Добірка наукової літератури з теми "Hydrolysats de protéines de pois"

Le traitement, le conditionnement et la transformation des produits de la pêche génèrent une quantité importante de sous-produits de la pêche (SPP). Ces derniers sont constitués notamment par des têtes, des viscères, de la peau, des écailles, des arêtes, des queues, etc. A défaut d’une stratégie de valo­risation, ils sont jetés et deviennent alors source de pollution, ce qui pose un problème environnemental et sanitaire. Face à cette contrainte, l’équipe du laboratoire Valoremar de l’Ins­titut halieutique et des sciences marines a mis en oeuvre un programme de recherche étudiant la possibilité de valoriser les SPP en alimentation avicole. L’étude a été initiée en raison de la présence probable de molécules valorisables dans les SPP, notamment des protéines. Nous avons ainsi constitué la base protéique de l’alimentation des poulets avec de la farine de SPP (1), mélangée à d’autres ingrédients disponibles, sources de matières énergétiques, minéraux, vitamines…Au laboratoire, la farine a été préparée avec des sous-produits de poulpe et de calmar fournis par une société de pêche basée à Toliara, suivant le procédé de transformation rapporté par le département de la pêche de l’Organisation des Nations unies pour l’alimentation et l’agriculture (2). Il s’agit d’un traitement thermique visant à séparer les fractions solides, huileuses et aqueuses. La farine de SPP a été produite à partir des frac­tions solides et a permis d’élaborer les rations expérimentales (1) (tableau I). L’introduction des farines de poulpe et de cala­mar s’est faite en remplaçant 50 p. 100 (lots C50 et P50) ou 100 p. 100 (lots C100 et P100) du tourteau d’arachide dans un aliment à base de son de maïs et de son de riz.Les poulets étaient des mâles de race locale d’un poids moyen de 250 g à l’entrée et de 485 g en moyenne après la quarantaine. Le test a été réalisé en station sur cinq lots de 25 poulets dont un lot témoin. Les poulets ont été élevés dans les mêmes conditions d’habitat et ont reçu leur nourriture respective de 120 g par tête par jour, en deux distributions (matin et après-midi). La crois­sance des animaux a été suivie jusqu’à 12 semaines. Un autre essai, utilisant des régimes comparables, a porté sur le transfert des techniques aux bénéficiaires. Il a été réalisé dans une ferme pilote et conduit par l’association Ezaka de Saint Augustin, dis­trict de Toliara II, région Atsimo Andrefana.Le rendement de la production de farines de SPP a été de 15 p. 100. Les farines produites étaient très riches en protéines, avec des teneurs de 60,8 p. 100 pour les sous-produits de poulpe et de 52,1 p. 100 pour ceux de calmar. Introduites dans les ali­ments composés (tableau I), les farines des sous-produits de poulpe et de calmar ont permis un gain moyen de poids quotidien allant jusqu’à 17,4 g pour le lot P100. La figure 1 montre que le poids vif des poulets des cinq lots a varié, après 12 semaines d’expérience, en fonction de la nature et de la quantité des SPP utilisés, avec des valeurs atteignant 1 943 g pour le lot P100 et 1 614 g pour le lot C100, contre 1 199 g pour le lot témoin.Dans la ferme pilote de Saint Augustin, les bénéficiaires ont uti­lisé les sous-produits des poissons (figure 2). Le poids vif final de 1 683 g pour les poulets nourris avec des aliments à base de la farine de sous-produits de poisson a été supérieur à celui du lot témoin.Cette étude montre que les SPP, existant en quantité importante sur le littoral sud-ouest de Madagascar, peuvent être valorisés. Si Toliara abonde en SPP, essentiellement des sous-produits de poulpe et de calmar générés par les sociétés de pêche, Saint Augustin génère plutôt des SPP issus des ménages ou des restau­rants. On estime par exemple que 200 tonnes par an de SPP sont générées par une société d’exportation des produits halieutiques basée à Toliara.Le transfert des techniques de valorisation des SPP aux bénéfi­ciaires a été réalisé à travers la mise en place d’une ferme pilote. Ceci permet de confirmer l’impact de l’étude dans le monde rural. Le développement de la filière avicole serait ainsi accueilli favora­blement dans cette localité en tant qu’activité générant des revenus après la pêche. Au laboratoire, l’étude d’une voie de valorisation en alimentation piscicole a attiré l’attention de l’équipe en utilisant non seulement les farines des SPP mais aussi les hydrolysats des protéines des SPP.Les auteurs remercient le Service de coopération et d´actions culturelles de l’ambassade de France à Madagascar pour l’appui financier du projet SPP.

