l’acidificazione del digestato, l’aggiunta di uno standard interno, l’estrazione con DMC e centrifugazione finale prima della analisi in gas cromatografia accoppiata alla spettrometria di massa (GC-MS). I valori delle varie figure di merito del metodo determinati in fase di calibrazione sono risultati confrontabili con i dati di letteratura dei metodi convenzionali. Il metodo risulta adatto allo scopo proposto, e presenta alcuni aspetti vantaggiosi come la bassa quantità di campione richiesta per la analisi, la procedura di preparazione rapida e la minor contaminazione della strumentazione analitica. Il metodo è stato poi applicato a 17 campioni di digestato, provenienti da impianti di digestione anaerobica che lavorano in condizioni operative diverse e che alimentano biomasse di composizione eterogenea. Le condizioni di stabilità dei vari impianti sono state valutate sulla base di alcuni parametri come VFA totali, concentrazione di acido acetico e di acido propionico e loro rapporto, concentrazione totale di VFA a catena lunga (C4-C5). L’utilizzo del DMC e della tecnica GC-MS permette anche di individuare altri acidi organici ciclici ed aromatici nei campioni, per i quali studi futuri potrebbero evidenziarne un utilizzo come ulteriori indicatori di condizione del processo.

Negli ultimi anni sono emerse evidenze che supportano un ruolo di HPV nella patogenesi del cancro al polmone ed è stata riscontrata la presenza e l’espressione, attraverso distinte linee di ricerca, degli oncogeni di HPV nei tumori polmonari supportando l’ipotesi che forme oncogeniche del virus possano agire come cofattori nel processo carcinogenico. Per chiarire il ruolo di HPV nello sviluppo del tumore del polmone abbiamo utilizzato la linea cellulare polmonare A549 come modello cellulare e, dopo infezione con costrutti esprimenti gli oncogeni E6, E7 ed E6/E7 di HPV16, con un approccio di tipo proteomico, abbiamo studiato i cambiamenti nel profilo di espressione proteica delle diverse linee cellulari infettate, rispetto alla controparte normale, associate alla presenza degli oncogeni. Dall’analisi dei replicati dei gels bidimensionali tra le cellule non infettate e infettate stabilmente con HPV16E6/E7, si sono trovate 17 proteine differenzialmente espresse di almeno 2 volte, la cui intensità media normalizzata fosse statisticamente significativa (p<0.05). L’identificazione delle proteine è stata effettuata con esperimenti di spettrometria di massa MALDI-TOF-MS e nLC-ESI-Q-TOF-MS/MS. Le possibili relazioni e associazioni funzionali tra le proteine espresse differenzialmente nelle linee infettate con gli oncogeni di HPV16 sono state valutate tramite il programma bioinformatico Ingenuity Pathway Analysis. Il risultato, derivante da tutte e tre le diverse condizioni di infezione, suggerisce un coinvolgimento funzionale di processi di inibizione dell’apoptosi e le proteine Annexin IV, Gp96, Hsp27 e Tumor protein-translationally controlled 1 identificate come regolatori principali della sopravvivenza cellulare e inibizione della morte cellulare programmata.
In recent years data have accumulated implicating the involvement of oncogenic HPVs in bronchial carcinogenesis and the presence and expression of oncogenic HPV transcripts in non-small cell lung cancers have been reported throughout distinct studies. Taken together these data seem to support the hypothesis that oncogenic HPVs could act as co-factor in lung carcinogenesis. To further understand the role of HPV in the development of lung cancer we employed the lung cell line A549 stably infected with HPV16E6, HPV16E7 and HPV16E6/E7 constructs to investigate by a proteomic approach the protein profile changes associated with the expression of these oncogenes. Replicated 2-DE gels from uninfected and stably HPV16E6/E7 infected A549 cells were compared for changes in protein profile. We identified 17 different polypeptides whose average normalized spot intensity was statistically significant (p<0.05) and differed by 2- fold. The protein identification was achieved by peptide mass fingerprinting by MALDI-TOF-MS and nLC-ESI-Q-TOF-MS/MS peptide ladder sequencing Relationships between differentially expressed proteins and the HPV-induced infection mechanism have been clustered by knowledge-base database functional association network analysis. The results, deriving from the networks obtained from all three different infection conditions, suggested the functional involvement of a cell death inhibition pathway with central nodes including Annexin IV, Gp96, Hsp27 and Tumor protein-translationally controlled 1 as major key proteins for cell viability and inhibition of apoptosis pathway.

