Дисертації з теми "Gènes de sensibilité"

Le Tomato spotted wilt virus est un virus dommageables pour Solanac. L’évolution adaptative de la RNA-dependent RNA polymerase du TSWV a été analysé. Le génome de l’isolat TSWV-LYE51 a été séquencé. L’analyse s’est portée sur le gène de la RdRp impliquée dans la transcription et réplication du génome viral. Un modèle 3D de cette protéine a été créé par modélisation par homologie. Des analyses phylogénétiques et de sélections ont permis de mettre en évidence des hot-spots de mutations adaptatives et des domaines contraints. Une recherche de gènes candidats de la plante hôte impliqués dans la sensibilité au TSWV a été menée : pour réaliser leur cycle, les virus détournent de nombreux facteurs de l’hôte via des interactions directes. Ces facteurs sont des sources de résistance via leur absence ou leur modification. J’ai réalisé des cribles double-hybrides en levure en utilisant un domaine contraint comme appât. Mes résultats ont permis d’identifier plusieurs gènes candidats dont la validation est à venir. Mes travaux ont permis d’obtenir de nouvelles informations sur les mécanismes du cycle viral et la capacité d’adaptation du TSWV. Tout cela ouvre de nouvelles perceptive sur le développement de résistance par perte de sensibilité, en utilisant la variabilité naturelle ou inées. Malgré des résistances dominantes chez la tomate et le piment, de nouveaux isolats contournant sont apparus. Il est primordial de développer de nouvelles résistances génétiques durables face au TSWV. Mes travaux de thèse ont eu pour objectif de caractériser un isolat de TSWV et d’identifier des interactions protéiques entres le TSWV et la plante hôte, Solanum Lycopersicumduite des gènes candidats
The Tomato spotted wilt virus is the second most destructive plant virus, particularly in Solanacea. Despite resistance genes found in Tomato and Pepper toward this virus, new isolates were able to overcome those genes. There is an urgent need to develop new durable genetic resistance. Resistance by loss of susceptibility is one of the great opportunities. My thesis falls within the ambition to characterize a TSWV isolate and to identify protein interaction between the virus and his host, Solanum Lycopericum. TSWV RNA-dependent RNA polymerase adaptive evolution and constrained domains was analyzed. TSWV-LYE51 genome was sequenced. We decided to focus on the RdRp which is the key protein for cycle life. This protein is responsible of the transcription and replication of the viral genome. A 3D model of this protein was made by homology modeling. Phylogenetic and selection analysis show up some hot-spot of adaptive mutation and constrained domains. Those results were useful to search resistance genes. Then, we were looking for candidates genes implicated in TSWV sensibility. Virus has to hijack host cellular protein in order to accomplish its cycle and infect its host. Host proteins are susceptibility factors. Those factors could lead to resistance by their absence or their modification. To find them, some yeast-two hybrid screenings were made using constrained domains previously identify as bait. We identify several candidates’ genes which still have to be validated. My work allows us to obtain new information about TSWV infectious mechanism and its adaptation. It brings new perspective in loss-of-susceptibility resistance development by using natural variability

Le diabète de type 2 (DT2) représente la forme la plus commune de diabète touchant plus de 170 millions de personnes dans le monde. Les mécanismes physiopathologiques à l'origine de l'hyperglycémie chronique associent des défauts de sécrétion de l'insuline et de son action sur des organes cibles déterminés par des interactions entre des facteurs de risuqe génétiques et environnementaux. Plusieurs gènes responsables de formes monogéniques de diabète ont été identifiés; toutefois, les déterminants génétiques influençant la prédisposition aux formes communes du DT2 sont encore peu connus. Afin d'identifier de nouveaux variants de susceptibilité, nous avons utilisé deux types d'approches: - une analyse d'association familiale de variants de gènes candidats positionnels au locus 3q27 au sein de familles présentant une liaison génétique avec le DT2 apparaissant avant 45 ans; - et l'exploration d'un gène candidat physiologique , PTPN1, par une étude cas-contrôlés dans plusieurs cohortes de sujets diabétiques et obèses. L'étude du locus 3q27 dans les 148 familles françaises à forte agrégation de DT2 (432 sujets diabétiques et 129 sujets normoglycémiques) a permis de confirmer la liaison génétique ave cl'âge d'apparition du diabète. Deux gènes ont été explorés: KNG1 codant pour kininogène, le précurseur de la bradykinine, et EIF4A2, un facteur d'initiation de la synthèse protéique négativement régulé par le glucose dans des cellules -pancréatiques de rat (INS832/13). Un variant (SNP rs266714 C/T), localisé en amont du gène EIF4A2, a montré une association au DT2 et à l'âge de survenue du diabète au sein des familles. Les paires d'atteints porteuses d'au moins un allèle T à risque montrent un lod-score de 5. 24 pouvant expliquer la liaison au DT2. De plus, ce variant explique en partie la liaison génétique avec l'âge de survenue du diabète. Le SNP rs266714 pourrait modifier le niveau d'expression du facteur EIF4A2 qui module la traduction de certains ARN messagers ainsi que le taux de synthèse protéique notamment dans les cellules -pancréatiques. Le gène PTPN1 code pour la protéine tyrosine phosphatase 1B, régulateur négatif des voies de signalisation de l'insuline et de la leptine. Une association au DT2 et à l'obésité modérée est observée pour un variant au locus du gène PTPN1. Chez 736 sujets normoglycémiques non obèses, 2 SNP introniques sont associés à des variations de traits quantitatifs du métabolisme glucido-lipidique : augmentation du HOMA-B et des triglycérides, diminution du HDL-cholestérol suggérant un rôle possible dans la survenue du syndrome métabolique. Ce type d'approche génétique permet d'améliorer nos connaissances des voies de signalisation pouvant être impliquées dans le développement du DT2 et de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques
Type 2 diabetes (T2D) is the most common form of diabetes affecting more than 170 million people worldwide. The T2D pathophysiological mechanisms are characterized by defects of insulin secretion and insulin action leading to chronic hyperglycaemia determined by interactions between genetic and environmental risk factors. Although many genes responsible for monogenic forms of diabetes were identified, genetic determinants influencing T2D predisposition are still largely unknown. To identify new susceptibility variants, we used two approaches : - a familial association study of positional candidate gene variants at the 3q27 locus in falilies showing linkage to T2D with onset before 45 years ; and the exploration of a physiological candidate gene, PTPN1, through case-control analyses in different groups of subjects with type 2 diabetes or obesity. The analysis of the 3q27 locus in French families with strong T2D aggregation (432 diabetes subjects and 129 normoglycaemic subjects) confirmed of a genetic linkage with T2D age-of-onset. Two genes were investigated : KNG1, coding for kininogen, the bradykinin precursor, and EIF4A2 coding for the Eukaryotic Translation Initiation Factor 4 alpha 2, a translation initiation factor involved in protein synthesis which is down-regulated by glucose in rat pancreatic beta cells (INS832/13). A variant (rs266714), located upstream of the EIF4A2 gene showed association with T2D and T2D age-of-onset in the families. Affected sib-pairs sharing at least one at risk T allele showed a LOD-score of 5. 24 which could explain the T2D linkage. Moreover, this variant partly explains the age-of-onset linkage. The rs266714 SNP could modify the expression level of the eIF4A2 factor which modulates mRNA translation and protein synthesis rates in pancreatic beta cells. The PTPN1 gene codes for the protein tyrosine phosphatase 1B, a negative regulator of the insulin and leptin signalling pathways. An association with T2D and moderate obesity is observed for a variant at the PTPN1 gene locus. In 736 normoglycaemic non obese subjects, 2 intronic SNPs associate with variations of quantitative traits of glucose and lipid metabolism : increased HOMA-B and triglycerides, decreased HDL-cholesterol, which suggests a possible role in metabolic syndrome. This genetics approach contributes to an improved understanding of the pathways involved in the development of T2D and to propose new therapeutic targets

La gp17 est une glycoprotéine qui a été purifiée à partir du liquide séminal de sujets sains et qui présente une forte affinité pour CD4. Par ailleurs, elle a été mise en évidence dans les kystes mammaires de patientes présentant une pathologie kystique bénigne du sein, mais aussi dans 50 à 80% des cancers du sein. Hormis le fait que la gp17 constitue un marqueur des cellules et des glandes apocrines, ses fonctions sont mal connues. Le travail développé au laboratoire et qui fait l'objet de cette thèse a eu pour but de caractériser les propriétés de la gp17 vis à vis de CD4. Nous avons montré que la gp17 est capable d'inhiber l'apoptose de lymphocytes du sang, induite par l'agrégation séquentielle de CD4 et du complexe CD3-TCR à l'aide d'anticorps dirigés contre ces 2 molécules. Cette propriété fonctionnelle nous a conduits à analyser le rôle de la gp17 sur les voies de signalisation dépendantes de la stimulation du complexe CD3-TCR, et à déterminer si l'effet modulateur exercé par la gp17 est dépendant de sa fixation sur CD4. L'utilisation de la synthèse peptidique sur membrane associée à la biosynthèse de gp17 recombinante sauvage et mutée par transfection transitoire de cellules COS nous a permis d'identifier les acides aminés de la gp17 qui interviennent dans sa fixation sur CD4, soit par contact direct, soit en maintenant les régions d'interaction dans une configuration optimale. Par ailleurs, nous avons comparé les effets de la gp17 naturelle, la gp17 recombinante sauvage et la gp17 recombinante mutée ayant perdu son affinité pour CD4, sur la variation de certains paramètres intracellulaires induite par stimulation du complexe CD3-TCR. Ainsi, nous avons montré sur une lignée de cellules Jurkat CD4+ et CD3+ que la gp17 ne module pas l'augmentation de [Ca2+lI induite par l'agrégation du complexe CD3-TCR. En revanche, nous avons montré que dans les mêmes conditions de stimulation, la gp17 provoque une inhibition de la phosphorylation de certaines protéines cytoplasmiques, selon un mécanisme dépendant de la fixation de la gp17 sur CD4. De plus, nous avons montré que l'incubation de cellules Jurkat avec la gp17 provoque une augmentation significative de la quantité de p56Jck associée à CD4 selon un mécanisme également dépendant de la fixation de la gp17 sur CD4. Nous suggérons donc que la fixation de gp17 sur CD4 puisse désensibiliser les lymphocytes T à la stimulation ultérieure du TCR. Cette désensibilisation étant indépendante de l'augmentation de [Ca 2+li nous suggérons que la gp17 puisse agir sur la formation des complexes multimoléculaires localisés sous la membrane plasmique, consécutif à la stimulation du complexe CD3-TCR, et notamment sur l'activation de la voie Ras. Ces travaux qui méritent d'être approfondis pour disséquer le mode d'action de la gp17 sur la désensibilisation relative des lymphocytes T CD4+ permettront éventuellement de mieux comprendre le dysfonctionnement des lymphocytes infiltrant les tumeurs mammaires dans lesquelles la gp17 est fortement exprimée.