Les peptides chélateurs de métaux (PCMs), issus d'hydrolysats de protéines, présentent diverses applications dans les domaines de la nutrition, de la pharmacie, des cosmétiques, etc. Cependant, l'approche empirique généralement utilisée pour découvrir des peptides bioactifs à partir d'hydrolysats est longue et coûteuse en raison de nombreuses étapes de fractionnement, de séparation et d'évaluation des activités biologiques. Cette thèse a donc pour but de développer une nouvelle approche pour la prédiction de la séparation des PCMs en utilisant la modélisation et la simulation chromatographiques basées sur l'analogie entre la chromatographie d'affinité sur ions métalliques immobilisés (IMAC) et la résonance plasmonique de surface (SPR). Pour la première fois, l'analogie SPR-IMAC a été étudiée expérimentalement sur 22 peptides et 70% d'entre eux ont validé cette analogie, puisque les peptides bien retenus en IMAC étaient également dotés d'une bonne affinité pour Ni2+ en SPR. Dans un deuxième temps, des peptides ayant une forte affinité pour Ni2+ (c'est-à-dire une faible constante de dissociation KD en SPR et un temps de rétention élevé en IMAC) ont été utilisés pour étudier la simulation des profils de concentration de peptides à la sortie de la colonne en IMAC. La connaissance des isothermes d'adsorption étant nécessaire pour effectuer la simulation, il a fallu développer une méthodologie pour prédire les paramètres de l'isotherme de Langmuir en IMAC à partir des données SPR. La simulation a été évaluée en comparant les temps de rétention expérimentaux et simulés qui devraient être proches pour une prédiction fiable. Par conséquent, plusieurs approches ont été étudiées pour déterminer les paramètres de sorption de Langmuir. L‘approche la plus intéressante a introduit un facteur correctif sur la capacité d'adsorption maximale qmax seulement. En effet, l'affinité des peptides pour le Ni2+ immobilisé étant supposée constante quelle que soit technologie utilisée (SPR vs. IMAC), la constante d'affinité KA n'a pas été modifiée. Parallèlement, les applications industrielles des PCMs et des hydrolysats peptidiques ont été étudiées. Tout d'abord, des hydrolysats de protéines de pois ont été produits par protéolyse enzymatique soit avec l'Alcalase® suivi de la Flavourzyme® (Alc+Flav≤1kDa), soit par la Protamex® suivi de la Flavourzyme® (Prot+Flav≤1kDa). La technologie SwitchSENSE® a mis en évidence la présence de peptides chélateurs de Ni2+ et les tests antioxydants ont montré que l'hydrolysat Prot+Flav≤1kDa avait une activité antiradicalaire et un pouvoir réducteur plus élevés, liés à son degré d'hydrolyse plus élevé et à la quantité de peptides de petite taille. Les hydrolysats de protéines de pois et les PCMs ont ensuite été étudiés pour leur capacité à inhiber l'oxydation des lipides dans les émulsions. Ils ont ralenti l'oxydation des lipides par chélation des métaux pro-oxydants (tels que Fe2+) en réduisant les produits d'oxydation primaires et secondaires, responsables de la détérioration des produits contenant des lipides. Ainsi, les hydrolysats de pois et les PCMs pourraient être utilisés comme antioxydants dans les produits alimentaires et cosmétiques, comme alternatives aux produits chimiques tels que l'EDTA, le BHT et le TBHQ
Metal-Chelating Peptides (MCPs), from protein hydrolysates, present various applications in nutrition, pharmacy, cosmetic etc. Yet, the empirical approach generally used to discover bioactive peptides from hydrolysates is time consuming and expensive due to many steps of fractionation, separation and biological activities evaluation. Thus, this PhD aimed to develop a novel approach for MCPs separation prediction using chromatography modelling and simulation based on the analogy between Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) and Surface Plasmon Resonance (SPR). For the first time, the SPR-IMAC analogy was experimentally investigated on 22 peptides and 70% of them validated this analogy, since peptides well retained in IMAC were also endowed with a good affinity for Ni2+ in SPR. In the second time, peptides with high affinity for Ni2+ (i.e low dissociation constant KD in SPR and a high retention time in IMAC) were used to study the modelling and simulation of peptide concentration profiles at the column outlet in IMAC. Since knowledge of adsorption isotherms was required to perform simulation, it was necessary to develop a methodology for predicting Langmuir isotherm parameters in IMAC from SPR data. The validity of simulation was evaluated by comparing experimental and simulated retention times that should be close for reliable prediction. Therefore, several approaches were evaluated to determine Langmuir sorption parameters, the most interesting one introduces a correction factor on the maximum adsorption capacity qmax alone, assuming that the affinity of peptides for immobilized Ni2+ did not change depending on the technology used (SPR vs. IMAC), thus affinity constant KA was not modified. Meanwhile, industrial application of MCPs and hydrolysates