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Zusammenfassung Gegenstand und Fragestellung: Untersuchungen zur Wirkung von Galakturoniden als Futtermittelzusatz im Vergleich zum Leistungsförderer Flavophospholipol und einer Kontrollgruppe bei Absetzferkeln. Material und Methoden: In einer Fütterungsstudie wurden Galakturonide als Futterzusatz im Vergleich zu Flavophospholipol in der Ferkelaufzucht getestet (Galakturonide: 10 g bzw. 5 g/kg Futter, Flavophospholipol: 10 mg/kg Futter). Die Ferkel erhielten drei Tage vor bis 27 Tage nach dem Absetzen die verschiedenen Futterzusätze oder keinerlei Futterzusatz. Den Futterrationen der Gruppe 1 (n = 42) wurden Galakturonide, der Gruppe 3 (n = 42) Flavophospholipol und der Gruppe 2 (n = 40) kein derartiger Futterzusatz beigefügt. Von allen Ferkeln wurden rektale Kottupferproben in drei- bis siebentägigen Intervallen genommen und einer mikrobiologischen Untersuchung unterzogen. Ergebnisse: Bezüglich bakteriologischer Untersuchungsergebnisse (Inzidenz von hämolysierenden pathogenen E. coli, Serotypen, Antibiogramme), der Lebendmassezunahme und des Futteraufwandes ergaben sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den verschiedenen Gruppen. Ein- bis mehrfach resistente hämolysierende E. coli wurden von Absetzferkeln aller Gruppen ausgeschieden. Schlussfolgerung: Die weitere Untersuchung von aus Pflanzen gewonnenen Futterzusätzen ist sinnvoll.

ABSTRACT A “plasmid-curing effect” of multiresistant Escherichia coli by flavophospholipol, an antibiotic used as an antimicrobial growth promoter (AMGP) in animal feeds, has been reported to occur in vitro and in vivo under experimental conditions. In this study, the effect of flavophospholipol under field conditions was studied. The prevalence and degree (proportion of resistant strains to the total numbers present per gram of feces) of resistance of indicator bacteria, E. coli and enterococci, was determined in fecal samples from three groups of pigs that were fed a commercial finisher feed without any AMGP. Group A was the negative control group without any AMGP, group B received the same feed with 9 mg of flavophospholipol/kg of feed (study group), and group C received the same feed with 15 mg of avoparcin/kg (positive control). Fecal samples from each pig were collected at the start and at the end of the study and assessed for the prevalence and degree of resistance against antibiotics commonly used either for therapy in pig medicine or as an AMGP. Before the start of the study, all pigs were colonized with multiresistant E. coli by mixing three resistant pig isolates through their feed after disturbance of the colonization resistance of the intestinal flora by a 3-day course of lincomycin and spectinomycin. At the end of the study, the overall prevalence and degree of resistance of E. coli in the fecal flora had increased significantly in groups A and C but remained at the same level as at the start of the study in group B. The prevalence of vancomycin resistance was 44 and 41% in groups A and B, respectively, but only very low numbers of vancomycin-resistant enterococci (VRE) per gram of feces were found. In the avoparcin-fed group, the prevalence was 72%, and in 57% of the samples, more than 50% of all enterococci present were vancomycin resistant. The prevalence of resistant Enterococcus faecalis increased only in the flavophospholipol-exposed group, from 23% before the start of the study to 43% at the end of the study. It was concluded that flavophospholipol effectively suppressed the augmentation and dissemination of multiresistant E. coli in the intestinal flora of fattening pigs. Avoparcin use strongly selected for VRE carriage and excretion. Therefore, as neither flavophospholipol nor any related molecule is used therapeutically, no cross-resistance with therapeutic antibiotics exists and no transmissible resistance has been shown; the major decrease in resistance in intestinal E. coli of flavophospholipol-fed animals seemed to outweigh the small increase in the risk of transfer of flavophospholipol-resistant E. faecalis from animals to humans via the food chain.

ABSTRACT The influence of vancomycin and flavophospholipol (FPL) on the transfer rate of conjugative plasmids harboring the vancomycin resistance operon vanA was determined in several clinical and animal isolates of Enterococcus faecium. FPL significantly inhibited the frequency of transfer of conjugative VanA plasmids up to 70-fold. Vancomycin had no significant effect on the transfer rate of VanA plasmids.