Avec l'avènement de la téléphonie et des réseaux mobiles, l'impact des radiofréquences (RF) sur la santé humaine est plus que jamais un sujet d'actualité. Les résultats des recherches Homme et animal restent controversés et ne permettent pas de conclusion définitive sur l’existence ou non d’effets des RF, notamment sur le cerveau. Ainsi, nos résultats montrent que chez le rat, jeune, adulte et âgé, une exposition de 3 mois à un signal LTE 4G (900 MHz, 61V/m, DAS = 0,33 W/kg) n’a aucun effet sur l’apprentissage et la mémoire spatiale récente et ancienne, ni sur l’anxiété ou la locomotion. L’expression des gènes a été étudiée par séquençage haut débit des ARNm, en conditions "Basal" et "Apprentissage" dans l’hippocampe dorsal et le cortex préfrontal médian. Nos résultats montrent que des gènes appartenant à des regroupements fonctionnels spécifiques sont modulés en réponse à l’exposition aux RF dans l'hippocampe dorsal en condition "Basal" et dans le cortex préfrontal médian, pendant et suite à un apprentissage spatial. Cependant, il est important de noter que ces modulations génétiques n'impactent pas le rappel d'un souvenir récent ou ancien. En perspective, il sera important de connaître les possibles répercussions que ces régulations peuvent avoir à plus long terme sur le fonctionnement cérébral
The increasing development of mobile phone technology and networks raises the question of the impact of electromagnetic fields in the radiofrequency range (RF) on human health and well-being. However, data from humans and animal scientific research remain controversial and do not allow to conclude about potential harmful effects of RF, particularly on the brain. Thus, our results showed that, in young, adult and aged rats, a chronic exposure (3 months) to a 4G LTE signal (900 MHz, SAR = 0.33 W/kg, 61V/m) had no impact on spatial learning and long-term memory, nor on anxiety and locomotion. Gene expression was studied using high throughput RNA sequencing in the dorsal hippocampus and medial prefrontal cortex, both in "Basal" and "Learning" conditions. Our results show that some genes belonging to specific functional groups were modulated by RF in the dorsal hippocampus in "Basal" condition and, in the median prefrontal cortex during and after spatial learning. However, it is to note that these gene expression modulations have no impact on recent or remote memory. In perspective, it will be important to explore the potential effects of such changes in brain functioning

L'ethylene, hormone vegetale, est impliquee dans de nombreux aspects du developpement des plantes et dans leur reponse a des modifications environnementales. La derniere etape de sa voie de biosynthese catalysee par l'acc oxydase est codee par une petite famille multigenique. Le travail presente montre que, chez le melon, l'acc oxydase est codee par trois genes, cm-aco1, cm-aco2 et cm-aco3, qui ont ete clones et sequences. Ils sont exprimes differentiellement au cours du developpement et en reponse aux stress. Cm-aco1 est exprime dans les fruits murs, les feuilles et les fleurs senescentes et dans les feuilles blessees ou traitees a l'ethylene. Les transcrits codes par cm-aco2 ont ete uniquement detectes dans les graines germees et les hypocotyles etioles. Les conditions d'expression de cm-aco3 sont essentiellement liees au developpement foliaire et floral. Le gene cm-aco1 est induit dans les feuilles blessees par une voie directe et independante de l'ethylene. L'accumulation des transcrits est rapide et n'est pas affectee par l'utilisation d'un inhibiteur irreversible de l'action de l'ethylene. De plus, des tabacs transgeniques portant des deletions progressives de la region 5'non traduite de cm-aco1, fusionne au gene rapporteur gus, ont deux regions independantes impliquees dans l'induction de cm-aco1 apers blessure ou un traitement a l'ethylene. L'analyse fonctionnelle du promoteur de cm-aco1 a ete entreprise par des experiences de biolistique. Une region de 154 paires de bases porte deux sequences susceptibles d'etre impliquees dans la sensibilite a l'ethylene. La premiere presente des homologies avec la boite gcc qui confere la sensibilite a l'ethylene des genes pr. La deuxieme est retrouvee dans les promoteurs de deux autres genes, codant l'acc oxydase, induits par l'ethylene. Des experiences de retardement sur gel ont mis en evidence l'existence d'interaction adn/proteines specifiques intervenant dans chacune de ces regions.

Décrypter les mécanismes de résistance aux thérapies ciblées anticancéreuses représente un enjeu majeur de progrès médical pour l'identification de futures cibles thérapeutiques. Dans notre panel de lignées tumorales, la résistance aux inhibiteurs des PKCs est principalement associée à la transition épithélio-mésenchymateuse. Dans les cellules résistantes, nous avons observé une augmentation de l'expression de marqueurs mésenchymateux et une diminution de l'expression de marqueurs épithéliaux. De plus, Pendothéline-1 et la mutation activatrice G13D sur l'exon 2 de K-Ras apparaissent comme des marqueurs moléculaires potentiels de la résistance. PTX-008 est un agent ciblant la galectine-1, une lectine impliquée dans la prolifération tumorale et l'augmentation du potentiel métastatique. PTX-008 inhibe la prolifération des cellules tumorales à phénotype épithélial exprimant faiblement la galectine-1. Dans la lignée la plus sensible d'origine ORL, PTX-008 inhibe l'expression de la galectine-1 et les voies de survie et de prolifération PI3K/AKT et MAPKs. Dans les xénogreffes, PTX-008 diminue la croissance tumorale, l'angiogenèse et le développement de métastases. En combinaison, PTX-008 a des effets synergiques avec plusieurs thérapies utilisées en clinique. De plus, l'acquisition de la résistance à PTX-008 est associée à l'acquisition par les cellules d'un phénotype mésenchymateux et à une inhibition de l'expression de la galectine-1. Nos résultats permettent d'envisager une meilleure sélection des patients sur des critères biologiques pour l'indication de thérapies ciblées, et de valider la galectine-1 comme une nouvelle cible prometteuse dans le traitement des cancers
Deciphering mechanism of resistance to anticancer targeted therapies represent a crucial challenge of medical progress for the identification of future therapeutic targets. In our panel of tumor cell lines, résistance to PKCs inhibitors is mainly associated with epithelial to mesenchymal transition. Indeed, resistant cells show an increase in mesenchymal markers concomitant with a decrease in epithelial markers. Our findings point out endothelin-1 and activating K-Ras mutation as the molecular factors responsible of PEP005 and enzastaurin resistance, respectively. PTX-008 is a compound aimed to target galectin-1, a lectin implicated in tumor proliferation and metastatic dissemination. PTX-008 inhibits the proliferation of tumor cells with épithelial phenotype and low levels of galectin-1. In thé PTX-008-sensitive head and neck cell line, PTX-008 decreases galectin-1 expression and blocks PI3K/AKT and MAPK pathways. In xenografts, PTX-008 treatment inhibits tumor growth, angiogenesis and metastatic dissemination. In combination, PTX-008 shows synergistic effects with another antiangiogenic agent as sunitinib, and potentiates the effects of several classical cytotoxic compound used in clinical practice. Moreover, a cell line PTX-008-resistant has been developed in our lab, which displays a mesenchymal phenotype and a marked galectin-1 expression decrease. Altogether, our results may contribute to optimize future selection of patients candidate to targeted therapies, and validate galectin-1 as a promising new target for innovant anticancer approaches