were studied. First, pea protein hydrolysates were produced by either Alcalase® followed by Flavourzyme® (Alc+Flav≤1kDa) or Protamex® followed by Flavourzyme® (Prot+Flav≤1kDa). SwitchSENSE® technology evidences the presence of Ni2+ chelating peptides and antioxidants tests showed that Prot+Flav≤1kDa has higher radical scavenging and reducing power, related to its higher degree of hydrolysis and small-size peptides quantity. Secondly, pea hydrolysates and MCPs were investigated for their ability to inhibit the lipid oxidation in emulsions. They slowed down lipid oxidation through chelation of prooxidant (metals such as Fe2+) reducing primary and secondary oxidation products responsible of deterioration of lipid containing products. Thus, pea hydrolysates and MCPs could be used as antioxidants in food and cosmetic products, as alternative to chemicals such as EDTA, BHT and TBHQ

L’hydrolyse pepsique de la myoglobine de muscle squelettique rouge de thon Thunnus Albacares génère un mélange de peptides et d'heme. En vue de caractériser les peptides de cet hydrolysat, nous les avons purifiés par une méthode de chromatographie liquide haute performance mise au point au laboratoire. Il a ainsi été montré que la chromatographie d'exclusion, associée à la chromatographie en phase inverse permettait de résoudre efficacement ce mélange de peptides, malgré sa complexité. La composition en acides aminés des peptides a été déterminée par la méthode du picotag complétée par la méthode de la dérivée seconde qui est une méthode spectrale permettant de détecter et de quantifier les acides aminés aromatiques. La séquence des peptides a ensuite été déduite de la comparaison de leur composition en acides aminés avec la séquence connue de la myoglobine de thon. Ce travail nous a permis de définir les sites de coupure de la pepsine dans nos conditions expérimentales et de les comparer avec ceux décrits dans la littérature. La recherche de peptides actifs n'a pas permis de mettre en évidence dans notre mélange de peptides opioïdes, ni de peptides activateur ou inhibiteur de la croissance cellulaire. Par contre, certaines fractions peptidiques présentent une activité inhibitrice de l'enzyme de conversion de l'angiotensine et d'autres une activité inhibitrice des contractions de l'iléon de cobaye. Des fractions présentent en outre une capacité de fixation de l'heme supérieure à celle de la molécule native. Le type de liaisons existant entre l'heme et les peptides en mélange n'a pas été clairement défini, mais il semblerait que l'heme se lie aux peptides, non pas par des liaisons fortes de type covalentes mais plutôt par des liaisons faibles, facilement détruites lors des processus de purification ou simplement par variation de PH.

L'utilisation d'hydrolysats d'origine marine dans les aliments destinés à l'aquaculture est en pleine expansion face au plafonnement des pêches mondiales. Cependant les besoins des animaux sont encore mal définis orientant les recherches vers la fabrication d'aliments plus spécifiquement adaptés. Les objectifs de ce travail étaient d'identifier et de caractériser des facteurs de croissance et des agents sécrétagogues présents dans des hydrolysats d'origine marine et pouvant avoir un effet in vivo sur la croissance et le développement des larves de la crevette tropicale Litopenaeus vannamei. Cette recherche a été réalisée en trois parties : l'optimisation de la fabrication des hydrolysats, la caractérisation des activités biologiques et l'effet in vivo de l'incorporation des hydrolysats dans l'alimentation des larves de l. Vannamei. L'optimisation de l'hydrolyse du muscle de morue, Gadus morhua, par l'alcalase a défini les conditions opératoires permettant de détecter la présence d'activités biologiques. L'affinité que possèdent les facteurs de croissance et les agents sécrétagogues pour certains récepteurs présents sur les cellules ar4-2j a été exploitée afin de caractériser les activités biologiques détectées dans les hydrolysats de morue et de crevette (litopenaeus aztecus). Des fractions partiellement purifiées ont présenté des caractéristiques d'élution ainsi que des affinités de liaisons comparables à celles retrouvées avec les peptides de la famille des cholecystokinines et les facteurs de croissance. La purification d'une enzyme spécifique du système digestif des crevettes pénaeides, la chymotrypsine, a permis la fabrication d'un hydrolysat de muscle de morue en quelque sorte plus spécifique des larves cultivées. L'influence de ces hydrolysats sur la croissance et le développement des larves de la crevette l. Vannamei a été étudiée. Bien qu'il soit difficile de conclure à l'effet stimulateur de croissance et de digestion des peptides précédemment détectés, l'hydrolysat de morue par la chymotrypsine a un effet bénéfique sur le développement des animaux. Ces différents types d'approches de recherche sont des étapes essentielles afin de caractériser de nouveaux hydrolysats susceptibles de favoriser la croissance, la survie et le développement des larves de poissons et de crustacés.