La valutazione del profilo steroideo mediante cromatografia liquida abbinata alla spettrometria di massa (LC-MS/MS è di grande utilità nella diagnosi e tipizzazione delle masse del surrene. Abbiamo analizzato il profilo steroideo basale e post test di soppressione al desametasone, in 302 pazienti con incidentaloma surrenalico, mediante un metodo LC-MS/MS per la quantificazione di 11 steroidi. Abbiamo poi valutato le associazioni con la salute cardiovascolare durante il periodo di follow-up. Lo scopo secondario prevedeva lo studio della steroidogenesi intra-tumore ed il confronto con il tessuto surrenalico normale corrispondente, mediante lo sviluppo di un nuovo metodo LC-MS/MS per la caratterizzazione di un pannello di 22 steroidi surrenalici. Da tale studio è emerso che i soggetti con adenoma unilaterale e secrezione disregolata di cortisolo avevano valori basali più elevati di cortisolo, 11-desossicortisolo e corticosterone e livelli ridotti di DHEA rispetto ai pazienti con adenoma non funzionante. I pazienti con secrezione disregolata hanno mostrato la mancata soppressione di cortisolo, 11-desossicortisolo e corticosterone post test al desametasone indipendentemente dalla morfologia della lesione. I livelli di cortisolo e corticosterone post test al desametasone erano inoltre associati con una prevalenza più elevata del peggioramento dell’ipertensione. Pazienti con adenoma unilaterale e secrezione disregolata avevano un’incidenza più elevata del peggioramento dell’ipertensione e per l’insorgenza di nuovi eventi cardiovascolari rispetto ai non secernenti, con il cortisolo post desametasone (Hazard Ratio 1.02, 95% CI 1.01-1.03, P<0.001) ed il corticosterone basale (Hazard Ratio 1.06, 95% CI 1.01-1.12, P<0.031) come maggiori predittori. Dallo studio della sterodogenesi tissutale è emerso il potenziale valore informativo di alcuni steroidi non tradizionali, le cui variazioni erano frequentemente riscontrate nel tessuto tumorale rispetto al tessuto surrenalico normale. I pazienti con incidentaloma surrenalico hanno mostrato un profilo steroideo differente in relazione allo status funzionale ed alla morfologia dei surreni che si associava a differenti livelli di rischio cardiovascolare.
The assessment of steroid profile by liquid-chromatography tandem mass spectrometry has proved to be of great usefulness in the diagnosis and characterization of the adrenal masses. We analyzed the circulating steroid profile in 302 patients with adrenal incidentaloma, by an LC-MS/MS method for the quantification of 11 steroids. We then assessed the associations with cardiovascular health during the follow-up period (median 39 months). The secondary aim was the exploratory study of intra-tumor steroidogenesis and the comparison with the corresponding normal tissue, through the development of a new LC-MS/MS method for the characterization of a panel of 22 adrenal steroids. We found that subjects with unilateral adenoma and dysregulated cortisol secretion had higher basal values of cortisol, 11-deoxychortisol and corticosterone and reduced DHEA levels compared to patients with non-functioning adenoma. Moreover, subjects with hyperplasia and dysregulated cortisol secretion had high cortisol and reduced androgen levels compared to non-functioning hyperplasia. Patients with dysregulated secretion showed no suppression of cortisol, 11-deoxycortisol and corticosterone post dexamethasone-test regardless of lesion morphology. After suppression-test, cortisol and corticosterone levels were also associated with higher prevalence of worsening hypertension. Patients with unilateral adenoma and dysregulated secretion had higher incidence of worsening hypertension and of onset of new cardiovascular events than non-secreting, with post-dexamethasone cortisol (Hazard Ratio 1.02, 95%CI 1.01-1.03, P<0.001) and basal corticosterone (Hazard Ratio 1.06, 95%CI 1.01-1.12, P<0.031) as major predictors. The study of tissue sterodogenesis revealed the usefulness of non-classical steroids, such as the metabolites of cortisol, progesterone, 16-hydroxyprogesterone and some 11-oxidized C19-androgens such as 11-hydroxydrostenedione, 11-ketoadrostenedione and 11-hydroxytestosterone whose variations were frequently found in adrenal lesions compared to normal adrenal tissue. We concluded that patients with adrenal incidentaloma showed a different steroid profile in relation to the functional status and morphology of the adrenals, which was associated with different levels of cardiovascular risk.