De plus en plus d’inhibiteurs de kinase (IKs) sont testés dans le cancer de la prostate qui représente chez l’homme un enjeu de santé publique majeur de par son incidence (1er cancer) et sa mortalité (4ème cancer). Les essais cliniques pour évaluer l'efficacité des IKs dans cette indication ont donné des résultats mitigés malgré la présence de leurs cibles pharmacologiques dans les tumeurs de prostate (VEGF, EGFR, CMET..), pouvant faire penser que l’inefficacité serait en partie liée à la molécule elle-même et à sa pharmacocinétique/pharmacodynamie. En effet, les IKs sont sujets à un métabolisme et un transport intense via des enzymes de phase I et II et des transporteurs contrôlés pour la majorité par le récepteur nucléaire PXR (Pregnane X Receptor, gène NR1I2). En plus d’être abondamment exprimé dans le foie et le long du tractus gastro-intestinal, PXR est également exprimé dans certaines tumeurs épithéliales et pourrait être impliqué dans la résistance aux chimiothérapies par augmentation du catabolisme et de l’efflux de ces agents anticancéreux. A ce jour une seule étude a révélé l’expression de PXR dans le cancer de la prostate sans en avoir évalué l’impact sur la réponse aux traitements utilisés dans cette indication. En collaboration avec le Pr G. Fromont, nous avons observé dans une cohorte de 449 patients que l’expression de PXR était plus fréquemment retrouvée dans les cancers résistants à la castration et les métastases, par rapport aux cancers cliniquement localisés dans lesquels l’expression de PXR était corrélée avec le stade TNM et le score ISUP. Ces résultats confirment donc l’intérêt d’étudier le rôle que peut jouer PXR et les gènes du métabolisme et du transport qu’il régule, dans la sensibilité aux IKs dans les cancers de la prostate.Nous avons mesuré l’expression de PXR et de ses gènes cibles dans les lignées de cancer de la prostate 22RV1, LnCap, PC3 et DU145. Les résultats montrent une expression significative des enzymes et transporteurs responsables de la détoxication des IKs mais une faible expression de PXR liée à des phénomènes d’hyperméthylation NR1I2 dans nos lignées Cela nous a conduit à établir des modèles de surexpression stable de PXR dans lesquels l’agoniste SR12813 est capable d’induire l’activité transcriptionnelle de ce xénorécepteur, indiquant la compétence métabolique de ces lignées. À l'aide de ces modèles, nous avons démontré que la surexpression de PXR module la réponse à l’erlotinib, le dasatinib, le dabrafénib et l’afatinib démontrant que PXR joue un rôle fonctionnel dans la sensibilité à ces IKs. Nous avons également démontré que certains inhibiteurs avaient des propriétés agonistes de PXR, notamment le dabrafénib qui montre un effet agoniste plus marqué que le composé de référence SR12813, ce qui n’a jamais été démontré. Cette découverte originale nous a conduit à engager une collaboration pour tenter de cristalliser le complexe PXR/dabrafénib et à tester l’hypothèse que l’induction de l’activité PXR pouvait entraîner une modification du métabolisme et/ou du transport d’autres médicaments co-administrés. Or, nous avons observé dans la lignée 22RV1 un effet additif entre le dabrafénib et le tramétinib, une combinaison approuvée dans le traitement du mélanome, qui devient antagoniste lorsque PXR est surexprimé, résultat qui va effectivement dans le sens de notre hypothèse même s’il reste à démontrer que cet effet est bien lié à une altération du métabolisme de ces IKs, ce que nous sommes en train d’évaluer en dosant les métabolites de ces IKs. L’ensemble de nos données pourraient servir de rationnel biologique dans le choix des IKs ou de leurs combinaisons à tester avec les hormonothérapies et chimiothérapies déjà utilisés dans le traitement du cancer de la prostate, afin de potentialiser la réponse tumorale
More and more kinase inhibitors (KIs) are tested in prostate cancer that represents a major health issue in men with its incidence and mortality rates. Clinical trials to evaluate KIs efficacy in prostate cancer gave disapointing results depsite the presence of KIs pharmacological targets in prostate tumors (VEGF, EGFR, CMET..), suggesting that inefficiency of these drugs would be at least in part linked to the inhibitor itself or its pharmacodynamics/pharmacokinetics parameters. Indeed KIs are metabolized and transported via phase I and II enzymes that are mainly controlled by the xenoreceptor PXR (Pregnane X Receptor, gène NR1I2). It is mainly expressed in liver and gastro-intestinal tract but also in epithelial tumors. PXR is also involved in the resistance to chemotherapies by increasing the catabolism and the efflux of these anticancer agents. To date only one study evaluated PXR expression in prostate cancer without evaluating its impact on treatment efficacy. In collaboration with Pr G. Fromont we analyzed a cohort of 449 prostate tumors and observed that PXR was more frequently detected in castration resistant or metastatic tumors as compared to clinically localized forms in which PXR expression was significantly correlated with TNM and ISUP Score. These results confirmed the interest to study the potential role of PXR and its target genes in the sensitivity to kinase inhibitors in prostate cancer models.We measured the expression of PXR and its target genes in prostate cancer cell lines 22RV1, LnCap, PC3 and DU145. The results showed that enzymes and transporters involved in KI detoxification was significantly expressed in these cells whereasPXR was poorly expressed due to hypermethylation of NR1I2 in our cells. This lead us to develop specific prostate cancer cell models stably overexpressing PXR in which transcriptional activity of PXR can be induced by its known agonist SR12813 further indicating that prostate cancer cells are metabolically competent. Using these models we showed that PXR overexpression modulates the sensitivity of 22RV1 cells to erlotinib, dasatinib, dabrafenib and afatinib, demonstrating that PXR plays a functional role in the sensitivity to KIs. We also demonstrated that several KIs were PXR agonists, including dabrafenib that displayed enhanced agonistic properties as compared to SR12813, a result that was never published before. This original finding led us to engage the cristalization of PXR/dabrafenib complex and to test whether induction of PXR could lead to an alteration of metabolism and transport of other drugs that are co-administered. In this line we have observed that in 22RV1 cells the additive effect of the combination of dabrafenib with trametinib that is already approved in the treatment of melanomas, became antagonistic when PXR was overexpressed in these cells. This result is supporting our hypothesis though we still need to demonstrate that this effect is linked to a change in drugs metabolism, which is currently under investigation by the measurement of the known metabolites of these KIs.Altogether, our data could serve as rational basis for the choice of kinase inhibitors or their potential combinations that could be tested in further clinical trials alone or in association with hormone therapies or with chemotherapies that are currently prescribed in the treatment of advanced prostate cancers, in order to potentiate tumor response