L'etude a permis d'evaluer l'influence des facteurs genotypiques et phenotypiques sur la composition proteique des graines de pois (pisum sativum l. ). Apres optimisation des conditions d'analyse, une methode d'etude, associant la chromatographie et un traitement statistique des courbes, a ete developpee. A partir des chromatogrammes d'une collection de varietes cultivees dans trois lieux differents, l'analyse discriminante pas a pas est utilisee pour predire l'origine genotypique ou geographique. La repartition des echantillons sur les cartes discriminantes montre que la variabilite de la composition proteique globale depend principalement du genotype. Cette approche a, en outre, permis d'evaluer la variabilite genetique de la composition proteique de l'espece pisum. Contrairement aux varietes de grande culture, les varietes atypiques et primitives presentent une variabilite genetique importante. Une etude comparative de ces resultats avec ceux obtenus par spectroscopie proche infrarouge, montre que la methode chromatographique developpee est mieux adaptee a l'analyse de la composition proteique des graines. L'analyse des spectres proche infrarouge permet une meilleure discrimination des lieux de culture et des genotypes lisses/rides, sur la base de bandes d'absorption attribuables a l'eau et a l'amidon. Dans une etude de la variabilite phenotypique du rapport viciline/legumine en fonction de la teneur en proteines des graines, une correlation est mise en evidence entre ces variations et l'heterogeneite moleculaire des proteines. L'influence des conditions de culture sur ce rapport varie suivant les genotypes. Le polymorphisme de ces proteines apparait principalement influence par l'origine genetique de l'echantillon. Son incidence sur la qualite nutritionnelle de la graine est differente selon les varietes. La methode d'analyse developpee dans cette etude, associee a l'analyse multidimensionnelle des donnees, montre des potentialites importantes. En particulier, elle permet de definir des perspectives pour l'amelioration varietale du pois

Le but du present travail est d'apporter une contribution a l'effort deploye par divers groupes de chercheurs afin de mieux comprendre le mode d'action et les effets de la cuisson-extrusion sur les constituants alimentaires. Le pois (pisum sativum l. ) a ete retenu comme substrat en raison de sa composition et de ses potentialites nutritionnelles. Des techniques tres variees faisant appel a la microscopie photonique et electronique, a la spectroscopie et a de nombreuses autres methodes d'etude des proprietes physico-chimiques (solubilite, electrophorese, hydrolyse enzymatique. . . ), ont ete employees afin de caracteriser au mieux les echantillons avant et apres cuisson-extrusion a l'aide d'un extrudeur pilote bi-vis clextral bc-45. Les observations microscopiques ont permis d'expliquer un certain nombre de proprietes des extrudats telles que la densite, la solubilite et la capacite d'absorption d'eau. Par ailleurs, l'etude des effets des variations d'une large gamme de parametres de cuisson-extrusion a permis d'etablir un bareme d'intensite de traitement en relation avec le degre de transformation des constituants (en particulier les proteines) pouvant etre evalue et predit par analyse multidimensionnelle de spectres proche infra-rouge des extrudats. Sous des conditions moderees, les proteines ont ete peu affectees au niveau macromoleculaire malgre leur faible indice de solubilite du a leur agregation. En revanche, sous des conditions severes, toutes les fractions proteiques etaient impliquees dans des pontages covalents et subissaient des degradations chimiques et macromoleculaires notables

Cette thèse a permis d'étudier l'obtention de peptides biologiquement actifs ou à propriétés fonctionnelles à travers la mise en œuvre et le développement de procédés de préparation et d'hydrolyse d'isolats de protéines issus de tourteaux de colza. Tout d'abord, un procédé de préparation de deux isolats protéiques se différenciant par le type de protéines les constituant (Globuline ou Albumine) a été développé. Les deux isolats ne possèdent pas de bonnes propriétés fonctionnelles mais leur hydrolyse partielle par l'Alcalase 2,4L permet d'en améliorer certaines. Puis, l'action hydrolytique de protéases commerciales (Alcalase 2,4L, Pronase SG, Neutrase 0,8L, Prolyve BS, Lypaïne 6500, Orientase 90N, Espérase 7,5L) sur l'isolat de globulines a été comparée. La