2007/2008
Gli Idrocarburi Policiclici Aromatici (IPA), generati da processi di combustione o dispersi a seguito di sversamenti di petroli, risultano essere tra i microinquinanti organici più diffusi nell’ambiente. Essi sono spesso veicolati dal particolato atmosferico emesso da sorgenti in cui avvengono combustioni incomplete, quali motori presenti in autoveicoli o navi, sistemi di riscaldamento, impianti industriali. Le emissioni possono quindi contaminare il comparto atmosferico e le deposizioni secche o umide di particolato aerodisperso trasferiscono gli inquinanti a suoli, specchi d’acqua e indirettamente ad organismi viventi. Un ulteriore elemento di possibile criticità ambientale è associato ai residui solidi della combustione (es. ceneri pesanti), che possono contenere vari microinquinanti, tra cui gli idrocarburi policiclici aromatici, che hanno un potenziale tossico e cancerogeno, e che nel passato sono stati smaltiti sul territorio in discariche non sempre adeguatamente costruite e gestite. Lo studio sviluppato per la preparazione della presente tesi riguarda un ambito territoriale costiero, compreso tra Trieste e Muggia, in cui insiste – accanto a sorgenti comuni e diffuse quali il traffico auto-veicolare e portuale, impianti di riscaldamento e attività industriali quali un cementificio ed un inceneritore – una sorgente di idrocarburi policiclici aromatici di una certa rilevanza, costituita da una cokeria che è parte dell’impianto siderurgico a ciclo integrale situato nel rione di Servola, a Trieste. Il processo di distillazione del carbone, in particolare quando avviene in modo imperfetto ed in impianti di vecchia concezione, è una sorgente emissiva di contaminanti che non permette il rispetto degli standard ambientali nella sua prossimità, in particolare per quel che riguarda gli IPA e il particolato aerodisperso. Un significativo lavoro di caratterizzazione ambientale nella prossimità dell’impianto è stato eseguito dall’Agenzia Regionale per la Protezione dell’Ambiente del Friuli Venezia Giulia, che mette in atto campagne di monitoraggio istituzionale. Il presente lavoro, svolto nell’ambito del dottorato di ricerca, si è posto l’obiettivo di fornire informazioni complementari ed integrative al quadro ambientale disponibile, mettendo a punto procedure analitiche e di campionamento robuste che consentano di integrare i dati generati dalla ricerca universitaria con quelli prodotti dagli organi istituzionali di controllo ambientale. Una prima serie di campagne di indagini, svolta tra febbraio e luglio del 2006, ha consentito di determinare le concentrazioni di IPA nelle polveri fini, campionando per la prima volta il PM2.5 nel territorio giuliano, in un sito urbano a Trieste e in un sito posizionato lungo la costa, sottovento, rispetto ai venti prevalenti, alla zona industriale e portuale, che è potenziale sorgente di inquinanti organici persistenti. Le concentrazioni di PM2.5 risultano più critiche rispetto ai valori obiettivo di quanto lo sia il PM10 rispetto ai limiti vigenti. Sono stati determinati gli IPA nel PM2.5, in collaborazione con ARPA-FVG, evidenziando situazioni comparabili e non critiche rispetto al valore obiettivo per le concentrazione di benzo[a]pirene in atmosfera, con sporadici sforamenti rispetto alla media annuale di 1ng·m-3. È stata rilevata una marcata stagionalità nelle concentrazioni di IPA, con valori relativamente elevati in inverno e molto bassi in estate. La presenza di maggiori concentrazioni di ossidanti in atmosfera nel periodo estivo, attesa ad esempio per l’ozono, può giocare un ruolo, non ancora esplorato, nell’abbassare le concentrazioni di IPA