Ce travail a porté sur l'identification et la caractérisation de nouveaux facteurs de l'hôte nécessaires au cycle infectieux des virus à ARN (genre Potyvirus) chez Arabidopsis thaliana, ces facteurs pouvant constituer des cibles pour la lutte génétique contre les phytovirus. L'exploration de la diversité génétique naturelle d'Arabidopsis a conduit à l'identification d'un gène récessif de résistance au Watermelon mosaic virus (WMV) chez l'accession Cvi-0. Il s'agit du gène rwm1 qui agit à un stade précoce de l'interaction en empêchant l'accumulation du virus au niveau des premières cellules infectées. Les résultats de clonage positionnel de rwm1, de séquençage d'allèles de résistance et de sensibilité et de validation fonctionnelle argumentent en faveur d'un rôle de la phosphoglycérate kinase chloroplastique (cPGK), une enzyme clé de la photosynthèse, dans la résistance conférée par rwm1. En parallèle, une stratégie gène candidat a été mise en œuvre pour étudier le rôle de la protéine kinase Target Of Rapamycin (TOR) dans l'interaction plante-potyvirus. La caractérisation de lignées RNAi pour le gène TOR d'Arabidopsis montre une diminution voire une suppression de l'accumulation du WMV, ainsi qu'une réduction de l'accumulation du Turnip mosaic virus. L'étude comparative de la composition des complexes de liaison à la coiffe entre une lignée sauvage et une lignée RNAi TOR en conditions saines et infectées par le WMV suggère un rôle de TOR dans l'interaction avec les potyvirus par le biais d'une régulation de l'activité du facteur d'initiation de la traduction eIF3
This work describes the use of forward and reverse genetics in Arabidopsis thaliana to identify and characterize new host factors required for the infectious cycle of plant RNA viruses (genus Potyvirus). The exploration of the Arabidopsis natural genetic diversity led to the identification of the recessive rwm1 gene for resistance to Watermelon mosaic virus (WMV). Rwm1-mediated resistance was identified in the Cvi-0 accession where it acts at an early stage of the infection process by impairing virus accumulation in initially infected tissues. Map-based cloning results, allelic sequence analysis and functional validation experiments, strongly suggest the involvement of chloroplast phosphoglycerate kinase (cPGK), a key photosynthetic enzyme, in rwm1-mediated resistance. In parallel, a candidate gene approach was developed to investigate the potential role of the TOR kinase (Target Of Rapamycin) in the control of susceptibility to potyviruses. Arabidopsis RNAi lines displaying partial TOR inactivation showed a significant decrease of susceptibility to the infection by two potyviruses, namely WMV and Turnip mosaic virus. The results from a comparative proteomic analysis of cap-binding complexes between wild type and TOR RNAi infected and healthy lines suggest that TOR could play a role in plant-potyvirus interactions by regulating the activity of the translation initiation factor eIF3. Overall, this work opens a challenging research area to provide novel insights on the molecular principles underlying viral infection processes and opportunities to improve and optimize the way we tackle plant resistance to viruses through a diversification of genetic targets

Depuis que les firmes pharmaceutiques ont arrêté la production des déterminants pénicilliniques, l'utilisation des tests cutanés comme méthode de diagnostic est devenue moins standardisée. De plus, les tests cutanés peuvent parfois exposer le malade au risque d'une allergie sévère. Les tests de transformation lymphocytaire (TTL) pour le diagnostic d'une allergie aux pénicillines se basent sur l'utilisation des éléments radioactifs et présentent une sensibilité insuffisante. Le but de notre étude est d'établir une méthode de laboratoire fiable pour le diagnostic des allergies aux pénicillines et qui soit simple et sans danger pour le patient. L'étude a inclus 18 sujets allergiques à l'amoxicilline et 11 témoins. Suite à un prélèvement sanguin, les cellules mononucléaires périphériques sanguines (PBMC) sont isolées par la méthode Ficoll-Hypaque. Les cellules ainsi obtenues sont alors stimulées in vitro avec de l'amoxicilline libre à la concentration de Img/ml. La stimulation par la Phytohemaglutinnine A (PHA) est utilisée pour un contrôle ^positif. Les cytokines IL-2, IL-5 et IFN- y, sécrétées dans le surnageant des cultures lymphocytaires, sont dosées par la méthode ELISA. L'expression au niveau de la transcription des gènes de certaines cytokines (IL- 2, 4, 5, 13, TGF-J3, TNF- a et l'INF- y) est étudiée par RT-PCR. La technique ELISPOT est utilisée pour la détection de ITNF- y seulement. Pour toutes les techniques employées, l'étude des cytokines exprimées en réponse à la stimulation est faite aux 2eme et 5eme jours. À ce jour, notre étude contient le plus grand nombre de patients et de sujets contrôles, en comparaison avec d'autres études publiées qui ont utilisé la méthode ELISA pour le diagnostic de l'allergie à la pénicilline. La comparaison entre patients et témoins a porté sur les valeurs A qui représentent la différence des concentrations des cytokines après et avant stimulation par amoxicilline. Les tests statistiques t de Student et de Mann-Whitney Rank sont utilisés. Les méthodes RT-PCR et ELISPOT n'ont pas été concluantes. Par contre, l'étude par ELISA des différentes cytokines dans le surnageant des cultures lymphocytaires est la méthode la plus sensible et la plus spécifique (respectivement 80% et 100%). L'ensemble des résultats montre clairement que le dosage des cytokines par ELISA, après stimulation in vitro de lymphocytes humains sensibilisés, reste un excellent moyen diagnostic sans aucun danger pour le malade. Outre le fait que les kits ELISA sont disponibles sur le marché, cette méthode peut être réalisée dans de nombreux laboratoires sans avoir recours à un équipement très spécialisé