valorisation des hydrolysats a porté sur leur capacité à promouvoir la croissance de cellules animales cultivées dans un milieu sans sérum de veau fœtal. Il a été montré que les cinétiques d'hydrolyse, la taille des peptides produits et l'activité biologique des hydrolysats sont significativement influencées par la spécificité de l'enzyme et qu'il existe une relation enzyme / degré d'hydrolyse (DH) / activité ciblée. Enfin, nous avons montré pour trois systèmes enzyme/substrat différents (Alcalase/Globuline, Pronase/Globuline et Alcalase/Albumine) qu'à un DH et à un pH donnés, la composition peptidique des hydrolysats est indépendantes des concentrations initiales en enzyme et en substrat et de la température. Ainsi, la prédiction de l'évolution temporelle du DH, quelles que soient les valeurs de ces paramètres, permet de contrôler la génération d'un mélange peptidique aux propriétés ciblées. Un modèle phénoménologique basé sur le schéma réactionnel de Michaelis-Menten a alors été construit afin de simuler les cinétiques d'hydrolyse en réacteur discontinu. Pour cela, les phénomènes limitants impliqués dans l'hydrolyse (inhibition ou inactivation de l'enzyme, modification du substrat) ont été mis en évidence
This thesis made it possible to study obtaining biologically active peptides or with functional properties through the development of processes for the preparation and the hydrolysis of protein isolates resulting from rapeseed cakes. First, a method of preparation of two protein isolates being different by the type of proteins (Globulin or Albumin) was developed. The two isolates do not have good functional properties but their partial hydrolysis by Alcalase 2. 4L improves some of them. Then, the hydrolytic action of commercial proteases (Alcalase 2. 4L, Pronase SG, Neutrase 0. 8L, Prolyve BS, Lypaïne 6500, Orientase 90N, Espérase 7. 5L) on the isolate of globulins was compared. The valorisation of the hydrolysates related to their capacity to promote the growth of animal cells cultivated in a serum-free medium. It was shown that the kinetics of hydrolysis, the size of produced peptides and the biological activity of the hydrolysates are significantly influenced by the specificity of the enzyme and there is a relation enzyme/ degree of hydrolysis (DH)/ targeted activity. Lastly, we showed for three different enzyme/substrate systems (Alcalase / Globulin, Pronase / Globulin and Alcalase / Albumin) that at given DH and pH, the peptide composition of the hydrolysates is independent of the initial enzyme and substrate concentrations and of the temperature. Thus, the prediction of the temporal evolution of the DH, whatever the values of precedent parameters, allows to control the generation of a peptide mixture with targeted properties. A model based on the reaction pathway of Michaelis-Menten was then built in order to simulate the hydrolysis kinetics in batch reactor. For that, limiting phenomena implied in the hydrolysis (inhibition or inactivation of the enzyme, modification of the substrate) were highlighted

La protection et la vectorisation de certaines molécules actives, alimentaires et pharmaceutiques, nécessitent de les séparer de leur environnement en les piégeant dans des matrices structurées capables de les libérer à un endroit et à un instant bien précis. Lorsqu'il s’agit de systèmes d'encapsulation à base d'émulsions sèchées par le procédé d'atomisation, la maîtrise de ces matrices requiert à la fois la connaissance des propriétés des membranes interfaciales et de celles de la matrice de séchage. La caractérisation, par tensiométrie, des propriétés interfaciales des protéines de pois, en présence et en absence de pectine, polyélectrolyte anionique, permet l’étude des interactions protéines/pectine aux interfaces H/E et leur effet sur la stabilité de l’émulsion lors du séchage par atomisation. L’étude de l’effet des propriétés de la matrice de séchage, à base de maltodextrines, permet de relier leurs interactions vis-à-vis de l’eau aux performances d’encapsulation des émulsions séchées. Les études à l’échelle moléculaire mettent en évidence le rôle de la pectine dans la stabilisation de la structure secondaire des globulines de pois lors du séchage, ce qui se traduit par une meilleure protection de la molécule active encapsulée. Enfin, l’analyse de la cinétique de libération d’une molécule volatile modèle, l’hexanoate d’éthyle, permet d’évaluer les propriétés barrière des couches interfaciales et d’identifier le mécanisme de libération. L’ensemble de ces travaux menés à différentes échelles permet de contribuer à la compréhension des divers mécanismes impliqués dans (i) la stabilisation des émulsions par des interfaces multicouches à base de protéines/polysaccharides, (ii) leur résistance au séchage par atomisation et enfin (iii) leur capacité à protéger et à libérer des composés sensibles