ABSTRACTThe effects of avilamycin, zinc bacitracin, and flavophospholipol on broiler gut microbial community colonization and bird performance in the first 17 days posthatch were investigated. Significant differences in gut microbiota associated with gut section, dietary treatment, and age were identified by terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP), although no performance-related differences between dietary treatments were detected. Similar age-related shifts in the gut microbiota were identified regardless of diet but varied between the ilea and ceca. Interbird variabilities in ileal bacterial communities were reduced (3 to 7 days posthatch) in chicks fed with feed containing antimicrobial agents. Avilamycin and flavophospholipol had the most consistent effect on gut microbial communities. Operational taxonomic units (OTU) linked to changes in gut microbiota in birds on antimicrobial-supplemented diets were characterized and identified. Some OTUs could be identified to the species level; however, the majority could be only tentatively classified to the genus, family, order, or domain level. OTUs 140 to 146 (Lachnospiraceae), OTU 186/188 (Lactobacillus johnsonii), OTU 220 (Lachnospiraceae), OTUs 284 to 288 (unclassified bacterial spp. orRuminococcaceae), OTU 296/298 (unclassified bacterium orClostridiales), and OTU 480/482 (Oxalobacteraceae) were less prevalent in the guts of chicks fed antimicrobial-supplemented diets. OTU 178/180 (Lactobacillus crispatus), OTU 152 (Lactobacillus reuterior unclassifiedClostridiales), OTU 198/200 (Subdoligranulumspp.), and OTU 490/492 (unclassified bacterium orEnterobacteriaceae) were less prevalent in the gut of chicks raised on the antimicrobial-free diet. The identification of key bacterial species influenced by antimicrobial-supplemented feed immediately posthatch may assist in the formulation of diets that facilitate beneficial gut microbial colonization and, hence, the development of alternatives to current antimicrobial agents in feed for sustainable poultry production.

Enterokokken gelten primär als opportunistische Erreger mit geringer Pathopotenz. Sie zeichnen sich allerdings durch ausgeprägte natürliche und erworbene Resistenzen gegen eine Vielzahl von Antibiotika aus. Besorgniserregend ist hierbei insbesondere das Auftreten von Vancomycin-resistenten Enterokokken. Glycopeptidantibiotika, wie Vancomycin und Teicoplanin, werden als Reserveantibiotika gegen multiresistente gram-positive Erreger, wie zum Beispiel Methicillin-resistente Staphylococcus aureus-Stämme (MRSA) eingesetzt. Der VanA-Typ der Glycopeptidresistenz, welcher zuerst in Enterococcus faecium beschrieben wurde, ist die in Zentraleuropa vorherrschende Variante der Glycopeptidresistenz. Das Transposon Tn1546, das die vanA-Resistenzdeterminante kodiert, liegt häufig auf großen konjugativen Plasmiden vor und kann zwischen Enterokokken-Stämmen transferiert werden. In dieser Arbeit wurde der direkte Einfluss von Vancomycin und eines weiteren Antibiotikums, Flavophospholipol (FPL), auf die Rate des konjugativen Transfers des vanA-Operons in E. faecium untersucht. Das Phosphoglycolipidantibiotikum FPL wird derzeit als Leistungsförderer in der Tiermast eingesetzt. Beide Antibiotika induzieren die Expression der Glycopeptidresistenz vom VanA-Typ. Es konnte gezeigt werden, dass Flavophospholipol in unterschiedlichen Konzentrationen die Häufigkeit des Transfers von konjugativen VanA-Plasmiden sowohl in klinischen E. faecium-Isolaten, als auch in E. faecium-Stämmen aus Tierfaeces signifikant hemmte. Vancomycin zeigte keinen signifikanten Effekt auf die Transferrate der VanA-Plasmide. Somit konnte nachgewiesen werden, dass in E. faecium kein funktionaler Zusammenhang zwischen der Induktion des vanA-Operons durch Vancomycin und FPL und der Transferfrequenz der konjugativen VanA-Plasmide unter dem Einfluss der beiden Antibiotika besteht. Weiterhin wurde die Induktion des vanA-Operons unter dem Einfluss verschiedener Antibiotika in einem E. faecium-Isolat näher untersucht. Hierbei wurde die Expression des 39 kDa VanA-Ligase Proteins direkt durch das Western Blot-Verfahren dargestellt. Eine Induktion der Expression des VanA-Ligase Proteins erfolgte durch Inhibitoren der späten Phase der Zellwandsynthese, wie Vancomycin, Flavophospholipol, Bacitracin und Tunicamycin. Außerdem konnte eine leichte Induktion des VanA-Ligase Proteins durch Fosfomycin, Cefalexin und Cefuroxim, Meropenem und Clindamycin nachgewiesen werden. Somit konnte gezeigt werden, dass Cefuroxim und Clindamycin zwei Antibiotika, die in klinischen Studien eine Besiedelung mit VRE begünstigen, auch eine geringe Zunahme der VanA-Ligase Expression bewirken. Zudem wurde deutlich, dass durch den Einfluss von Hitzestress und osmotischem Stress keine Induktion der 39 kDa VanA-Ligase Bande erfolgt. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung einer putativen Resistenz-determinante gegen Flavophospholipol. Die Eigenschaft der FPL-Resistenz konnte nicht durch in vitro-Filterkonjugation von FPL-resistenten auf FPL-sensitive E. faecium-Stämme übertragen werden. Zur molekularen Untersuchung der Resistenz gegen Flavophospholipol wurde ein resistenter E. faecium-Stamm durch das konjugative Transposon Tn916 mutagenisiert. In allen identifizierten FPL-sensitiven Mutanten war die Insertionstelle des Transposons und dessen Orientierung im Chromosom identisch und es deletierte ein 1,5 kb großer genomischer Bereich „downstream“ der Transposon-Insertionsstelle. Dieser Bereich umfasste das 3´-Endes des Gens für eine putative Threonyl-tRNA Synthetase und den Genlocus für einen putativen Transkriptionsregulator. Die Sequenzen in allen Mutanten begannen ca. 200 bp vor dem Startcodon eines Gens für ein putatives Penicillin-Bindeprotein (PBP). In Northern Blot-Analysen konnte gezeigt werden, dass die Transkription des putativen PBP in der Mutante 64/3-1 schwächer war als im Wildtyp 64/3. Außerdem wurden durch 3H Penicillin-Markierung von PBP-Extrakten Unterschiede im Expressionsmuster der Penicillin-Bindeproteine im Wildtyp und in der Mutante deutlich. Während im Wildtyp fünf Penicillin-Bindeproteine zu erkennen waren, fehlten PBP2 und PBP3 in der Mutante 64/3-1. Die Größe von PBP3 entsprach hierbei der geschätzten Größe des putativen PBP von 79 kDa. In der Mutante 64/3-1 fand wahrscheinlich durch den Verlust eines putativen Regulators oder wichtiger regulatorischer Bereiche eine Veränderung im Expressionsmuster der Penicillin-Bindeproteine statt, welche zum FPL-sensitiven Phänotyp führte. In dieser Arbeit konnte zudem gezeigt werden, dass Flavophospholipol in E. faecium an PBP2 und PBP3 bindet und es sich hierbei um bifunktionale „high molecular weight“ Penicillin-Bindeproteine mit Transglycosylase- und Transpeptidase-Untereinheit handeln muss
Enterococci are primary opportunistic pathogens. Species of this genus are inherently resistant to many antimicrobial agents and readily acquire additional resistances, which is likely the reason why enterococci have become prominent nosocomial pathogens. Glycopeptides, such as vancomycin and teicoplanin are the antibiotics of last resort for the treatment of methicillin-resistant staphylococci (MRSA). In Central Europe, the VanA-type is the most frequent genotype of acquired glycopeptide resistance. The vanA gene cluster is located on transposons of the Tn1546 type, which are integrated into conjugative plasmids, and can therefore be transferred among enterococcal strains. In this study, the influence of vancomycin and flavophospholipol (FPL) on the conjugative transfer of vanA plasmids was determined in several Enterococcus faecium strains. FPL is a phosphoglycolipid antibiotic used as a growth promoter in animal husbandry. Both antibiotics have an inducing effect on the vanA operon. We showed that subinibitory concentrations of FPL inhibit the tranfer of vanA plasmids. This inhibitory effect is dose-dependend and was observed both in clinical and animal isolates of E. faecium. Vancomycin had no significant effect on the transfer rate of vanA plasmids. These results suggest that there is no functional link between the induction of vancomycin resistance of VanA-type and the frequency of transfer of conjugative vanA plasmids in E. faecium. Furthermore, the influence of some antibiotics on the VanA ligase protein expression was examined by Western-blotting analysis. Induction of the 39 kDa protein could be detected after addition of some cell-wall active agents such as vancomycin, flavophospholipol, bacitracin and tunicamycin. Fosfomycin, cefalexine and cefuroxime as well as meropenem and clindamycin had a weaker inducing effect on the VanA ligase protein expression. Heat- and osmotic stress had no effect on the expression of the VanA ligase. A further objective of this study was the identification of a putative Flavophospholipol resistance determinant. Transfer of the FPL resistance between E. faecium strains could not be detected in filter mating experiments. For the molecular analysis of the Flavophospholipol resistance an insertional mutagenesis was carried out in a FPLr E. faecium strain using the conjugative transposon Tn916. The chromosomal insertion sites of the transposon were identical in all identified mutants with a 1.5 kb sequence deletion downstream of Tn916. Sequence analysis of the deleted area revealed homolgy to the 3´-end of a putative threonyl-tRNA synthetase gene and the gene of a putative regulator. The sequences in all mutants began about 200 bp upstream of the startcodon of a putative penicillin-binding protein (PBP) gene. The transcription of this penicillin-binding protein was weaker in the transposonmutant 64/3-1 than in the wildtype 64/3 as could be shown by Northern hybridisation. Further, binding-studies using 3H penicillin showed differences in the expression pattern of the penicillin-binding proteins between wildtype and mutant 64/3-1. The wildtype contained five PBP, while PBP2 and PBP3 where not marked in mutant 64/3-1. The size of PBP3 corresponds with an estimated size of the putative penicillin-binding protein of 79 kDa. This results suggest that the change in the penicillin-binding protein expression pattern of FPLs mutant 64/3-1 may be caused by the loss of a putative regulator or an important regulatory sequence. The PBP studies also show that FPL binds to PBP2 and PBP3 in E. faecium and these are likely bifunctional high molecular weight penicillin-binding proteins with transglycosylase- and transpeptidase-modules