Since the withdrawal of penicillin determinants from the market, in addition to the hazard of re-exposing the patient to the drug, skin testing for the diagnosis of penicillin allergy has become less accurate and less standardized. The assay currently used, the lymphocyte transformation test (LTT), lacks sufficient sensitivity, and requires the use of radioactive material. The objective of this study was to establish an accessible and reliable method for the safe diagnosis of penicillin allergy. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from 18 patients who were allergic to penicillin and 12 control subjects using the Ficoll-Hypaque method. The isolated, sensitized cells were stimulated in vitro with amoxicillin (1 mg/mL). Stimulation with phytohemagglutinin A (PHA) was used as the positive control. Transcriptional expression of specific cytokines (IL-2, -4, -5 and -13, TGF-p, TNF-a and IFN-y) was assessed by RT-PCR. IFN-c expression was also evaluated by ELISPOT. Secreted levels of IL-2, -5 and IFN- y were measured by ELISA. All of these assays were performed two or five days, post-stimulation. This study of the in vitro diagnosis of penicillin allergy by the measurement of cytokine concentration in the supernatants of sensitized lymphocytes cultures involved the largest number of patients to-date. The A values (difference in cytokine concentration in the supernatants before and after stimulation) were compared between cases and controls using different statistical tests (Student's t test and the Mann-Whitney rank test). Of the various tests performed in this study, measurement of secreted cytokines using ELISA was the most sensitive and specific (80% and 100% respectively). In vitro stimulation of human lymphocytes sensitized to amoxicillin is a safe and useful test for the diagnosis of penicillin allergy if the ELISA is used to measure cytokine expression. The advantages are that it can be performed by many laboratories since kits to determine cytokines are widely available, and it can be done without the need for particularly specialized equipment

Ralstonia solanacearum, l'agent causal du flétrissement bactérien, est considéré comme l'un des agents pathogènes bactériens les plus importants au monde. Le pouvoir pathogène de cette bactérie du sol est principalement basé sur son système de sécrétion de type III (SST3) et ses effecteurs de type III (ET3s), provoquant la maladie sur plus de 250 espèces végétales. R. solanacearum injecte ses ET3s à travers cette seringue moléculaire directement à l'intérieur de la plante hôte. Ces ET3s détournent les réponses de défense de la plante, soit dans le cytoplasme, soit dans le noyau, afin de supprimer l'immunité de la plante et de favoriser la multiplication bactérienne. La sécrétion des ET3s est finement contrôlée au niveau post-traductionnel par des protéines associées au contrôle de la sécrétion de type III, et par des protéines chaperonnes de type III.A ce jour, la fonction in planta de ces effecteurs et protéines chaperonnes, et la manière dont R. solanacearum module l’immunité de la plante en sa faveur restent mal comprises. Mon projet de thèse visait à mieux comprendre le rôle des déterminants de la pathogénicité de R. solanacearum en identifiant certaines des cibles d’A. thaliana, directes ou indirectes, modulées par la bactérie. Pour ce faire, j'ai utilisé des populations naturelles d'A. thaliana à deux échelles géographiques et adopté l'approche consistant à confronter des populations naturelles à des mutants de R. solanacearum dans lesquels des déterminants majeurs de pathogénie sont mutés. Cette approche est nouvelle puisque à ce jour les études d’association pangénomique (GWAS) menées sur les interactions plantes-agents pathogènes utilisent des souches sauvages de phytopathogènes. En outre, cette approche a permis de découvrir une diversité de réponses qui n'avaient pas été détectées auparavant. Dans la première partie de mon projet de thèse, j'ai identifié des QTLs impliqués dans la résistance quantitative à la maladie en réponse à des mutants simples de R. solanacearum, et j'ai validé fonctionnellement ces QTLs (Quantitative Trait Loci) comme facteurs de sensibilité. Dans la deuxième partie de ma thèse, nous avons étudié un gène codant pour une protéine de type NLR que nous avons appelé Bacterial Wilt Susceptibility 1 (BWS1). Nous avons montré que BWS1 agissait comme un facteur de sensibilité quantitatif, ayant un rôle de régulateur négatif dans une réponse immunitaire dépendante de SGT1.)
Ralstonia solanacearum, the causal agent of bacterial wilt, is considered one of the world’s most important bacterial pathogens. This soil-borne bacterium relies mainly on its type III secretion system (T3SS) and type III effectors (T3Es) in order to cause disease in more than 250 plant species. R. solanacearum injects its T3Es through this molecular syringe directly inside the host plant. These T3Es hijack plant defense responses in either the cytoplasm or the nucleus aiming to suppress plant immunity and promote bacterial multiplication. T3E secretion is finely controlled at the post-translational level by helper proteins, called T3SS control proteins, and type III chaperones.To date, the in planta function of these effectors and helper proteins and how R. solanacearum modulates plant genes to its favor remains poorly understood. My thesis project aimed to better understand the role of R. solanacearum pathogenicity determinants by identifying some of the direct or indirect plant targets of A. thaliana, modulated by the bacterium. For this purpose, I used natural populations of A. thaliana on two geographical scales and adopted the approach of challenging mapping populations to R. solanacearum mutants in which major pathogenic determinants are mutated. This approach is new since most of the GWAS (Genome-Wide Association Studies) in plant-pathogen interactions use wild-type strains of phytopathogens. Furthermore, it unveiled a previously undetected diversity of responses. In the first part of my Ph.D. project, I identified QTLs (Quantitative Trait Loci) involved in quantitative disease resistance to R. solanacearum single mutants and I validated these QTLs as susceptibility factors. In the second part of my thesis, we studied a gene encoding for a NLR protein that we called Bacterial Wilt Susceptibility 1 (BWS1). We showed that BWS1 was acting as quantitative susceptibility factor, mediating a negative regulation of an SGT1-dependent immune response

L'administration de Ganciclovir permet de contrôler l'alloréactivité de cellules T génétiquement modifiées (CGM) par le transfert ex vivo du gène de la thymidine kinase du virus Herpès Simplex (HSV-TK). Une limitation à cette approche est liée à la présence d'une forme inactive de ce gène résultant d'un épissage alternatif. Afin de surmonter cette limitation, notre équipe a développé une forme corrigée (cHSV-TK) fusionnée avec la forme tronquée du CD34 (tCD34) permettant un tri immunomagnétique des CGM. Nous montrons dans la première partie de cette thèse que malgré cette correction, des CGM CD34+ mais résistantes au Ganciclovir peuvent être générées après transduction avec un vecteur codant la protéine de fusion tCD34/cHSV-TK par deux mécanismes impliquant des délétions au sein du gène HSV-TK et une protéolyse partielle de la protéine de fusion dont seule la partie CD34 reste exprimée. Dans la deuxième partie de la thèse, nous avons comparé l'ancien protocole de transfert du gène utilisé lors de notre étude clinique de phase I/II, utilisant une activation CD3 et une sélection par G418 à un " nouveau " protocole que nous proposons d'utiliser prochainement, utilisant une costimulation CD3-CD28 et un tri immunomagnétique basé sur le gène de sélection ΔNGFR. Nous montrons que le nouveau protocole présente des avantages en terme de prolifération, de sensibilité à l'apoptose et de métabolisme protéique, dus à la costimulation CD3-CD28 et à l'absence de sélection par G418, mais une expression de molécules HLA de classe II augmentée pourrait possiblement être associée à une immunogénécité accrue des CGM, un élément à considérer lors de l'utilisation de ce nouveau protocole