nel particolato. È stata quindi messa a punto, presso i laboratori universitari, una procedura di trattamento dei campioni – basata sull’estrazione accelerata con solvente e su uno stadio di purificazione dell’estratto – e di analisi degli IPA in gas cromatografia accoppiata alla spettrometria di massa, che ha consentito di indagare, con modeste modifiche, matrici diverse provenienti da vari comparti ecologici. La validità della filiera analitica è stata verificata con la determinazione delle concentrazioni di IPA in matrici certificate (mitili liofilizzati SRM2977, sedimento di porto di acqua dolce BCR535, fango di impianto di trattamento BCR088) e con un'intercalibrazione con i laboratori ISPRA, ARPA-FVG ed INCA di Marghera per le analisi sul particolato atmosferico. Nella seconda serie di indagini si sono eseguiti monitoraggi nell’arco di otto mesi del 2007, campionando gli IPA aerodispersi totali (su filtro per le polveri totali sospese e su schiuma poliuretanica per la frazione più volatile), PM10 e PM2.5 in prossimità del perimetro dell’impianto siderurgico presente nel rione di Servola a Trieste ed in un sito relativamente remoto identificato nei pressi dell'Università. La caratterizzazione sperimentale della contaminazione da IPA aerodispersi ha permesso di identificare nella cokeria una sorgente di IPA molto rilevante. Si sono determinate concentrazioni totali di benzo[a]pirene (BaP) aerodisperso (nelle immediate vicinanze della Ferriera quasi sempre oltre il valore obiettivo medio annuale di 1ng·m-3) e di IPA totali, che risultano mediamente 100 volte superiori a quelli misurati presso l'Università (presso la quale non si sono mai registrati valori critici). Si è potuto mostrare anche come i profili di concentrazione degli IPA nei due siti (distanti quasi cinque chilometri) siano molto simili; contributi da altre sorgenti (es. emissioni tipicamente urbane come traffico veicolare e riscaldamento domestico/aziendale) non risultano marcatamente evidenti nel periodo di osservazione considerato. Anche a seguito dei risultati della seconda campagna, sono stati implementati degli adeguamenti per diminuire le emissioni incontrollate dall’impianto. Una validazione dei risultati sperimentali conseguiti durante tale campagna di monitoraggio è stata effettuata grazie ad un interconfronto in cui sono stati coinvolti i laboratori dell'Agenzia Nazionale per la Protezione dell’Ambiente e per i servizi Tecnici (ora ISPRA), dell'ARPA Friuli Venezia Giulia, del Consorzio Interuniversitario INCA di Marghera e dell’Unità di Ricerca in Chimica Ambientale dell’Università. I risultati dell'interconfronto hanno confermato la buona qualità delle metodologie di campionamento e analisi eseguite presso i nostri laboratori, dando un riscontro positivo sulle prestazioni sulle analisi di IPA nel particolato atmosferico, ma anche in fanghi e sedimenti. A seguito di ciò si sono iniziate caratterizzazioni di suoli – nell’ambito di sperimentazioni sul fitorimedio di siti contaminati da IPA – non riportate nella presente tesi. Un’ulteriore campagna di campionamenti ed analisi è stata svolta nel 2008, raccogliendo campioni di particolato atmosferico nell'area abitata di Servola, focalizzando l’attenzione sul contenuto di BaP nel particolato PM10, secondo una norma entrata in vigore con il Decreto Legislativo 152/07 pubblicato il 13 settembre 2007, che recepisce la direttiva europea 2004/107/CE e con il recepimento della norma tecnica EN 15549:2008. Ciò ha comportato una ritaratura delle metodiche di campionamento; in particolare sono stati scelti due siti di campionamento rappresentativi di aree abitate a Servola (“ex-Scuola” e