The protection and the vectorization of active, food and pharmaceutical molecules, require separating them from their environment by entrapping them in structured matrices able to release them at the precise place and the quite time. When these encapsulation systems are based on dry emulsions, the control of the matrices requires the knowledge of both the properties of the interfacial membranes and those of the drying matrix. The characterization, of the interfacial properties of pea proteins, in presence and absence of pectin, an anionic polyelectrolyte, allows the study of the interactions proteins/pectin at O/W interfaces and their effect on the emulsion stability during spray-drying process. The study of the effect of the properties of the dehydration matrix, maltodextrins, makes it possible to link their interactions with water to the encapsulation efficiency of dry emulsions. The molecular investigation highlights the role of pectin in the stabilization of the secondary structure of pea globulins during drying, which results in a better protection of the encapsulated active molecule. Lastly, the analysis of the release kinetics of a volatile molecule makes it possible to evaluate the barrier properties of the interfacial layers and to identify the release mechanism. The whole of this work at various scales makes it possible to contribute to the understanding of the various mechanisms implied in the emulsion stabilization by multi-layered interfaces containing proteins/polysaccharides, their resistance to spray-drying and finally their capacity to protect fragile compounds

La calmoduline (CaM) est une protéine de transduction du signal calcium (Ca2+), ubiquiste et dont la structure est très conservée parmi les eucaryotes. L'expression de mutiples isoformes de CaM est un signe distinctif de cette protéine chez les végétaux supérieurs. Elles n'ont pas d'activité catalytique propre mais interviennent spécifiquement dans de nombreuses voies métaboliques associées au développement ou aux réponses aux stress. Des analyses menées par spectrométrie de masse ont permis d'identifier trois isoformes protéiques de CaM dans les graines de pois. Elles diffèrent par des substitutions uniques d'acides aminés au sein de la première hélice alpha N-terminale. Les gènes de CaM appartiennent à une petite famille multigénique. Les ADNc pleine longueur codant les trois isoformes (PsCaM1, 2 & 3) ont été clonés et ont permis de déduire des amorces spécifiques dessinées dans les régions 5' et 3' non-traduites les plus divergentes. Les études d'expression, menées par RT-PCR semi-quantitative, ont montré une accumulation différentielle de chaque transcrit au cours de la germination. PsCaM1 & 2 sont détectés en quantités différentes dans les axes embryonnaires et les cotylédons secs, puis s'accumulent au cours de l'imbibition jusqu'à la percée de la radicule, alors que PsCaM3 apparaît au moment de la percée de la radicule et son niveau augmente progressivement dans les axes et les cotylédons. Afin de caractériser les propriétés biochimiques de chaque isoforme, les trois protéines ont été surexprimées dans Escherichia coli sous forme de protéines de fusion avec un Strep-tag (CaM1-ST, CaM2-ST & CaM3-ST). Les expériences de réactivation de la NAD kinase CaM dépendante de pois ont donné les mêmes résultats pour les trois protéines. Par contre, les analyses fonctionnelles utilisant la technique de gel-retard ont montré des différences entre les trois isoformes. CaM1-ST se lie de manière stoechiométrique au peptide synthétique dérivé du site de fixation de la CaM sur la CaM Kinase II, alors que CaM2-ST et CaM3-ST présentent une affinité moindre pour ce peptide. En utilisant un autre peptide synthétique idéal, Trp-3, ces affinités sont encore plus réduites. L'étude ultérieure de la distribution cellulaire de la CaM et l'identification des enzymes cibles de la CaM au cours de la germination permettront d'élucider l'implication des diverses isoformes de CaM dans les voies métaboliques associées à la germination.