The infusion of Ganciclovir can allow controlling the alloreactivity of gene-modified T cells (GMC) expressing the Herpes Simplex virus thymidine kinase (HSV-TK). A limitation to this approach was related to the presence of an inactive form of th HSV-TK gene, resulting from an alternative splicing. In order to circumvent this problem, a corrected HSV-TK (cHSV-TK) gene was fused to a truncated splice variant of the human CD34 molecule (tCD34) allowing for the immunomagnetic sorting of GMC. We demonstrated in the first part of this thesis that, despite this correction, CD34-positive, but Ganciclovir-resistant, GMC can still be generated after transduction with a vector encoding a tCD34/cHSV-TK fusion protein, through two mechanisms involving deletions in the HSV-TK part of the transgene and a partial proteolysis of the fusion protein, of which only the CD34 part is still expressed. In the second part, we compared the " old " protocol previously used to produce GMC during our first clinical trial, using a CD3 activation and G418 selection to a " new " protocol that we propose to use in future studies, using a CD36CD28 activation and ΔNGFR expression-based immunomagnetic selection. We show that the new protocol has advantages in terms of proliferation, sensitivity to apoptosis and protein metabolism, because of the CD3-CD28 costimulation and the absence of G418 selection, but also an increased expression of HLA class II molecules, which could be related to a potentially increased immunogenicity of GMC. This later point should be considered if using the new protocol for future clinical trials

Malgré les bénéficies cliniques considérables de la prise en considération du contexte moléculaire tumoral, les thérapies ciblées présentent certaines limitations majeures. La première partie de ces travaux se concentre sur l’étude des inhibiteurs de tyrosine kinase ciblant l’EGFR dans les cancers bronchiques non à petites cellules. L’amélioration des méthodes de détection des biomarqueurs a été complétée par la caractérisation in vitro d’un mécanisme de résistance acquise non précédemment identifié. L’exposition de cellules pulmonaires à un agent mutagène puis une pression de sélection a ainsi mis en évidence la signature TBK1 et l’effet synergique de la co-inhibition s’est révélé intéressant. Le deuxième aspect concernent les inhibiteurs de PARP, incontournables dans la prise en charge des cancers de la sphère gynécologique. Ces thérapies reposant sur le principe de létalité synthétique, la présence de mutations pathogènes de BRCA1/2 est un pré-requis, illustrant la problématique des variants de signification inconnue. Face à la nécessité de leur caractérisation fonctionnelle, une étude transcriptionnelle des variants d’épissage par extraction de l’ARNm depuis les prélèvements FFPE a d’abord été réalisée. Puis, afin d’évaluer tous les variants, l’édition génomique a été développée comparant les efficacités d’édition d’un variant d’intérêt et d’un variant silencieux dans un contexte haploïde où ces gènes sont essentiels. La signification biologique de variants de BRCA1/2, et la généralisation de notre approche à l’ensemble des gènes suppresseurs de tumeur essentiels de nos cellules, peut ainsi être évaluée en 3 semaines, délai compatible avec les impératifs cliniques
Despite significant clinical benefit from the consideration of molecular context, targeted therapies are still challenging. First part of this work focused on tyrosine kinase inhibitors targeting EGFR in non small cell lung cancers. Thus, improvement of biomarkers detection methods was completed by in vitro characterization of an unreported mechanism of acquired resistance. Briefly, pulmonary cells were exposed to a mutagen agent and a selection pressure was applied with EGFR inhibitors allowing the detection of TBK1 signature. Finally, synergic effect of that co-inhibition was highlighted. Now essentials in gynaecological cancers management, PARP inhibitors represent the second part of that work. Those targeted therapies are based on synthetic lethality. Consequently, BRCA1/2 pathogenic mutations are required for their administration, illustrating the issue of variants of uncertain significance. Toward their functional characterization necessity, a transcriptional analysis of splicing variant was first conducted on mRNA extracted from FFPE samples. Then, to evaluate functional signification of all types of variants, genomic edition was developed. Editing efficiencies of the unknown variant and a silent control one were compared in a haploid model where those genes are essentials. Functional signification of BRCA1/2 variants, and thereby mutations from all essential tumor suppressor genes in our model, can be evaluated in three weeks which is compatible with clinical management

De nombreuses espèces sont capables d’adopter des phénotypes alternatifs, en réponse à des stimuli environnementaux, un phénomène appelé plasticité développementale adaptative. Cette faculté permet aux organismes de faire face à des habitats hétérogènes. De nombreuses études ont montré que le caractère « plasticité » présente une variabilité naturelle, cependant la base génétique et moléculaire de celle-ci a rarement été élucidée. Cette étude porte sur un exemple de plasticité développementale chez le nématode Caenorhabditis elegans qui, lorsque les conditions environnementales sont très défavorables, est capable d’adopter un stade larvaire alternatif de résistance appelé dauer. Nous nous sommes intéressés à un isolat naturel de C. elegans, JU751, qui a la capacité inhabituelle d’entrer en dauer en réponse à des stress environnementaux peu intenses (densité de population, température élevée, agents oxydatifs, pathogènes). Une analyse QTL (Quantitative Trait Locus) nous a permis d’identifier la cause génétique de cette hypersensibilité : une délétion de 92 pb qui affecte l’expression du gène eak-3. Le gène eak-3 est exclusivement exprimé dans les cellules endocrines XXX, et semble participer à la production de l’hormone acide dafachronique (DA), un stéroïde inhibiteur de l’entrée en dauer. Une réduction de l’expression de eak-3 engendre une diminution constitutive de la production de DA, abaissant ainsi le seuil de stress environnementaux nécessaires à l’induction de dauers. En plus d’affecter la décision d’entrer en dauer, la délétion eak-3, réduit la vitesse de développement des larves. Ainsi, en conditions favorables, JU751 atteint la maturité sexuelle avec un retard d’environ trois heures. Ce retard développemental lié à un effet pléiotropique du déficit en DA, suggère que la délétion eak-3 a conduit à l’émergence d’un trade-off entre durée de développement et plasticité développementale. En accord avec ce scénario, nous avons montré lors d’expériences de compétition, que la délétion eak-3 était rapidement remplacée par l’allèle de référence en conditions favorables. À l’inverse, la délétion eak-3 confère un avantage sélectif net en conditions expérimentales stressantes, en facilitant la formation de dauer. Notre étude figure parmi les rares ayant caractérisé avec succès la base moléculaire de l’évolution de la plasticité développementale adaptative et montre que, du fait de la pléiotropie hormonale, un changement génétique unique peut engendrer un trade-off entre plusieurs traits d’histoire de vie