via Pitacco) sono stati acquisiti campionatori di PM10 ad alto volume, integrando la rete di monitoraggio di ARPA-FVG con informazioni nel centro abitato prossimo all’impianto. I risultati di questa campagna di campionamento – conseguiti successivamente agli adeguamenti impiantistici della Ferriera – evidenziano come nelle aree prese in esame le situazioni di criticità riscontrate nelle precedenti campagne non vengano registrate; si verificano ancora sforamenti del valore limite di PM10 di 50μg·m-3, ma gli sforamenti al valore obiettivo di BaP di 1ng·m-3, sono molto più sporadici (1 sforamento su 43 giornate nel sito “ex-Scuola”, e 6 sforamenti su 47 in via Pitacco). Si è ritrovata una stagionalità nell'andamento delle concentrazioni di PM10 e di BaP nell'aria, con situazioni più critiche registrate nei mesi invernali. La presenza degli IPA è stata indagata anche nel comparto marino, vicino alla sorgente industriale di IPA aerodispersi. L'indagine sul bioaccumulo di IPA in Mytilus galloprovincialis nello specchio di mare prossimo all’impianto siderurgico e al terminal petroli – finalizzata ad evidenziare l’ingresso degli IPA nelle acque costiere ed in particolare la possibile contaminazione del biota a seguito di esposizioni di breve durata (cinque mesi) – ha fornito indicazioni sulle cinetiche di bioaccumulo caratteristiche delle diverse situazioni ambientali considerate, evidenziando una situazione di criticità nei pressi dell'area industriale ed una elevata biodisponibilità degli IPA disciolti in quello specchio d'acqua. La differenziazione delle analisi in diversi organi bersaglio (epatopancreas, branchie ed il resto del corpo) e l'integrazione dei livelli di contaminazione rilevati nei tessuti con il contenuto lipidico degli stessi ha mostrato una correlazione diretta fra livello di IPA accumulati e contenuto lipidico, confermando l'epatopancreas come organo bersaglio per l’accumulo di questa classe di inquinanti idrofobici. L'utilizzo di un organismo bioaccumulatore come Mytilus galloprovincialis si è rivelato essere un utile mezzo per la valutazione del grado di contaminazione di acque marine soggette a forte pressione antropica, anche in campagne di misura di durata relativamente breve. In conclusione, grazie all'attività svolta nel presente dottorato di ricerca è stato possibile approfondire vari aspetti sull'entità della contaminazione da idrocarburi policiclici aromatici sul territorio triestino, evidenziando alcune criticità in prossimità dell'impianto siderurgico di Servola. Misure di mitigazione delle emissioni in atmosfera, attuate durante l’arco di sviluppo del lavoro qui riportato, paiono contenere significativamente la criticità correlabile alla presenza di questi cancerogeni nell’aria ambiente. IPA bioaccumulabili sono tuttavia ancora significativamente presenti nelle acque costiere antistanti l’area industriale di Servola. Gli sviluppi del lavoro qui riportato sono orientati allo studio dei processi che modificano stagionalmente le concentrazioni degli IPA nel particolato, associabili all’azione di ossidanti atmosferici, quali l’ozono, sul PMX raccolto sui filtri e sull’impiego delle metodologie di estrazione ed analisi messe a punto per lo studio della contaminazione di campioni biologici, sedimenti e terreni. Si sono iniziati studi ad esempio nel contesto della valutazione di tecniche di fitorimedio per il recupero di aree contaminate da idrocarburi policiclici aromatici e ricerche in merito all'uso di gasteropodi terrestri e marini come bioaccumulatori di IPA, per la valutazione di potenziali rischi per l’ecosistema e la salute umana in siti inquinati.
XXI Ciclo
1974