Adaptive developmental plasticity is a common phenomenon allowing organisms to cope with heterogeneous habitats through sensation of environmental cues inducing alternative phenotypes. While there is increasing information on the molecular mechanisms regulating developmental plasticity as well as ample evidence that such plasticity displays natural genetic variation, we still have limited information on how the degree of sensitivity to environmental cues regulating plasticity evolves through specific changes at the molecular level. Focusing on the plastic life history switch between reproductive and arrested (dauer) developmental stages in the nematode Caenorhabditis elegans, we characterized the molecular nature of enhanced sensitivity to dauer-inducing cues in the wild isolate JU751. This isolate has the unique tendency to readily form dauers not only at moderate population density but also in response to an array of diverse, yet relatively mild environmental stressors (high temperature, starvation, oxidative stress, pathogens). Based on QTL mapping, we identified a 92bp deletion in the presumptive promoter region of the gene eak-3 – drastically reducing eak-3 expression in JU751 – as the underlying causal variant.Eak-3 is exclusively expressed in the endocrine XXX cells, indicative of its role in affecting signalling through the steroid hormone dafachronic acid, the central downstream component controlling the binary dauer decision. Constitutively reduced levels of eak-3 thus reduce steroid hormone levels, hence lowering the environmental sensitivity threshold for dauer induction, consistent with the observed enhancement of JU751 dauer induction in response to any of several different environmental cues. Therefore, evolution of increased environmental sensitivity of the JU751 dauer decision has occurred through modulation of a hormonal level. Testing for potential pleiotropic consequences of the eak-3 variant in JU751 using allelic replacement lines, we find this deletion to cause a subtle, yet significant delay of postembryonic reproductive growth in favourable conditions, delaying age at reproduction by ~3 hours. This developmental delay is indeed due to reduced steroid hormone signalling, suggesting that acquisition of the eak-3 deletion in JU751 has led to the emergence of a trade-off between developmental timing and environmental sensitivity of a plasticity switch. Consistent with this scenario, we experimentally show the eak-3 deletion allele to be rapidly outcompeted in environments favouring reproductive (non-dauer) growth; in contrast, the deletion may provide a significant fitness advantage through facilitated dauer production in highly stressful environments. Together, our results show how a specific molecular change can underlie the evolution of adaptive developmental plasticity, and they further provide a rare example illustrating how seemingly complex life history trade-offs can emerge through hormonal pleiotropy caused by a single genetic change

CONTEXTE La syphilis est une maladie ré-émergente depuis 2000. Son traitement est simple, mais son diagnostic est complexe. La technique d’amplification génique de Treponema pallidum (Tp-PCR) existe depuis 1990 mais le CDC l’a incluse dans sa définition de cas en janvier 2014. OBJECTIFS 1) Evaluer la performance diagnostique de la Tp-PCR à différents stades cliniques et milieux biologiques. 2) Mesurer la sensibilité, spécificité et les valeurs prédictives de la Tp-PCR en fonction de 3 groupes de référence dans des ulcères récents. 3) Comparer les performances des 2 principales cibles de Tp-PCR.MATÉRIEL ET MÉTHODES Premièrement, une revue systématique et méta-analyse des études publiées depuis 1990 ont été menées. Ensuite une étude multicentrique prospective a été conduite dans 5 villes européennes pendant 2 ans chez des patients avec un ulcère oro-génital. Tous ont reçu le test de référence local et 2 Tp-PCRs dans l’ulcère (gène tpp47 vs. polA). Les valeurs de sensibilité, spécificité et valeurs prédictives de la Tp-PCR ont été calculées comparativement au fond noir (FN), à la sérologie et à un gold standard amélioré. La concordance des 2 cibles a été évaluée par un coefficient kappa.RÉSULTATS PRINCIPAUX La méta-analyse conclut que la Tp-PCR a une meilleure performance dans les ulcères récents. L’étude clinique montre que la Tp-PCR décrit une meilleure performance comparativement au gold standard amélioré et a même une meilleure sensibilité que le FN. Les 2 cibles ont la même valeur diagnostique et une concordance quasi parfaite. CONCLUSIONS La Tp-PCR ciblant tpp47 ou polA est cliniquement utile pour diagnostiquer une syphilis primaire et pourrait même remplacer le FN sous certaines conditions
BACKGROUND Syphilis has re-emerged in at-risk populations since 2000. Although the treatment of syphilis is simple, its diagnosis remains challenging. Treponema pallidum Polymerase Chain Reaction (Tp-PCR) has been used in the diagnosis of syphilis since 1990 but it is included in the case definition of the CDC since January 2014. OBJECTIVES 1) To assess the accuracy of Tp-PCR in various biological specimens and syphilis stages. 2) To measure its diagnostic performance (sensitivity, specificity and predictive values) in ulcers from early syphilis compared to three groups of reference. 3) To compare the accuracy of the two most currently used targets: tpp47 and polA genes.METHODS We conducted a systematic review and meta-analysis of all studies published from 1990. We implemented a multicentre, prospective, observational study in 5 European cities between 09/2011 and 09/2013 among patients with an oral or genital ulcer suggestive of syphilis. All patients were tested with traditional reference tests plus 2 Tp-PCRs (tpp47 and polA). We estimated the sensitivity, specificity and predictive values of Tp-PCR compared to darkfield microscopy (DFM), serology and an enhanced gold standard. We used the kappa coefficient to assess the agreement between the 2 targets.MAIN RESULTST p-PCR had the best accuracy in ulcers from early syphilis. Tp-PCR performed better when compared to the enhanced gold standard and had a higher sensitivity than DFM. The 2 Tp-PCRs had a similar accuracy and an almost perfect agreement.CONCLUSIONS Tp-PCR targeting either tpp47 or polA is clinically useful to confirm an early syphilis in smears and could even replace DFM under specific conditions